ATIK MANTAR KOMPOSTUNUN LGNOSELÜLOZK ENZM KAYNAI OLARAK KULLANIMI

Transkript

1 ÖZEL EGE LSES ATIK MANTAR KOMPOSTUNUN LGNOSELÜLOZK ENZM KAYNAI OLARAK KULLANIMI HAZIRLAYAN ÖRENC: Menderes Karaköse (10B) DANIMAN ÖRETMEN: Mesut Esen ZMR 2011

2 ÇERK LSTES Projenin Amacı 3 1.Giri 1.1. Mantar Yetitirme ve Kompost Yapımı 1.2. Alfa amilaz 1.3. Selülaz 1.4. Ksilanaz glukosidaz 1.6. Lakkaz Yöntem 2.1. Örnek alımı 2.2. Ekstraksiyon 2.3. Enzim aktivitelerinin ölçümü DNS yöntemi amilaz enzim aktivitesinin belirlenmesi Ksilanaz enzim aktivitesinin belirlenmesi Selülaz enzim aktivitesinin belirlenmesi glukosidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi Lakkaz enzim aktivitesinin belirlenmesi 2.4. Protein tayini Sonuçlar ve tartıma Kaynaklar 26

3 Projenin Amacı Organik tarım toprakların, ekosistemin ve insanların salıının sürdürülebilir biçimde devam ettirilmesini salayan bir üretim sistemidir ( Uluslararası Organik Tarım Hareketleri Federasyonu). Bu nedenle organik tarım için kullanılacak gübrenin organik olması tarımın da daha kaliteli olması için önemli bir etkendir. Bu amaçla mantar yetitirildikten sonra geriye kalan bir ürün olan atık mantar kompostunun (AMK) yararlı ekilde kullanılması çevreci bir bakı açısının temel hedeflerinden biridir. Yüksek nem ve organik madde içeriine sahip olan atık mantar kompostu büyük oranda gübre olarak kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra topraın fiziksel özelliklerinin, topraın verimliliinin ve ürün performansının deerlendirilmesi için atık mantar kompostu toprak ıslahında kullanılabilir. Topraa kompost ilavesiyle topraktaki boluk hacmi arttırılarak topraın daha kolay havalandırılması salanır. Böylece topraın yapısal düzeni salanmı olur. Atık mantar kompostu topraın su tutma kapasitesini arttırarak kurak mevsimlerde tuzlanmayı da önler. Yapılan çalımalarda aır metallerin biriktii topraklarda atık mantar kompostunun düzenli olarak kullanılması toprak kalitesini olumlu yönde etkiledii bulunmutur. Bunların dıında düük oranda da olsa atık mantar kompostundan biyogaz üretiminde de yararlanılabilmektedir. Son yıllarda atık mantar kompostunun çeitli lignoselülozik enzimlerin kaynaı olarak kullanımı giderek önem kazanmaktadır. Samana hayvan gübresi katılımı ve doal koullarda karıtırma ile yapılan inkübasyonun ardından pastörize edilen kompost ticari mantar türleri (Agaricus bisporus var. campestris veya Pleurotus ostreatus ) ile aılanır. Hasadın ardından elde edilen atık mantar kompostu, son yıllarda tekrar önem kazanan çounlukla bitkisel atıkların mikroorganizma besini olarak kullanıldıı katı kültür fermantasyonuna benzer ekilde, içinde ticari mantar türlerinin hücre dıı enzimlerini içeren bir organik materyaldir. Lignoselülozik materyalin biyolojik parçalanmasına sebep olan ve bir çok biyoteknolojik uygulama alanı bulunan bu enzimler atık mantar kompostunda yüksek oranda bulunmaktadır ve atık mantar kompostunu deerli bir yan ürün haline getirmektedir. Bu çalımada beyaz apkalı kültür mantarı olarak da bilinen Agaricus bisporus un ticari üretiminin gerçekletirildii kompost aamalarından alınan örneklerde 5 farklı

4 lignoselülozik enzim aktivitesinin aratırılması ve ekonomik deere sahip bir enzim kaynaı olarak kullanılabilirlii aratırılmıtır. 1. Giri Kompost bitki ve hayvan orijinli artıkların bir araya toplanıp gübre yapmak üzere çürümeye terk edilmesiyle elde eden organik bir karıımdır. Kompost oluum süreci ise canlı organizmalarının ve organik maddelerin topraa karııp çürüyerek minarelize olması doada madde yani besin dönüümünü, enerji akıını, doal sisteme balı canlıların yaamlarını sürdürebilmesini, tüm fiziksel, kimyasal ve biyolojik elemanların denge içerisinde fonksiyonelliini sürdürmesini salayan en önemli olgudur. Kompostlama aslen bir fermantasyon biçimi olup aerobik ve anaerobik olarak ikiye ayrılmaktadır. Kompost esas kullanım alanı olan organik gübre olarak kullanılması yanında mantar yetitiricilii içinde kullanılabilir. Ancak mantar yetitirmek için kullanılan kompost özel ilemler sonucunda elde edilir. Mantar yetitirildikten sonra geriye kalan atık mantar kompostu (AMK) son yıllarda farklı biçimde kullanılmaktadır. AMK gübre olarak, biyogaz üretiminde, biyoremediasyon ve lignoselülozik enzim geri kazanımı amacı ile kullanılabilmektedir. Bu çalımada Foça-zmir de yer alan bir mantar üretim çiftliinden farklı üretim basamaklarından alınan atık mantar kompost örneklerinden sıvı ekstraksiyon yöntemi ile geri kazanılan lignoselülozik enzimlerin nicel tayinleri yapılarak, AMK enzim kaynaı olarak kullanılabilirlikleri aratırılmıtır Mantar Yetitirme ve Kompost Yapımı Mantar insan beslenmesinde önemli bir yere sahiptir. Toprak üzerindeki beyaz renkli sap ve apka yenen kısımdır. Ülkemiz mantar yetitiricilii için uygun koullara sahip olmasına ramen bu alandaki bilgi eksikliinden dolayı iletmelerin yaygınlaması ilerleme istenen ölçekte deildir. Kültür mantarcılıında apkalı mantar (Agaricus bisporus) en çok yetitirilen mantar türüdür. Mantarın gelimesi için belirli koulların salanması gerekir. Bu koullar ısı, nem, CO 2 içerii gibi abiyotik faktörlerdir. Mantar tüm bu oluum boyunca yaklaık %70-90 neme ihtiyaç duyar. Nem de kompostun belirli aralıklarla ıslatılması ve sıkıtırılmasıyla salanmaktadır. Nem kaybının önlenmesi için oluturulan kompostun üzerine toprak örtülmektedir. Belirli zaman aralıklarında karıtırılarak buday saplarının iyice çürümesi beklenir. Mantar, geliim döneminde güne ııına ihtiyaç duymamaktadır. Eer ıık alırsa apkada lekeler oluur ve bu durum kalitenin bozulmasına sebep olur. Miselin geliimi sırasında

5 havalandırma; odada yükselen ısı ve nem oranını azaltmak için yapılır. Mantarın gelitii ortamda CO 2 miktarının yükselmesi verimin hızla dümesine neden olmaktadır. Gelien mantarlar, aerobik canlılar oldukları için mutlaka O 2 ne ihtiyaç duyarlar. Kültür mantarı üretiminde kullanılan en elverili kompost tavuk gübresi ile yapılan komposttur. Kompost oluturmak için buday sapı, buday kepei, tavuk gübresi, amonyum nitrat, üre, pamuk tohumu küspesi ve alçı kullanılmaktadır. Kompost karıımı oluturulduktan sonra kompost oluum sürecinde etkili olan ancak ticari mantar üretiminde istenmeyen mikroorganizmaları ve patojenleri baskılamak için 60 ºC de yaklaık 6 gün süren pastörizasyon ilemi uygulanmaktadır. Pastörizasyon ileminden sonra komposta, üretilecek ticari mantarın ekimi yapılmaktadır. Tohum olarak, buday tohumuna sardırılmı mantarın (Agaricus bisporus ) vejetatif yapısı olan miseller hazırlanan kompost üzerine ekilir. Miselin komposta sarımı sırasında odada 20-25ºC ısı olmalıdır. 25ºC ısının üzerinde miselin geliimi yavalar. 30ºC de misel ölür. Misel geliimi gün beklendikten sonra örtü topraı ilave edilerek kökün tutunabilecei misellerin yumaklatıı ve suyu iyi tutar hale gelmektedir. Örtü topraı örtüldükten sonra ısının düürülmesi gerekir. Bu devrede ısı 15-18ºC arasında olmalıdır. 15ºC nin altında misel sarımı ve gelimesi yava olup verim az olmaktadır. 18ºC nin üzerindeki ısıda ise mantar verim ve kalitesinde düüklük görülmektedir. Su tutma kapasitesi az olan örtü topraı, mantar veriminin de dümesine neden olur. Örtü topraı atıldıktan gün sonra hasat yapılmaya balanmaktadır. Mantar geliimi takip edilerek belirli zaman aralıklarında hasat yapılmaktadır. Hasattan sonra geriye kalan kısım atık mantar kompostu olarak bilinir ve bu karıım çounlukla depolama alanlarına bırakılır. Odalar boaltılıp yeniden üretime ilk basamaktan balanır. Bu durumda mantar üretiminin kompostun oluturulmasından odalardan boaltılmasına kadar geçen süre toplamda gün arasında deimektedir. Kompost, içerisinde birçok lignoselülozik substrat içermektedir ve süreç ilerledikçe substratlar parçalanarak daha kolay parçalanabilir organik son ürünler oluur. Atık olan mantar kompostunun en verimli ekilde kullanılması bizim temel hedeflerimizden biridir. Bir dier önemli hedefimiz ise daha kaliteli bir tarım için yüksek nem ve organik madde içeriine sahip olan atık mantar kompostunu gübre olarak kullanmaktır. Bunun yanı sıra topraın fiziksel özelliklerinin, topraın verimliliinin ve ürün performansının deerlendirilmesi için atık mantar kompostu, biyoremediasyon ileminde kullanılabilir. Biyolojik olarak parçalanmaya sebep olan enzimler, atık mantar

6 kompostunda yüksek oranda bulunduu için enzim kaynaı olarak da faydalanılır. Bunların dıında atık mantar kompostu biyogaz oluturmada kullanılır. Bu çalımada atık kompostta incelenen be enzimden dört tanesi (-amilaz, karboksimetil selülaz, ksilanaz ve -glukosidaz) hidrolaz sınıfının üyesi olup beinci enzim (lakkaz) oksido-redüktaz sınıfının üyesidir Alfa amilaz Amilazlar hidrolazlar grubuna giren, niasta ve glikojen moleküllerini hidrolize eden enzimlerdir. -amilaz enzimi, niasta molekülündeki baları parçalayarak glikoz, maltoz, maltotrioz oluumunu salar. Niasta, çok sayıda glikoz molekülünün farklı ekillerde balanmasıyla olumu polisakkarit özellikte bir bileiktir. Bazı bakteriler ve mantarlar tarafından üretilen -amilaz, -amilaz, glikoamilaz ve glikoizomeraz gibi enzimler niastayı parçalama yeteneine sahiptirler. Uluslararası Biyokimya Birlii nin yaptıı sınıflandırmaya göre - amilaz, eter hidrolaz grubunda yer almaktadır ve - 1,4 glukanglukanohidrolaz (E.C ) olarak adlandırılmaktadır (Telefoncu,1993.) Bu enzimlerle ilgili ilk çalıma Ohlsson un 1930 yılında yapılmıtır. Malt substratından elde ettii parçalayıcı enzimleri alfa () ya da beta () amilazlar olarak isimlendirmitir. Amilazlar endoamilazlar ve ekzoamilazlar olmak üzere balıca iki grupta da incelenebilmektedir. Bugün ise amilazlar, niastaya etki mekanizmaları ve oluturdukları ürünlere balı olarak -amilaz, -amilaz ve amiloglikosidaz olmak üzere 3 gruba ayrılmıtır. Amilaz enziminin substratı olan niasta, bitkilerin bir depo karbonhidratı olup, D- glukoz birimlerinden oluan ve (C 6 H 10 O 5 ) n kapalı formülü ile gösterilen bir moleküldür. Amiloz ve amilopektin denen 2 farklı yapıdaki polisakkaritten olumutur, dolayısıyla heterojen yapıdadır -Amilaz ticari olarak kullanılan ilk enzimdir yılında Japonya da tekstil endüstrisinde haıl alma ilemi için ticari amaçla üretilmitir. Tekstil endüstrisinde dokuma sırasında ipliklerin salam ve düzgün olması ve daha dayanıklı olup kopmaması için iplikler niasta içeren bir çözelti ile muamele edilmektedirler. Bu ileme haıllama adı verilir. Kuma dokunduktan sonra, kumataki fazla niastanın

7 uzaklatırılması gerekir. Bu ileme de haıl alma adı verilmektedir. Haıl alma ajanı olarak da yaygın olarak -amilaz enzimi kullanılmaktadır (Tarakçıolu, 1979; Sarıkaya 1995; Cheetham, 1995). Bu yaklaımdan sonra -amilazın uygulama alanı oldukça genilemi ve çeitlenmitir. Daha sonraki yıllarda -amilaz enzimi niasta ileme endüstrisinde niasta sıvılatırma ajanı olarak kullanılmıtır yılında ise -amilaz ve amiloglukozidaz kullanılarak niastadan toz ve kristal dekstrozun endüstriyel üretimine balanmıtır (Sarıkaya, 1995). -Amilaz enziminin dier bir kullanım alanı ise fırıncılık ürünleridir (Hamer, 1995). Ekmek yapımında gerek fermantasyon gerekse piirme sırasında ekmein kabarmasını, hacim kazanmasını salayan CO 2 gazıdır. Maya fermantasyonunun gerçekletirilmesi her eyden önce ortamda yeterli miktarda fermente olabilir ekerin varlıına balıdır. Ancak unlarda maya faaliyeti için gerekli fermente olabilir eker miktarı çok düük (% 0,1-0,5), niasta miktarı ise çok yüksektir. Amilaz enzimleri unda mevcut bulunan niastayı (% 4-10) ve jelatinize olmu niastayı parçalayarak fermente olabilir ekerleri oluturmaktadırlar. Ancak -amilaz salam budaydan çekilen unda çok az miktarda bulunmaktadır. Yine unda bulunabilecek - amilaz miktarı un verimine balı olarak deimektedir. Bu enzimler tekstil ve kaıt endüstrisinde, glikoz ve fruktoz urupları ve tutkal üretiminde, alkol fermantasyonunda kullanılmaktadırlar. Alkol üretiminde hammadde olarak kullanılan niastalı materyaller -amilaz enzimi ve amiloglukozoksidaz enzimleri ile muamele edilmektedir (Sarıkaya, 1995). Meyve suyu endüstrisinde de özellikle elma ve armut sularının berraklatırılmasında -amilaz kullanılmaktadır. Meyveler tam olgunlamadan toplandıında meyve halen niasta içermektedir. Bu durum ise meyve sularında bulanıklıa yol açmaktadır. Bu sorun ortama -amilaz ilave edilerek giderilebilmektedir (Eki, 1988, Sarıkaya, 1995). -Amilazların dier bir kullanım alanı ise deterjan üretimidir. Enzimler deterjan katkısı olarak ilk kez 1913 yılında Alman kimyacı Otto Röhm tarafından kullanılmıtır. Bu amaçla günümüzde enzim üreticileri sıvı ve toz her tip deterjan için farklı formüllendirilmi proteazlar üretmektedirler. Porteazlara ek olarak -amilaz, selülaz ve lipaz gibi enzimler de deterjanlara katılmaktadır. Ayrıca proteazlar dıında lipazlar, selülazlar ve -amilazların da yaygın kullanılmasının desteklenmesi deterjan sektöründeki enzimlerin farklı bakı açıları kazanmasına neden olacaktır (Telefoncu, 1997). Amilazlar niasta ve glikojen moleküllerini hidrolize eden ekstraselüler enzimlerdir. Bu enzimler hayvanlar ve bitkiler tarafından da sentezlenmesine ramen;

8 kontrollü koullarda kısa sürede ürün elde edilmesinden dolayı mikroorganizmalar asıl kaynaı oluturmaktadır. Mikroorganizmalar içerisinde Aspergillus niger, A. oryzae, A. candidus gibi bazı funguslar ile Pseudomonas, Saccharophila bazı Clostridium ve Bacillus türleri ve alt türleri gelmektedir (Sarıkaya, 1995). Enzim protein yapısında olduundan enzim aktivitesi ph, sıcaklık gibi bazı faktörlerden etkilenmektedir. -Amilazların optimum ph aralıı enzimin elde edildii kaynaa göre farklılık göstermektedir. Sıcaklık, ph gibi enzim aktivitesine etkili faktörlerin yanı sıra çeitli metal iyonlarının da aktiviteyi etkiledii aratırmalarla belirlenmitir. Enzim aktivite gösterebilmek için Ca ++ iyonlarına ihtiyaç duyan bir metallo proteindir. Kalsiyum, ekstrem ph ve sıcaklıklarda pepsin, tripsin ve papain gibi proteazlara karı enzimi dayanıklı kılmaktadır. -amilazın katalitik aktivitesi için gerekli olan bu metalin enzime balanma gücü enzim kaynaına balıdır (Sarıkaya, 1995). Klor iyonu da enzim stablizasyonu için gereklidir. Ayrıca Cl - iyonu enzim aktivatörüdür. Enzim aktivitesini artıran bu gibi iyonların yanı sıra bazı iyonlar ve maddeler enzim aktivitesini olumsuz etkilemektedir. Örnein; Cu, Hg ve Pb gibi aır metaller enzimi inhibe etmektedir. Bunun yanı sıra üre de -amilazı inhibe etmektedir., 1.3. Selülaz Selüloz, bitki biyokütlesinin yaklaık % 40 ını oluturan bir substrattır. Selüloz genellikle bitki kalıntıları, özellikle huhubat sapları ve sonbaharda dökülen yaprakların büyük kısmını oluturmaktadır. Yaklaık glikoz biriminin -1,4- glikozidik balar ile düz bir ekilde balanması ile oluur. Selülozun suya karı yüksek çekicilii olmasına ramen, suda hiç çözünmez. Selüloz glikoza, en az üç farklı enzimin birlikte çalıması ile hidrolize olabilir. Bu enzimler; endoglukanaz, ekzoglukanaz ve - glukosidaz dır. Lignin, selüloz ve hemiselüloz huhubat saplarının en önemli kısımlarıdır. Bu maddeler hücre duvarları içinde yer alır. Birinci fermantasyon sırasında bu maddeler parçalanır ve ileride mantarın besin maddesi kaynaını oluturur. Bu bakımdan mantar kompostunda bir bitki materyaline yer verirken, onun yapısı ve içerdii maddelerin bilinmesi gerekir. Selülozu hidrolize eden enzimler geni çapta mantar ve bakterilerden elde edilmektedir. Böyle enzimler çeitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılmaktadır. Ticari olarak en çok kullanılan selülaz Trichderma sp. tarafından üretilmektedir. Ayrıca

9 selülazlar Aspergillus, Penicillium, Basidiomycetes ve Bacillus türlerinden de elde edilmektedir. Selülaz enzimi, Uluslararası Biyokimya Birlii nin yaptıı sınıflandırmaya göre E.C endohidrolaz olarak kodlanmı olup karboksimetil selülaz olarak da isimlendirilmektedir. Selülolizik enzimler, sıvı kazancını arttırmak ve iyi bir renk elde etmek için alkol üretiminde kullanılmaktadır. Deterjanlarda selülazın varlıı renklerin canlanmasına, yumuamasına ve partikül halindeki topraın uzaklamasına neden olmaktadır. Ayrıca selülaz kot pantolonların biyolojik olarak talanmasında kullanılmaktadır. Selülazın dier kullanım alanları, selülozik biyokütlenin ve yemlerin besin deerini ve sindirilebilirliliini artırmak, zirai ve endüstriyel atıkların enzimatik sakkarifikasyonudur. Selülozik materyallerin enzimatik hidrolizi üzerine gerçekletirilen biyoteknolojik ilemler günümüzde oldukça artmıtır. Yenilenemeyen kaynakların giderek azalması; selülozu gıda, enerji, yakıt ve dier ürünler için temel ham madde haline getirmitir. Selüloz, bitkiler tarafından büyük miktarlarda üretilen çok önemli bir ham maddedir ve öncelikle lignin ile iliki kurarak lignoselülozu meydana getirirler. Lignoselülozdan, lignin bariyerini ayırmak için ön muamele gerekmektedir Ksilanaz Ksilanazlar (E.C ,_-1,4-D-xylanohydrolase), pentozanazlar veya hemiselülazlar olarak da isimlendirilmektedir. Ksilanaz enzimleri, polimer yapıyı ksilobioz ve ksiloz oligomerlerine ve bunların çesitli alt birimlerine parçalarlar. Ksilan, yüksek bitkilerin hücre duvarının hemiselülozik kısmının temel bileenidir ve yüksek potansiyelde kullanılı son ürünlere parçalanabilen ikinci en bol kaynaktır. Bitki hücre duvarları mikroorganizmaların canlı bitki dokusuna geçiini engellemek için bir bariyer meydana getirmektedir (Gamerith ve ark., 1992). Doal olarak bulunan lignoselülozik bitki biokütlesinin içeriinin % unu heterojen polisakkaritler olan ve selülozla ilikili bir ekilde bulunan hemiselülozik materyaller oluturur. Biokütle, dünyanın yakıt ihtiyacını karılayan ve yeterince kısa bir döngüye sahip olan alternatif doal kaynaklardır. Ksilan yüksek yapılı bitkilerin hücre duvarının hemiselülozik kısmının temel bileenidir ve yüksek potansiyelde kullanılı son ürünlere parçalanabilen ikinci en bol kaynaktır (Yang ve ark., 1995; Salles ve ark., 2000). Pek çok bakteri ve mantar ksilanı sindirmek için ksilanaz enzimine ihtiyaç duymaktadır (Gamerith ve ark., 1992; Salles ve ark., 2000).

10 Ticari olarak satılan ksilanazlar çounlukla bakteriyel ve fungal kaynaklardan elde edilmektedir. Ksilanaz üretiminde yararlanılan bakteri ve fungus türlerine örnek olarak; Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus licheniformis, B. subtilis, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reseii ve Thermoascus aurantiacus örnek olarak verilebilir. Büyük bir kısmı lignin, selüloz ve hemiselülozdan oluan lignoselülozlar yeryüzünde en çok bulunan doal polimerlerdir. Yeryüzüne ulaan güne enerjisinin %0,1 i bitkilerin fotosentezi sonucu tutulmaktadır. Ksilan bitkilerde en fazla bulunan hemiselülozdur ve yüksek bitkilerin toplam kuru maddelerinin %35 ini oluturarak selülozdan sonra ikinci sırada yer alır. Ksilanaz parçalanması için endo ve ekzo beta ksilanaz ile beta-ksilanaz dıında birçok enzime ihtiyaç duyulmaktadır. Beta ksilanaz yem ve kaıt sanayinin yanı sıra -amilaz enzimi ile birlikte fırıncılık sanayinde de kullanılmaktadır. Ksilanın yemlerde kısmi olarak hidrolizi rumen sindirimi esnasında selülaz enzimlerinin yemdeki selüloza ulaımını kolaylatırır. Ksilanın yemden tamamen uzaklatırılması barsak rahatsızlıklarına neden olacaından arzu edilmemektedir. Ksilanaz enzimleri mikroorganizmalarda oldukça yaygın olarak bulunmaktadır. Etki ettikleri substrat tipleri, etki mekanizmaları, inhibitörlerle olan reaksiyonları ve kinetik kapasitelerindeki farklılıklardan dolayı bütün ksilanaz tipleri ekmek yapımında kullanılmaya uygun deildir. Ekmek yapımında kullanılmaya uygun olan ksilanazlar, daha çok suda çözünemeyen arabinoksilanlar üzerine etkili olanlardır. Bu nedenle patojenler ve saprofitler hücre duvarı parçalayan enzimler üretmektedirler. Çevresel düzenlemeler kaıt ve kaıt hamuru endüstrisinde aartma ileminde klor kullanımını sınırlamıtır (Yang ve ark., 1995). Günümüzde çevreyi endüstriyel atıklardan korumak için kaıt ve kaıt hamuru endüstrisinde mikrobiyal enzim sistemlerinin uygulanması önem kazanmıtır (Lin ve ark., 1999). Bu nedenle çevre kirliliini indirgeme yaklaımlarından biri, kaıt hamurunun ksilanaz kullanılarak ön ilemlerden geçirilmesidir. Bu yaklaım, aartma kimyasallarının özellikle de klor bileiklerinin önemli derecede indirgenmesine ve kirliliin azaltılmasına izin vermektedir (Christov ve ark., 1996). Kaıt hamurunun ksilanaz kullanılarak aartılması ilemi oldukça gelecek vaat etmektedir. Bu alandaki ilk çalımada 1986 da kaıt hamurunu aartmak için endoksilanazların kullanımının kimyasalları indirgedii bildirilmitir. Pek çok aratırma ise bu gözlemi dorulamı, geniletmi ve bu teknolojiyi ticari bir duruma

11 getirmitir (Gressesse, 1999). Ksilanazlar, aaç kabuklarının çıkartılmasında, geri dönütürülmü liflerin boyasının çıkarılmasında ve kaıt hamurunun çözülmesinin hazırlıı için selülozun saflatırılmasında önemli derecede kullanılmaktadır (Yang ve ark., 1995). lk ksilanaz ile aartma çalımaları mantar ve mayaların bilinen enzimlerinin kullanımına odaklanmıtır. Ancak bunların aktivite gösterdikleri optimum ph asidiktir. Aartma ilemi ise güçlü alkali koullar altında gerçekletirilmektedir. Bu nedenle alkali koullar altında enzimatik aartma ileminde fonksiyon gösterebilmesi, enzim için oldukça önemli bir karakteristik özelliktir. Termostabil alkali ksilanazların kullanımı enzimle kaıt hamuru aartma için ph ve sıcaklık ayarlamalarını oldukça indirgeyerek önemli derecede teknik ve ekonomik avantaj salamıtır. Ayrıca ksilanaz, ıra ve meyve suyunun arıtılması, meyve ve sebzelerin suyunun elde edilmesi için kullanılmaktadır (Wong ve ark., 2000). Ksilanazın dier önemli bir kullanım alanı ise yem endüstrisidir. Aırlık kazancında ve çavdarla beslenmi ızgaralık piliç için yem dönütürme verimindeki daralma intestinal viskosite ile ilikilidir. Piliçlerin çavdar tabanlı diyetlerine ksilanazın katılması intestinal viskositenin indirgenmesine böylece hem piliçlerin aırlık kazancında hem de yemlerin dönütürülmesindeki etkinlii arttırmaktadır (Wong ve ark., 2000). Ksilan, zirai ve gıda endüstrilerinin atıklarında yüksek miktarlarda bulunurlar. Bu nedenle, ksilanaz atık sudaki ksilan ı ksiloz a dönütürülmesi için kullanılır. Enzimatik hidrolizin etkili ilemlerinin gelitirilmesi hemiselülozik atıkların muamelesinde yeni umutlar ortaya çıkarmıtır (Wong ve ark, 2000) glukosidaz -glukosidaz (EC ), sellobiaz olarak da isimlendirilir. Bitkisel polisakkaritlerin ana bileeni olan selülozun hidrolizinden sorumlu olan hidrolaz sınıfı enzimlerden biridir. -1,4 glikozidik baı ile balı glikoz monomerlerinden oluur. Selülozun hidrolizi selülozu daha küçük birimlere parçalayan endo -1,4 glukonaz (EC ) ile balatılır. -glukosidaz sellobiozun iki molekül glukoza hidrolizini katalizleyerek selülozun tamamen degradasyonunu tamamlar. Bu hidroliz ile sellobiyozu kullanamayan mikroorganizmalar için kullanılabilir karbon kaynaı olan glukoz ortama verilmi olur. Bu nedenle -glukosidaz selülozun hidrolizinde hız

12 sınırlayıcı bir faktördür. -glukosidazlar esas olarak toprak mikrobiyal heterotrofları olan Mucor ve Actinomucor gibi Mucorales (Fungi) türleri tarafından sentezlenir. Bu mikroorganizmalarda -glukosidaz sentezi selüloz parçalanma ürünleri olan sellobiyoz, glukoz ve glukoz metabolitleri tarafından indüklenir. Son yıllarda toprak kalitesinin biyolojik indikatörleri olarak ekstraselüler enzimlerin kullanımına yönelik ilgi giderek artmaktadır. Kolay ölçümleri, ekolojik önemleri, çevresel strese karı duyarlı olmaları ve toprak ileme metotlarına hızlı yanıt vermeleri bu ilginin ana sebebidir. -glukosidaz aktivitesi kompostlama sürecinin ve toprak kalitesinin izlenmesinde önemli bir enzimdir. Çünkü kompostlama ve toprak kalitesinin temel faktörü olarak kabul edilen organik madde döngülerinde merkezi bir role sahiptir. Aratırmalar, - glukosidaz aktivitesinin kompostta yaygın olması, selüloz degradasyonuna karıan üç enzimin etkinliinin kolayca belirlenebilmesine olanak salaması, toprak organik maddesinin (SOM) dönüümü üzerine fiziko-kimyasal faktörlerin etkisinin incelenmesinde önemli bir indikatör olarak kabul etmektedirler Lakkaz Lakkaz (benzenediol: oksijen oksidoredüktaz; EC ) enzimleri, oksidoredüktaz sınıfına ait bir enzimdir. Hem fenolik hem de fenolik olmayan ligninle ilikili bileikleri okside edebildii gibi biyolojik yıkıma dirençli olan çevre kirleticilerini de oksitleyebilmektedirler. Buna ilaveten, elektron alıcısı olarak NAD(P) + gibi pahalı kofaktörler yerine moleküler oksijeni kullanmaları ve zararlı olan hidrojen peroksite gereksinim duymamaları gibi nedenlerle, lakkaz enzimleri son zamanlarda oldukça ilgi çekici bir aratırma alanı oluturmaktadırlar. Lakkaz enzimlerinin sahip olduu bu oksidasyon yetenei bazı endüstriyel ve biyoteknolojik süreçlerde bu enzimlerin oldukça kullanılı olarak uygulanmasına yol açmaktadır. Bu tip endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamaların çounluunu ise kâıt ve kâıt hamuru endüstrisi, tekstil ve petrokimya endüstrilerinden kaynaklanan atık suların detoksifikasyonu ve çeitli biyosensörler olarak kullanımı oluturmaktadır. Lakkazlar aynı zamanda anti kanser ilaçların üretimi için katalist olarak ve hatta kozmetik ürünlerinde katkı maddesi olarak dahi kullanılmaktadırlar. Buna ilaveten lakkaz enzimleri, herbisidler, pestisidler ve patlayıcılar gibi ksenobiyotik bileiklerle kirlenmi topraklardan ve sulardan bu tip

13 kirleticileri uzaklatırma ve polimerik ürünler oluturma kapasiteleri nedeniyle, biyoremediasyon ajanları olarak da kullanılabilmektedirler. Enzimatik oksidasyon teknikleri, meyve sularında, biralarda ve araplarda kararmaya, puslanmaya ve bulanıklıa yol açan istenmeyen fenolik bileiklerin giderilmesi amacıyla ve tekstil, gıda sanayiinde, odun ileme, farmasötik ve kimya gibi oldukça farklı endüstriyel alanlar için potansiyel bir uygulama alanına sahiptirler. Elektron alıcısı olarak moleküler oksijen üzerinde geri dönüen enzimler en çok ilgi çeken enzimlerdir. Bu nedenle, yukarıda bahsedilmi olan amaçlar için lakkaz enzimi özellikle tercih edilmektedir. Lakkaz mediatör sistemler (LMS) (lakkaz aracılıklı sistemler) ise kaıt hamurunun delignifikasyonu ve beyazlatılması, organik kirleticilerin oksidasyonu, çaylardaki drogların ve fenollerin analizi gibi biyosensörlerin veya biyoyakıt hücrelerinin gelitirilmesi, polimer sentezi, tekstil boyalarının renk giderimi, bioremediasyon, fungisidaller, meyve sularının ve arapların berraklatırılması gibi çok sayıdaki sürece uygulanmıtır. Claus ve ark., ise LMS nin tekstil boyalarının renk giderimlerini artırdıını, hatta lakkaz aracılıı ile parçalanmaya karı dirençli olan bazı tekstil boyalarının dahi renk giderimlerinin gerçekletirildiini belirlemilerdir. Tekstil endüstrisi boyar madde üretiminin 2/3 ünü kullanmaktadır ve tekstil ürünlerinin ilenmesini salayan ya ilemler esnasında büyük hacimlerde su ve kimyasal madde tüketilmektedir. Tekstil sanayinde kullanılan kimyasal ajanlar ise kimyasal içerikleri açısından oldukça çeitli olup, inorganik bileiklerden polimerlere ve organik ürünlere kadar deimektedir. Tekstil sanayiinde kullanılan ticari boyaların çeitlilii çok fazla olup, bu boyaların yıllık üretimi de yüksektir. Kimyasal yapıları nedeni ile tekstil boyaları ııa, suya ve farklı kimyasal oksitleyici ajanlara maruz kaldıklarında ise renk solmalarına karı oldukça dirençlidirler ve sentetik orijinleri nedeniyle bu boyaların çounun renk giderimlerini (dekolorizasyon) salamak da oldukça zordur. Bu boyaların parçalanma ürünleri çok daha toksik olabildiinden, tekstil boyası içeren atıkların muamelesinde fiziko-kimyasal yöntemler yerine enzimatik yöntemler tercih edilmektedirler. Ksenobiyotiklerle birlikte polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH) toprak kontaminasyonunun temel kaynaını olutururlar. Bu nedenle, bu tür bileiklerin parçalanması çevre açısından oldukça önemlidir. Lakkaz enzimlerinin katalitik özellikleri ise PAH lar ve klorofenoller gibi bileiklerin parçalanmasında kullanılabilir. Son zamanlarda yapılan bir çalımada ise, Trametes modesta kaynaklı lakkaz

14 enziminin 2,4,6- trinitrotoluen (TNT) degredasyon ürünlerinin immobilizasyonunda rol aldıını göstermilerdir. Lakkaz enzimleri indirgenmi TNT metabolitlerini organik toprak matriksine balayabilmekte, böylece de sava amaçlı kullanılan patlayıcı kalıntılarının detoksifikasyonu salanmaktadırlar. Bu tip uygulamalar için, ksenobiyotik bileiklerle kontamine olmu toprakların lakkaz enzimlerini üreten mikroorganizmalar ile kontamine edilerek iyiletirilmesini salamak en ekonomik ve kullanılı metottur. Lakkaz enzimlerinin ticari uygulamalarının önündeki en önemli engel yeterli enzim stounun bulunmaması ve redoks-aracılarının fiyatıdır. Bu problemlerin çözümüne yönelik önemli çalımalar ise son zamanlarda yapılmaktadır. Bu nedenle, lakkaz enzimlerinin ucuza ve aırı üretimini salayacak olan heterolog konakçıların aratırılması ve aynı zamanda da bu enzimlerin çok daha aktif ve güçlü olması için kimyasal veya protein mühendislii yöntemleri ile modifiye edilmelerine yönelik çalımaların sürdürülmesi gerekmektedir (Münir, 2009). 2. Yöntem 2.1. Örnek Alımı Aratırmada kullanılan örnekler zmir-foça yolu üzerinde bulunan PE-MA kültür mantarı çiftliinden alındı. Raf sistemi uygulanan mantar çiftliinde örnekler kültivasyon ortamından ve kompostun 3 farklı aamasında alındı. Örnekler sırasıyla; kompostlama süreci sonunda örtü topraı atılmadan önce, birinci hasat bitimi ve ikinci hasat bitiminden sonra örtü topraı kaldırılarak alındı. Denemeler örneklerin alındıı gün yapılmı olup örnekler üç tekrarlı olarak çalııldı Ekstraksiyon Alınan atık kompost örneklerindeki enzim aktivitelerini belirlemek için ilk olarak enzimin ekstraksiyon ilemine tabi tutulması gerekir. Bu ilemde enzim aktivitesinin miktarına etki edebilecek nötral ve alkali proteazların inhibisyonu amacıyla içinde 1 mm EDTA (etilen daimin tetra asetik asit), 1mM PMSF (fenilmetilsülfonilflorid) ilave edilmi 20 mm sodyum asetat tamponu (ph:5) hazırlandı. Ayrıca enzimlerin tampon çözeltisine geçiini arttırmak amacı ile yüzey gerilimini düüren %0,1 lik Tween 80 çözeltisi de tampona ilave edildi. Örnekler 1/10 oranında hazırlanan tampon içerisinde 1 saat 4 C de çalkalamalı inkübatörde muamele edildi. nkübasyon sonunda karıım 5000

15 rpm de 4 C de 20 dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonunda santrifüj tüplerindeki çökelek üzerinde kalan sıvı kısım (supernatant) enzim aktivitesi ölçümlerinde kullanıldı Enzim Aktivitelerinin Ölçümü Süpernatant içindeki -amilaz, ksilanaz ve selülaz enzimlerinin aktivitelerinin hesaplanmasında DNS (dinitro salisilik asit) yöntemi kullanıldı. -glukosidaz enziminin aktivitesi, sentetik bir substrat olan p-nitrofenil -D hidrolizi sonucu açıa çıkan nitrofenil miktarının ve Lakkaz aktivitesi ise ABTS nin oksidasyonu sonucu oluan ürün miktarının spektrofotometrik olarak belirlenmesi ile saptandı. Uygun reaksiyon koullarında inkübasyondan sonra okunan absorbans deerleri -amilaz, ksilanaz, selülaz ve -glukosidaz enzimlerinin hacimsel aktivitelerinin hesaplanmasında kullanıldı. Hacimsel enzim aktiviteleri aaıdaki formül kullanılarak hesaplandı. Hacimsel Enzim aktivitesi(unit/ml) =[(Abs/Eim) X Reaksiyon Hacmi(ml)/Zaman(dak.) X Enzim Hacmi]X Seyreltme katsayısı Lakkaz enziminin hacimsel aktivitesinin hesaplanmasında ise aaıdaki formül kullanıldı. Hacimsel Enzim aktivitesi = [Abs 420 X V T X 10 6 ] / [ X V E X t(süre)] X Seyreltme Faktörü Aratırmada kullanılan tüm enzimlerin spesifik aktivitesi aaıdaki formülden yararlanılarak hesaplandı. Spesifik Enzim Aktivitesi (Unit / mg protein)=hacimsel aktivite/protein miktarı DNS Yöntemi: DNS Reaktifinin Hazırlanması DNS reaktifi enzim aktivitelerini durdurmakla görevlidir. %1 lik DNS çözeltisi hazırlanırken 1 gr DNS, 20 ml 2 M NaOH çözeltisi içerisinde çözüldü. Karıım, kaynar suda üzerine 50 ml distile su ilave edilerek çözülmeye devam edildi. Tamamen

16 çözünme gerçekletikten sonra 30 gr K-Na- tartarat ilave edilip hacim 100 ml ye tamamlandı milaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Enzim aktivitesini belirlemek için 0,2 g niasta substratı, 20 ml 0,02 M ph:7 fosfat tamponunda çözüldü. Hazırlanan niasta çözeltisinden 0,9 ml temiz tüplere aktarıldı ve üzerine 1/10, 1/20, 1/40 enzim seyreltmeleri ile 1 ml ye tamamlandı. Reaksiyon karıımı 37ºC de 5 dakika bekletildi. Üzerlerine 1 er ml DNS reaktifi ilave edilerek 10 dakika kaynar suda tutuldu. Üzerine 10 ml distile su eklenir ve 1 er ml alınarak 540 nm de absorbansları okundu (Resim 1). Resim 1. -milaz Enzim Aktivite Tayini. Bir unit -amilaz aktivitesi (unit/ml) reaksiyon koullarında 1 mg glukoz oluturan enzim miktarı olarak belirlendi. Bu, hacimsel aktivite olarak da ifade edilir. Hacimsel aktivitenin mg daki protein miktarına bölünmesi ile enzimin spesifik aktivitesi (unit /mg protein) hesaplandı. Maltoz Standart Grafiinin Hazırlanması 2 g maltoz 24 saat 65 C de kurutuldu. Kurutulan maltozdan 0,2 gram tartılarak 20 ml 0,02 M ph: 7 fosfat tamponu içerisinde çözüldü, vortekste karıtırıldı. 0,02 M ph:7 fosfat tamponu ile 1 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml lik seyreltmeler yapıldı. 37ºC 5 dakika bekletildi. Üzerine 1 er ml DNS reaktifi eklenerek kaynar suda 10 dakika muamele edilen reaksiyon karıımına 10 ml distile su ilave

17 edildi. Bu karıımın 1 er ml si küvetlere alınarak spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda absorbans deeri okundu. DNS yönteminin uygulanması ile elde edilen A 540 deerleri kullanılarak maltoz standart grafii çizildi. Bu grafikten faydalanarak enzim aktivitesi hesaplandı Ksilanaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Enzim aktivitesini belirlemek için 0,2 g ksilan substratı, 20 ml 0,1 M ph:7 fosfat tamponunda çözüldü. Hazırlanan ksilan çözeltisi 0,9 ml temiz tüplere aktarıldı ve üzerine 1/10, 1/20, 1/40 enzim seyreltmeleri ile 1 ml ye tamamlandı. Reaksiyon karıımı 37ºC de 20 dakika bekletildi. Üzerlerine 1 er ml DNS reaktifi ilave edilerek 10 dakika kaynar suda tutuldu. Üzerine 10 ml distile su eklendi ve 1 er ml alınarak 540 nm de absorbansları okundu (Resim 2). Resim 2. Ksilinaz Enzim Aktivite Tayini. Bir unit ksilanaz aktivitesi (unit/ml) reaksiyon koullarında 1 mg ksiloz oluturan enzim miktarı belirlendi. Bu deer hacimsel aktivite olarak da ifade edildi. Hacimsel aktivitenin mg daki protein miktarına bölünmesi ile enzimin spesifik aktivitesi (unit /mg protein) hesaplanmı oldu. Ksilan Standardının Hazırlanması 2 g D-ksiloz 24 saat 65 C de kurutuldu. Kurutulan D-ksiloz 0,2 gram tartılarak 20 ml 0,1 M ph: 7 fosfat tamponu içerisinde çözüldü, vortekste karıtırıldı. 0,1 M ph:7 fosfat tamponu ile 1 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml lik seyreltmeler yapıldı. 40 C de 20 dakika bekletildi. Üzerine 1 er ml DNS reaktifi eklenerek kaynar suda 10 dakika muamele edilen reaksiyon karıımına 10 ml distile su

18 ilave edildi. Bu karıımın 1 er ml si küvetlere alınarak spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda absorbans deeri okundu. DNS yönteminin uygulanması ile elde edilen A 540 deerleri kullanılarak D-ksiloz standart grafii çizildi. Bu grafikten faydalanarak enzim aktivitesi hesaplandı Selülaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Enzim aktivitesini belirlemek için 0,2 g karboksimetilselüloz substratı, 20 ml 0,2 M ph:5 asetat tamponunda çözüldü. Hazırlanan karboksimetilselüloz çözeltisi 0,9 ml temiz tüplere aktarılır ve üzerine 1/10, 1/20, 1/40 enzim seyreltmeleri ile 1 ml ye tamamlandı. Reaksiyon karıımı 37ºC de 45 dakika bekletildi. Üzerlerine 1 er ml DNS reaktifi ilave edilerek 10 dakika kaynar suda tutuldu. Üzerine 10 ml distile su eklenir ve 1 er ml alınarak 540 nm de absorbansları okundu (Resim 3). Resim 3. Selülaz Enzim Aktivite Tayini. Bir unit selülaz aktivitesi (unit/ml) reaksiyon koullarında 1 mg glukoz oluturan enzim miktarı belirlendi. Bu deer hacimsel aktivite olarak da ifade edildi. Hacimsel aktivitenin mg daki protein miktarına bölünmesi ile enzimin spesifik aktivitesi (unit /mg protein) hesaplanmı oldu. Glukoz Standart Grafiinin Hazırlanması 2 g glukoz 24 saat 65 C de kurutuldu. Kurutulan glukozdan 0,2 gram tartılarak 20 ml 0,2 M ph: 5 asetat tamponu içerisinde çözüldü, vortekste karıtırıldı. 0,2 M ph:5 asetat tamponu ile 1 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml lik seyreltmeler yapıldı. Karıımlar 37 C 45 dakika bekletildi. Üzerine 1 er ml DNS reaktifi

19 eklenerek kaynar suda 10 dakika muamele edilen reaksiyon karıımına 10 ml distile su ilave edildi. Bu karıımın 1 er ml si küvetlere alınarak spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda absorbans deeri okundu. DNS yönteminin uygulanması ile elde edilen A 540 deerleri kullanılarak glukoz standart grafii çizildi. Bu grafikten faydalanarak enzim aktivitesi hesaplandı Glukosidaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Enzim aktivitesini belirlemek için 20 mm 4-nitrofenil -D glukopiranosid substratı, 20 ml 0,2 M ph:4,6 asetat tamponunda çözüldü. Hazırlanan 4-nitrofenil -D glukopiranosid çözeltisi 0,9 ml temiz tüplere aktarıldı ve üzerine 1/10, 1/20, 1/40 enzim seyreltmeleri ile 1 ml ye tamamlandı. Reaksiyon karıımı 37ºC de 20 dakika bekletildi. nkübasyon süresi tamamlandıktan sonra hazırlanan Na 2 CO 3 (sodyum karbonat) çözeltisinden 0,5 ml ilave edilerek reaksiyon durduruldu. 1 er ml küvetlere alınarak spektrofotometrede 420 nm de absorbansları okundu (Resim 4). Resim 4. -Glukosidaz Enzim Aktivite Tayini. - Glukosidaz enzim aktivitesi hazırlanan p-nitrofenil standart grafii kullanılarak aaıdaki formül ile hesaplandı. Bir unit - Glukosidaz enzim aktivitesi reaksiyon koullarında dakikada 1 µ mol p-nitrofenil oluturan enzim miktarı olarak ifade edildi.

20 P-nitrofenil Standart Grafiinin Hazırlanması 20mM p-nitrofenil substratı 0,2 M ph: 4,6 asetat tamponu içerisinde çözüldü, vortekste karıtırıldı. 0,2 M ph:4,6 asetat tamponu ile 1 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml lik seyreltmeler yapıldı. 37 C 20 dakika bekletildi. nkübasyon süresi tamamlandıktan sonra hazırlanan Na 2 CO 3 (sodyum karbonat) 0,5 ml ilave edilerek reaksiyon durdurulur ve 420 nm de absorbansına bakıldı. A 420 deerleri kullanılarak p-nitrofenil standart grafii çizildi. Bu grafikten faydalanarak enzim aktivitesi hesaplandı Lakkaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Enzim aktivitesini belirlemek için 5 mm ABTS (2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) 20 ml 0,1 M ph: 4 asetat tamponunda çözüldü. Hazırlanan ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) çözeltisi 1/200, 1/400, 1/800 enzim seyreltmeleri ile 1 ml ye tamamlandı. Reaksiyon karıımı oda sıcaklıında 5 dakika bekletildi. nkübasyon süresi tamamlandıktan sonra 1 er ml küvetlere alınarak spektrofotometrede 420 nm de absorbansları okundu (Resim 5). Resim 5. Lakkaz Enzim Aktivite Tayini. Bir unit (U) enzim aktivitesi, 1 dakikada 1 µmol ABTS yi dönüüme uratan enzim miktarı olarak tanımlandı. Aktiviteler U/L olarak ifade edildi. Lakkaz aktivitesi aaıdaki formülle hesaplandı. Enzim Aktivitesi= [Abs 420 X V T X 10 6 ] / [ X V E X t(süre)] X Seyreltme Faktörü

21 Abs= absorbansdaki artı V T = toplam tepkime hacmi (ml) s = ABTS substratının moleküler ekstinksiyon katsayısı ( M -1 cm -1 ) V E = enzim hacmi (ml) 2.4. Protein Tayini Bradford Yöntemi: 50 l olacak ekilde belirli seyreltmelerle hazırlanan örneklere 1.5 ml Coomassie Brillant Blue G-250 reaktifi ilave edildi ve 10 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra 595 nm dalga boyunda spektrofotometrede absorbans okundu. Bradford Reaktifinin Hazırlanması: 20 mg, %95 lik etanol (50ml) içinde çözüldü. Üzerine 27,5 ml %88 lik fosforik asit ilave ederek distile su ile 500 ml ye tamamlanıp Whatman No1 filtre kaıdı ile filtre edildi. Protein Standard Çözeltisinin Hazırlanması Pek çok protein tayin yönteminde bilinen bir proteinin kullanılmasıyla çizilen standart grafikler yardımıyla, bilinmeyen örnein miktarına ulaıldı. Saflatırılmak istenen proteinin saf bir örneiyle ölçümü kalibre etmek ve benzer renk verimine ulamak için en iyi çözümdür. Bunun mümkün olmadıı durumlarda en yaygın olarak kullanılan protein standardı Bovin Serum Albumin dir (BSA). Hazırlanan standartların doruluu en az %1 olmalıdır. Standart Bovin Serum Albumin (BSA) in 1500 µg/ml; 1000 µg/ml, 750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml,125 µg/ml, 25 µg/ml konsantrasyonlarına göre BSA standart çözeltisi hazırlandı. Bu standart çözeltiden 0,05 ml alınıp üzerine 1,5 ml Coomassie Brillant Blue G-250 ilave edildi. 10 dakika inkübe edildikten sonra 595 nm dalga boyunda spektrofotometrede absorbansı ölçüldü. Absorbans deerleri ve BSA miktarına göre standart grafik çizildi. 3. Sonuçlar ve Tartıma Mantar kompostu hazırlanmasına benzer bir mikrobiyal ürün üretimi yöntemi olan Katı Kültür Fermentasyonu (KKF) uzun zamandır bilinen bir teknik olmasına ramen son yıllarda hücre dıı enzim üretiminde ucuz substratların kullanılması nedeni ile büyük önem kazanmıtır. Bu tekniin atıklara uygulanmasıyla çevresel problemlere yol açan lignoselülozik tarımsal atıkların doada birikimi önlenebildii gibi, enzim ve

22 antibiyotik gibi deerli ürünler de elde edilebilir.kompost üretim süreci; serbest su bulunmayan nemlendirilmi katı substratlar üzerinde mikroorganizma geliimini ve onların metabolik faaliyetlerinin oluumunu kapsar. Bu çalımada beyaz apkalı kültür mantarı olarak da bilinen Agaricus bisporus un ticari mantar üretiminin gerçekletirildii kompost içindeki lignoselülozik enzim aktiviteleri aratırılmıtır. Atık mantar kompostuyla yapılan incelemelerde lignoselülozik enzim aktivitelerinin sonuçları ve protein miktarları aaıda verilmitir. Kompostun örtü topraı olmayan kısmından alınan örnekte toplam protein miktarı 0,61 mg/ml dir. Bu protein miktarında -amilaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,017 u/ml (Tablo.1), ksilanaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,004 u/ml (Tablo.2), selülaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,0004 u/ml (Tablo.3), -glukosidaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,0003 u/ml (Tablo.4), lakkaz enziminin hacimsel aktivitesi 65,70 u/ml (Tablo. 5) olarak belirlenmitir. Kompostun 1. hasat sonrasında alınan örneinde toplam protein miktarı 0,54 mg/ml dir. Bu protein miktarında -amilaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,006 u/ml (Tablo.1), ksilanaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,014 u/ml (Tablo.2), selülaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,00015 u/ml (Tablo.3), -glukosidaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,0004 u/ml (Tablo.4) ve lakkaz enziminin hacimsel aktivitesi 41,67 u/ml (Tablo.5) olarak belirlenmitir. Kompostun 2. hasat sonrasında alınan örneinde toplam protein miktarı 0,51 mg/ml dir. Bu protein miktarında -amilaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,006 u/ml (Tablo.1), ksilanaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,0123 u/ml (Tablo.2), selülaz enziminin hacimsel aktivitesi 0,0u/ml (Tablo.3), -glukosidaz enziminin hacimsel aktivitesi 0, u/ml (Tablo.4) ve lakkaz enziminin hacimsel aktivitesi 5,31 u/ml (Tablo.5) olarak belirlenmitir. Kompostlasma sürecinde enzim aktiviteleri deerlendirildiinde atık mantar kompostunun potansiyel bir lakkaz enzim kaynaı olduu bulunmutur. Yüksek miktarda olutuu düünülen enzimler, uygun bir ekstraksiyon yönteminin atık mantar kompostuna uygulanmasıyla enzim geri kazanımına olanak salar. Lakkaz enziminin geri kazanımı endüstride birçok sektörün daha ucuz ve salıklı bir yolla ürün üretimine katkı salamaktadır. Lakkaz enziminin sahip olduu oksidasyon yetenei, onun birçok endüstriyel ve biyoteknolojik süreçte kullanılmasına yol açar. Çounlukla kâıt ve kâıt hamuru endüstrisi, tekstil ve petrokimya endüstrilerinden kaynaklanan atık suların

23 detoksifikasyonu ve çeitli biyosensörler olarak kullanılır. Lakkazlar aynı zamanda anti kanser ilaçların üretimi için katalist olarak ve hatta kozmetik ürünlerinde katkı maddesi olarak dahi kullanılmaktadırlar. Buna ilaveten lakkaz enzimleri, herbisidler, pestisidler ve patlayıcılar gibi ksenobiyotik bileiklerle kirlenmi topraklardan ve sulardan bu tip kirleticileri uzaklatırma ve polimerik ürünler oluturma kapasiteleri nedeniyle, biyoremediasyon ajanları olarak da kullanılabilmektedirler. Enzimatik oksidasyon teknikleri, meyve sularında, biralarda ve araplarda kararmaya, ve bulanıklıa yol açan istenmeyen fenolik bileiklerin giderilmesi amacıyla ve tekstil, gıda sanayiinde, odun ileme, farmasötik ve kimya gibi oldukça farklı endüstriyel alanlar için potansiyel bir uygulama alanına sahiptir. Atık mantar kompostundan elde edilen lakkaz enzimi kaıt hamurunun delignifikasyonu ve beyazlatılması, organik kirleticilerin oksidasyonu, çaylardaki drogların ve fenollerin analizi gibi biyosensörlerin veya biyo-yakıt hücrelerinin gelitirilmesi, polimer sentezi, tekstil boyalarının renk giderimi, bioremediasyon (petrol kirliliinin giderilmesi), fungisidaller, gibi çok sayıdaki sürece uygulanabilir. Tablo 1. Atık mantar kompostunun farklı zamanlarında alınan örneklerdeki -amilaz enziminin spesifik ve hacimsel aktiviteleri.

24 Tablo 2. Atık mantar kompostunun farklı zamanlarında alınan örneklerdeki ksilanaz enziminin spesifik ve hacimsel aktiviteleri. Tablo 3. Atık mantar kompostunun farklı zamanlarında alınan örneklerdeki selülaz enziminin spesifik ve hacimsel aktiviteleri.

25 Tablo 4. Atık mantar kompostunun farklı zamanlarında alınan örneklerdeki - glikosidaz enziminin spesifik ve hacimsel aktiviteleri. Tablo 5. Atık mantar kompostunun farklı zamanlarında alınan örneklerdeki lakkaz enziminin spesifik ve hacimsel aktiviteleri.

26 Teekkür Çalımalarım sırasında laboratuar destei salayan, bilgi ve deneyimlerini paylaan Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öretim Üyesi Doç.Dr. hsan Yaa ya ve Burçin Çelik e teekkür ederim. Projem boyunca yardımlarını esirgemeyen Biyoloji öretmenim Mesut Esen e, Bilim Kurulu E Bakanı Dr. Aye Türker e ve bizi bilimsel çalımalara tevik eden, bu konuda her türlü destei veren okul yöneticilerimize teekkür ederim. 4. Kaynaklar Adams, M.R., (1986), Progress in ndustrial Microbiology. Elsevier, 23, Amsterdam Akyüz M., Kırba S., (2009), Bazı Tarımsal ve Endüstriyel Atıkların Pleurotus spp. Üretiminde Kompost Olarak Deerlendirilmesi, Ekoloji 18, 70, Aygan A, (2008), Haloalkolofil Bacillus sp. zolasyonu, Amilaz, Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerinin Üretimi, Karakterizasyonu ve Biyoteknolojik Uygulamalarda Kullanılabilirlii, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Proje No: FBE 2003-D- 18 sayfa Baran M., (2001), Miksobakterilerden -amilaz enziminin ayrımı ve saflatırılması, Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yükseklisans Tezi, 4-11 s., Isparta. Cheetham, P. S. J., (1995). The applications of enzymes in industry. handbook of Enzyme Biotechnology. (Wiseman, A.-eds), Ellis Horwood. Cornwall. Claus, H.; Faber, G.; König, H.; (2002), Redox-mediated decolorization of synthetic dyes by fungal laccases, Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, Çömlekçiolu U., Özköse E., Akyol., Ekinci M. S., (2010), Anaerobik Fungusların Bitki Dokularını Kolonizasyonu ve Enzimatik Yıkımı, Hayvansal Üretim 51(1), Eki, A., (1998). Meyve Suyu Durultma Teknii. Gıda Teknolojisi Dernei yayınları No: s. Ankara.

27 Eren K. Ö., Çömlekçiolu U., Dostbil N., (2006), Bazı Mikrobiyal Enzimler ve Endüstrideki Kullanım Alanları KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(1). Gamerith, G., Groicher, R., Zeilinger, S., Herzag, P., Kubicek, C.P., (1992), Cellulasepoor xylanase produced by Trichoderma reesei RUTC-30 on hemiselulase substrates. Apply Microbial Biotechnol., 38, Güner K. G., Dalıolu O., (2008), Ksilanaz Enziminin Ekmek Yapımında Kullanımı Türkiye 10. Gıda Kongresi, Erzurum. Hamer, R.J., (1995). Enzymes in the baking industry. Enzymes in the Food processing. (Tucker, G.A., Woods, L.F.J.,-eds) Chapman and Hall, Glasgow. Karademir A., Akgül M., Tutu A., (2002), Kaıt Endüstrisinde Enzim Kullanımına Genel Bir Bakı: Enzimlerin Kabuk Soyma, Liflerin Modifikasyonu, Çözünebilir Kaıt Hamuru ve Selüloz Üretiminde Kullanımı, KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 5(1). Ko H.G., Park S.H., Kim S.H., Park H.G., Park W.M., Detection and recovery of hydrolytic Enzymes from spent compost of four mushroom species, Folia Microbiol.50(2), Krishna, Hari, S., Sekhar, K.C., Saresh Babu, J., Srirami Reddy, D., (2000). Studies on the production and application of cellulase from Trichoderma reesi, QM-9414, Bioprocess Engineering 22, Mondini C., Fornasier F., Sinicco T., Enzymatic activity as a parameter for the characterization of the composting process, Soil Biology & Biochemistry,36, Münir T., (2009), Lakkaz, Kısım 2: Potansiyel, endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamaları, Marmara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 22,

28 Özdemir C., (2006), Mantar yetitiricilii Samsun Valilii Tarım l Müdürlüü Çiftçi Eitimi ve Yayım ube Müdürlüü, Samsun. Salles, B.C., Cunha, R.B., Fantes, W., Sousa, M.V., Filho, E.X.F., (2000), Prufication and Characterization of a new xylanase from Acrophiolophora nainiana. Journal of Biotechnology, 81, Sarıkaya, E., (1995), -Amilaz üreten bazı Bacillus sularının gelime parametreleri, enzim özellik ve üretim koullarının optimizasyonu.. Doktora Tezi (Yayınlanmamı), 114s, Ankara. Tarakçıolu, Y., (1979), An Amylase Producing Maltotiose from Bacillus subtilis. Agric. Biol. Chem. 49 (4), Telefoncu, A., (1997). Enzimlerin Endüstriyel Uygulamaları. Enzimoloji. (Telefoncu, A.- eds). Fen Fak. Yayınları No: zmir. Tiquia S.M., Tam N.F.Y., (1997), Composting of spent pig litter in turned and forcedaerated piles, Environment Pollution 99(1998) Topal S., Pembeci C., Borcaklı M., (2000). Türkiye nin Tarımsal Mikoflorasının Endüstriyel Öneme Sahip Bazı Enzimatik Aktivitelerinin Incelenmesi-I: Amilaz, Proteaz, Lipaz, Turk J Biol 24, TÜBITAK. Uluslararası Organik Tarım Hareketleri Federasyonu Vargas-García M.C., Suárez-Estrella F., López M.J., Moreno J., (2010), Microbial population dynamics and enzyme activities in composting processes with different starting materials, Waste Management 30,

29 Yang, V.W., Zhuang, Z., Elegir, G., and Jeffries, T.W., (1995), Alkaline-active xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp. solat from kraft pulp. Journal of Industrial Microbiology, 15, Yaa., Çaldırcı H., (2007), Mikrobiyal Fizyoloji Uygulama Kitabı, Ege Üniversitesi Yayınları Fen Fakültesi Yayın No:204 ISBN: , s. Yıldız T., (2008), Farklı Rumen Funguslarına Ait Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerinin Analizi, Kahramanmara Sütçü mam Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Proje No:2007/3-14 sayfa 7-9.