ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Yurdanur BOZDEMİR KETEN TOHUMU (Linum Usitatissimum) EKSTRAKTINDA KATALAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİM AKTİVİTELERİ KİMYA ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KETEN TOHUMU (Linum Usitatissimum) EKSTRAKTINDA KATALAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİM AKTİVİTELERİ Yurdanur BOZDEMİR YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI Bu Tez 22/02/2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza: İmza: İmza: Doç.Dr.Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof.Dr.Seyhan TÜKEL Prof. Dr.Nuray ŞAHAN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof.Dr.Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2006YL27 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaklardan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotografların kaynak göstermeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KETEN TOHUMU EKSTRAKTINDA (Linum Usitatissimum) KATALAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİM AKTİVİTELERİ Yurdanur BOZDEMİR ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİMDALI Danışman : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Yılı :2007, Sayfa : 45 Jüri : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof.Dr.Seyhan TÜKEL Prof. Dr.Nuray ŞAHAN Bu araştırmada, yüksek antioksidan etkiye sahip olduğu bilinen keten tohumu (linum usitatissimum) ekstraktında; katalaz (E.C ) ve süperoksit dismutaz (EC ) enzimlerinin aktiviteleri tayin edilmiştir. Enzimlerin kısmen saflaştırılmalarında; homojenizasyon, ultrasantrifüjleme ve PD-10 (Sephadex G- 25M) kolon kromotografisi basamakları sırasıyla uygulanmıştır. Ultrasantrifüj sonrası katalaz ve süperoksit dismutaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri sırasıyla 15,94 U/mg prot. ve 2,05 U/mg prot. olarak, PD-10 kolon kromatografisi ile yapılan tuzdan ayrıştırma işlemi sonrası katalaz ve süperoksit dismutaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri yine sırasıyla 17,56 U/mg prot. ve 4,90 U/mg prot. olarak bulunmuştur. Ayrıca bu iki enzimin 4 o C deki depolama kararlılıklarına bakılmıştır. 96 saat sonunda katalazın aktivitesi tamamen kaybolmuş, süperoksit dismutazın aktivitesi ise % 59,60 azalmıştır. Anahtar Kelimeler : Keten tohumu, Katalaz, Süperoksit Dismutaz, Serbest radikaller I

4 ABSTRACT MSc THESIS CATALASE AND SUPEROXIDE DISMUTASE ENZYMES ACTIVITIES IN FLAXSEED (Linum Usitatissimum) EXTRACT Yurdanur BOZDEMİR DEPARTMENT OF CHEMISTRY INSTITUE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assos.Prof. Güzide YÜCEBİLGİÇ Year :2007, Pages : 45 Jury : Assos. Prof. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof.Dr.Seyhan TÜKEL Prof. Dr.Nuray ŞAHAN In this study, catalase (E.C ) and superoxide dismutase (EC ) activities were determined in the extract of flax seed (linum usitatissimum) with high antioxidant effect. Activities were determined after homogenization, ultracentrifugation and PD-10 (Sephadex G-25M) column chromotography steps. After the ultracentrifugation step, catalase and superoxide dismutase spesific activities were found as U/mg prot. and 2.05 U/mg prot., respectively. After desalting with PD-10 column chromotography, catalase and superoxide dismutase spesific activities were found as U/mg prot. and 4.90 U/mg prot., respectively. Both enzyme preparations were stored at 4 o C and after 96 hours catalase lost almost all of its activity. However, superoxide dismutase activity was decreased about % Key Words : Flax seed, Catalase, Superoxide Dismutase, Free radicals II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans çalışmam süresince, gerek bilimsel konularda gerekse manevi anlamda benden yardımlarını esirgemeyen değerli danışman hocam Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ e bana her zaman gösterdiği ilgi, sabır, iyi niyeti ve güler yüzü için sonsuz teşekkür ederim. Çalışmalarımda engin bilgisiyle bana destek olan sayın hocam Prof. Dr. Seyhan TÜKEL e ve moral desteği ve yardımları için Yrd. Doç. Dr. Ramazan BİLGİN e teşekkürlerimi sunarım. Laboratuvara adım attığım ilk andan itibaren bana karşı hep yardım sever ve çok sabırlı olan hocalarım Arş. Gör. Özlem ALPTEKİN e, Deniz YILDIRIM a ve Arş. Gör. Hasan KARADAĞ a, arkadaşım Dilek ALAGÖZ e çok teşekkür ederim. Yaşamımın her aşamasın da bana hep destek olup sevgi ve ilgilerini hiçbir zaman eksik etmeyen sevgili aileme ve özellikle de ablam Emine BOZDEMİR e ve tanıştığımız ilk günden beri hayatımın en önemli parçası olarak, varlığını heran hissettiren ve bana müthiş bir güç veren sevgili eşim Ender GÜLAL a sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ...I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER...IV ÇİZELGELER DİZİNİ...VI ŞEKİLLER DİZİNİ...VII SİMGELER VE KISALTMALAR...VIII 1. GİRİŞ Serbest Radikaller Serbest Radikal Türleri Süperoksit Radikali Hidrojen Peroksit Hidroksil Radikali Nitrik Oksit Singlet Oksijen Serbest Radikallerin Etkileri Antioksidan Savunma Sistemleri Antioksidan Enzimler Katalaz Süperoksit Dismutaz Glutatyon Peroksidaz Keten Tohumu Keten Tohumunun İçeriği ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METHOD Materyal Metod Molar Ekstinksiyon Katsayısı Tayini Antioksidan Enzimlerin Ekstraksiyonu 21 IV

7 PD-10 Kolonunun Hazırlanması Proteinlerin PD-10 Kolonuna Uygulanması CAT Aktivitesi Tayini SOD Aktivitesi Tayini Protein Tayini Enzimlerin Depolama Kararlılığı BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Molar Ekstinksiyon Katsayısı ve Protein Tayini İçin Yapılan Çalışmalarda Elde Edilen Bulgular Keten Tohumu (Linum Usitatissimum) Ekstraklarında Yapılan Çalışmalarda Elde Edilen Bulgular PD-10 Kolon Çalışması PD-10 Kolon Çalışması Sonucu En Yüksek Aktiviteyi Gösteren Örnekler Kullanılarak Katalaz ve Süperoksit Dismutaz Enzimlerinin Depolama Kararlılığının Belirlenmesi Tartışma SONUÇ VE ÖNERİLER Sonuçlar Öneriler...38 KAYNAKLAR...39 ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Çizelge 1.2. Çizelge 1.3. Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Çizelge 4.3. Çizelge 4.4. Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. Çizelge 4.7. Hücre içi antioksidanlar...7 Membran antioksidanlar...8 Bazı kuru yağlardaki, yağ asiti bileşenleri (wt%)...15 H 2 O 2 in farklı derişimlerdeki çözeltilerinin 240 nm deki ölçülen absorbans değerleri...25 Standart protein grafiği için elde edilen bulgular...26 Keten tohumu (linum usitatissimum) CAT ı için PD-10 kolonundan alınan eluatlarda 280 nm de okunan absorbans değerleri ve aktivite değerleri...29 Keten tohumu (linum usitatissimum) SOD ı için PD-10 kolonundan alınan eluatlarda 280 nm de okunan absorbans değerleri ve aktivite değerleri...31 Sephadex G-25 M kromotografisi sonucu en yüksek aktiviteyi gösteren örneklerin değişik sürelerdeki CAT ve SOD enzimlerinin % spesifik aktivite değerleri...32 CAT enzimi için keten tohumu türünün kaba homojenattan başlayarak PD-10 kolonuna uygulanmasına kadar olan işlemler ve hesaplanan parametreler...34 SOD enzimi için keten tohumu türünün kaba homojenattan başlayarak PD-10 kolonuna uygulanmasına kadar olan işlemler ve hesaplanan parametreler...34 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Katalaz enziminin hem b ve hem d grupları Şekil 1.2. Katalazın etki mekanizması Şekil 4.1. H 2 O 2 in 240 nm deki standart grafiği Şekil 4.2. Standart protein eğrisi Şekil 4.3. Keten tohumu (linum utitatissimum) CAT ı için PD-10 kolonundan alınan eluatlarda 280 nm de okunan absorbans değerleri ve aktivite değerleri Şekil 4.4. Keten tohumu (linum utitatissimum) SOD ı için PD-10 kolonundan alınan eluatlarda 280 nm de okunan absorbans değerleri ve aktivite değerleri Şekil 4.5. Sephadex G-25 M Kromotografisi Sonucu En Yüksek Aktiviteyi Gösteren Örneklerin Değişik Sürelerdeki Katalaz Enzimi % Spesifik Aktivite Değerleri Şekil 4.6. Sephadex G-25 M Kromotografisi Sonucu En Yüksek Aktiviteyi Gösteren Örneklerin Değişik Sürelerdeki Süperoksit Dismutaz Enzimi % Spesifik Aktivite Değerleri VII

10 SİMGELER VE KISALTMALAR CAT Prot. SOD LPO GSH-Px GOD ALA LA OA EPA DHA : Katalaz : Protein : Süperoksit dismutaz : Lipit peroksidasyon : Glutatyon peroksidaz : Glukozoksidaz : Alfa-Linolenik Asit : Linoleik Asit : Oleik Asit : Eikosa Pentaenoik Asit : Dokosa Heksaenoik Asit VIII

11 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR 1. GİRİŞ 1.1. Serbest Radikaller Serbest radikaller, kanser, alerji, diabet, katarakt, nörodejeneratif hastalıklar, arterioskleroz gibi birçok hastalığın patogenezinde rol oynayan ve bu nedenle son zamanlarda üzerinde en çok çalışılan konular arasında yer almaktadır. Serbest radikaller, somatik hücrelere ve bağışıklık sistemine saldıran moleküllerdir ve dış orbitallerinde bir veya daha fazla eşlenmemiş elektron ihtiva eden atom veya moleküller olup, bu elektronlarını paylaşabilmek için diğer moleküllerle hızla reaksiyona girerler (Hurst ve ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998). Serbest radikaller elektron transferi, enerji üretimi ve diğer metabolik işlevlerde temel oluştururlar. Ancak radikallerle reaksiyona giren moleküllerin bir elektronu azaldığı için onlarda reaktif bir hale gelir ve bu reaksiyon zincirleme olarak devam ederken kontrolsüz bir davranış gösterirse hücrede hasarlara neden olur. Serbest radikaller etkilediği atomun dolayısıyla o atomun bulunduğu maddenin görevini yapamamasına sebep olur. Sonuç olarak, etkilenen maddenin biyolojik önemine ve onun tamir edilip edilememesine bağlı olarak önemli veya önemsiz kalıcı veya geçici etkiler gösterir. Serbest radikaller hem normal metabolizmanın yan ürünü olarak, hem de toksik maddelerin etkisiyle oluşabilmektedir (Cross, 1987). Serbest radikal yaratan kaynaklar radyasyon, virüsler, güneş ışınlarının bir kısmı olan ultraviole ışınları, hava kirliliğini yaratan fosil kökenli yakıtların yanma sonundaki ürünleri, sigara dumanı, enfeksiyon, stres, yağ metabolizması sonunda çıkan ürünler gibi hücre metabolizmasının toksik ürünleri, bazı tahrip edici kimyasallar, haşere kontrol ilaçları ve birçok başka etkenlerdir.yani içinde bulunduğumuz çevrede çeşitli fiziksel ve kimyasal olaylar nedeniyle devamlı bir radikal yapımı vardır, hücresel koşullarda da ciddi bir miktar ve çeşitlilikte radikal üretilmektedir. Serbest radikaller üç temel mekanizma ile oluşur: 1. Kovalent Bağların Homolitik Kırılması; Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar ve yüksek sıcaklık kimyasal bağların kırılmasına neden 1

12 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR olur. Kırılma sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalıyorsa, bu tür kırılmaya homolitik kırılma denir ve her iki atom üzerinde de paylaşılmamış elektron kalır. 2. Normal Bir Molekülün Elektron Kaybetmesi; Radikal özelliği olmayan bir molekülden elektron kaybı sırasında dış orbitalinde paylaşılmamış elektron kalıyorsa radikal formu oluşur. Örneğin askorbik asit, glutatyon gibi hücresel antioksidanlar, radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formu oluşur. 3. Normal Bir Moleküle Elektron Transferi; Radikal özelliği olmayan bir moleküle tek elektron transferi ile dış orbitalin de paylaşılmamış elektron oluşuyorsa bu tür indirgenme radikal oluşumuna neden olabilir. Örneğin moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi, radikal formu olan süperoksitin oluşumuna neden olur. Biyolojik sistemler de serbest radikaller en fazla elektron transferi sonucu meydana gelirler (Hurst ve ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998). Serbest radikaller pozitif yüklü, negatif yüklü veya elektriksel olarak nötral olabilirler. Organik veya inorganik moleküller şeklinde olabilirler Serbest Radikal Türleri Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasın da anahtar rolü oynayan maddeler; oksijenin kendisi, süperoksit, hidrojen peroksit, geçiş metallerinin iyonları, nitrik oksit ve hidroksil radikalidir. Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları ile sonuncu meydana gelir. Hatta bu radikaller içinde süperoksit ve nitrik oksit temel radikaller sayılabilir. Çünkü süperoksit ve nitrik oksit enzimatik mekanizmalarla, devamlı olarak ve önemli derişimde üretilen radikal türleridirler. Ayrıca bu iki radikal, biyolojik sistemlerde tanıdığımız diğer bütün radikaller ile radikal yapıda olmayan reaktif türlerin oluşumunu başlatabilecek özelliktedirler 2

13 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Süperoksit Radikali Canlılarda oluşan ilk ve temel oksijen radikali süperoksit radikalidir (Süperoksit Anyonu, O.- 2 ). Başlıca şu mekanizmalarla üretilmektedir: (a) İndirgeyici özellikteki biyomoleküler oksijene tek elektron verip kendileri oksitlenirken süperoksit radikali oluşur. Hidrokinonlar, flavinler, tiyoller, ferrodoksinler, indirgenmiş nükleotitler gibi yüzlerce biyolojik molekül aerobik ortamda oksitlenirken süperoksit yapımına neden olurlar. (b) Başta çeşitli dehidrogenazlar ve oksidazlar olmak üzere, yüzlerce enzimin katalitik etkisi sırasında süperoksit radikali bir ürün olarak oluşabilir. (c) Mitokondrideki enerji metabolizması sırasında oksijen kullanılırken, tüketilen oksijenin % 1-5 kadarı süperoksit yapımı ile sonlanır. Buradaki radikal yapımının nedeni NADH-dehidrogenaz ve koenzim-q gibi elektron taşıyıcılardan oksijene elektron kaçağının olmasıdır. (d) Aktive edilen fagositik lökositler, bol miktarda süperoksit üreterek fagozom içine ve bulundukları ortama verirler. Hücresel koşullarda üretilen süperoksit, oksitleyici veya indirgeyici olarak davranabilir. Aldığı elektronu metal iyonuna, sitokrom-c ye veya bir radikale verirse tekrar oksijene oksitlenir. Sit c (Fe 3+ ) + O 2.- O 2 + Sit c (Fe 2+ ) (1) getirebilir. İndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu da süperoksit meydana Cu + + O 2 Cu 2+ + O 2.- (2) Hidrojen Peroksit Oksijenin enzimatik olarak iki elektronla indirgenmesi yada süperoksitlerin enzimatik ve non-enzimatik dismutasyonu tepkimeleri sonucu oluşur. 3

14 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 (3) O e - + 2H + H 2 O 2 (4) Hidrojen Peroksit yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özelliği taşımaz, reaktif bir tür değildir. Hidrojen Peroksitin oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin nedeni, demir, bakır gibi metal iyonlarının varlığında hidroksil radikalinin öncülü olarak davranmasıdır. Hidrojen Peroksit özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki reaktif demir formlarını oluşturur. Bu formdaki demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri başlatabilir. Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH - + OH (5) Hidroksil Radikali Biyolojik ve kimyasal sistemler de üretilen hidroksil radikali (. OH) canlılarda iki mekanizma ile oluşabilir : (a) İyonlaştırıcı radyasyonun etkisi ile sulu ortamda su moleküllerinin iyonlaşması gerçekleşir. 2H 2 O H 2 O + + e - + H 2 O* (6) Uyarılmış su molekülü (H 2 O*) homolitik yıkım ile; H 2 O + ise bir su molekülü ile tepkimeye girerek hidroksil radikali oluştururlar. Bu tepkimeler çok kısa sürede gerçekleşir ve üretilen OH, radyasyonun canlılardaki toksik etkisinden sorumlu başlıca kimyasal türdür. (b) Hidrojen Peroksitin eksik indirgenmesi ile OH yapımı, vücutta bu radikalin en önemli kaynağıdır. Hidrojen peroksitin iki elektron ile indirgenmesi ile su oluşurken, tek elektron ile indirgenmesi OH yapımına neden olur, bu tür 4

15 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR indirgenme Fe, Cu gibi metal iyonları tarafından katalizlenir. Askorbik asit, süperoksit gibi indirgeyici bileşiklerin de bulunduğu ortamda oksitlenen metal iyonu tekrar indirgendiğinden hidrojen peroksit den OH yapımı sürekli bir duruma gelir. H 2 O 2 + Askorbat (veya O 2.- ) OH + semidehidroaskorbat (7) Nitrik Oksit Nitrik oksit ( NO), çok önemli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen nitrojen merkezli bir radikaldir. Paylaşılmamış elektron aslında nitrojen atomuna ait ise de, bu elektronun hem nitrojen hem de oksijen atomu üzerinde delokalize olması nedeniyle tam radikal özelliği taşımaz. Bunun sonucu bilinen diğer radikallere göre reaktivitesi baskılandığından oldukça uzun ömürlüdür. Vücudumuzda NO sentezini sağlayan mekanizmalar son derece kısıtlıdır. Radikal olarak reaktivitesi düşük olan NO, metal içeren merkezler ve radikaller ile büyük bir hızla tepkimeye girer. Özellikle lipid radikaller ile tepkimeye girmesi NO e antioksidan bir etki kazandırır. Oksijen radikallerindeki durumun aksine, nitrik oksidi ortamdan temizleyen herhangi bir özel enzim yoktur. Aerobik ortamda NO stabil değildir. Derişiminin artması ile oksidasyonu hızlanır. Bu nedenle ortamdaki derişimi ile kendi ömrü arasında ters bir orantı vardır Singlet Oksijen Singlet oksijen ( 1 O 2 ), ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Oksijenin enerjetik olarak uyarılan bu formunda reaktivite çok yüksektir. Aldığı enerjiyi çevreye dalga enerjisi şeklinde verip yeniden oksijene dönebilir. Başlıca şu mekanizmalarla vücutta oluşabilir: (a) Pigmentlerin (örneğin flavin içeren nükleotidler) oksijenli ortamda ışığı absorplamasıyla, (b) Hidroperoksitlerin metaller varlığındaki tepkimelerinde, 5

16 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR (c) Kendiliğinden dismutasyon tepkimeleri sırasında, (d) Sitokrom p450 tepkimeleri, laktoperoksidaz enziminin etkileri sırasında. (Hurst ve ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998). 1.3.Serbest Radikallerin Etkileri Mitokondrial, endoplazmik ve nükleer elektron transport sistemlerinde (sitokrom p450), peroksizomlarda, monosit ve nötrofillerin fagositozu gibi normal metabolik olaylar sırasında bol miktarda serbest radikal üretilir. Bir anlamda serbest radikaller, solunum ve sindirim gibi normal vücut faaliyetlerinin zehirli atıkları durumundadır. Araştırmacılar, insan vücudundaki her hücrenin günde ortalama serbest radikalin hücumuna uğradığını belirtmektedirler. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezse; hücre membranı proteinlerini yıkarak hücreleri öldürmek, membran lipit ve proteinlerini yok ederek hücre membranını sertleştirip hücre fonksiyonunu engellemek, nükleustaki genetik kodu içinde taşıyan, hücrenin üretimini ve büyümesini sağlayan nükleik asite (DNA) etki edip, DNA yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmek, bağışıklık sistemindeki hücreleri yok ederek bağışıklık sistemini zorlamak, yaşlanma ve kanser gibi olaylara neden olabilirler (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000) Antioksidan Savunma Sistemleri Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinen; serbest radikalleri nötralize eden, serbest radikal hasarlarını tamir etmeye yardımcı olan ve vücudun onlardan etkilenmesini minimize eden veya kendini yenilemesini sağlayan besinlerin bir sınıfıdır (Ames ve ark. 1993; Müftüoğlu, 2003). Antioksidanları anlayabilmek için onların nötralize ettiği serbest radikallerin kaynağını ve neler yapabileceğini bilmemiz gerekir. 6

17 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Antioksidanlar olarak adlandırılan mikro besin maddeleri, yiyecekleri özellikle yağları oksidasyon ve bozulmaktan koruyan maddelerdir. Adlarından da anlaşılacağı üzere oksijenin diğer maddelerle birleşmesini önleyerek canlıdaki maddelerin okside olmasını engellerler. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen türlerini toplayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler. Antioksidan sistem bütün bunları yaparken temelde; serbest radikalleri hücre zarına, nükleik asitlere (DNA) ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar. Antioksidan özelliği bilinen bir çok farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını özellikle bitkilerden alırken, bir kısmını vücut kendisi üretir. Antioksidanlar, endojen kaynaklı (doğal) ve eksojen kaynaklı olmak üzere başlıca iki ana gruba ayrılabildiği gibi serbest radikalin meydana gelişini önleyenler ve mevcut olanları etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye ayrılabilirler. Ayrıca enzim olanlar ve olmayanlar şeklinde de sınıflandırılabilirler. Hücrelerin hem sıvı hem membran kısımlarında bulunabilirler. (a) Endojen (Doğal) antioksidanlar: -Enzimler: Katalaz, Süperoksit Dismutaz, Glutatyon Peroksidaz -Enzim olmayanlar: β-karoten, E vitamini, Askorbik asit, sistein, albumin, bilurubin, hemoglobin v.s. (b)eksojen antioksidanlar: Ksantin oksidaz inhibitörleri, NADPH oksidaz inhibitörleri (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000). Çizelge 1.1. Hücre içi antioksidanlar (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000) Superoksit Dismutaz (Cu, Zn, Mn ) Katalaz Süperoksit radikalinin katalitik olarak uzaklaştırılması H 2 O 2 in uzaklaştırılmasında Glutatyon Peroksidaz H 2 O 2 in ve lipit hidroperoksitlerinin uzaklaştırılmasında 7

18 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Çizelge 1.2. Membran antioksidanlar (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000) Vitamin E Yağda erir, zincir kırıcı antioksidandır. Plazmadaki lipoprotein lipitlerini de korur. Β-Karoten Yağda erir, radikal temizleyicisidir. Singlet oksijeni ortadan kaldırır. Koenzim-Q Temel rolü enerji metabolizmasındadır. Redükte durumda antioksidan olarak görev yapabilir. 1.5.Antioksidan Enzimler Enzimler çok yüksek katalizleme gücüne sahip protein yapısındaki biyolojik katalizörlerdir. Bir canlıdaki parçalanma ve yapım (sentez) reaksiyonlarının tümü enzimlerin katalitik aktiviteleri ve yöntemleriyle gerçekleştirilmektedir. Bu tanıma göre de, enzimler canlılığın oluşumu ve devamı için elzem maddelerdir. Canlı dışında da aktivite göstermeleri enzimlerin önemini bir kat daha artırmaktadır. Enzim üretimi genlerin kontrolü altında gerçekleştirilmekte (bir gen-bir enzim) ve her enzimin kendine özgü sıcaklık, iyon tepkimesi (ph) ve basınç koşulları bulunmaktadır. Bugün enzimler gıda, ilaç ve kimya endüstrisinde, dericilik, boya ve temizlik maddeleri üretimi gibi özel konularda, biyoloji ve biyoteknoloji bilim dallarında, tıp, tarım, veterinerlik ve tekstil endüstrisi alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. En önemli antioksidan enzimler; süperoksit anyonunu hidrojen peroksite dönüştüren süperoksit dismutaz (SOD), organik peroksitleri detoksifiye eden glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve hidrojen peroksiti suya indirgeyen katalaz (CAT) dır. Ve bu endojen antioksidan enzimler serbest radikalleri zararsız hale getirirler. Böylece organizma serbest radikaller ve aktif oksijen türlerinden etkilenmez (Arosio ve ark. 2000). 8

19 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Katalaz Katalaz enzimi (H 2 O 2 : H 2 O 2 oxidoreductase E.C ) tabiatta çok yaygın olarak bulunmaktadır. Katalaz (CAT), sitokrom sistem içeren memeli ve memeli olmayan organizmalarda bulunurken, genelde anaeroblarda bu enzime rastlanmamaktadır. Hemen hemen tüm aerobik mikroorganizmalarda, bitki ve hayvan hücrelerinde katalitik aktivitesi yüksek konsantrasyonda mevcuttur. Oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonlarında rol oynayan enzimlere oksidoredüktazlar denilir ve CAT oksidoredüktazların (Oksidazlar, dehidrojenazlar, hidroperoksidazlar, oksijenazlar) bir grubu olan hidroperoksidazlar sınıfında yer alır. Hidroperoksidazlar, substrat olarak hidrojen peroksit veya diğer organik peroksitleri kullanırlar, aynı zamanda canlıyı zararlı peroksitlere karşı korurlar. Peroksitlerin birikmesi serbest radikallerin ortaya çıkmasına ve membran yapısının bozulmasına, aterosikleroz ve muhtemelen kanser oluşumuna neden olur (Higashi ve ark. 1974; Halliwel ve ark. 1990; Nicholls ve ark. 2000). Katalaz, hidrojen peroksitin su ve oksijene dönüştürülmesini katalizleyen ve böylece hidrojen peroksitin hücresel bileşiklere zarar vermesini engelleyen koruyucu bir enzimdir. Hidrojen peroksit, katalaz tarafından parçalanmazsa vücut için çok tehlikeli bir serbest radikal olan hidroksil radikalinin öncülü olarak davranır ve bu radikal hücrede kalıcı hasarlara neden olur. 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 (8) CAT, hidrojen peroksiti substrat olarak, hem elektron alıcısı hemde elektron vericisi olarak kullanmaktadır. (Lanir ve Schejter 1975; Jones ve Masters 1976; Nicholls ve ark. 2000; Robertson, 2004). Birçok in vivo ortamlarda peroksidaz aktivitesi olarak CAT tercih edilmektedir. CAT kanda, kemik iliğinde, mukoz membranlarda, böbrek ve karaciğer de bulunur. Temel fonksiyonu oksidazlar tarafından ortaya çıkan hidrojen peroksiti ortadan kaldırmaktır. 9

20 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Şekil 1.1. Katalaz enziminin hem b ve hem d grupları Birçok dokuda oksidaz ve CAT aktivitesi beraber çalışır. Katalitik reaksiyonda iki basamak yer alır: İlk basamakta katalazın Ferrik (Fe 3+ ) içeren hali, bileşik-1 (Porfirin Katyon Radikali) oluştururken peroksit molekülü ile tepkime verir ve burada peroksit molekülü indirgenir. Sonrasında ikinci basamakta başka bir hidrojen peroksit molekülü yükseltgenerek bileşik-1 doğal halini alır. Bu reaksiyonlarda hidrojen peroksit hem elektron alıcısı hemde vericisi olarak görev yapar (Kremer, 1970; Lardinois, 1995; Switala ve Loewen 2002). 10

21 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Şekil 1.2. Katalazın etki mekanizması (Anderson ve Dawson 1991) H 2 O 2 + Enz.-Fe( 3+ ) H 2 O + O=Fe ( 4+ )-Enz. (9) Bileşik-1 H 2 O 2 + Enz.-Fe( 4+ )=O O 2 + Fe ( 3+ )-Enz. (10) Bileşik Süperoksit Dismutaz Süperoksit Dismutaz enzimi (superoxide oxido reductase, EC ) oksijeni metabolize eden tüm hücrelerde bulunur. Oksijen toksisitesine karşı önemli bir defanstır. Süperoksit dismutaz ın fonksiyonu aerobik organizmaları süperoksitin zararlı etkisine karşı korumaktır. Süperoksit radikallerinin, H 2 O 2 ve oksijene hızlıca dismutasyonunu katalize eder. SOD katalitik aktivitesi çok yüksek olan bir enzimdir (Fridovich, 1973; Lavelle ve ark. 1973; Petkau ve ark. 1975; Sheng ve ark. 2004). SOD. O O H + H 2 O 2 + O 2 (11) 11

22 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR Kofaktör olarak içerdiği metal iyonuna göre üç sınıf dismutaz enzimi vardır: (a) Bakır ve Çinko içeren dismutazlar (Cu, Zn SOD) genel olarak ökaryotik hücrelerin sitozolünde ve kloroplastlarda bulunur. Tek disülfit bağı ile birbirine bağlı iki aynı alt birimden oluşur ve alt birim başına birer çinko ile bakır içerirler. Enzimin etkinliği için bakır mutlaka gerekli iken çinko; Co 2+, Hg 2+, Ca 2+ ile yer değiştirebilir. Dismutasyon bakır ile süperoksit radikali arasındaki etkileşimle başarılır. (b) Mangan içeren dismutazlar (Mn SOD) prokoryotlarda ve mitokondri matriksinde bulunur. Birbirinin aynı iki alt birimden oluşan ve her alt birimde bir atom Mn içeren dismutazlardır. (c) Demir içeren dismutazlar (Fe SOD) prokaryotlarda ve bazı bitkilerde bulunur. Mn süperoksit dismutaza benzer yapıdadır Glutatyon Peroksidaz Glutatyon Peroksidaz enzimi (GSH-Px. EC ) hidrojen peroksit ve lipit hidroperoksitlerinin bozunumunu (lipit peroksidasyonunda zincir kırıcı etki) katalizler. Glutatyon peroksidaz enzimi reaksiyon esnasında redükte glutatyonu (GSH) elektron akseptörü olarak kullanır ve sonuçta oluşan okside glutatyon (GSSG) NADPH bağımlı glutatyon redüktaz enzimi tarafından rejenere edilir. GSH-Px H 2 O 2 + 2GSH GSSG + 2 H 2 O (12) GSH-Px 2GSH + R-O-OH GSSG + 2 H 2 O + ROH (13) Glutatyon (γ-glutamil sisteinil glisin, GSH) ; serbest sülfidril gruplu tripeptitdir. Glutatyon peroksidazın katalizlediği reaksiyonla, membran lipitlerinin ve hemoglobinin peroksitlerle oksidasyonuna karşı koyulur. Bu reaksiyon hemoglobinin methemoglobine oksidasyon oranını azaltarak eritrositin ömrünü uzatır. 12

23 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR 1.6.Keten Tohumu Keten (Linum usitatissimum); cm yükseklikte, mavi çiçekli ve bir yıllık bir kültür bitkisidir. Latince ismi Çok faydalı bitki anlamına gelmektedir. Keten Mısırlılardan beri tarımı yapılan ve çok değişik amaçlarla kullanılan bir bitkidir. Tohumları; 4-6 mm uzunlukta, yumurta biçiminde, yassı, parlak, kırmızımtırak esmer renkli, kokusuz, lezzetli ve yağlıdır Keten Tohumunun İçeriği -Omega-3 (ALA: Alfa-Linolenik Asit), Omega-6 (LA: Linoleik Asit) ve Omega-9 (OA: Oleik Asit) yağ asitleri, (Omega-3 yağ asiti oranı, Omega-6 nın yaklaşık dört katıdır) -Yüksek oranda çözünür ve çözünmez lif, -Protein, -Lignanlar (Bitkisel östrojen), -Vitaminler (A vitamini (Beta-karoten), E vitamini, C vitamini, vitamin B12), -Mineraller (Bol miktarda potasyum, az miktarlarda ise magnezyum, demir, bakır, çinko), -Aminoasitler bulunur. Temel yağ asitleri olan, linoleik yağ asitleri (Omega-6 grubu yağ asitlerinin öncüsü) ve linolenik yağ asitleri (Omega-3 grubu yağ asitlerinin öncüsü) vücut tarafından enerji kaynağı olarak kullanılırlar ve diğer yağ asitlerinin ham maddesi veya yapı taşlarıdırlar. Temel yağ asitleri; hücre zarlarının (çeperinin), birçok önemli hormonun ve kimyasal habercilerin yapılması için gereklidir. Omega-3 ün prekursörü (ilk başlangıç şekli) kısa zincirli tip olarak bilinen ALA (Alfa-linolenic Acid) Alfa-Linolenik Asit tir (Omega-3 ün biyosentezi için başlangıç materyali). ALA; EPA ve 3. seri prostaglandin lerin (PGE3-Hücresel etkinliği düzenleyen hormonlar) prekürsörüdür. ALA in bir temel yağ asiti 13

24 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR olarak görev yapmasının sebeplerinden biride, vücut tarafından diğer iki temel yağ asidi olan EPA ve DHA e dönüştürülmesidir (EPA: Eikosa Pentaenoik Asit ve DHA: Dokosa Heksaenoik Asit, EPA vedha; Omega-3 ailesinin bir parçası olan çoklu doymamış yağ asitleridir). İnsan vücuduna faydalı olabilmesi için bu kısa zincirli omega-3 yağ asitlerinin (ALA) uzun zincirli yağ asiti tipleri olan EPA ve DHA e dönüştürülmesi gerekmektedir. Vücut bu dönüşümü kendisi yapabilmektedir. Fakat bazı hastalıklar bu dönüşümü azaltabilmekte veya engellemektedir. EPA ve DHA gibi daha faydalı asit türlerine dönüşüm yaş, beslenme ve hormonal durum gibi faktörlerle sınırlanmaktadır. Doymuş yağlar, kolesterol ve karşı yağ asitleri bakımından zengin bir beslenme alışkanlığı, vücudun bu doymamış yağ asitlerini üretme yeteneğini azaltır. EPA (eicosapentaenoic acid) ve DHA (docosahexaenoic acid) iyi kolesterolü yükseltir, kötü kolesterolü (LDL) düşürür, yüksek tansiyonda düşürücü etki yapar, kanın pıhtılaşma eğilimini azaltır, plazma trigliserid düzeyini, aritmi riskini azaltırlar. Trigiliseritler kalp hastalığı riskinin artmasından sorumlu maddelerdir. Omega-3 doymamış yağları, trigliseritleri %30 gibi yüksek bir oranda düşürebilir ve böylelikle kalp krizi riskini azaltabilir. Dolayısı ile alfa-linolenik asitin koroner kalp hastalığı riskini azalttığı tespit edilmiştir. Aynı zamanda kalp krizine veya tromboz a (damarda veya kalpte kanın pıhtılaşması) neden olabilen damarlardaki pıhtılaşmayı önlemeye de yardım etmektedir (Chan ve ark. 1991; Lorgeril ve ark. 1994). Keten tohumu üzerine yapılan araştırmalar, düzenli keten tohumu kullanımının dolayısı ile alfa linolenik yağ tüketiminin, arteriosklerozun (damar sertliği) gelişmesini önleyebileceğini, iltahabi hastalıklarda ve otobağışıklık rahatsızlıklarında etkili olabileceğini göstermektedir. Omega-3 çe dengeli beslenmenin kanseri engelleyici özellikleri de tespit edilmiştir (Serraino, 1991) Ayrıca keten tohumu yağı olan ALA gibi temel yağ asitleri vücutta beyin ve sinir dokularını yapmak, beyin hücrelerinin birbirleriyle bağlantısı ve beyin sinyallerinin doğru bir şekilde iletimi için de kullanılmaktadır. Omega-3 ve Omega-6 temel yağ asitleri vücudumuzda prostaglandin lerin yapılması için özellikle önemlidir. Prostaglandinleri vücut, temel yağ asitlerinden yapılmaktadır. Prostaglandinler hormon benzeri maddeler olup; vücuttaki birçok faaliyeti 14

25 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR düzenlemekten sorumludurlar. Bunlar arasında iltihaplanma, ağrı, şişkinlik, tansiyon, kalp, böbrekler, sindirim sistemi ve vücut sıcaklığı sayılabilir. Ayrıca allerjik reaksiyonlar, kan pıhtılaşması ve diğer hormonların yapılması için de önemlidirler. Bugüne kadar 50 yi aşkın, etkinlik derecesi değişik prostaglandin bulunmuştur (Fritsche ve Johnston 1990; Sardesai, 1992; Cunnane, 1993; Munoz ve ark. 1995). Çizelge 1.3. Bazı kuru yağlarda ki, yağ asiti bileşenleri (wt%) Chiantore 1999) Yağ Palmitik, Stearik Oleik, Linoleik, (Lazzari ve Linolenik, C 16:0 C 18:1 C 18:2 C 18:3 Keten tohumu Ceviz Haşhaş tohumu Yakın zamanda yapılan araştırmalarda keten tohumunun kabuklarında lignan isimli çok önemli ve faydalı özellikleri olan bir madde bulunmuştur. Lignanlar bitkisel kökenli bir kimyasal madde grubudur. Keten tohumunda SDG (Secoisolariciresinol glucoside) isimli lignan bulunmaktadır. Bu madde bir çeşit karbonhidrat olup; fenolik bileşikler veya polifenol olarak sınıflandırılır (aktif polisakkarit) (Kurzer). Lignanlarla ilgili ilk rapor 1980 lerde araştırmacıların vejeteryan beslenen kişilerde, vejeteryan olmayanlara göre ve göğüs kanseri olmayan hastalarda, olanlara göre daha fazla lignan bulunmasıyla ilgilidir. Lignanların genel olarak, bitkilerde bulunan ve memelilerde bulunan olmak üzere 2 tipi vardır. Bitkisel lignan (keten tohumundaki gibi) bir memeli tarafından yendiğinde kalın bağırsaktaki (kolon) bir faydalı-iyi bakteri tarafından memelilerde bulunan lignan tipine (ED: EnteroDial ve EL: EnteroLactone) dönüştürülür. Bu yüzden keten tohumu lignanı (SDG); memelilerde ED ve EL tipi lignanların prekursörüdür. Lignanların birçok biyolojik özellikleri vardır. Bu özellikler onu çeşitli hastalıklarla savaşmada ve sağlığın iyileştirilmesi hususunda eşsiz yapar. 15

26 1. GİRİŞ Yurdanur BOZDEMİR SDG lignan sadece anti-kanser özelliğe sahip değil, aynı zamanda anti-viral (virüs öldürücü), anti-bakteriyel (bakteri öldürücü) ve anti-fungal (mantar-öldürücü) özelliklere de sahiptir. Ayrıca çok güçlü bir antioksidan ve farklı hastalıklara karşı bağışıklık sistemini güçlendirici bir maddedir (Brooks ve ark. 2004). 16

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yurdanur BOZDEMİR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Lokman Ö. ve ark. (2005), Maydonazdan katalaz enzimini; Amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE-Sephadex A50 jelinin kullanıldığı iyon değişim kromotografisi ile saflaştırmışlardır. Enzimin spesifik aktivitesi 1126 EU/mg, optimum ph, stabil ph değerleri 7 ve optimum sıcaklık ise 35 o C saptanmıştır. Malgorzata M. ve ark. (2005), Dondurulmuş soya fasülyesi filizlerindeki antioksidan enzim aktivitelerini incelemişlerdir. 1 o C ye soğutulmuş filizlerde ki CAT ve SOD aktivitelerinin 25 o C dekine göre arttığı gözlenmiştir. Kailash P., (2004), Keten tohumundan izole edilen keten lignanı bileşiğinin hipokolesterolemik ve antiarteriosklerozik etkisini incelemiştir. Bu çalışmanın amacı; lignan bileşiğinin hiperkolesterolemik tavşanlarda (i) serum kolesterolünü, (ii) oksidatif stresi ve (iii) arteriosklerozu azaltıp azaltmadığının tayin edilmesidir. Tavşanlar dört gruba ayrılmıştır: Grup I, kontrol; Grup II, lignan bileşiği kontrol (lignan bileşiği, 40 mg/kg günlük vücut ağırlığı); Grup III, 0.5% kolesterol; Grup IV, 0.5% kolesterol diyeti+lignan bileşiği, (40 mg/kg günlük vücut ağırlığı). Kan örnekleri serum trigliserid (TG), toplam kolesterol (TC), LDL-C, HDL-C ve lipid peroksidasyon ürünü serum malondialdehid (MDA) ölçümleri için başlangıçtan önce ve deneysel diyetlerden 1 ve 2 ay sonra toplanmıştır. Grup III deki tavşanlar da, aortun yüzeyinin yaklaşık %50.84±6.23 ü arteriosklerozik değişikliklerle kaplanmıştır. Lignan bileşiği verilenlerde ise, arterioskleroz ilerleyişi %34.37 oranlarında azalmıştır. Liangquan S. ve ark. (2004), Bu çalışmada, Cu, Zn-Süperoksit dismutaz (I ve III) tütün yapraklarından (Nicotiana Tobacum) Amonyum sülfat, ethanolkloroform ve aseton ve DEAE-52, Sephadex G-75 kolon kromotografisi yardımıyla saflaştırılmıştır. Cu,Zn-SOD III ün bazı özellikleri belirlenmiştir. Cu,Zn-SOD III ün moleküler ağırlığı 22,976 Da olarak tayin edilmiştir. 17

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yurdanur BOZDEMİR Jacques R.Vanfleteren, (1992), İplik kurdu (Caenorhabditis Elegans) dokusundan Cu, Zn-Süperoksit Dismutaz enzimini saflaştırmışlardır. Enzim aktivitesi 2660 U/mg protein, moleküler ağırlığıda 37,5-40 kda aralığında saptanmıştır. Mitchell ve ark. (1991), Lahana iliklerinden (Trichoplusiani) katalazı; ethanol-kloroform fraksiyonu ve standart kolon kromotogrofisi ile saflaştırmışlardır. Enzimin spesifik aktivitesi 2,2X10 5 Unit, moleküler ağırlığı Da aralığında saptanmıştır. Enzimin biyokimyasal özellikleri (substrat spesifikliğinin önemi, kinetiği, tersinmez inhibitör olan 3-1,2,4-triazole(AT)ün mekanizmayı inaktive etmesi) üzerine çalışılmıştır. Beaumont ve ark. (1990), Patates kökünden (Solanum Tuberosum) katalazı; AcA-34 ultrajel kolonu ile saflaştırmışlardır. Yapılan aktivite çalışmaları sonucu enzimin spesifik aktivitesini yaklaşık 3000 U/mg protein değerinde saptamışlardır. Bir diğer çalışmada ise enzimin molekül ağırlığını 224 kda bulunmuştur. Ayrıca bu araştırmada enzim için siyanid ve azid inhibitörleri kullanmışlardır. Havir ve Mchale (1987), Tütün yapraklarından (Nicotiano Sylvestris) katalaz enzimini; Sephadex G-25 kolonu kullanarak saflaştırmışlardır (biri tipik düşük peroksidatik aktivitesi olan CAT-I ve diğeri yüksek peroksidatik aktivitesi olan CAT-III izoenzimlerini).bunların katalitik reaksiyonda Km değerleri CAT-I için 0,057 M ve CAT-III için 0,054 M olarak saptanmıştır. Hirasawa ve ark. (1987), Ispanaktan (Spinacea oleracea) katalaz enzimini saflaştırmışlar ve ıspanak katalazının spektroskopik özelliklerini incelemişlerdir. Yapılan aktivite çalışmaları sonucu enzimin spesifik aktivitesini yaklaşık U/mg protein değerinde saptamışlardır. Ayrıca jel filtrasyonu yardımıyla enzimin moleküler ağırlığınıda Da olarak bulmuşlardır 18

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yurdanur BOZDEMİR Yasuko Abe ve ark. (1987), Kurbağa ciğerinden (Rana Catesbeiana) Mn- Süperoksit dismutazı; elektroforetik homojenizasyon ile saflaştırmışlardır. Enzimin moleküler ağırlığı yaklaşık civarında olup, herbiri birer Mn atomu içeren 4 farklı subunit içermektedir ve amino asit dizilişinin insan ve tavuk karaciğerinden elde edilen Mn-SOD ile benzer olduğu saptanmıştır. 19

30 3. MATERYAL VE METOD Yurdanur BOZDEMİR 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Araştırmada kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olup Sigma, St. Louis, MO, Merck firmaları tarafından sağlanmıştır. Araştırmada enzim kaynağı olarak kullanılan keten tohumu (linum usitatissimum) örneği Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümünden temin edilmiştir. Araştırmada kullanılan kimyasallar, araç ve gereçler şunlardır: Kimyasallar; PVP (çözünebilir polyvinylpyrolidone), dithiothreitol, EDTA, PEG-4000 (polyetylen gylycol-4000), sephadex G-25M, potasyum dihidrojen fosfat, dipotasyum hidrojen fosfat, hidrojen peroksit, hidroklorik asit, sodyum hidroksit, bakır sülfat, folin-ciocalteu çözeltisi, xantin, xantin oksidaz, NBT (nitroblue tetrazolium), sodyum karbonat, sığır serum albümin (BSA), amonyum sülfat, bakır klorür ve keten tohumu (linum usitatissimum) örnekleri. Araç ve gereçler; UV-Vis spektrofotometre (ATI UNICAM), ph metre (HANNA 8417), magnetik karıştırıcı, ultrasantrifuj, anatilik terazi, otomatik pipet, cam kolonlar Metod Molar Ekstinksiyon Katsayısı Tayini Enzim aktivitesinin belirlenmesinde H 2 O 2 nin molar ekstinksiyon katsayısı kullanılmıştır. Bunun için H 2 O 2 nin belirli derişimlerde çözeltileri hazırlanıp 240 nm de absorbans değerleri okunmuş olup, okunan bu değerlerden elde edilen grafik eğiminden molar eksinksiyon katsayısı hesaplanmıştır. 20

31 3. MATERYAL VE METOD Yurdanur BOZDEMİR Antioksidan Enzimlerin Ekstraksiyonu Antioksidan enzimlerin ekstraksiyonunda Malgorzata M. ark. (2004) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. 1 g keten tohumu; 0,2 g sulandırılmış PVP (çözünebilir polyvinylpyrolidone), 2mM dithiothreitol, 0,1 mm EDTA ve 1,25 mm PEG-4000 eklenmiş 10 ml 0,1 M Fosfat tamponu içinde 1 saat boyunca 4 o C de homojenize edilmiştir. Sonrasında 1,5 ml hacmindeki Eppendrof tüplerine alınarak 10,000g de 15 dk. santrifüjlenmiş ve elde edilen süpernatant Miracloth filtresi ile süzülüp, PD-10 kolonun da (Sephadex G-25 M) tuzu ayrıştırılmıştır. Ekstraksiyonun bütün basamaklarında sıcaklığın 1-4 o C aralığında olmasına dikkat edilmiştir PD-10 Kolonunun Hazırlanması 3g Sephadex G-25 M jeli alınıp, 90 ml, 25 mm ph=8,0 (4 o C) Tris-HCI tamponu içerisine ilave edilmiştir. Kolon (1,7x10 cm) jel ile doldurulup 25 ml, 25 mm ph=8,0 (4 o C) Tris-HCI tamponu ile dengeye getirilmiştir. Kolonun dengeye gelmesi için bir gün beklenmiştir Proteinlerin PD-10 Kolonuna Uygulanması Katalaz ve süperoksit dismutaz enzimlerini içeren 1 ml enzim ekstraktı kolona uygulanmıştır. Örneklerin kolondan alınması 25 mm ph=8,0 (4 o C) Tris-HCI tamponu ile yapılmıştır. Protein örnekleri 1 ml hacmindeki tüplerde toplanmış ve toplanan her tüp için protein miktarına, katalaz ve süperoksit dismutaz enzim aktivitelerine bakılmıştır CAT Aktivitesi Tayini CAT aktivitesi Aebi tarafından önerilen ve Lartillot, S. ve arkadaşları (1988) tarafından geliştirilen metoda göre yapılmıştır. Enzimatik aktivite tayini, hidrojen 21

32 3. MATERYAL VE METOD Yurdanur BOZDEMİR peroksitin 240 nm deki absorbansının enzim ile etkileşmesinden sonra azalmasının zamana bağlı olarak ölçülmesiyle yapılmıştır. Hidrojen peroksit için molar ekstinksiyon katsayısı 0,0396 cm 2 μmol -1 dir. Yöntemde, uygun derişim ve ph daki tampon içinde 10 mm H 2 O 2 olacak şekilde substrat çözeltisi hazırlanır. 20 μl test edilecek enzim çözeltisi üzerine 2,5 ml substrat çözeltisi eklenir ve 37 o C de 2 dk. bekletilir. Reaksiyonu durdurmak için ortama 0,5 ml 1 M HCI çözeltisi ilave edilir. 240 nm de absorbansı (Ar) ölçülür. Kör olarak 2,5 ml tampon ve 0,5 ml 1 M HCI içeren çözelti kullanılarak aynı işlemler tekrarlanır. Hidrojen peroksitin başlangıçtaki absorbansını (As) belirlemek için; 2,5 ml substrat ve 0,5 ml 1 M HCI içeren çözeltinin absorbansı ölçülür. Proteinin neden olacağı absorbansı (At) belirlemek için ; 20 μl enzim çözeltisi, 2,5 ml tampon ve 0,5 ml 1 M HCI içeren çözeltinin absorbansı ölçülür. Enzimatik aktiviteden dolayı absorbans değişimi (A): A=(As+At)-Ar Enzim aktivitesinin IUml -1 cinsinden hesaplanmasında aşağıdaki formül kullanılır. A.Vt Aktivite = ε.t.ve V t =Toplam reaksiyon hacmi (ml) V e =Kullanılan enzim çözeltisinin hacmi (ml) ε = H 2 O 2 in molar ekstinksiyon katsayısı (0,0396 cm 2 μmol -1 ) t = Reaksiyon zamanı (dakika) Bu çalışmada her bir örnekteki protein miktarı belirlenerek aktivite μmol H 2 O 2 mg prot. -1 dk -1 olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi spektrofotometrik yöntemle 240 nm de ölçülmüştür (Havir,E. ve Mchale 1987). 22

33 3. MATERYAL VE METOD Yurdanur BOZDEMİR SOD Aktivitesi Tayini SOD aktivitesi, Sun, Y. ve ark. (1988) tarafından önerilen yöntem kullanılarak tayin edilmiştir. SOD aktivitesi, enzim ekstraktının NBT nin fotokimyasal redüksyonunu inhibe edebilme yeteneğinin ölçülebilmesi ile belirlenmiştir Yöntemde, 0,3 mm Xantin, 0,6 mm EDTA, 150 μg/l NBT, 400 mm Sodyum karbonat ve 1 g/l Bovine serum albumin biraraya getirilerek stok reaktif örneği hazırlanmıştır. Ayrıca Xantin oksidaz (167 U/mL) enziminden 18 μl alınıp, 3mL 2 M amonyum sülfat içerisinde çözülmüştür. Sonrasında iki tüp alınmış ve bunlara ayrı ayrı 2,85 ml stok reaktif örneği konulup, ilk aşamada sadece ikinci tüpe test edilecek enzim çözeltisinden 0,1 ml eklenmiştir. Hazırladığımız Xantin oksidaz çözeltisinden 50 μl alınıp, zaman not alınarak, ayrı ayrı her iki tüpede Xantin oksidaz ilave edilmiş ve 25 o C de 20 dk. bekletildikten sonra her iki tüpe reaksiyonu durdurmak için 0,1 ml bakır klorür eklenmiştir. İkinci aşama olarak da sadece birinci tüpe, test edilecek enzim çözeltisinden 0,1 ml ilave edilmiştir. Bir ve iki nolu tüplerde elde edilen çözeltilerin 560 nm de ki absorbansları köre karşı okunmuştur. Kör olarak saf su kullanılmıştır. kullanılmıştır. Enzim aktivitesinin IU.ml -1 cinsinden hesaplanmasında aşağıdaki formül A 1 - A 2 Aktivite = x 20 A 1 A 1 = 1. Tüpün absorbans değeri A 2 = 2. Tüpün absorbans değeri Protein Tayini Protein tayini Lowry yöntemi ile yapılmıştır. Bunun için içerikleri bildirilen A, B ve C çözeltileri hazırlanmıştır. 23

34 3. MATERYAL VE METOD Yurdanur BOZDEMİR 1. Çözelti A: 20 g Na 2 CO 3 ve 4g NaOH saf suda birlikte çözülüp son hacim 1 L ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 2. Çözelti B: 0,5 g CuSO 4.5H 2 O, %1 lik sodyum sitrat çözeltisinde çözülüp son hacim aynı çözelti ile 100mL ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 3. Çözelti C: 50 ml A çözeltisi ile 1 ml B çözeltisi karıştırılarak hazırlanmıştır (Kullanılacağı zaman hazırlanmasına dikkat edilmiştir). 4. Folin-Ciocalteu çözeltisi: Folin-Ciocalteu saf su ile 1:2 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır. 5. Satdart protein çözeltisi: 100mL de 3,95 mg sığır albümini olacak şekilde 0,9 luk NaCl çözeltisi ile hazırlanmıştır. 6. Standart protein eğrisini çizimi: 8 adet deney tüpü alınarak tüplere sırası ile 0, 50, 100, 125, 250, 500, 750 ve 1000 µl olacak şekilde standart protein çözeltisinden konulmuştur. Her tüp içeriğinin hacmi su ile 1 ml ye tamamlanmış, her tüpe 5 ml C çözeltisi ilave edilmiştir. 10 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra her tüpe 1:2 oranında seyreltilmiş Folin-Ciocalteu çözeltisinden 0,5 ml eklenmiştir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilip tüp içeriklerinin absorbansları köre karşı 750 nm de okunmuştur. Bu değerler derişime karşı grafiğe geçirilmiştir. Örneklerin protein içerikleri aynı yöntemle standart protein eğrisi kullanılarak değerlendirilmiştir Enzimlerin Depolama Kararlılığı PD-10 kolonundan geçen örnekler içerisinde en yüksek aktivite gösteren örnekler biraraya getirilmiş ve bu karışım +4 o C de 24, 48, 72, 96 saat süreyle bekletilmiştir. Bu saklama süreleri sonunda katalaz ve süperoksit dismutaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri ölçülmüştür. 24

35 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Yurdanur BOZDEMİR 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular Molar Ekstinksiyon Katsayısı ve Protein Tayini İçin Yapılan Çalışmalarda Elde Edilen Bulgular Enzim aktivitesinin belirlenmesinde H 2 O 2 nin molar ekstinksiyon katsayısı kullanılmıştır. Bunun için H 2 O 2 nin belirli derişimlerde çözeltileri hazırlanıp 240 nm de absorbans değerleri okunmuş, sonuçlar Çizelge 4.1 de verilmiş ve Şekil 4.1 de şematik olarak gösterilmiştir. Buna göre H 2 O 2 için 240 nm de molar ekstinksiyon katsayısı 0,0393 cm 2 µmol -1 olarak hesaplanmıştır. Çizelge 4.1. H 2 O 2 in farklı derişimlerdeki çözeltilerinin 240 nm deki ölçülen absorbans değerleri H 2 O 2 mm ABS 1 0, , , , , , , , , , , ,120 25

36 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Yurdanur BOZDEMİR ABS 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0393x R 2 = 0, H 2 O 2 mm Şekil 4.1. H 2 O 2 in 240 nm deki standart grafiği Enzim aktivitesi tayinindeki enzim miktarını belirlemek amacıyla protein tayini yapılmıştır. Sonuçların değerlendirilmesi amacıyla sığır serum albumini kullanılarak standart protein eğrisi çizilmiştir. Elde edilen bulgular Çizelge 4.2. de şematik olarak gösterilmiştir. Çizelge 4.2. Standart protein grafiği için elde edilen bulgular Derişim(mg/mL) Absorbans 0,013 0,039 0,025 0,074 0,031 0,091 0,063 0,177 0,125 0,342 0,188 0,469 0,250 0,596 26

37 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Yurdanur BOZDEMİR 0,7 0,6 y = 2,4855x R 2 = 0,9914 0,5 ABS (750nm) 0,4 0,3 0,2 0, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 mg pro/ml Şekil 4.2. Standart protein eğrisi Keten Tohumu (Linum Utitatissimum) Ekstraklarında Yapılan Çalışmalarda Elde Edilen Bulgular 1 g keten tohumu; 0,2 g sulandırılmış PVP (çözünebilir polyvinylpyrolidone), 2mM dithiothreitol, 0,1 mm EDTA ve 1,25 mm PEG-4000 eklenmiş 10 ml 0,1 M Fosfat tamponu içinde 1 saat boyunca 4 o C de homojenize edilmiştir. Elde edilen kaba homojenatın çok yoğun olması sebebi ile katalaz ve süperoksit dismutaz enzimlerinin spesifik aktivitelerine ve protein miktarlarına bakılamamıştır. Kaba homojenat 1,5 ml hacmindeki Eppendrof tüplerine alınarak 10,000g de 15 dk. santrifüjlenmiştir. Ultrasantrifüj sonrasında elde edilen çökelti atılarak süpernatantlar bir araya getirilip Miracloth filtresi ile süzülmüştür. Toplanan süpernatantlardaki protein miktarı 4,30 mg/ml, katalaz enziminin spesifik aktivitesi 15,94 U/mg, süperoksit dismutaz enziminin spesifik aktivitesi 2,05 U/mg olarak bulunmuştur. 27

38 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Yurdanur BOZDEMİR Ekstraksiyon sonunda elde edilen örnekte protein miktarı, katalaz enzim aktivitesi ve süperoksit dismutaz enzim aktivitesi ölçülmüştür PD-10 Kolon Çalışması Daha önceden 25 ml, 25 mm ph=8,0 (4 o C) Tris-HCI tamponu ile dengeye getirilmiş olan PD-10 kolonuna, Miracloth filtresinden süzülen çözeltinin 1mL si uygulanmıştır. Örneklerin kolondan alınması 25 mm ph=8,0 (4 o C) Tris-HCI tamponu ile yapılmıştır. PD-10 kolonun da (Sephadex G-25 M) tuzu ayrıştırılmış olan eluatlar 1 er ml hacminde toplanmış ve enzim tahlilleri için kullanılmıştır. Çalışma sonucu elde edilen veriler; çizelge 4.3 ve çizelge 4.4 de tablosal olarak, şekil 4.3 ve 4.4 de grafiksel olarak gösterilmiştir. 2,5 35,0 30,0 2,0 25,0 Absorbans (280nm) 1,5 1,0 20,0 15,0 Aktivite (U/ml) 10,0 0,5 5,0 0, Tüp No ABS Aktivite 0,0 Şekil 4.3. Keten tohumu (linum usitatissimum) CAT ı için PD-10 kolonundan alınan eluatlarda 280 nm de okunan absorbans ve aktivite değerleri 28

39 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Yurdanur BOZDEMİR Çizelge 4.3. Keten tohumu (linum usitatissimum) CAT ı için PD-10 kolonundan alınan eluatlarda 280 nm de okunan absorbans ve aktivite değerleri Tüp No 280 nm'deki Absorbans Değerleri 240 nm'de Ölçülen CAT Aktivite Değerleri 1 0,003 0, ,007 0, ,109 3, ,534 21, ,032 30, ,858 21, ,662 17, ,448 14, ,885 7, ,581 4, ,350 4, ,220 3, ,134 2, ,082 1, ,051 1, ,036 0, ,034 0, ,020 0, ,015 0, ,016 0, ,015 0, ,010 0, ,009 0, ,009 0, ,008 0, ,003 0, ,001 0, ,001 0,000 29