TÜBİTAK TÜRKHAYGEN-1 Projesi. Tür ve Irkların DNA İşaretleri ile Moleküler Tanımlanması Çalışma Paketi. I. Çalıştay. 2-3 Nisan 2007, ODTÜ

Transkript

1 TÜBİTAK TÜRKHAYGEN-1 Projesi Tür ve Irkların DNA İşaretleri ile Moleküler Tanımlanması Çalışma Paketi I. Çalıştay 2-3 Nisan 2007, ODTÜ Eğitim materyalini hazırlayan: Dr. Evren Koban I. GİRİŞ Bu çalıştayın amacı, proje çerçevesinde yer alan tür ve ırkların moleküler tanımlanması kısmından sorumlu araştırma gruplarının moleküler çalışmaları yürütecek elemanlarının toplanması, tanışması ve kullanılacak metodlar ve dikkat edilecek önemli noktalar yönlerinden bir ön bilgi sunulmasıdır. Ek 1 de tüm katılımcıların listesi verilmiştir. Projenin en temel noktası, proje kapsamında incelenecek türlerden ve ırklardan oluşturulacak populasyonlar için bireylerin seçimidir. Proje sonuçlarını doğrudan etkileyecek bu aşamadan sonra genetik tanımlamanın en temel basamağı da seçilen bireylerden temiz, kaliteli ve yüksek konsantrasyonda DNA elde edilmesidir. DNA ların uzun bir dönem saklanması planlandığından, DNA nın kitten ziyade fenol-kloroform yöntemi ile izolasyonu tercih edilmektedir. Bunun için şu referanstan yararlanılabilir: Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3Volume Set). Ayrıca, ekte (EK 2) laboratuvarımızda kullandığımız bu protokol verilmiştir. Çalıştay sırasında, önceden elde edilmiş DNA ların miktar ve kalite tayinleri yapılmış, daha sonra bu DNA lar yeterli miktarlar hesaplanarak mikrosatellit ve mtdna kontrol bölgeleri için PZR işlemleri yapılmış (dizi analizi için ayrıca PZR ürünleri temizlenip dizileme PZR işlemine tabi tutulmuştur), sonuçlar jelde kontrol edilmiş ve sonrasında otomatik DNA analizi cihazında analiz edilmiştir. İki gün boyunca yapılan işlemlerin detayları aşağıda verilmiştir. II. DNA ların Kontrol Edilmesi: DNA izolasyonundan sonra DNAların kalitesinin ve miktarının kontrol edilmesi, çalışmada işlemlerin optimizasyonu ve standartlaştırılması için gereklidir. Bunun için hem agaroz jel, hem de uv- spektroskopi ölçümleri kullanılmıştır. a) Agaroz jel elektroforezi ile: Agaroz jelde DNA kontrol ederken %0.6 lık ya da %0.8 lik jel hazırlanabilir. Agarozu çözdürmek için tampon solusyon olarak 0.5X TBE (Tris-Borik asit-edta) kullanıyoruz. DNA nın jelde görüntülenmesi için de EtBr kullanıyoruz. Bunu iki şekilde yapabiliriz: Agarozu tampon solusyonunda erittikten sonra bunun içine 2-3 µl kadar EtBr (10mg/ml) koyabiliriz ya da DNA ları jelde yürüttükten sonra görüntülemeden önce EtBr lı solüsyonun içinde dk kadar bekletebiliriz. EtBr kanserojen bir kimyasaldır. Bu kimyasala karşı eldivenlerden ziyade nitrile eldivenler koruyucudur. Yüksek konsantrasyondaki EtBr lı atıklar (özellikle pembe renkli jeller, EtBr 1

2 bulaşmış eldiven, kağıt havlu vs) tibbi atık olarak işlem görmelidir. EtBr içeren solusyonlar deaktive edilmelidir (ekte -EK 3- bu işlem için önerilen 3 metod bulunmaktadır). EtBr yerine daha az kanserojen olduğu düşünülen SYBR Green ya da SYBR Safe de kullanılabilir. 7 adet koyun DNA örneğimizin agaroz jel elektroforezi ile kontrolü için elektroforez tankımızın kasetinin hacmine uygun olarak 30 ml %0.8 konsantrasyonunda agaroz jel hazırlayıp içine EtBr ekledik ve donmasını bekledik. Bu sırada 3 µl su, 1 µl 6X yükleme tamponu (loading buffer) ve 2 µl DNA karıştırarak 7 örneği jele yüklemek üzere hazırladık. Kullandığımız 6X yükleme tamponu bromofenol mavisi (bromophenol blue; önde giden koyu mavi renk) ve ksilen sayanol (xylene cyanol; arkadan giden açık mavi renk) içermektedir. DNA gibi negatif yüklü olan ve jelde DNA ile aynı yönde hareket eden bu iki madde hem örneklerimizin jele yüklenebilmesini kolaylaştırabilmek için onları gözle görünür kılmakta hem de jelde yürürken yerlerini tayin edebilmemize yardım etmektedir. Böylece örneklerin fazla yürüyüp jelden çıkmaları önlenmiş olmaktadır. Jel donduktan sonra, jele örnekleri yükleyip (örnek numaraları sırasıyla: 3, 14, 46, 47, 48, 57, 65 ve DNA merdiveni), tanka uygulanabilecek max voltajı aşmamak kaydıyla (cihazınızın kullanma kılavuzunu mutlaka kontrol edin) 120 voltta 20 dakika yürüttük. Daha sonra jel uv ışığına tabii tutularak görüntülendi. Şekil 1 de jel görüntüleme cihazında UV altında çekilen jel fotoğrafı verilmiştir. Şekil 1. DNA kontrol için %0.8 lik agaroz jel. Soldan sağa sırasıyla örnekler: 3, 14, 46, 47, 48, 57 ve 65 ile en sağda DNA merdiveni (size ladder) yer almaktadır. En sonda yüklediğimiz DNA merdiveni konsantrayonu tayin edebilmek için referans olması amacıyla kullanılmıştır. Eğer λ DNA nız var ise farklı konsantrasyonlarda hazırlayıp (mesela 20 ng/µl, 50 ng/µl, 100 ng/µl ve 200 ng/µl gibi) örneklerinizin yanı sıra bunları da jele yükleyip örneklerinizle beraber yürütebilir ve örneklerinizin konsantrasyonunu belirlemek için bunlarla karşılaştırabilirsiniz. Biz MBI Fermentas ın GeneRuler 50 bp DNA merdivenini kullandık. Bunun konsantrasyonu 0.5 µg/µl. Jele bu DNA merdiveninden 1 µl yüklendiğinde 500 bandında (yukarıdan itibaren okla gösterilmiş olan 6. bant) 75 ng DNA bulunuyor. DNA merdivenini hazırlamak için 1 µl 2

3 GeneRuler 50 yi 1 µl yükleme boyası (loading dye) ve 4 µl su ile karıştırıyoruz; yani her 1 µl merdivenden 6 µl elde ediyoruz. Jele bu karışımdan 2 µl yükledik (hazırladığımız 6 µl karışımın üçte biri). Yani merdivenin de üçte birini (0.33 µl) yüklemiş olduk. Bu durumda da 500 bandında da üçte biri kadar DNA var; yani yaklaşık 25 ng. Bu bant ile DNA larımızın bantlarını karşılaştırıp konsantrasyonlarını tahmin edebiliriz. b) Spektrofotometre ile: Aynı koyun DNA sı örnekleri, 5 µl DNA µl su şeklinde 120 kat sulandırılmıştır ve uv spektrofotometre cihazında 260 nm (DNA için) ve 280 nm (protein için) dalga boylarında absorbans değerleri ölçülmüştür. UV Spektroskopi cihazında 260 nm dalga boyunda alınan 1 OD (optical density) değeri 50 µg/ml DNA konsantrasyonuna eşittir. Bu değer RNA için 40 µg/ml ve primer için ise 33 µg/ml dir. Bu denklikten yola çıkarak ve sulandırma faktörü de göz önüne alınarak DNAların konsantrasyonları hesaplanabilir. Her bir örnek için kontrol amaçlı 2 defa okuma yapılmıştır. Örneklerimiz için yaptığımız okumaların sonuçları Tablo 1 de verilmiştir. Tablo 1. Spektrofotometre DNA okuma değerleri. Konsantrasyon (sulandırılmış) Konsantrasyon x120 DNA Örnek # Oran A 260 /A 280 Nükleik Asit (µg/ml) Nükleik Asit (µg/ml) Hem agaroz jel sonuçları hem de uv spektroskopi sonuçları birbirleri ile karışılaştırılarak sonuçlardan emin olunduğunda bu DNA lar stok olarak saklanır ve bunlardan çalışmalarda kullanmak üzere 50 ya da 100 ng/µl konsantrasyonunda örnekler hazırlanır. Stok DNA lar böylece kontaminsayon riskinden korunmuş olur. Her bir örneğin konsantrasyonu yaklaşık olarak eşit olduğu için de optimize edilen koşullar açısından kullanılacak DNA miktarını µl bazında sabitlenmiş olur. DNA nın konsantrasyonu yüksek ise ve ondan daha az yoğun konsantrasyonda bir çalışma tüpü hazırlayacaksak önce DNA örneğini etüvde 55 C de yarım saat bekletiriz. Daha sonra bu 3

4 tüpten belli bir miktar DNA alıp (bu miktara DNA nın ne kadar yoğun olduğuna, çalışmalar için uygun konsantrasyonda toplamda ne kadar DNA çözeltisi hazırlamamız gerektiğine göre değişir) bunu hazırladığımız yeni tüpteki steril dh 2 O ya da TE solüsyonuna ekleriz. Hazırladığımız bu sulanmış DNA çözeltisini 37 C de gece boyu bekletip ertesi gün karıştırdıktan sonra tekrar agaroz jelde ve uv-spektrofotometre cihazında kontrol ederiz. İstediğimizden daha yoğun ise bir miktar daha steril dh 2 O ya da TE solüsyonu ekleriz, karıştırıp birkaç saat etüvde 37 C de bekletip tekrar aynı şekilde kontrol ederiz. İstediğimiz konsantrasyona ulaşıncaya kadar aynı işlemi tekrarlarız. Eğer istediğimizden daha az yoğun olmuş ise stok DNA mızdan (stok DNA yı etüvde 55 C de yarım saat beklettikten sonra) uygun bir miktar DNA ekleriz. Aşağıdaki şekilde stok DNA ve bu DNA lardan hazırlanmış daha az yoğun konsantrasyonda DNA ların agaroz jelde görüntülenmiş resmi vardır (Şekil 2). Şekil 2. DNA kontrol için %0.8 lik agaroz jel. Soldan sağa sırasıyla örnekler: (4 tane sulandırılmış DNA) 65, 14, 3, 66 ve 4 tane stok DNA 14, 3, 65, 66). 260 nm OD ölçümünün 280 nm OD ölçümüne oranı bize DNA mızda protein ya da RNA kontaminasyonu olup olmadığı hakkında bilgi verir. A 260 /A 280 oranının 1.8 ile 2.0 arasında olması beklenir. OD nin 2.0 nin üzerinde olması protein kontaminasyonuna, 1.8 in altında olması da RNA kontaminasyonuna işaret eder. Bu durumda PZR sonuçlarının sağlıklı çıkması için DNA ların temizlenmesi gerekmektedir. Tablo 1 ve Şekil 1 sonuçlarına bakılarak, DNA miktarlarını sulandırıp eşit hale getirmeden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) için bir tane çok yoğun DNA (3 numaralı), 2 tane de yaklaşık olarak gerekli yoğunlukta DNA (46 & 47 numaralı) seçtik. Buradaki amaç DNA miktarının PZR sonuçlarına olası etkisini görebilmektir. 11 Mayıs 2007 de ODTÜ de gerçekletirilen toplantıda DNA ların çözdürülmesi/sulandırılması işleminde 10 mm lık Tris HCl buffer (ph 8.0) kullanmanın uzun vadede DNA lar ve primerlerin bozulmaması için daha iyi olacağı konuşuldu. Ancak buffer ı hazırlamak için kullanılan suyun kalitesi önemli. Gerekirse suyun satın alınabileceği konuşuldu. III. DNA Bankası: DNA bankası için Hacettepe Hastanesi ne bulunan DNA bankasının müdürü Prof. Dr. Meral Özgüç ile görüşülmüş ve tavsiyeler alınmıştır. DNA lar kit ile değil, fenol kloroform metodu ile izole edilmelidir. Bu yolla izole edilen DNA ların moleküler ağırlığı kitle izole edilene kıyasla daha büyüktür. DNA nın saflığı, kalitesi ve miktarı da banka için uygundur. 4

5 DNA örnekleri -20 C ve -80 C de saklanmalıdır. Örnek toplama sırasında bazı hayvanlardan daha fazla örnekleme yapılmalı ve bunların DNA ları bankanın zamana bağlı kalite kontrolü nü yapmak için kullanılmalıdır. Periyodik olarak (6 ayda bir) kalite kontrol DNA ları çözdürülerek agaroz jelde kontrol edilir ve kontrol amaçlı seçilmiş DNA lokusları açısından PZR çoğaltma işlemleri gerçekleştirilir. Böylece DNA bankasındaki örneklerde fragmentasyon olup olmadığı ve PZR işlemi için sonuç verip vermedikleri kontrol edilir. VI. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ve Agaroz Jel Elektroforezi: Seçilen 3 DNA ile mikrosatellit DNA lokusları için PZR işlemi yapılmıştır ve sonuç agaroz jelde kontrol edilmiştir. Ayrıca DNA konsantrasyonları kontrol edilen 7 örneğin hepsi mtdna kontrol bölgesi için PZR işlemine tabi tutuldu ve yine agaroz jelde kontrol edildi. İşlemlerin detayları aşağıda verilmiştir. a) Mikrosatellit Lokusu Analizi İçin: Mikrosatellit lokusu analizi için, proje kapsamında seçilen koyun ırklarında incelenecek olan 20 mikrosatellit lokusundan 7 tanesi (OarFCB20, OarFCB48, OarFCB304, OarJMP29, OarJMP58, MAF65, MAF209) kullanılmıştır. Bu 7 lokus, primerlerinin T M dereceleri (erime sıcaklıkları) nedeniyle seçilmiştir. Primerler ile birlikte gelen kağıtlarda primerlerin konsantrasyonları ve T M dereceleri ile ilgili bilgi de bulunmaktadır. Bu kağıtlar yardımıyla primerlerinizi istediğiniz konsantrasyona nasıl sulandıracağınızı hesaplayabilirsiniz. 50 ya da 100 mm lık stok primer hazırlayıp, bundan daha da seyrelterek PZR işlemlerinizde kullanmak için µl hacimlerde 5 ya da 10 mm lık primerler hazırlayabilirsiniz. Böylece stoğunuzun kontaminasyon ihtimalini minimuma düşürürsünüz. Bu 5-10 mm lık hazırladığınız primerleri, dntp karışımını hazırladığınız gibi, Forward ve Reverse primer birlikte tek bir tüpün içine primer mix olarak da hazırlayabilirsiniz. PZR işlemi temel olarak 3 safhadan oluşmaktadır. Ön denaturasyon adımı (94 C de 2-5 dk), döngüden oluşan çoğaltma adımı (1 döngü 3 sıcaklıktan oluşuyor: 94 C - denaturation, anneal primer bağlanma sıcaklığı ve 72 C uzatma sıcaklığı) ve son adım olarak da çoğaltma işlemi sırasında eksik kalan işlemlerin tamamlanması için son uzatma (final extension) adımı. Primerlerin T M dereceleri, PZR ile çoğaltma işlemi sırasında anneal sıcaklığına karar vermemiz açısından referans bir sıcaklık değeridir. Eğer gradient fonksiyonu olan bir PZR cihazınız var ise (yani aynı anda PZR kuyularına farklı sıcaklıklar verebiliyorsa) T M den 5 C aşağısı ve ve 5 C yukarısını kapsayan aralığı tarayacak şekilde farklı PZR mixleri tek bir seferde denenebilir. Gradient PZR cihazınız yok ise olası annealing sıcaklıklarını tek tek kontrol edebilirsiniz. PZR reaksiyon karışımı için 10X PZR buffer kullanılabileceği gibi, 10X NH 4 buffer da test edilebilir (Fermentas Taq DNA polymerase ile birlikte geliyor ayrıca hazırlanabilir de). Ayrıca MgCl 2 konsantrasyonu da optimizasyon işlemleri sırasında 1.5 mm dan 4 mm a kadar test edilebilir. PZR çoğaltma işleminin sonucunu etkileyen başka 2 faktör de DNA miktarı ve primer miktarıdır. Bunlar da farklı konsantrasyonlar açısından test edilebilir. PZR çoğaltmasında alınan sonuçları iyileştirme amaçlı, BSA veya Triton-X100 kullanılabilir. BSA için PZR reaksiyon karışımının hacmine göre µg/µl miktarlarının ilavesi test edilebilir. 5

6 Çalışmamızda 3 DNA ve bir negatif kontrol (su) olmak üzere 4 örnek 7 lokus için PZR çoğaltmasına tabi tutulmuştur. Çoğaltma işlemine tabi tutulan mikrosatellit lokuslarının isimleri, primerlerinin hangi florasan renkler ile işaretlenmiş olduğu ve beklenen alel uzunluk aralıkları şöyledir: i) OarFCB20: Hex (sarı); bp ii) OarFCB48: Hex (sarı); bp iii) OarFCB304: Hex (sarı); bp iv) OarJMP29: Fam (mavi); bp v) OarJMP58: Tet (yeşil); bp vi) MAF65: Fam (mavi); bp vii) MAF209: Hex (sarı); bp PZR reaksiyonu için hazırlanan karışımın içeriği aşağıda Tablo 2 de verilmiştir. Tablo 2. Mikrostelit DNA yükseltgeme reaksiyon içeriği. PZR mix içindeki konsantrasyonlar Tek örnek için (µl) dh 2 O X PZR Buffer 1X mm MgCl 2 2mM dntp mix (10 mm) 200µM Primer (10 mm F & R mix) 3 pmol DNA ~ ng Taq 0.5 units PZR master mix (x32) Toplam lokus ve 4 örnek olmak üzere toplamda 28 reaksiyon tüpü vardır. Pipetleme hatası düşünülerek 32x lik karışım hazırlanmıştır. 7 farklı çift primer olduğundan yedi PZR master mix hazırlamak yerine içine primer koymadan bir adet PZR master mix hazırlanmıştır. Primerler ise DNA lar gibi tüplere tek tek konulmuştur. Karışımdan 11.7 µl üzeri uygun şekilde etiketlenmiş/yazılmış tüplere (total hacim DNA primer = = 11.7 µl) dağıtılmıştır. Bunun üzerine 3 µl DNA ve 0.3 µl ilgili primer mixden (F+R) eklenmiş ve PZR cihazına yerleştirilmiştir. Bu noktaya kadar işlemler buzun üzerinde yapılmıştır. PZR çoğaltma işleminde uygulanan sıcaklıklar ve süreleri aşağıdaki Tablo 3 te verilmiştir. Tablo 3. Mikrostelit DNA yükseltgeme koşulları. Aşamalar Sıcaklık Süre Denaturasyon 94º C 2, 5 dakika Denaturasyon 94ºC 20 saniye Yapışma (Annealing) 57ºC 20 saniye 30 döngü Uzatma (Extension) 72ºC 40 saniye Son Uzatma (Final Extension) 72º C 10 dakika Eğer PZR cihazınız ısıtmalı kapak değil ise mutlaka PZR karışımlarının üzerine 1 damla mineral yağ damlatmalısınız. Isı yalıtımı sağlar ve karışımın buharlaşmasını engeller. Otomatik DNA analiz cihazınıza yüklerken bu yağın mutlaka iyice temizlenmesi gerekmektedir. Eğer cihazınız ısıtmalı kapak ise, yani yağ koymayacaksanız, tüplerinizin 6

7 kapaklarını iyice kapattığınızdan emin olun. Hafif aralık kaldığında yine buharlaşma olacak ve PZR çoğaltma işleminiz gerçekleşmeyecektir. PZR sıcaklıkları ve süreleri de optimizasyon sırasında değişebilir. Eğer HotStart Taq enzimi kullanıyorsanız sıcaklık ve süresi kullandığınız taq enzimine göre olmalıdır. PZR çoğaltılması yapılacak DNA bölgesinin uzunluğuna göre uzatma (extension) zamanı da değişecektir. Ayrıca cihazın istenilen sıcaklıklara çıkma/inme hızı da bazen PZR çoğaltma işleminde etkili olabilmektedir ve cihazın fabrika ayarlarından farklı hızlar ayarlamanız gerekebilir. Son uzatma bazen hiç gerekli olmadığı gibi bazen de son uzatmadaki süre çoğaltılan bölgenin PZR ürünü kalitesini etkilemektedir. Bütün bunlar optimizasyon sırasında göz önünde bulundurmanız gereken noktalardır. Ayrıca, literatürleri takip edip neyi neden test etmeniz gerektiğini bilip, ona göre optimizasyon için deneyeceğiniz başka adımlar da olabilir. Eğitim çalışması sırasında PZR çoğaltması işlemi uyguladığımız mikrosatellit lokusların PZR sonuçları için %2 lik agaroz jel hazırlanmıştır. Jelin konsantrasyonunun önceki jele göre daha yoğun olmasının sebebi yürüteceğimiz PZR ürünlerinin uzunluklarının küçük olmasıdır. Artan konsantrasyon jelin çözünürlüğünü (resolution) arttırmaktadır. Hem büyüklük açısından birbirine yakın olan DNA bantları daha iyi ayırt edilir, hem de küçük bantlar seyrek jele göre daha yavaş yürüyeceklerinden jelden kaçırma ihtimali azalır. Bu hazırladığımız jele EtBr konulmamıştır. Jel donarken örnekler jele yüklemek için hazırlanmıştır: 3 µl PZR ürünü+1 µl loading buffer+2 µl dh 2 O. Sonra örnekler jelin kuyularına yüklenmiştir. En solda 50 bp DNA mikrosatellit, en sağda da yine 2 adet 50 bp DNA merdiveni ile bir adet pbr322 HaeIII enzim kesimi ile elde edilen DNA merdiveni (sağda en dıştaki) yüklenmiştir. 120 V ve 80 dk/saat yürüttükten sonra yarım saat EtBr lı suda bekletilen jel uv de görüntülenmiştir. Şekil 3 de mikrosatellit DNA lokuslarının PZR çoğaltması işleminin ardından agaroz jel elektroforezi ile görüntülendiği sonuçlar sunulmuştur. Şekil 3. 7 farklı mikrosatellit lokusunun PZR ürünlerinin kontrol edildiği %2 lik agaroz jel. Lokusların isimleri ve DNA örnek numaraları kuyuların üzeinde yazmaktadır (M: marker). 7 lokusun hepsinde PZR çoğaltma işlemi başarılı olmuştur. PZR bantları DNA ladder ile karşılaştırıldığında görüntülenen DNA bantları, beklenen allel uzunlukları ile uyuşmaktadır. Yoğun olan 3 numaralı DNA hiçbir mikrosatelit lokusu için PZR çoğaltması sonucu vermemiştir. Aynı şekilde DNA yerine su koyduğumuz negatif kontrolde de bant yoktur, yani işlemimiz sırasında kontaminasyon olmamıştır. Bu yedi lokusumuzun florasan renkleri ve beklenen alel uzunlukları şöyleydi: 7

8 viii) OarFCB20: Hex (sarı); bp ix) OarFCB48: Hex (sarı); bp x) OarFCB304: Hex (sarı); bp xi) OarJMP29: Fam (mavi); bp xii) OarJMP58: Tet (yeşil); bp xiii) MAF65: Fam (mavi); bp xiv) MAF209: Hex (sarı); bp Bu durumda: renkleri ve alel uzunlukları nedeniyle FCB20, FCB304, JMP29 ve JMP58 lokuslarının PZR ürünlerini karıştırıp otomatik DNA analiz cihazında birlikte gözlemlememiz mümkün olduğundan, PZR ürünlerinin hepsini karıştırdık. Bu karışımdan 2 µl alıp 1.5 µl Tamra DNA merdiveni (kırmızı renkte) ve 6.5 µl HiDi formamide ile karıştırıp 95 C de 3 dk denature edip hemen buza koyduk. Primerler dolayısıyla PZR çoğaltma işlemi ürünleri ya sarı ya mavi ya da yeşil renk ile işaretlidir. Bu durumda kırmızı renkli DNA merdiveni her seferinde PZR sonuçlarının karışımından analiz için aldığımız küçük miktar ile karıştırılabilir. Her seferinde hem PZR ürünleri hem de DNA merdiveni birlikte yürüyeceği için, PZR çoğaltma işlemi ile elde edilen DNA bantlarının uzunlukları bu iç büyüklük standardı nedeniyle en doğru şekilde tayin edilmektedir. Agaroz veya poliakrilamit jellerde DNA siz mikrosatellit başka kuyuda yürüdüğünden jelin polimerleşmesinde oluşabilen farklılıklar nedeniyle bazen hızlı ya da daha yavaş gidebilmekte ve diğer kuyularda yürüyen PZR bantlarının uzunlukları hatalı hesaplanabilmektedir. ABI 310 cihazının 47 cm kapilerini ve mikrosatellit lokusu analizi için kullanılan POP4 polimerini cihaza yerleştirip 46 ve 47 numaralı DNA için 4 çift primer ile gerçekleştirilen PZR çoğaltma işleminin sonuçlarını içeren karışımı cihaza yükledik. Örnek başına cihazın okuma işlemi dk sürmektedir. Her iki örneğin de cihaz tarafından okuma işlemi bittikten sonra sonuçlar GeneMapper (ABI) ile kontrol edilmiştir. Öncelikle her iki örneğin de iç DNA büyüklük standartları kontrol edilmiş ve gerekli bilgiler cihaza girilmiştir. Daha sonra her iki DNA örneği için elde edilen alellerin uzunlukları, kendileri ile birlikte aynı anda kolondan geçen iç DNA büyüklük standardının bantları için yapılan kalibrasyon ile otomatik olarak belirlenmiştir. Sonuçlar Şekil 4 ve Şekil 5 te verilmiştir: 8

9 Şekil 4: 46 numaralı DNA örneğinin FCB20, FCB304, JMP29 ve JMP58 mikrosatellit lokusları için gerçekleştirilen PZR çoğaltma işleminin sonucunun ABI 310 cihazı ile görüntülenmesi. 46 numaralı örneğin ilgili mikrosatellit lokuslar açısından PZR çoğaltma işlemi ile elde edilen alel uzunlukları (iç DNA büyüklük standardına göre belirlenmiştir) şöyledir: FCB20 FCB304 JMP 29 JMP58 : 90 bp (homozigot) : 165 bp/177 bp : 137 bp (homozigot) : 140 bp/158 bp Şekil 5: 47 numaralı DNA örneğinin FCB20, FCB304, JMP29 ve JMP58 mikrosatellit lokusları için gerçekleştirilen PZR çoğaltma işleminin sonucunun ABI 310 cihazı ile görüntülenmesi. 47 numaralı örneğin ilgili mikrosatellit lokuslar açısından PZR çoğaltma işlemi ile elde edilen alel uzunlukları (iç DNA büyüklük standardına göre belirlenmiştir) şöyledir: FCB20 FCB304 JMP 29 JMP58 : 88 bp/90 bp : 161 bp/189 bp : 114 bp/126 bp : 158 bp/168 bp 9

10 b) mtdna Dizi Analizi İçin: Mitokondriyal DNA analizinde, mikrosatellit lokusları için PZR çoğaltması yapmak üzere konsantrasyonları kontrol edilen 7 DNA örneği (3, 14, 46, 47, 48, 57 ve 65) ile beraber negatif kontrol amaçlı (kontaminasyon olup olmadığını görmek için) su kullanılmıştır. Tablo 4 ve Tablo 5 te yükseltgenme reaksiyon içeriği ve koşulları verilmiştir. Tablo 4. mtdna yükseltgeme reaksiyonu karışımının içeriği. PZR mix içindeki konsantrasyon Tek örnek için (µl) PZR master mix (x9) dh 2 O X PZR Buffer 1X mm MgCl 2 3mM BSA (50 mg/ml) 0.05 µg/µl mm dntp mix 200µM mm Primer mix 10 pmol DNA ~150 ng Taq polimeraz 0.5 units Toplam mtdna PZR çoğaltma işlemimizde mikrosatellit lokuslarımızın aksine, 7 çift değil bir çift primerimiz olduğu için master mixin içine primerimizi de koyduk. Her bir DNA nın konsantrasyonunu aşağı yukarı bildiğimiz için hepsinden 3 µl koymadık (vaktimiz olsaydı DNA ların konsantrasyonları yukarıda anlatıldığı gibi eşitlenir, hepsinden aynı hacimde konurdu, ancak vakit olmadığından pipetle farklı hacimlerde DNA çekilerek yaklaşık olarak aynı DNA miktarı konmaya çalışıldı), mesela 3 nolu örnekten 0.8 µl; 4 numaralı örnekten 1.2 µl; 46 ve 47 numaralı örneklerden 3er µl; 48, 57 ve 65 numaralı örneklerden de 2şer µl koyup eksik olanları su ile 3 µl ye (toplam DNA hacmini tablodaki hesaplamalarda 3 µl olarak belirlediğimiz için) tamamladık. Böylece PZR çoğaltması için her örnekten aşağı yukarı benzer miktarda DNA alınmış oldu. Master mixten de 22 µl bunun üzerine ekleyip (yani toplam PZR reaksiyonu hacmi 25 µl oldu) tüpleri PZR cihazına yerleştirdik. İşlemler buzun üzerinde gerçekleştirildi. Mikrosatellit DNA PZRişleminden farklı olarak reaksiyon karışımına BSA koyduk; çünkü daha önce denediğimizde BSA lı PZR sonuçlarının BSA sızlara göre daha iyi olduğunu tespit etmiştik Tablo 5. mtdna yükseltgeme koşulları. Aşamalar Sıcaklık Süre Denaturasyon 94 ºC 3 dakika Denaturasyon 94 ºC 20 saniye Yapışma (Annealing) 60 ºC 20 saniye Uzatma (Extension) 72 ºC 1 dakika 15 saniye Son Uzatma (Final Extension) 72 ºC 15 dakika 30 döngü PZR işlemi bittikten sonra örnekler önce 2% agaroz jelde kontrol edildi (Şekil 6). PZR çoğaltma ürünlerinden 4 µl örnek 2 µl loading buffer ve 6 µl su ile karıştırılarak jel yüklendi. 100 voltta 90 dk yürütüldü. 10

11 Şekil 6. mt DNA için %2 lik agaroz jel. Soldan sağa sırasıyla:50 bp DNA mikrosatellit, 3, 14, 46, 47, negatif kontrol, 48, 57, 65. Eğitim çalıştayından sonra laboratuvarımızda mtdna kontrol bölgesi için gerçekleştirdiğimiz PZR işleminde iki DNA örneği kullanılmış (3 ve 14 numaralı) ve optimizasyon amaçlı farklı parametreler test edilmiştir: (i) 2 farklı bağlanma sıcaklığı (annealing temperature), (ii) 3 farklı primer konsantrayonu ve (iii) PZR karışımını BSA lı ve BSA sız hazırlamak. 1% agaroz jelde kontrol edilen sonuçlar Şekil 7 de verilmiştir. Şekil 7. 3ve 14 numaralı DNA örnekleri ile yapılan optimizasyon çalışması sonucu. Üst sırada 60 C bağlanma sıcaklığının test edildiği sonuçlar verilmiştir. Soldan sağa: ilk 4 örnek için (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 3 pmol primer kullanılmıştır; ikinci 4 örnek için (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 5 pmol ve üçüncü 4 örnek için de (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 10 pmol primer kullanılmıştır. Alt sırada 57 C bağlanma sıcaklığının test edildiği sonuçlar verilmiştir. Soldan sağa: ilk 4 örnek için (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 3 pmol primer kullanılmıştır; ikinci 4 örnek için (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 5 pmol ve üçüncü 4 örnek için de yine (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 10 pmol primer kullanılmıştır. Elde edilen bu sonuçlara göre 10 pmol primer miktarı PZR işleminin sonucunu olumsuz etkilemiştir. Her iki bağlanma sıcaklığında da (annealing temperature) 3 pmol ve 5 pmol primer miktarı aynı yoğunlukta PZR ürünü vermiştir. PZR karışımında BSA olması özellikle 60 C bağlanma sıcaklığında belirgin bir fark yaratmıştır; BSA ile elde edilen PZR bantlarının kalınlığı (yani PZR ürünlerinin konsantrasyonu) BSAsız elde edilen ürünün bant kalınlığının 11

12 iki katı kadardır. 57 C bağlanma sıcaklığında da BSA ile elde edilen PZR ürünleri BSAsız elde edilenlere kıyasla biraz daha yoğundur, ancak bu sıcaklıkta BSAsız elde edilen PZR ürünlerinin konsantrasyonu da şekilde de görüldüğü gibi oldukça iyidir. Elde edilen bu sonuçlara göre bağlanma sıcaklığı 57 C ve primer miktarı ise 3 pmol olmalıdır. BSA kullanmak sonucu olumlu etkilediği için kullanılabilir. 3 pmol ve 5 pmol primer miktarı kullanımı benzer sonuçlar verdiği için istenilirse (minimum miktarlar kullanmak adına) 1 pmol ve 2 pmol primer miktarı da test edilebilir. Elde edilen PZR ürünü miktarı değişmiyorsa, PZR karışımında daha az primer kullanılabilir. DNA dizileme işlemi için kullanılacak DNA örneğinin temiz olması önemli olduğu için PZR çoğaltma işlemi ürünlerinin dizileme PZR işlemine tabi tutulmadan önce temizlenmesi gerekmektedir. Bunun için örnek olarak seçilen 46 ve 47 numaralı örnekler Q Biogene marka GeneClean Turbo for PZR kiti ile, kitin kullanım önerilerine göre temizlendi. Her kitin kendi solusyonları ve kendi kullanım önerisi vardır. Seçilen kitin kullanım klavuzu okunmalıdır. Qiagen ve Hybaid kitleri de kullanılabilir. Dizileme PZR işlemi tek yönlüdür; Her bir reaksiyon ya forward ya da reverse primer içerir. Dizileme işlemi için kullanılan yöntem Sanger in dizi sonlandırma (chain termination) yöntemidir. ABI firması tarafından cihazın özelliklerine uygun olarak üretilen Big Dye Terminator DNA sequencing v3.1 kiti kullanılmıştır. Her ne kadar kitin kullanım önerileri başlangıçta dikkate alınsa da buradan yola çıkılarak optimizasyon yapılabilir ve enzim daha az kullanılarak da sonuç elde edilebilir. Temizlenmiş mtdna bölgesine Tablo 6 ve Tablo 7 de gösterilmiş olan PZR reaksiyon içerikleri ve yükseltgenme koşulları uygulanmıştır. Tablo 6. Dizi PZR si reaksiyon içeriği. Tek Örnek PZR Mix (4x) İçin (µl) Big Dye v X Sequencing Buffer Primer (F ya da R) Temizlenmiş mtdna PZR ürünü dh 2 O Toplam 12 - Tablo 7. Dizi PZR si yükseltgeme koşulları. Aşamalar Sıcaklık Süre Denaturasyon 96º C 1 dakika Denaturasyon 96ºC 10 saniye Yapışma (Annealing) 50ºC 5 saniye 25 döngü Uzatma (Extension) 60ºC 4 dakika Bekletme (Hold) 4ºC Dizileme PZR işlemi bittikten sonra ürünlerin, oluşan DNA dizilerine bağlanmamış, florasan işaretle işaretlenmiş fazlalık ddntplerden ve PZR karışımı içinde yer alan diğer kimyasallardan temizlenmesi gerekmektedir. Aksi takdirde DNA analiz cihazının okuma 12

13 sonuçları sağlıklı olmayabilir. Bunun için EtOH çöktürmesi yapılabilir veya kit kullanılabilir. Literatürde bir çok protokol mevcuttur. Uyguladığımız EtOH çöktürmesi protokolü: PZR ürünlerine 2µl 3 M NaAc ve 50 µl %96 lık EtOH eklendi ve soğukta yarım saat bekletildi. 30 dakika, 5000 rpm ve 12 ºC de santrifuj yapıldı. Santrifuj sonunda tüpler ters çevrilip sallanarak içindekiler boşaltıldı ve havlu kağıt üzerinde ters olarak bir süre bekletildi. Pelet tüpe yapıştığı için tüpü ters çevirdiğimizde PZR ürünleri kaybolmamaktadır. Daha sonra tüplere 75 µl %70 lik EtOH eklendi. Yine 5000 rpm de ve 12 ºC de 10 dakika santrifuj edildi. Santrifuj sonunda tüpler ters çevrilip sallanarak içindekiler boşaltıldı ve havlu kağıt üzerinde ters olarak kuruyana kadar bekletildi. (Eğer rpm e çıkan mikroplate rotoru olan bir santrifuj cihazımız varsa mikroplate ler ile bu işlemi gerçekleştirebiliriz. Özellikle çok sayıda örnek ile uğraşıyorsak büyük kolaylık olacaktır. Bu durumda ters çevirip kurumasını beklemek yerine havlu kağıt koyduğumuz rotorun üzerine mikroplate i ters çevirip 700 rpm de 3-5 sn çevirirsek kuruyacaktır). Tüpler kurutulduktan sonra 10 µl HiDi formamide eklenip, hafifçe vortexlenip ABI otomatik sekans cihazına yüklendi. Her bir reaksiyon sonucu 61 cm kapilerde POP6 polimeriyle 3 saat yürütülerek sonuçlar cihaz tarafından otomatik olarak bilgisayara kaydedildi. Sequence Analyis (ABI) programi ile kromatogramlar görüntülendi. Dizileme işlemi başarılı olmamıştı. Bunun farklı sebepleri olabilir ama elimizdeki kitteki mevcut enzim oldukça eski olduğundan sebebinin bu olması kuvvetle muhtemel. Dizileme işleminin gerçekleşmemesinin sebepleri için iç kontroller kullanılabilir: (i) Standart DNA ve buna ait standart primer her dizileme PZR işlemi sırasında mutlaka konulmalıdır. (ii) Ayrıca bir de dizileme PZR işlemi gerçekleştirilmiş, temizlenmiş ve yüklemeye hazır standart da satılmaktadır. Bunun da her defasında örneklerle beraber yürütülmesinde fayda vardır. Eğer bu standart DNA nın dizileme PZR işlemi gerçekleşir ama sizin DNAlarınızın dizileme işlemi gerçekleşmezse, o zaman ya DNA nız ya da primeriniz problemlidir. Eğer hem standart DNA nın hem de sizin örneklerinizin dizileme PZR sonuçları çıkmadıysa ama dizisi hazır yapılmış standart cihaz tarafından güzelce okunduysa o zaman enzimde bir sorun vardır. Eğer hem standart DNA nın hem de sizin örneklerinizin dizileme PZR sonuçları çıkmadıysa ve ayrıca dizisi hazır yapılmış standart cihaz tarafından okunmadıysa o zaman cihazın lazerinde bir sorun vardır. 13

14 EK 1: Katılımcı Listesi İsim Aylin Özdemir Bengi Çınar Burcu Cingöz Emel Özkan Eren Yüncü Evren Koban Hande Acar Havva Dinç Koray Balcıoğlu Orhan Karaca Özgecan Korkmaz Ali Reha Ağaoğlu Seda Doğanlar Yalçın Yaman Yusuf Özşensoy Kurumu TÜBİTAK MAM ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., GENETİK A.B.D. ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., GENETİK A.B.D. NAMIK KEMAL UNİV., ZİRAAT FAK., ZOOTEKNİ A.B.D. ODTÜ, BİYOLOJİ BÖLÜMÜ ODTÜ, MERKEZİ LABORATUVAR ODTÜ, BİYOLOJİ BÖLÜMÜ ODTÜ, BİYOLOJİ BÖLÜMÜ TÜBİTAK MAM TAGEM, BALIKESİR ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., GENETİK A.B.D. ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., JİNEKOLOJİ ve DOĞUM A.B.D. SELÇUK ÜNİV., VETERİNER FAK., BİYOKİMYA A.B.D. TAGEM, BALIKESİR SELÇUK ÜNİV., VETERİNER FAK., BİYOKİMYA A.B.D. 14

15 EK 2: DNA İzolasyon İşlemi Laboratuvarımızda kullanılan, bazı küçük değişikliklerle uyguladığımız standart fenol:kloroform DNA izolasyonu metodu (Sambrook et al., 1989) şöyledir: 10 ml kan 0.5 ml EDTA (0.5 M; ph 8.0) içeren falkon tüpe konur ve 2X lysis buffer (10X Lysis solusyonu: 770 mm NH 4 Cl, 46 mm KHCO 3, 10mM EDTA) ile 50 ml ye tamamlanır. 10 dk boyunca tüpler alt üst edilerek iyice karıştırılır ve 30 dk buzun içinde bekletilir. Daha sonra tüpler 10 dakika santrifüj edilir (3000 rpm, +4 C). Supernatant fazı atılır ve pelete 3 ml salt/edta (75mM NaCl, 25 mm EDTA) eklenerek vortexlenir. 0.3 ml %10 SDS solusyonu ve 150 µl proteinase K (10 mg/ml) eklenerek örnekler 55 C de 3 saat etüvde bekletilir. Bekleme süresi bittiğinde 3 ml of fenol (ph 8.0) eklenir. Tüpler 20 sn oldukça sert bir şekilde çalkalanır, sonra yumuşak bir şekilde 5 dk boyunca ters yüz edilir. Daha sonra tüpler 10 dakika santrifüj edilir (3000 rpm, +4 C). Supernatant fazı temiz ve uygun şekilde etiketlenmiş yeni steril tüpe transfer edilir. Üzerine 3 ml fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) eklenir. Tüpler 20 sn oldukça sert bir şekilde çalkalanır, sonra yumuşak bir şekilde 5 dk boyunca ters yüz edilir. Daha sonra tüpler 10 dakika santrifüj edilir (3000 rpm, +4 C). Supernatant fazı steril ve uygun şekilde etiketlenmiş cam tüpe aktarılır. Üzerine 2 katı kadar 20 C de soğutulmuş etanol eklenir. Cam tüpler sert bir şekilde sallanır ve yoğunlaşarak çöken DNA cam çubuk ile alınarak 0.5 ml TE buffer (10mM Tris, 1mM EDTA PH 7.5) içeren 1.5 ml eppendorf tüpe aktarılır. Eğer DNA yeterince yoğunlaşıp çökmedi ise santrifüj işlemi ile çöktürülebilir. DNA hemen kullanılacaksa +4 C de, saklanak ise -20 C de muhafaza edilir. 15

16 EK 3: EtBr deaktivasyonu için önerilen metodlar: 1- Armour method This is the simplest method, but is somewhat controversial. One study found traces of mutagenic reaction mixtures using this method. (Lunn, G. and E. Sansone, Analytical Biochemistry, vol. 162, pp , 1987) Combine equal amounts of ethidium bromide solution and household bleach. Stir constantly for four hours or let sit for 2-3 days. Adjust ph to 4-9 with sodium hydroxide. Pour down drain with copious amounts of water. Lunn and Sansone method For each 100 ml of ethidium bromide solution: Add 5% hypophosphorus acid. Add 12 ml of 0.5 M sodium nitrate. Stir briefly and let stand for 20 hours. Adjust ph to 4-9 using sodium hydroxide. Pour down drain with copious amounts of water. 2- Quillardet and Hoffnung method This method uses 0.5 M potassium permanganate and 2.5 M hydrochloric acid. Since chlorine gas may be released in significant concentration, EHS does not recommend using this method. 3- Charcoal filtration Filtering the aqueous ethidium bromide waste solutions, free of other contaminants, through a bed of activated charcoal is a relatively simple and effective method for removal of ethidium bromide. Schleicher and Schuell ( or supply commercial filter funnel kits that use packaged charcoal disks that are graduated for easily tracking the amount of aqueous solution calculated for a fixed quantities of ethidium bromide residue. Filter the ethidium bromide solution through charcoal filter. Pour filtrate down the drain. Place charcoal filter in a sealed bag (e.g., Zip-loc) and place in biohazardous waste box for incineration. 16