AESKUBLOT Borrelia-G/-M Ref 4006 / 4007

Transkript

1 AESKUBLOT Ref 4006 / 4007

2

3 Kullanım Klavuzu İçerik 1 Kullanım Amacı Klinik Uygulamalar ve Test Prensibi Kit İçeriği Saklama Koşulları ve Raf Ömrü Kullanım Önlemleri ve Genel Talimatlar Numune Toplama, İşleme ve Saklama Tahlil Prosedürü Kantitatif Yorumlama Teknik Veriler Performans Verileri Literatür... 9 AESKU.DIAGNOSTICS GmbH & Co. KG Mikroforum Ring Wendelsheim, Germany Tel: Fax: Info@aesku.com

4 1 Kullanım Amacı AESKUBLOT Borrelia-G/M insan serumunda Borrelia burgdorferi karşı spesifik IgG/M in kalitatif tespiti için hassas membran bazlı enzim immunoanaliz kitidir. Antijenler, nitroselüloz zarı üzerinde tam olarak tanımlanmış pozisyonlarda paralel çizgiler olarak yer almaktadır. Bu tahlil pozitif ELISA sonuçlarının doğrulanması için bir araçtır. 2 Klinik Uygulamalar ve Test Prensibi Lyme hastalığı, spirochete Borrelia burgdorferi li enfeksiyonun sebep olduğu bir multisistem hastalıktır. Bu patojen Willy Burgdorfer tarafından 1981 yılında keşfedildi (Burgdorfer ve ark., 1982). Şimdiye kadar, hastalığın üç evre semptomu sınıflandırılmıştır. (Evre I: Erythema migrans semptom, Evre II: patojenin yayılması sonrası erken klinik bulgular, Evre III: geç bulgulu). Ancak bu sınıflandırma, çeşitli aşamalarında belirtileri örtüştüğü için kullanılmamaktadır. Günümüzde, hastalığın erken ve geç bulguları ayırt edilebilir durumdadır.. Erken evre, sınıflandırmadan önceki Evre I/II nin ve geç evre, Evre III ün yerini almıştır. Geç başlangıçlı, ciddi klinik belirtiler olabilir ve antibiyotikler ile tedavi güçtür. Bu nedenle, erken tanı büyük önem taşımaktadır. Avrupa'da Borrelia'nın ana taşıyıcısı, ahşap kenesi olarak bilinen Ixodes ricinus 'tur. (familyası: Ixodidae (kene) Yoğun ağaçlıklı alanlarda, özellikle yaz ve sonbaharda ortaya çıkarlar. Kene bir kez kan aldığında, patojenler kendi sindirim kanalında çoğalırlar. Daha sonra, bakteri tükürük bezine göçer ve yaraya tükürük ile enjekte edilirler. Erken form tanısı, Migrans Erythema nın klinik semptomlarına dayanmaktadır. Ancak, bu belirti hastaların % ında eksiktir. Ayrıca, daha sonraki aşamalarda belirtileri çok çeşitlidir. Bu nedenle Serolojik testler, tanıda önemli bir faktördür. En güvenilir kanıt kan, beyin omurilik sıvısı veya cilt biyopsisi patojenlerinin kültürü olmasına rağmen, bu test uzun süresi ve düşük hassasiyeti nedeniyle rutin teşhiş için yeterli( nitelikli) değildir. Borreliosis tanısında altın standart test eksikliği nedeniyle Alman Hijyen ve Mikrobiyoloji Derneği (DGHM) halen iki aşamalı test prosedürünün performansını önermektedir, ilk tanının değerlendirilmesi için, pozitif veya şüpheli ELISA sonuçları Western Blott gibi ek bir test yoluyla doğrulanan, genellikle bir ELISA testi gereklidir. Kullanılan Antijenler: Borrelia antigenlerinin terminolojisi p100 VlsE p58 p41 (Flagellin) p39 (BmpA) p31 (OspA) p23 (OspC) p18 (DbpA) Proteinlerin özellikleri Membran-vesicles protein Değişken ana protein- dizi gibi ifade edilen Karakterize değil Endoflagellin yapısal proteini Flagella complex Borrelia membrane protein A Dış yüzey, protein A Dış yüzey protein C, Farklı Borrelia alt tiplerinden karışım Decorin bağlayıcı protein A Page 1 of 9

5 Test Prensibi Antijenler nitroselüloz zar üzerine sıralar olarak uygulanmıştır. Membran spesifik reaksiyonları önlemek için bloke olur. Tam olarak tanımlanmış pozisyonlardaki spesifik antijenli membran-stripler, 1:101 oranındaki serum / plazma örneklerinde inkübe edilir. Eğer hasta antikorları, örnek içerisinde mevcut İse antijene bağlanır. Bağlanmamış kısım, takip eden aşamadaki yıkama işlemi ile uzaklaştırılır. Sonra, horseradish peroksidazına (konjugat) konjuge edilmiş anti-human immunoglobinleri inkübe edilir ve mikroplaka içindeki örneğin antijen-antikor kompleksi ile reaksiyona girer. Bağlanmamış konjugat, takip eden aşamadaki yıkama işlemi ile uzaklaştırılır. TBM-substrate eklenmesiyle enzimatik reaksiyon ve mavi çökelti oluşur. Reaksiyon distile su ile sonlandırılır. 3 Kit İçeriği HAZIRLANMASI GEREKEN MALZEMELER Madde Miktar Kapak rengi Solüsyon rengi Açıklama/İçerik Wash and sample buffer (5x) (yıkama ve numune tamponu) 2x 100 ml beyaz renksiz 1 L de hazırlanmak üzere 5x konsantre KULLANIMA HAZIR MALZEMELER Madde Miktar Kapak rengi Solüsyon rengi Açıklama/İçerik Conjugate, IgG (Ref 4006) 1 x 10 ml mavi mor Conjugate, IgM (Ref 4007) 1 x 10 ml yeşil yeşil İçerik: Horseradish peroxidase a konjuge Anti-human immunoglobulin G (IgG) İçerik: Horseradish peroxidase a konjuge Anti-human immunoglobulin M (IgM) TMB Substrate 1 x 10 ml siyah renksiz Stabilize TMB/H 2 O 2 Membran strip 24 strip Renk kodu: yeşil N/A Antijenlerle kaplı, klinik uygulamalar ve atest prensibi kısmına bakın Inkübasyon tepsisi 3 padet N/A N/A N/A cımbız, referans şablonu, puanlama tablosu, 1 er adet N/A N/A N/A KİT İLE SAĞLANMAYAN, GEREKLİ MALZEMELER Çalkalama platformu, silindir 1000 ml, pipett veya silindir 10 ml için, hassas pipetler (10, 1000 µl), kurutma veya filter kağıdı. Testlerimiz Amerika Birleşik Devletleri Farmakoloji (USP 26- NF 21) ve Avrupa Farmakoloji (Eur.Ph 4.ed.) tanımına göre, saflaştırılmış su ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır. 4 Saklama Koşulları ve Raf Ömrü Bütün reaktifleri ve mebran stripleri orijinal kutularında, 2-8 C/35-46 F de muhafaza edin. Hazırlanmış veye sulandırılmış solüsyonlar, hazırlandıktan sonra 2-8 C/35-46 F de en az 4 hafta stabildir.. Reaktifler ve stripler, her bileşenin belirtilen son kullanma tarihi içinde kullanılmalıdır. Bileşenleri son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. TMB çözeltisini yoğun ışığa maruz bırakmaktan kaçının Page 2 of 9

6 5 Kullanım Önlemleri 5.1 Sağlık Tehlike Verileri Bu ürün sadece IN VITRO DIAGNOSTIC kullanım içindir. Bu nedenle, bu kitin performansı için sadece eğitimli personel ve özellikle in vitro diagnostik yöntemleri tavsiye edilir. Bu ürün, amaçlanan kullanım koşullarında, özellikle toksik veya tehlikeli olarak kabul edilir olmasa da maksimum güvenlik için aşağıdakilere bakınız: Öneriler ve Önlemler Bu kit potansiyel tehlikeli bileşenler içerir. Kit reaktifleri her ne kadar göz ve cilt için tahriş edici olarak sınıflandırılmamış olsa da, reaktiflerin gözle temasından kaçınılması ve atılabilir eldiven giyilmesi önerilir Substrat koruyucu olarak kathon (1% v/v) içerir. Yutulmamalı ve deri veya mukoza zarı ile temasa girmesine izin verilmemelidir. Kit çalışırken sigara içmeyin, herhangi bir şey yemeyin veya içmeyin. Ağızınızla pipetleme yapmayın. Hasta numuneleri bulaşıcı hastalıkları bulaştırma riskli olarak ele alınmalı ve ulusal koşullara uygun olarak işlenmelidir. 5.2 Genel Kullanım Talimatları Mevcut çeşitli AESKUBLOT-testlerini ayırt etmek için renk kodlaması, striplerin referans çizgisinin üstünde uygulanmıştır: Renk Kodu sarı turuncu mavi kahverengi mor siyah yeşil AESKUBLOT ANA-12 Pro ANA-17 Pro Myositis Pro Liver Pro Vasculitis Pro Gastro Pro Borrelia-G and Borrelia-M Etiketleme dahil ürün bilgilerinin yanlış olması halinde, lütfen üretici firmayla veya kit sağlayıcınızla irtibata geçiniz. Wash ve sample buffer, lotlar ve test kitleri arasında değiştirilebilir. Diğer bütün bileşenler her test kiti için spesifiktir ve birbirleri arasında değiştirlemezler. Otoimmünite ve Borrelia tanı testleri arasında maddeleri değiştirmeyin! Testin optimal performansı için bütün bileşenleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmesi(20-32 C/ F), iyice çalkalanması ve inkubasyon şemasının takip edilmesi önerilir. Bileşenleri 37 C/98.6 F den yüksek sıcaklığa maruz bırakmayın. Page 3 of 9

7 Substrate solüsyonunu daima kaliteli yeni pipet uçlarıyla pipetleyin, reaktifi ışıktan koruyun. Konjugatı, daha önceden başka reaktifler ile kullanımış pipet uçlarıyla pipetlemeyin. Bant renk yoğunluğunun, diğer referans metodolojileri ile elde edilen antikor titreleri ile ilişkili olması gerekmez. Normal bilinen kan vericilerden alınan numuneler otoantikorlar içerebilir. Hasta örneği yüksek düzeyde bağışıklık kompleksleri veya diğer immünoglobulin agregasyonları içeriyorsa, spesifik olmayan bağlanmalardan ötürü oluşan yalnış pozitif sonuçlar gözardı edilemez. Kesin klinik tanı, sadece yapılan test sonuçlarına dayandırlmamalı, tüm klinik ve laboratuvar bulguları bir hekim tarafından değerlendirilmiş olmalıdır. Tanının doğrulannması için farklı teşhis metodları kullanılmalıdır. 6 Numune Toplama, İşleme ve Saklama Tercihen yeni toplanmış( alınmış) serum örnekleri kullanın. Kan almada Ulusal yönergeler takip edilmelidir. İkterik, lipemik, hemolize veya bakteri bulaşmış numuneleri kullanmayın. Serumdaki partiküller düşük hızlı santrifüjleme ile (<1000 x g) giderilmiş olmalıdır. Kan örnekleri temiz, kuru ve boş tüpler ile toplanmış olmalıdır Santrifüj işleminden sonra serum numuneleri ilk 8 saat içerisinde kullanılmalıdır. Alternatif olarak, numuneler ayrı ayrı ve sıkıca kapatılarak, 48 saate kadar kullanım için 2-8 C/35-46 Fde muhafaza edilmeli, veya daha uzun süreli kullanımlar için -20 C/-4 F de dondurulmalıdır. Numuneleri tekrar tekrar çözüp dondurmaktan kaçının. Isıyla inaktive olmuş numuneleri kullanmayın. Page 4 of 9

8 7 Tahlil Prosedürü 7.1 Çalışma Öncesi Hazırlık Konsantre wasf buffer I (yıkama tamponu) 1+4 oranında distile su ile dilüe edin (örn: 20 ml + 80 ml). 7.2 Test Adımları Önemli Notlar: Tam olarak bu protokolü izleyin. Protokolde belirtilen iki bileşenin basamak 6,9 da tepsiye ilave edilip edilmediğinden emin olun. Stribin inkübasyon adımları sırasında kurumasına izin vermeyin. Stribe parmaklarınızla dokunmayın, cımbız kullanın. Strip inkübasyonundan sonra üzerine taşmasından kaçınarak, dilüe numunleri tamamen kaldırın. İnkübasyon aşamasında, stribi sürekli sallayın. İnkübasyon tepsisinin bir yanına wash buffer ile birlikte sample buffer, konjugat ve substrat verin. Strip üzerine akmasına izin vermeyin. Adım Açıklama 1. Teste başlamadan önce 7.1 adımındaki hazırlıkların yapılmış olduğundan emin olun 2. Stribi inkübasyon tepsisine doğru yerleştirin(referans hattı ve renk kodu yukarıda olmalıdır). İnkubasyon tepsisine 1 erml wash buffer ve sample buffer koyun 5 dakika inkübe edin. KONTROLLER & NUMUNELER 3. Sample buffer lı belirlenmiş inkübasyon tepsisine 10 µl serum/plazma numunesini pipetleyin C/ FDe çalkalayarak 45 dakika inkübe edin. Sonra numuneyi tamamen çıkartın Page 5 of 9

9 5. 3 kez,1.5 ml wash buffer ile çalkalayarak 5 dakika yıkayın. Her yıkama aşamasından sonra yıkama tamponunu çıkartın. KONJUGAT 6. Stripli her inkübasyon tepsisinin içerisine 700 µl wash buffer ve 300 µl konjugat pipetleyin C/ F de çalkalayarak 45 dakika inkübe edin. Konjugatı çıkarın kez,1.5 ml wash buffer ile çalkalayarak 5 dakika yıkayın.her yıkama aşamasından sonta wash buffer ı çıkartın. SUBSTRAT 9. Stripli her inkübasyon tepsisinin içerisine 700 µl dh 2 O ve 300 µl substrat pipetleyin C/ F de çalkalayarak 15 dakika inkübe edin, yoğun ışıktan koruyun. Substratı çıkartın. STOP 11. Stripli her inkübasyon tepsisine 2 ml dh 2 O pipetleyin. 1 dakika çalkalayarak inkübe edin. dh 2 O ı çıkartın. Bu basamağı bir kez daha tekrarlayın. 12. Strip inkübasyon tepsisini çıkartın. Stribi filtre kağıdı arasında kurutun. 13. Kurutulmuş strip 6 saat içerisinde yorumlanabilir. Page 6 of 9

10 8 Kalitatif Yorumlama 8.1 Manual Analiz Herbir AESKUBLOT Borrelia-G/M test stribinde karşılıklı olarak uygulanmış 4 kontrol bantı vardır. 1.) Fonksiyon kontrolü strip numarasının altındadır.(her serum örneği ile kuvvetli pozitif reaksiyon) 2.) Konjugat kontrol IgG veigm (uyan konjugatla kuvvetli pozitif reaksiyon. Kullanılan seruma bağlı olarak diğer konjugat kontrolde spesifik olmayan zayıf bir renk gelişebilir.) 3.) Yoğunluğu tanısal bantların sonucu değerlendirmek için kullanılan Cut-Off kontrol Test sonuçları -Fonksiyonel kontrol görünür, -Cut-off kontrol görünür, -ve ilgili konjugat control görünür ise, geçerli kabul edilir. Kurumuş strip,referans hattı (yapışkan membran) ile aynı hizada ayarlanarak hesap tablosuna yerlerştirilir. Strip referans hattı ile referans şablonunu hizalayın.sonuçlar sadece, her stribin cut-off kontrolü referans alınarak yorumlanır AESKUBLOT Borrelia-G sonuçları aşağıdaki gibi yorumlanır. Yorumlama negatif sınır pozitif IgG VlsE haricinde 1 bant > Cut-Off VlsE veya1 band + p41 Cut-Off p41 dışındaki 2 bant Cut-Off AESKUBLOT Borrelia-M sonuçları aşağıdaki gibi yorumlanır. Yorumlama negatif sınır pozitif IgM p41 haricinde bant yoksa > Cut-Off OspC veya p41 veya p18 haricinde 1 bant Cut-Off OspC veya p18 veya diğer 2 band Cut-Off Sonuçlar hesaplama tablosu üzerine kayıt edilebilir. Page 7 of 9

11 Kontrol değerlerinin uygun kriterlerde olmaması durumunda, test geçersizdir ve tekrarlanmalıdır. Sınır değerde olan numunelerin tekrar test edilmesi önerilir. Aşağıdaki teknik konular kontrol edilmelidir: -Reaktiflerin (hazırlanan) son kullanım tarihleri, -Muhafaza koşulları -Pipetlerin, ekipmanların inkübasyonun kondusyonları -Yıkama metodları. Test edilen numuneler, anormal sonuçlar veya herhangi bir sapma gösteriyorsa veya doğrulama kriterleri operatörün sorumluluğu dışındaki nedenler dışında uygun çıkmıyorsa, lütfen üretici firma veya test kitini sağlayıcı firma ile irtibata geçiniz. Tıbbi laboratuarlar ulusal düzenlemelere bağlı kalarak, kendi kontrollerini ve / veya iç havuz serumlarını kullanarak, iç kalite kontrollerini gerçekleştirmelidir. 9 Teknik Veriler Örnek Malzemesi Örnek Hacmi: Toplam İnkübasyon Süresi: Muhafaza: Test: serum 10 µl numune C/ F ta 142 dakika 2-8 C/35-46 F; sadece original şişelerinde 24 test 10 Performans Verileri 10.1 Bağıl Hassasiyet ve Özgünlük Lyme Borreliosis şüphesi olan 80 serumda, AESKUBLOT Borrelia G/M ve diğer ticari hat immunoanaliz kiti kulanılarak bir karşılaştırılmalı bir araştırma çalışması yapıldı. n = 80 diğer ticari hat immunoanaliz kiti pozitif negatif AESKUBLOT Borrelia-G/M pozitif 52 7 negatif 2 19 Tahliller arasında %96,2 oranında pozitif uyuşum ( bağıl hassasiyet) tespit edildi. Ayrıca, uyumsuz serumlar başka bir blot-test ile incelenmiştir. Sonuçlar AESKUBLOT Borrelia-G/M ile doğrulanmıştır. Bundan başka, yeni Borrelia enfeksiyon şüphesi olan 32 hastanın serumu, AESKUBLOT Borrelia-M ve diğer ticari hat immunoanaliz kiti kullanılarak bir karşılaştırmalı çalışma ile incelenmiştir. Page 8 of 9

12 n = 32 diğer ticari hat immunoanaliz kiti pozitif negatif AESKUBLOT Borrelia- M pozitif 9 3 negatif 1 19 Tahliller arasında %90 oranında pozitif uyuşum ( bağıl hassasiyet) tespit edildi. Ayrıca, uyumsuz serumlar başka bir blot-test ile incelenmiştir. Üç serumun ikisi çpozitif bulunmuştur. Negatif serum da doğrulanmıştır. Negatif uyuşumu (bağıl özgünlük) belirlemek için, 400 sağlıklı kan vericisi AESKUBLOT Borrelia-G / M kullanılarak incelenmiştir. 35 tanesi AESKUBLOT Borrelia-G. ile IgG için pozitif tespit edilmiştir ki bu da % 91.3 tür 11 tanesi AESKUBLOT Borrelia-M. ile IgM için pozitif tespit edilmiştir ki bu da % 97.3tür. 11 Literatür Burgdorfer W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP (1982). Lyme disease A tick-borne spirochetosis?. Science. 216: For further reading: Engstrom SM, Shoop E, Johnson RC (1995). Immunoblot interpretation criteria for serodiagnosis of early Lyme disease. J Clin Microbiol. 33: Wilske B (2005). Epidemiology and diagnosis of Lyme borreliosis. Annals of Medicine. 37,8: Stanek G, Strle F (2003). Lyme borreliosis. Lancet. 362: Page 9 of 9

13 In Vitro Diagnostik kullanım için Pour diagnostic in vitro Ιn Vitro Diagnostikum Para uso Diagnóstico in vitro katalog numarası Référence Catalogue Bestellnummer Número de catálogo lot Lot Chargen Bezeichnung Lote CE uygunluk Beyanı Déclaration CE de Conformité Europäische Konformität Déclaracão CE de Conformidade 24 test 24 tests 24 Bestimmungen 24 Testes Kullanım için talimatlara bakın Voir les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten Ver as instrucões de uso Da utilizzarsi entro Utilise avant le Verwendbar bis Utilizar antes de 2-8 C de muhafaza Conserver à 2-8 C Lagerung bei 2-8 C Conservar entre 2-8 C Üretici Fabriqué par Hergestellt von Fabricado por Nitrroselluloz kaplı strip Strip de nitrocellulose couché Nitrozellulosemembran-Streifen mit aufgebrachten Antigenen Tira de nitrocelulose revestido Yıkama tamponu Tampon de Lavage Waschpuffer Solucão de lavagem Bloklama Reaktifi réactif de blocage Blockier-Reagenz Bloqueio de reagente 10 ml ile hazırlayın reconstituer avec 10 ml rekonstituiren mit 10 ml reconstituir com 10 ml For in vitro diagnostic use Para uso diagnóstico in vitro In Vitro ιαγνωστικό μέσο Cataloge number Numéro de catálogo Αριθμός παραγγελίας Lot Lote Χαρακτηρισμός παρτίδας EC Declaration of Conformity Declaración CE de Conformidad Ευρωπαϊκή συμφωνία 24 tests 24 pruebas 24 προσδιορισμοί See instructions for use Ver las instrucciones de uso Λάβετε υπόψη τις οδηγίες χρήσης Use by Utilizar antes de Χρήση μέχρι Store at 2-8 C (35-46 F) Conservar a 2-8 C Φυλάσσεται στους 2-8 C Manufactured by Fabricado por Κατασκευάζεται από Coated nitrocellulose strip Tira de nitrocelulosa recubierta Επίστρωση λωρίδα νιτροκυτταρίνης Wash buffer Solución de lavado Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Blocking Reagent Reactivo bloqueante Αντιδραστήριο αποκλεισμού Reconstitute with 10 ml reconstituir con 10 ml Ανασύσταση με 10 ml