Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. İsa GÖKÇE 2008 Her hakkı saklıdır

Ebat: px
Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. İsa GÖKÇE 2008 Her hakkı saklıdır"

Transkript

1 T.C. GAZİSMAPAŞA ÜİVERSİTESİ FE BİLİMLERİ ESTİTÜSÜ PCR EACER LARAK YEİ KİMYASALLARI KULLAABİLİRLİĞİİ ARAŞTIRILMASI Sema BİLGİ Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. İsa GÖKÇE 2008 er hakkı saklıdır

2 T.C. GAZİSMAPAŞA ÜİVERSİTESİ FE BİLİMLERİ ESTİTÜSÜ KİMYA AABİLİM DALI YÜKSEK LİSAS TEZİ PCR EACER LARAK YEİ KİMYASALLARI KULLAABİLİRLİĞİİ ARAŞTIRILMASI Sema BİLGİ TKAT 2008 er hakkı saklıdır

3 Doç. Dr. İsa GÖKÇE danışmanlığında, Sema BİLGİ tarafından hazırlanan bu çalışma 13/08/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalı nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan: Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ İmza: Üye : Doç. Dr. İsa GÖKÇE İmza: Üye : Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ İmza: Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü

4 TEZ BEYAI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Sema BİLGİ

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi PCR EACER LARAK YEİ KİMYASALLARI KULLAABİLİRLİĞİİ ARAŞTIRILMASI Sema BİLGİ Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. İsa GÖKÇE Moleküler biyoloji alanında önemli yer tutan ve bir in vitro DA parçaları çoğaltma metodu olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) geniş uygulama alanına sahip bir tekniktir. PCR, DA nın istenilen bir parçasını çoğaltmada duyarlı, seçici ve son derece hızlı bir yol sağlayan çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen genelde düşük verim ve spesifite problemleriyle sıkça karşılaşılır. Böyle problemli PCR reaksiyonlarının optimizasyonu için yaygın bir yaklaşım, reaksiyon karışımına bazı kimyasalların küçük miktarlarının ilavesidir. Yapılan bu çalışmayla, PCR ın verimini ve spesifitesini artırmada etkili olan PCR enhancerlarından oluşan bir enhancer kombinasyonu oluşturularak bu kombinasyonun değişik parametrelerde nasıl etkinlik gösterdiği, hangi şartlarda etkin bir PCR enhancer olarak kullanılabileceği ortaya konulmaya çalışıldı. Yapılan bu çalışmayla, son yıllarda genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan tekniklerden olan PCR ın verimini ve spesifitesini arttırmayla, moleküler biyolojik teşhise yönelik amaçlar için ticari enhancerlara alternatif daha ekonomik enhancer kombinasyonlarının oluşturulması hedeflendi. 2008, 75 sayfa Anahtar kelimeler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), Enhancer, Plazmit DA i

6 ABSTRACT Master Thesis IVESTIGATI F EW CEMICALS AS EACERS F PCR Sema BİLGİ Gaziosmanpaşa University Graduate School of atural and Applied Sciences Department of Cemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. İsa GÖKÇE The polymerase chain reaction (PCR) is an in vitro DA fragment amplification method that has an important place in molecular biology and it is highly versatile process. PCR is an effective, very fast and selective method for required DA fragment amplification but usually it encounters with low yield and specificity problems. The most common way of optimisation of these PCR reactions is to add very little amount of some chemicals into the reaction mix. In this work, effective enhancer combinations formed for increasing yield and specificity of PCR and it has been tried to reveal to fact that how efficient these combinations in different parameters and in what conditions they can be used as an effective PCR enhancer. In this study it is aimed to achieve to obtain alternative economic enhancer combinations for molecular biologic diagnosis by increasing yield and specificity of PCR that recently become one of the most commonly used technique in genetics and molecular biology. 2008, 75 pages Anahtar Kelimeler: Polimerase chain reaction (PCR), Enhancer, Plasmid DA ii

7 TEŞEKKÜR Öncelikle her zaman her konuda yanımda olan bana güç veren sevgili aileme ve çalışmam süresince bilgi ve tecrübesiyle bana rehberlik eden saygıdeğer hocam Doç. Dr. İsa GÖKÇE ye, deneysel çalışmalarım süresince laboratuarlarını bana açan sayın Doç. Dr. Şaban Tekin ve grubuna, Sayın Yrd. Doç. Dr. İskender Parmaksız a, manevi desteklerinden dolayı tüm çalışma arkadaşlarıma, lisansüstü eğitimim süresince 2210-Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı çerçevesinde verdiği bursla gerek bilimsel aktivitelere katılarak gerekse zengin bir kütüphane oluşturarak kendimi yetiştirmeme maddi katkılarından dolayı TÜBİTAK a sonsuz teşekkürler. iii

8 İÇİDEKİLER Sayfa ÖZET..i ABSTRACT..ii TEŞEKKÜR.iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİİ...vi ŞEKİLLER DİZİİ viii TABLLAR DİZİİ ix 1. GİRİŞ 1 2. KURAMSAL TEMELLER Deoksiribonükleik Asit Yapısı Ve Özellikleri Pürin ve Pirimidin Bazları ükleositler ükleotidler ükleik Asitler (DA) DA Çift Sarmal Yapıdadır ükleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu DA nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Çoğaltılması Polimeraz Zincir Reaksiyonunun luşum Mekanizması PCR nın Temel Bileşenleri Kalıp DA Polimerazlar Primerler dtp Tamponlar ve MgCl PCR Engelleyicileri (İnhibitörleri) ve Artırıcıları PCR nin İşleyişi PCR Ürünlerinin Belirlenmesi Ve Analizi PCR ptimizasyonu ve PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması Magnezyum İyonları Taq DA polimeraz konsantrasyonu Sıcaklıklar.23 iv

9 Touchdown PCR ot start PCR ested PCR Sillüs sayısı ve uzunluğu PCR katkı maddeleri MATERYAL ve YÖTEM Materyal Kullanılan Malzemeler ve Kimyasal Maddeler Cihazlar Tampon ve Çözeltilerin azırlanışı ,5 M EDTA Çözeltisi X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu Etidium Bromür X Bromophenol Blue FSB LB ve LB Agar Primerlerin azırlanışı mm lık dtp Mixin azırlanışı Kalıp DA nın azırlanışı Enhancer Çözeltilerinin azırlanışı Yöntem ücre kültürü ve Transformasyon Kalıp DA nın üretimi ve izolasyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonları Thermal Cycler ın Program Ayarı Agaroz Jel Elektroforezi BULGULAR ve TARTIŞMA SUÇ...70 KAYAKLAR...73 ÖZGEÇMİŞ...74 v

10 Simgeler g L M o o C s SİMGE ve KISALTMALAR DİZİİ Açıklamalar Gram Litre Molar Derece Santigrat Derece Saniye Kısaltmalar Açıklama µl Mikrolitre µm Mikromolar A Adenin AIDS Kazanılmış immün yetmezlik sendromu AP-PCR Arbitrarily Primed PCR Ark. Arkadaşları AT Adenin timin bç Baz Çifti BSA Bovine (sığır) serum albümin C Sitozin C-2 İkinci karbon cda Komplamenter DA datp Deoksiadenozin trifosfat dctp Deoksisitidin trifosfat dd 2 Deiyonize destile su (ultra saf su) dgtp Deoksiguanozin trifosfat dk Dakika DMS Dimetilsülfoksit DA Deoksiribonükleik Asit dtp Deoksiribonükleosid Trifosfat dsda Çift zincirli DA DTT Ditiotrietol dttp Deoksitimidin trifosfat E.coli Escherichia coli vi

11 EDTA G GC kb ma mg MgCl 2 ml mm mm nm nmol D 260 PAGE PCR Pfu pmol RAPD RA Rase rpm RT-PCR SDS ssda T TAE TE Tm TMAC UV v/v w/v Etilendiamintetraasetik Asit Guanin Guanin Sitozin Kilobaz Miliamper Miligram Magnezyum klorür Mililitre Milimetre Milimolar anometre anomol 260 nm deki optik dansite Poliakrilamid jel elektroforezi Polimeraz Zincir Reaksiyonu Pyroccoccus furiosus Pikomol Random Amplified Polymorphic DA Ribonükleik Asit Ribonükleaz Rotation Per Minute Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu Sodyum dodesil sülfat Tek zincirli DA Timin Tris-Asetat EDTA Tris-EDTA Erime sıcaklığı (melting temperature) Tetrametilamonyum klorid Ultraviyole acim/hacim Ağırlık/hacim vii

12 ŞEKİLLER DİZİİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Pürin ve pirimidin bazlarının kimyasal yapısı 3 Şekil 2.2. ükleositlerin kimyasal yapısı 4 Şekil ükleotitlerin kimyasal yapısı...5 Şekil 2.4. DA nın kimyasal yapısı...6 Şekil 2.5. DA nın yapısı...7 Şekil 2.6. PCR ın oluşum mekanizması 10 Şekil 2.7. PCR sıcaklık döngüleri:1.aşama:denatürasyon; 2.aşama:primerin bağlanması; 3.aşama:sentez..19 Şekil 2.8. Q solutionın polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri 29 Şekil 4.1. Test edilen compatible solutelerin kimyasal yapıları 46 Şekil 4.2. Test edilen düşük moleküler ağırlıklı amitlerin kimyasal yapıları...48 Şekil 4.3. Test edilen düşük moleküler ağırlıklı sülfonların kimyasal yapıları 51 Şekil 4.4. Test edilen sülfoksitlerin kimyasal yapıları..53 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jelelektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü 59 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü...60 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü 61 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü...62 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü...63 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü..65 Şekil C lik annealing sıcaklığında kalıp olarak plazmit DA saflaştırılmaksızın doğrudan e.coli kullanılarak gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü.66 Şekil Çalışmamızda test edilen enhancerların kimyasal yapıları...68 viii

13 TABLLAR DİZİİ Tablo Sayfa Tablo 2.1. Termostabil DA polimerazlar ve kaynakları...13 Tablo 2.2. PCR da sıklıkla kullanılan DA polimerazların özellikleri..13 Tablo 2.3. PCR artırıcıları..18 Tablo 2.4. PCR optimizasyonunda önemli değişkenler.21 Tablo 3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonlarında kullanılan enhancer konsantrasyonları ve hacimleri..39 Tablo 3.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonlarında kullanılan enhancer kombinasyonlarının bileşenleri..40 ix

14 1. GİRİŞ Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), spesifik bir DA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), DA nın istenilen bir dizisini çoğaltmada duyarlı, seçici ve son derece hızlı bir yol sağlar. Moleküler biyoloji alanında önemli yer tutan ve bir in vitro nükleik asit çoğaltma metodu olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) geniş uygulama alanı olan bir tekniktir. PCR ın kullanım alanları, (1) orak hücre anemisi, AIDS, lösemi vb. birçok hastalığın DA ve RA temeline dayalı tanısı için klinik tıpta; (2) Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında; (3) Doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde; (4) Allelik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde; (5) Arkeolojik örnekler kullanılarak evrimin incelenmesi alanlarında; (6) Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında; (7) Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde; (7) Probe'ların oluşturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında; (8) DA dizi analizinde, büyük miktarda DA örneklerinin oluşturulmasında; (9) Tarımda tohum saflığının belirlenmesinde kullanılabilir. Kısacası, PCR, çok geniş kullanım alanı olan ve modern genetikte çok yönlü kullanılabilen tekniklerden biridir. PCR çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen, PCR ile DA amplifikasyonunda, özellikle hedef dizinin veya primerin GC muhtevası yüksek olduğunda düşük verim ve spesifite problemleriyle sıkça karşılaşılır ve bu durum ya PCR ürününün oluşmaması veya birden fazla fragmentin ortaya çıkmasına yol açar. Böyle reksiyonların optimizasyonu için yaygın bir yaklaşım, reaksiyon karışımına dimetilsülfoksit (DMS), betaine, polyethylene glycol ve formamit gibi belirli organik kimyasalların küçük miktarlarının ilavesidir. Betaine, dimetil sülfoksit gibi küçük sülfoksitler, formamit gibi küçük amidler ya da β-merkaptoetanol gibi indirgeyici bileşikler son yıllarda kullanılan en önemli PCR arttırıcı katkı maddeleri (enhancerlar) olmakla beraber yüksek işlem hacimli deneyler için yeterince etkin değillerdir. Q-solution gibi ticari enhancerlar yukarıda sözü edilen enhancerlara göre daha etkin sonuçlar verirler ancak maliyetlerinin

15 2 yüksek olması, kimyasal bileşimlerinin tam olarak bilinememesi gibi başlıca iki dezavantaja sahiptirler (Ralser ve ark., 2006). Bu çalışmada, GC ce zengin kalıpların ya da problemli PCR ürünlerinin amplifikasyonunun optimizasyonunda etkili olan PCR arttırıcı bileşiklerin (enhancerların) değişik parametrelerde nasıl etkinlik gösterdiği, hangi şartlarda etkin bir PCR enhancer olarak kullanılabileceği ortaya konulmaya çalışıldı. Bu kapsamda, projemizde yapılan çalışmalar ile önce, literatür çalışması yapılarak enhancer olma (PCR da amplifikasyonu etkili bir şekilde artırabilme) potansiyeline sahip olan kimyasal maddeler belirlendi ve bunlar içinden amacımıza uygun olanlar seçildikten sonra standart PCR reaksiyonları için optimum şartlarda bu kimyasalların çeşitli kombinasyonlarının enhancer olarak kullanılabilirliği araştırıldı. Çalışmamız son yıllarda genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan tekniklerden olan PCR ın verimini ve spesifitesini arttırmaya yönelik çalışmalara katkıda bulunacak olması ayrıca Q-çözeltisi (Q-solution) gibi ticari enhancerlara alternatif olarak kullanılabilecek daha ekonomik enhancerların tespit edilmesi yönüyle önem taşımaktadır.

16 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1. Deoksiribonükleik Asit Yapısı ve Özellikleri Pürin ve Pirimidin Bazları DA da başlıca iki sınıf baz vardır: Pürin ve pirimidin bazları. Bütün bazlar pürin ve primidin türevleridir. Pürin ve pirimidin bazlarının her ikisi de aromatik karakterdedir. Pürin, bir pirimidin ve ona bitişik bir imidazol halkasından oluştuğundan pirimidin türevi olarak da düşünülebilir. ükleotitlerde en çok bulunan azotlu bazlar; urasil, timin ve sitozin pirimidinleri ile adenin ve guanin pürinleridir (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). 2 2 Adenin Guanin 2 Sitosin Timin Urasil Şekil 2.1. Pürin ve pirimidin bazlarının kimyasal yapısı

17 ükleositler Pürin ve pirimidin bazlarının, bir 2-deoksi-D-riboza bağlanmasıyla nükleositler oluşur. Bir nükleositte pentozun anomerik 1 no lu karbonu, primidinin 1 no lu, pürinin ise 9 nolu azotuna -glikozid bağı ile bağlanmıştır (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). Başlıca deoksiribonükleositler deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksitimidin ve deoksisitidindir. 2 2 Deoksiadenozin Deoksiguanozin 2 Deoksisitidin Deoksitimidin Şekil 2.2. ükleositlerin kimyasal yapısı

18 ükleotidler ükleotidler, nükleositlerin fosfat esterleridir. Biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DA da bulunan esterleşme 5 nolu karbon atomu üzerindedir. Böyle bir bileşik 5 - nükleotid olarak gösterilir. Üstlü sayı pentoz şekerindeki bir karbon atomunu belirler. Üstsüz sayı ise, pürin ve pirimidin bazlarının halka atomlarından birisine işaret eder P - Deoksiadenilat - P - Deoksiguanilat 2 - P - P - - Deoksisitidilat Deoksitimidilat Şekil ükleotitlerin kimyasal yapısı

19 ükleik Asitler (DA) DA deoksiribonükleotitlerin kovalent bağlanmış zincirlerinden meydana gelmiştir. Zincirler, bir nükleotidin 5 hidroksil grubu ile bunu takip eden nükleotidin 3 -hidroksil grubu arasında fosfodiester köprüsü ile oluşturulur. ükleik asit zincirinde 5 ve 3 uçları bulunur. Bu zincirlerin baz dizlişleri verilirken 5 3 yönü kullanılır (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). P Baz C 2 P Baz C 2 P Baz C 2 DA Şekil 2.4. DA nın kimyasal yapısı

20 DA Çift Sarmal Yapıdadır Birbirini izleyen deoksiriboz ve fosfat gruplarının hidrofilik omurgası dış yüzeyde olup, yapıyı çevreleyen suyla ilişkidedir. er bir deoksiribozun furanoz halkası, C-2 iç taraf yapısındadır. er bir iplikçiğin pürin ve pirimidin bazları çift sarmalın iç tarafına yığılmıştır. Ayrıca hemen hemen düzlemsel ve hidrofobik olan halkasal yapılar birbirine çok yakın ve uzun eksene dik pozisyondadır (elson ve Cox, 2005). DA ikili sarmalı, nonpolar iç bölgedeki baz çiftlerinin etkileşimi sonucu oluşan hidrofobik ilişkilerle stabilize edilir. idrojen bağları, doğru baz çiftleşmesinin oluşumunun yanında DA kararlılığına da katkıda bulunurlar. Stabilizasyonda ayrıca katyonik ilişkiler ve bazlar arasında van der Waals etkileşimleri de önemlidirler. DA stabilitesi, sahip olduğu GC baz miktarından etkilenir. GC baz eşleşmesi, AT eşleşmelerinden farklı olarak iki yerine üç hidrojen bağı ile gerçekleştirildiğinden GC bakımından zengin bölgeler daha kararlıdır (Topçu, 2007). DA omurgasının fosfatları negatif yüklere sahip olduklarından birbirlerini iterler. Bu durum DA kararlılığını azaltıcı bir olgudur. Yüksek tuz konsantrasyonu bu etkiden kaynaklanan kararsızlığı azaltır. Etidyum bromid gibi hidrofobik, planar yapıdaki moleküller DA sarmalının merkezindeki baz çiftlerinin arasına girerek heliksin genişlemesine neden olurlar (Topçu, 2007). Şekil 2.5. DA nın yapısı 1. DA nın formülü 2. Çift zincirli DA

21 ükleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu İkili sarmal DA nın denatürasyonu sonucu -bağları kopar, çiftli yapı çözülür ve zincirler birbirinden ayrılır. Ancak, kovalent bağlar kırılmaz. Isı ya da kimyasal yolla uyarılabilen zincirlerin ayrılması sırasında DA nın akışkanlığı azalır, UV absorpsiyonu ve denge yoğunluğu artar. Isı sonucu oluşan denatürasyona bazen erime (melting) denir. Isıtılan DA çözeltisinin UV absorpsiyonundaki artış, hiperkromik kayma olarak adlandırılır ve ölçümü çok kolaydır (Klug ve Cummıngs, 2003). G C baz çifti, A=T ye göre bir fazla hidrojen bağı içeriğinden, ısıya karşı daha dayanıklıdır. Bu nedenle, A=T ye göre daha fazla G C çifti içeren DA ların tamamen denatüre olması için daha yüksek sıcaklıklar gereklidir. Eğer erime sırasında, DA nın 260 nm deki absorpsiyonu (D 260 ) izlenir ve sıcaklığa karşı grafiğe geçirilse, bir erime profili elde edilir. Bu profilin ya da eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir ve DA zincirinin %50 sinin açılmış ya da denatüre olduğu noktayı gösterir. Eğrinin platosu maksimum optik yoğunluğa (.D) ulaştığında, denatürasyon tamamlanmıştır ve ortamda sadece iki tek zincir bulunmaktadır (Klug ve Cummıngs, 2003). Isı ile denatüre edilen DA yavaşça soğutulursa, tamamlayıcı zincirler arasındaki rastgele çarpışmalar sonucu zincirler tekrar bir araya gelir. Uygun sıcaklıkta, zincirlerin ikili yapısını kazanmasını sağlayacak şekilde hidrojen bağları tekrar kurulur. Soğuma zamanıyla birlikte oluşan ikili sarmal sayısı artacaktır. Duruma göre, ikili sarmal oluşumu için bazlar arasında tam bir uygunluk gerekli değildir, ancak bir araya gelen zincirlerde, en azından yer yer baz eşleşmesinin olduğu bölgeler bulunmalıdır (Klug ve Cummıngs, 2003). 2.2.DA nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Çoğaltılması ücrelerde DA doğal olarak, replikasyon ile çoğalır. DA çift sarmalında birbirinden ayrılan ipliklerin tamamlayıcıları sentezlenerek bir DA molekülünden onunla aynı olan iki yavru molekül meydana gelir. Buna göre de hücre bölünmesiyle yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen geçerler. er yeni hücre jenerasyonunda genlerin kopya sayılarının iki katına çıkması nedeniyle jenerasyonlar boyunca DA miktarı başlangıca

22 9 göre üssel olarak artar. Örneğin 30 jenerasyon sonra hücre ve gen sayısında milyarlarca kez artış olur. In vitro koşullarda istenilen bir genin ya da özgün bir DA dizisinin çok sayıda kopyasının elde edilmesi için rekombinant DA yöntemleri ile DA klonlamasına ek olarak, 1980 li yıllardan itibaren Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) da kullanılmaya başlanmıştır (Temizkan ve Arda, 2004). PCR ilk kez Kaliforniya da Berkeley yakınlarında, Cetus Firmasında çalışan Kary Mullis tarafından 1985 yılında icat edilmiştir. İlk PCR da E.coli DA polimeraz I in Klenow fragmanı kullanılmıştır (Mullis,1990). Bu enzim, DA dupleksinin denatüre olduğu ısıya erişmeden denatüre olup aktivitesini kaybediyordu. Bu nedenle her döngüde reaksiyon ortamına ilave ediliyordu. Ayrıca, reaksiyon ortamı, işlemler için gerekli olan farklı ısılarda su banyoları arasında dolaştırılıyordu. Bu şekilde yapılan PCR reaksiyonu son derece zahmetliydi. Daha sonra iki önemli aşama kaydedildi: 1. Isıya dayanıklı bir DA polimeraz, Yellowstone Ulusal Parkındaki bir sıcak su kaynağından izole edilen Thermus aquaticus bakterisinden elde edildi. Bu bakteri 85 C nin üstündeki bir sıcaklıkta kendi DA sını replike etmekteydi. 2. tomatik ısı kontrollü, ısıyı çok süratle azaltıp, artırabilen cihazlar yapıldı (İşcan, 2003). PCR ile istenilen genlerin ya da DA dizilerinin jenerasyonlara bağlı replikasyonu, hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. Aynen doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30 jenerasyon sonra seçilmiş bir DA dizisinin aşağı yukarı milyar katını kopyalar (Temizkan ve Arda, 2004) Polimeraz Zincir Reaksiyonunun luşum Mekanizması Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler, kalıp DA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenirler. Primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfat (dtp) varlığında primerin 3 hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DA ipliğine tamamlayıcı olan yeni

23 10 DA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin bağlanması (annealing) ve primerlerin uzatılması (extension) olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Ardarda tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve primerlerin uzaması evreleriyle DA parçaları üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır (Temizkan ve Arda, 2004). PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu 3 aşamadan oluşan siklüs: 1.Aşama: denatürasyon 94 C de 1dakika 2.Aşama: primerlerin bağlanması 54 C de 45 saniye Sens ve Revers Primerler!!! 3.Aşama: primerlerin uzatılması 72 C de 2 dk yalnızca dtp ler Andy Vierstracte 1999 Şekil 2.6. PCR ın oluşum mekanizması

24 PCR nın Temel Bileşenleri PCR ın temel bileşenleri, kalıp olarak kullanılan DA molekülü, DA polimeraz enzimi, primerler, dtp karışımı, tampon ve MgCl 2 dür Kalıp DA PCR da genomik DA lar, plazmid ve faj DA ları, çeşitli genler ve hatta herhangi bir DA parçası kalıp olarak kullanılabilir. Bu kalıp DA molekülleri amaca göre cda, genom kitaplıkları halinde, ya araştırma laboratuarları ve kliniklerden ya da ticari olarak elde edilir (Temizkan ve Arda, 2004). Kalıp olarak kullanılacak DA temiz olmak zorunda değildir. Kurumuş kan veya semen gibi adli tıp örnekleri, tek bir saç teli, uzun süre saklanmış tıbbi örnekler, mumya kalıntıları ve fosil gibi değişik kaynaklardan, genomik DA elde edilebilir (İşcan, 2003). PCR de kalıp olarak tek ya da çift iplikli DA nın yanı sıra RA da kullanılabilir. Kalıp olarak RA kullanılacaksa total RA ya da poli (A) + RA dan önce klasik yolla cda elde edilir ya da Thermus thermophilus kaynaklı rekombinant Tth DA polimeraz enzimi kullanımıyla aynı tüpte RA dan DA ürününün elde edilmesi tek kademeli olarak yapılabilir. Eğer yüksek molekül ağırlıklı genomik DA kalıp olarak kullanılacaksa, DA kısmi kesim yapan otl ya da Sfil gibi restriksiyon enzimleriyle kesildikten sonra kullanılmalıdır. Genellikle kalıp DA da hedef dizinin konsantrasyonu bilinmediğinden, PCR nın pozitif kontrol DA ile optimizasyonu faydalıdır. ptimizasyon çalışmalarında normalde klonlanmış bir DA parçası için nanogram, genomik DA için ise mikrogram düzeyindeki miktarlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004). Eğer çoğaltılacak kalıp DA dizisi hakkında bilgi mevcut değilse, bu durumda gelişigüzel başlatılmış (Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR)) veya gelişigüzel çoğaltılmış polimorfik DA (Random Amplified Polymorphic DA (RAPD)) yöntemleri kullanılarak genomik parmak izleri çıkartılabilir (İşcan, 2003).

25 12 En iyi kalıplar, DA sentezini durdurabilen ya da nükelotit bazlarının yanlış birleşmesine neden olabilen çentikler, kırıklar ve kontamine edici proteinler içermeyen kalıplardır. Yüksek GC muhtevasına ve sekonder yapıya sahip kalıpların amplifikasyonunu optimize etmek oldukça zordur (Buckingham ve Flaws, 2007) Polimerazlar DA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz ederler. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5 uçtan 3 uca doğru olup, primerin serbest 3 hidroksil ucuna ortamdaki dtp lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır (Temizkan ve Arda, 2004). Termostabil (sıcaklığa dayanıklı) DA polimeraz enziminin PCR de kullanılmaya başlanması araştırma ve klinik laboratuarlarında rutin olarak yapılan deneylere teknolojik olarak büyük bir avantaj sağlamıştır. Önceleri kullanılan Escherichia coli nin DA polimeraz I enziminin Klenow fragmenti sıcaklığa dayanıklı olmadığı için, her PCR döngüsünde denatürasyon aşamasından sonra yeniden enzim ekleme zorunluluğu duyulmaktaydı. Ancak günümüzde kullanılan termostabil DA polimerazlarla bu sorun ortadan kalktığından enzimin amplifikasyonun başlangıcında tüplere konulması yeterli olmaktadır (Temizkan ve Arda, 2004).

26 13 Günümüzde PCR de yaygın bir şekilde kullanılan bazı termostabil DA polimerazların adları ve kaynakları Tablo 2.1 de, bu enzimlerin özellikleri Tablo 2.2 de verilmiştir. Tablo 2.1 Termostabil DA polimerazlar ve kaynakları DA polimeraz Doğal/Rekombinant Kaynak Taq Amplitaq Amplitaq (Stoffel fragment) ot Tub TM Pyrostase TM Vent TM Deep Vent TM Tth Pfu UITma TM Doğal Rekombinant Rekombinant Doğal Doğal Rekombinant Rekombinant Rekombinant Doğal Rekombinant Thermus aquaticus T. aquaticus T. aquaticus Thermus flavis T. flavis Thermococcus litoralis Pyrococcus GB-D Thermus thermophilus Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima Tablo 2.2. PCR da sıklıkla kullanılan DA polimerazların özellikleri Taq/ Stoffel Vent TM Pfu Tth Amplitaq fragment UITma TM Termostabilite > >50 * 95 C deki yarılanma ömrü (dakika) 5 3 ekzonükleaz var yok yok yok var Yok aktivitesi 3 5 ekzonükleaz yok yok var var yok Var aktivitesi Processivity * * * * * * * * Kalıbı uzatma oranı 75 >50 >80 60 >33 * * * (ükleotid/saniye) Revers transkriptaz zayıf zayıf * * * * * * var * * * aktivitesi luşan DA ucu 3 A 3 A >%95 * * * 3 A Küt küt *97,5 C de ölçülmüştür. * * Enzimin DA kalıbından ayrılmaksızın kalıba eklediği ortalama nükleotid sayısı. * * *Bilgi bulunmamaktadır.

27 Primerler Gen çoğaltılması dâhil PCR ın birçok uygulaması için kalıp DA ya tamamen tamamlayıcı olan primerlere gereksinim vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler nükleotid uzunluğundadır. ligonükleotid primerler, primer sentezi yapan laboratuarlardan ya da ticari olarak elde edilebilirler. Primer tasarımı yapılırken çoğaltılması istenen DA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere tamamlayıcı olan primerler tasarlanır. Primer tasarımı yapmak için bilgisayar programları da geliştirilmiş olmakla beraber, çoğu zaman araştırıcılar ilgilendikleri genleri ya da DA parçalarını çoğaltmak için kendileri primer tasarımı yapmak durumundadırlar. Tasarım yapılırken mümkün olduğunca dört bazın eşit sayıda kullanımına dikkat edilir. Primerin Tm değeri, amplifikasyon reaksiyonunun spesifitesi için kritik bir aşama olan optimal annealing sıcaklığının belirlenmesi için başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Dolayısıyla forward ve revers primerler benzer Tm değerine sahip olacak şekilde tasarlanmalıdır ki her ikisi de aynı annealing sıcaklığında optimal olarak hibridize olabilsin. Tm primerlerin uzunlukları arttırılarak ya da kalıp üzerinde daha çok ya da daha az G ve C lere sahip bölgelere yerleştirilerek ayarlanabilir (Buckingham ve Flaws,2007). Sonucu olumsuz etkileyici istenmeyen oluşumları en aza indirgemek için önem verilmesi gereken bazı noktalar: primerlerin polipürün, poliprimidin ya da tekrarlı bölgeler içermemesi, primer çiftlerinin 3 uçlarının birbirine ya da primer içindeki bir bölgeye tamamlayıcı olmaması (Temizkan ve Arda, 2004), primerin dimer oluşturmasını engellemek için 3 ucunda G ve C ler bulunmamasıdır (İşcan, 2003). Spesifik bir primerin 5 ucuna, genellikle primer annealinginin spesifitesini etkilemeyecek şekilde restriksiyon enzimi tarafından tanınacak bir diziden oluşan tail (kuyruk), bir capturing dizi ya da radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bir etiket (label) ilave edilebilir (Lisby, 1998).

28 dtp Deoksiribonükleozid trifosfatlar (datp,dgtp, dttp, dctp) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Taq DA polimeraz düşük dtp konsantrasyonlarında (10-100µM) kalıba uygun, doğru bazları seçmede daha başarılı olmakla birlikte, normal koşullarda PCR 100 µm dtp konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Ayrıca optimal dtp konsantrasyonu; (1) MgCl 2 konsantrasyonuna, (2) reaksiyon koşullarına, (3) primer konsantarsyonuna, (4) çoğaltılmış ürünün boyuna, (5) PCR döngü sayısına bağlıdır. Yapılacak PCR için en uygun dtp konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir (Temizkan ve Arda, 2004) Tamponlar ve MgCl 2 PCR tamponları enzim aktivitesi için optimal şartlar sağlar. KCl (20-100mM), amonyum sülfat (15-30 mm) ya da tek değerli katyonların diğer tuzları önemli tampon bileşenleridir. Bu tuzlar DA nın denatürasyon ve annealing sıcaklıklarını ve enzim aktivitesini etkiler. Tampon/tuz şartlarının etkisi farklı primerler ve kalıplar için değişiklik gösterir. PCR da kullanılan çeşitli tamponlar arasında en çok kullanılanı Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur. Diğer enzimler için de benzeri tamponlar bulunmakta ve bunlar çoğunlukla satın alınan enzimle birlikte 10 konsantrasyonda sağlanabilmektedir. Mg +2 iyonları dtp ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar, polimeraz aktivitesini uyarırlar ve çift iplikli DA nın Tm değerini artırırlar, ayrıca primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu nedenle MgCl 2 ün PCR ın özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCl 2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mm lık değerler tercih edilir. Düşük Mg +2 konsantrasyonu, enzim etkinliğini düşürerek ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg +2 konsantrasyonu ise yanlış birleşmeleri destekleyerek spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl 2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl 2 kullanımına gerek yoktur (Temizkan ve Arda, 2004) PCR Engelleyicileri (İnhibitörleri) ve Artırıcıları. PCR çeşitli maddeler ile engellenebildiği gibi aynı zamanda bu maddelerin kullanımıyla artırılabilir. Birçok faktör PCR nin engellenmesine yol açar, burada sadece

29 16 optimizasyon çalışmaları için sıklıkla kullanılanlardan söz edilecektir. Çeşitli tipteki maddelerin engelleme için tehlike oluşturması PCR de kullanılan biyolojik örneklerin çeşitliliğinden ve DA izolasyonunda kullanılan yöntem ve maddelerden kaynaklanmaktadır. Çok sayıda değişik biyolojik örnek (hayvan dokuları ve vücut sıvıları, bakteri örnekleri, adli ve arkeolojik materyaller) PCR de DA kaynağı olarak kullanılır. Örneğin insan DA sı, periferal kan hücrelerinden, idrardan, feçesden, hücre döküntülerinden, saç kökünden, semenden, serebrospinal sıvıdan, biyopsi materyallerinden, amniyon sıvısından, plasenta ve koriyonik villus gibi değişik biyolojik kaynaklardan izole edilir. Bu doğal kaynaklar çok çeşitli bilinmeyen engelleyicileri içerirler. Bu nedenle inhibisyonun olmadığına ilişkin olarak PCR kontrolleri yapılmalıdır. DA izolasyonu için en sık kullanılan materyallerden biri kandır. Kanın pıhtılaşmasını engellemek için EDTA lı ya da heparinli tüpler kullanılır. Ancak heparin PCR için potansiyel bir inhibitördür. Bunun dışında kanda bulunan porfirin gibi diğer maddeler de PCR için kuvvetli inhibitör etki gösterirler, bu nedenle DA izolasyonu sırasında lizis ve santrifüjleme aşamalarında uzaklaştırılırlar (Temizkan ve Arda, 2004). Biyolojik örneklerin çeşitliliği nedeniyle, bu farklı kaynaklardan DA izolasyonu yöntemleri de birbirlerinden oldukça farklıdır ve bu durum izolasyon işlemleri sırasında farklı inhibitörlerin uzaklaştırılmasını zorlaştırır. Farklı kaynaklardan da olsa DA izolasyonu işlemlerinde hücre parçalanması ve denatürasyon için deterjanlar kullanılır. DA izolasyonunda çoğunlukla kullanılan Triton X-100, Tween 20, onidet P40 gibi iyonik olmayan deterjanların %5 in altındaki konsantrasyonları genellikle PCR yi engellemezler. Diğer yandan sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi iyonik deterjanlar sadece son derece düşük konsantrasyonlarda kullanıldıklarında tolere edilebilirler. Bu nedenle PCR den önce fenol ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi ile uzaklaştırılmalıdırlar. Bu deterjanlar normal olarak PCR de tolere edilebildikleri konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonlarda kullanılırlar. Örneğin SDS %1-2 (w/v) konsantrasyonda kullanılır, ancak Taq DA polimeraz %0,01 (w/v) den yüksek konsantrasyonlarda inhibe olur. SDS in düşük konsantrasyonlarının inhibitör etkisi iyonik olmayan belli deterjanların (%0,5 Tween 20 ve onidet P40 gibi) kullanımıyla ortadan kaldırılabilir (Temizkan ve Arda, 2004; Gelfand, 1989).

30 17 Deterjanların kullanıldığı izolasyon işlemlerinin çoğu, denatürasyona uğramış proteinleri parçalayan proteinaz K nın varlığında gerçekleştirilir. Taq DA polimeraz, protein yıkımına duyarlı olduğundan proteinaz K uzaklaştırılmalı ya da inhibe edilmelidir. 95 C de termal denatürasyon bu inhibisyon için yeterlidir. Sıcaklık uygulamasını genellikle proteinaz K yı da denatüre edecek fenol ekstraksiyonu izler. Ardışık olarak uygulanan santrifüjleme DA nın sıvı fazda kalmasını sağlarken, proteazı da fenol fazına ayırır. Fenolün çok düşük miktarları bile PCR yi engelleyeceğinden, kalan fenol, kloroform: izoamil alkol (49:1) veya eter ekstraksiyonu ya da DA nın etanol ile çöktürülmesi ile uzaklaştırılabilir (Temizkan ve Arda, 2004). Birçok araştırıcı çeşitli maddelerin eklenmesinin PCR etkinliği ya da özgünlüğünü artırdığını belirlemişlerdir. Bu maddelerin etkilerini nasıl gösterdikleri tam olarak belirlenmemiş olmasına rağmen, konu ile ilgili çeşitli açıklamalar vardır. Örneğin, Bovine serum albumin ( µg/ml) inhibitörleri bağlar ve enzimi stabilize eder. Dithiothreitol (0.01 mm) enzim aktivitesini artırabilen indirgeyici şartlar sağlar. Reaksiyon karışımına ilave edilen formamit ( 1%-10%) yüksek sekonder yapıya sahip DA nın denatürasyon sıcaklığını düşürerek primerlerin bağlanma olasılığını artırır. 1%-10% luk konsantrasyonlarda ilave edilen dimetil sülfoksit, gliserol ve triton X-100 gibi kaotropik ajanlar (chaotropic agents) sekonder yapıları azaltabilir böylece zor bölgeler boyunca polimerazın zinciri uzatmasına imkan verir. Bu ajanlar bir de enzim stabilitesine katkıda bulunurlar (Buckingham ve Flaws, 2007). Bu arttırıcı maddelerin kullanımındaki en önemli güçlük, başarılı bir sonuç almak için hangi maddenin hangi tip PCR de kullanılacağının belirli olmamasıdır. Artırıcılar belirli bir konsantrasyonda kullanıldıklarında PCR ı olumlu olarak etkilerler, ama aynı koşullar bir başka PCR da aynı etkiyi göstermeyebilirler. Bu maddelerin bazıları Tablo 2.3 de verilmiştir. Bu PCR artırıcılarının (enhancerların) yüksek konsantrasyonlarının Taq DA polimerazı inhibe ettiği düşünüldüğünden optimum konsantrasyonları deneysel olarak belirlenmelidir (Temizkan ve Arda, 2004).

31 18 Tablo 2.3. PCR artırıcıları Madde Konsantrasyon Formamid %5 Dimetil sülfoksit (DMS) <%10 Tetrametilamonyum klorid (TMAC) µM Polietilen glikol 6000 (PEG) %5-15 Gliserol %10-15 Tween 20 % deaza-dgtp Kullanılacak toplam dgtp nin %75 i PCR nin İşleyişi Termostabil DA polimerazların ve farklı sıcaklık derecelerini istenilen süreler için otomatik olarak ayarlanabilen PCR aletlerinin (thermal cycler) kullanıma sunulması, PCR nin verimi ve kullanımında önemli gelişmelere yol açmıştır. Verimli bir PCR için; (1) denatürasyon, (2) primerlerin bağlanması, (3) primerlerin uzaması, (4) döngü sayısı, (5) PCR makinesinin sıcaklık iniş ve çıkış süreleri önemlidir (Temizkan ve Arda, 2004). Polimeraz zincir reaksiyonu mikrotüplerde gerçekleştirilir. Amaca göre farklı PCR tüpleri ve değişik sıcaklık dereceleri kullanılabilir. PCR de bir döngüyü oluşturan aşamaların sıcaklık değerleri ile süreleri Şekil 2.7 de verilmiştir. PCR çift zincirli DA ile başlar. İlk aşamada (denatürasyon aşamasında) çift zincirli DA replike edilebilmesi için iki tek zincire denatüre edilir. Bu kalıba bağlı olarak birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar C de örnek ısıtılarak gerçekleştirilir. Başlangıç denatürasyon aşaması genomik ya da diğer büyük DA kalıp fragmentleri için uzatılabilir. Sonraki denatürasyonlar daha kısa olabilir. Bir sonraki aşama PCR ın spesifitesi açısından çok büyük önem taşıyan annealing aşamasıdır. Annealing sıcaklığının primerler ve reaksiyon şartları ile optimize edilmesi önemlidir. Annealing sıcaklıkları C arasında olup genellikle deneysel olarak belirlenir. Başlangıç noktası primer dizilerinin Tm si kullanılarak belirlenebilir. Reaksiyon şartları, tuz konsantrasyonu, yanlış eşleşmeler, kalıp durumu ve sekonder yapı reaksiyondaki primerlerin gerçek Tm sini etkileyecektir. Primerlerin Tm değerinin hesaplanması için çeşitli formüller ve bilgisayar programları kullanılmaktadır.

32 19 Çoğu zaman hesaplanan Tm değerinin 3-5 C altındaki sıcaklıklar bağlanma sıcaklığı olarak seçilir ve daha sonra optimum sıcaklık değeri denenerek saptanır (Temizkan ve Arda, 2004). Primerlerin uzaması aşamasında genellikle Taq/Amplitaq DA polimerazların polimerizasyon aktivitesi için en uygun sıcaklık derecesi olan 72 C kullanılır. Uzama aşaması için çoğu zaman iki dakika yeterli olmakla birlikte, eğer uzun amplikonlar (PCR ile çoğaltılan DA parçası) çoğaltılıyorsa süre artırılır. PCR ürünü olan tüm moleküllerde reaksiyonun tamamlanmasını garanti altına almak için son döngünün uzama süresi çoğunlukla uzun (10-15 dakika) tutulur (Temizkan ve Arda, 2004). Toplam döngü sayısı genellikle arasındadır. Döngü sayısının artırılması halinde istenmeyen ürünler fazlalaşırken, istenen ürünlerde herhangi bir artış meydana gelmez. Bu yüzden 40 dan fazla sayıda döngüden oluşan PCR reaksiyonları genellikle başarılı sonuçlar vermez (Temizkan ve Arda, 2004). Şekil 2.7. PCR sıcaklık döngüleri:1. aşama: denatürasyon; 2. aşama: primerin bağlanması; 3. aşama: sentez

33 PCR Ürünlerinin Belirlenmesi ve Analizi PCR ürünleri (amplikonlar) boyları primerlerle sınırlandırılmış DA parçası ya da parçaları dır. PCR ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi edinilebilir: (1) edef DA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi (2) Başlangıç materyali olarak kullanılan DA ya da RA nın kabaca ya da kesin miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi (3) Dizi analizi PCR tamamlandıktan sonra ürünler başka bir aşamada kullanılmadan önce, ürün kalitesi kontrol edilmelidir. Çünkü PCR bazen çeşitli nedenlerden dolayı başarılı olmayabilir. Örneğin, kullanılan DA kaliteli değildir, seçilen primerler uygun değildir veya birden fazla tanıma dizisi vardır. Ürün doğru boyutlarda değildir. Bazen ürün oluşmuştur ancak çoğaltılacak gen uzunluğunda değildir. Bu durumda primerlerden birisi diğer primere yakın bir bölgeye yerleşmiştir ya da primerler yanlışlıkla tamamen farklı bir geni tanımıştır. Jelde birden fazla bant gözlemlenebilir, bu durumda primerlerin bazısı doğru yerlere yerleşmiştir, ancak bazıları yanlış yerleşerek, farklı dizilerin çoğaltılmasına neden olmuştur (İşcan, 2003). Fragmante edilmiş DA moleküllerinin ayrıştırılmasında, tanımlanmasında ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemler poliakrilamid (PAGE) ve agaroz jel elektroforezleridir (Sambrook, 1989). Bu metodların ilkesi; yapısındaki fosfat grubu nedeniyle negatif yüklere sahip olan DA moleküllerinin elektriksel alanda pozitif elektroda doğru hareket etmesidir. Bu işlemde jel porları nedeniyle küçük DA molekülleri daha hızlı hareket ederler. Yöntem basit olması, kısa zamanda yapılabilmesi ve yoğunluk gradienti gibi diğer yöntemlerle ayrıştırılamayan fragmanların analizine olanak sağlaması bakımından moleküler biyolojide sıklıkla kullanılmaktadır. Standart agaroz jeller genellikle PCR ürünlerinin (200 bç-50 kb büyüklüğündeki DA moleküllerinin) analizi için yeterli ayırma gücüne sahiptir. Poliakrilamid jeller ise daha çok bç büyüklüğündeki DA moleküllerinin analizlerinde kullanılmaktadır (Topçu, 2007). Agaroz ya da poliakrilamid jellerde, bir flouresan boya olan ve DA zincirlerinin arasına giren, etidyum bromür (EtBr) boyaması ile ürünler görülür. Boyamadan sonra DA, jelde bir UV transilüminatörden yararlanılarak görülebilir hale gelir. Jelin kalıcı görünümü fotograflanarak elde edilir. Boyutu bilinen işaret DA lar

34 21 ve kontrol PCR ürünleri de aynı elektroforez jeline uygulanır, böylece çoğaltılmış ürünün boyutu hakkında fikir edinilir (Temizkan ve Arda, 2004) PCR ptimizasyonu ve PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması PCR nin etkinliği ve özgünlüğünde etkili olan çeşitli faktörler vardır. Bunlardan kalıp DA nın kalitesi, primer tasarımı, MgCl 2 konsantrasyonu, DA polimeraz ve tampon koşulları özellikle önemli olanlardır (Grunewald, 2003). Bu faktörlerin hepsi Tablo 2.4. de verilmiştir. Tablo 2.4. PCR optimizasyonunda önemli değişkenler 1. PCR de sıcaklık profili (primerlerin bağlanması, uzama, denatürasyon, bir evreden diğerine geçiş zamanı, döngü sayısı) 2. Magnezyum iyonunun konsantrasyonu 3. Primer tasarımı ve konsantrasyonu 4. Kalıp kalitesi ve konsantrasyonu 5. PCR tamponu 6. dtp konsantrasyonu 7. PCR arttırıcı eklenmesi 8. PCR inhibitörleri 9. ested primerlerle sekonder PCR 10. ot-start PCR PCR amplifikasyonunun başarısına bağlı olarak optimize şartlara ihtiyaç duyulabilir. Test örnekleri ile paralel kontrol reaksiyonları gerçekleştirmek, herhangi bir spesifite ya da kontaminasyon problemlerinin olup olmadığını göstermek için önemlidir (McPherson and Moller, 2007). Bu nedenle her PCR uygulamasına uygun kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontroller enzimin aktif olduğundan, tamponun optimal olduğundan, primerlerin doğru dizilere bağlandığından ve termal cyclerın (PCR aletinin) uygun biçimde çalıştığından emin olmak için yapılmalıdır. DA sız bir negatif kontrol (kontaminasyon kontrolü ve reagent blank olarak da adlandırılır), reaksiyon karışımının kalıp DA ya da önceki uygulamadan kaynaklı amplifiye edilmiş ürünlerle kontamine edilmediğinden emin olmak için kullanılmalıdır. edef dizinin bulunmadığı DA kullanılarak gerçekleştirilen negatif bir kontrol (negative template control)

35 22 primerlerin DA nın istenmeyen dizilere bağlanmadığından emin olmak için gerçekleştirilir. Bazı PCR uygulamalarında internal kontrol gerçekleştirilir. Kontrolün bu türünde (amplifikasyon kontrolünde) primerlerin ikinci bir seti ve ilgisiz bir hedef (unrelated target), test örneği amplifiye edilmese bile reaksiyonun çalıştığını göstermek için reaksiyon karışımına ilave edilir. Özdeş bir örnek üzerinde amplifikasyon kontrolünü gerçekleştirmek kabul edilebilir olmasına rağmen, amplifikasyon kontrolleri tercihen test reaksiyonu ile aynı tüpte gerçekleştirilir. Bu tür kontrol PCR sonuçları pozitif ya da negatif olarak rapor edildiğinde ki negatif hedef dizilerin mevcut olmadığı anlamına gelir, çok önemlidir. Amplifikasyon kontrolü, örnek için doğru negatif ve amplifikasyon başarısızlığı (false-negatif) arasında ayrım yapmak için önemlidir (Buckingham ve Flaws, 2007) Magnezyum İyonları Magnezyum iyon konsantrasyonu PCR spesifitesi açısından önemlidir. dtp-mg 2+ kompleksleri nükleik asitlerin şeker-fosfat omurgası ile etkileşir ve Taq DA polimeraz aktivitesini etkiler. Bu yüzden MgCl 2 konsantrasyonunun değişimi aynı şartlar altında bir diğerinden önemli ölçüde farklı davranan bir primer/template çiftine yol açabilir. Mg 2+ iyon konsantrasyonunun etkisini analiz etmek için genel strateji, standart tamponu ayarlamaktır ki MgCl 2 konsantrasyonu genellikle 0.5 ya da 1mM lık aşamalarla 0.5 ve 5mM arasında değişir. Genelde konsantrasyonlardan biri, önemli ölçüde artmış PCR ürün örneği gösterecektir. Reaksiyonda dtp lerin konsantrasyonu değiştirildiğinde Mg 2+ konsantrasyonunun değiştirilmesi gerektiği hatırlanmalıdır (McPherson ve Moller, 2007). Ayrıca enzimatik DA sentezi için optimal Mg +2 konsantrasyonu kullanılan DA polimerazın özellikleri tarafından belirlenir. Örneğin Taq ve Klentaq DA polimerazlar için optimal Mg +2 konsantrasyonu sırasıyla 1,5-2 ve 3-4 mm dır. Bu nedenle kullanılan DA polimeraza bağlı olarak PCR karışımında doğru Mg +2 konsantrasyonunun kullanıldığından emin olmak gerekir. Çok yüksek Mg 2+ konsantrasyonu, DA polimerazın aktivitesini artırarak DA sentezinin verimini artırırken non-spesifik ürünlerin amplifikasyonuna yol açabilir. Çok düşük Mg 2+ konsantrasyonu ise PCR spesifitesini artırırken amplifikasyon veriminin düşmesine neden olacaktır (Ignatov ve ark., 2002).

36 Taq DA polimeraz konsantrasyonu Eğer hiç ürün bandı elde edilemediyse ya da zayıf bandlar elde edildiyse çok az Taq DA polimeraz kullanılmış olabilir. Taq DA polimerazın farklı versiyonları çeşitli spesifik aktivite ve konsantrasyonlarda sağlanabilir. Termostabil proofreading DA polimerazlar Taq DA polimerazdan daha düşük processivitye sahip olabilir ve bu nedenle başarılı amplifikasyon için daha fazla enzime ihtiyaç duyulabilir. Termostabil polimerazların yüksek sıcaklıklarda inaktive olacağını hatırlamak da önemlidir çünkü polimerazların inaktivasyonu ürün miktarının azalmasına yol açabilir. Mümkün olduğunca düşük denatürasyon sıcaklığı kullanarak 90 C nin üzerinde enzimin geçireceği zamanı sınırlandırmaya çalışmak önemlidir. Örneğin birçok protokolde tavsiye edilen 94 C den ziyade 90 C ya da 92 C lik bir sıcaklıkda çalışmak ve/ya da denatürasyon aşaması için süreyi kısaltmak önemlidir (McPherson ve Moller, 2007) Sıcaklık Denatürasyon PCR için tek zincirli kalıpları sağlamak üzere kalıbın etkin olarak denatüre edilmesi önemlidir. Eğer bu aşama verimsiz olursa kısmen denatüre olmuş duplex moleküller, etkin primer bağlanmasını ve DA nın uzatılmasını önleyecek biçimde hızla yeniden birleşecektir. er bir siklüsün başlangıcında kısa bir denatürasyon aşaması vardır. Birçok protokol bu aşamada 94 C lik bir sıcaklık kullanırken GC ce zengin olanlar daha yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyabilmelerine rağmen birçok kalıp için C lik bir sıcaklık kullanmak yeterli olabilir. Reaksiyonda en yüksek DA polimeraz aktivitesini kaybetmemek için etkin en kısa süre ve en düşük etkin sıcaklık kullanmaya çalışmak yararlıdır (McPherson ve Moller, 2007). Annealing PCR ın başarısı şiddetle spesifiteye bağlıdır ki bu, primerin yalnızca hedef dizisine bağlanması anlamına gelir bu nedenle bu moleküler etkileşimi optimize etmek önemlidir. Primerin yalnızca onun mükemmel komplementerine bağlanıp bağlanmadığı önemli ölçüde annealing sıcaklığına bağlıdır. Genellikle daha yüksek annealing

37 24 sıcaklığı primerin kalıp üzerindeki komplementer dizisine daha spesifik bağlanmasını sağlar ve böylece yalnızca hedef dizi amplifikasyonu daha büyük bir olasılıkla gerçekleşir. Daha düşük sıcaklık, kalıp ve primer arasında daha fazla yanlış eşleşmelere neden olabilir ki bu, hedef olmayan dizilerin amplifikasyonunun artmasına neden olur. Pratikte annealing aşamasına 55 C gibi bir sıcaklıkda başlamak genellikle uygundur. Eğer ürünün zayıf kazanımı ve nonspesifik ürünlerin amplifiyesi söz konusu olursa optimal annealing sıcaklığının deneysel olarak belirlenmesi gerekli olabilir ayrıca bu durum MgCI 2 konsantrasyonunun optimizasyonu ile ilişkilendirilebilir. Annealing için genellikle yaklaşık 30-60s lik bir süre önerilir ve daha kısası daha iyidir. Polimeraz, annealing sıcaklığında kısmi aktiviteye sahip olacağından bu sıcaklıkda reaksiyonun daha uzun tutulması nonspesifik ürünlerin amplifikasyon riskini artıracaktır (McPherson ve Moller, 2007). Ayarlanan annealing sıcaklık aşaması kalıp ve primer arasındaki eşleşmenin spesifitesini değiştirebilir. Eğer hiç ürün yoksa sıcaklığın çok yüksek olduğu düşünülüp azaltılabilir, örneğin başlangıçta 55 C olan sıcaklık 50 C ye azaltılabilir. Yeni sıcaklıkda primerler daha etkin olabilir. Eğer yalnızca bir primerin bulunduğu kontrol lane larında ürünler varsa bu, tek primerin kalıbın bir bölgesinden daha fazlasına bağlandığını ve ürünleri ürettiğini gösterir. Bu durumda annealing sıcaklığı arttırılmalıdır. Çalışılan annealing sıcaklığı optimal değilse ne olur? Kaç sıcaklık denenmeli ve ne aşamada sıcaklık ayarlanmalıdır? Daha da önemlisi böyle bir optimizasyon deneyini gerçekleştirmek için kaç tane termal cyclera sahip olmak gerekir? Günümüzde bir reaksiyonda optimal annealing sıcaklık profillerinin eş zamanlı olarak belirlenmesi gerektiğinde, buna imkan veren bir gradient bloğa sahip olan termal cyclerlar kullanılmaktadır. Gradient bloğa sahip PCR cihazlarında PCR şartlarının optimizisyonu süresince önceden belirlenen 8 ya da 12 farklı sıcaklığı eş zamanlı test eden tek bir blok kullanılmaktadır. Böylece farklı annealing sıcaklıklarına ihtiyaç duyulan bağımsız deneylerin eş zamanlı olarak gerçekleştirilmesi mümkün olmaktadır. Ancak her laboratuvar böyle bir cihaza sahip değildir. Primer/template annealingini optimize etmek için, annealing sıcaklığını başlangıçta 2-5 C lik ayarlamalarla test etmek uygun bir yoldur (McPherson ve Moller, 2007).

38 Touchdown PCR Touchdown PCR, başlangıçta primerlerin Tm sinden daha yüksek annealing sıcaklığı ile başlar ve ondan sonra PCR ın ilk siklüsleri süresince annealing sıcaklığı Tm nin altına kademeli olarak düşürülür. Bu, herhangi bir nonspesifik annealing olayı gerçekleşmeksizin primerlerin yalnızca doğru hedef dizilerine spesifik olarak bağlanmalarını sağlar. Böylece elde edilen ilk ürünler spesifik olduğundan PCR ın ilk siklüslerinde doğru hedef dizilerin konsantrasyonu artar. Don ve ark. tarafından tanımlanan thumb kuralına göre yaklaşık 20 nükleotit uzunluğunda primerler kullanıldığında ilk 20 siklüs süresince annealing sıcaklığı 65 C den 55 C ye her iki siklüsde bir 1 C düşürülürek gerçekleştirilir. ndan sonra reaksiyon 55 C lik bir annealing sıcaklığında bir 10 siklüs daha gerçekleştirilerek tamamlanır (McPherson ve Moller, 2007). Ya da başlangıç siklüsünde annealing sıcaklığı, primerlerin Tm değerine eşit ya da 2-5 C altında bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar 1-2 C/siklüslük aşamalarla düşürülür. Touchdown PCR, başlangıç primer-kalıp çift zincir oluşumunun spesifitesini ve böylece final PCR ürününün spesifitesi artırır (Anonim, 2005) ot start PCR DA bir örnekden ekstrakte edildiğinde kaçınılmaz biçimde birkaç DA tek zincirli formda olacaktır. PCR analizinin bileşenleri oda sıcaklığında karıştırılırsa primerler tek zincirli DA ya spesifik olmayacak biçimde bağlanabilirler. Taq polimeraz oda sıcaklığında bir miktar aktiviteye sahip olduğu için örnek thermal cyclera konulmadan önce spesifik olmayan DA sentezlenebilir. Bunu engellemek için uygulanabilecek metotlardan biri, sıcaklık optimal primer annealing sıcaklığına ya da üzerine çıkıncaya kadar reaksiyonun temel bileşenlerinden birini (Taq polimeraz ya da MgCl 2 gibi) reaksiyon ortamına koymamaktır-bu yöntem hot-start PCR olarak adlandırılır. Bu, spesifik olmayan primer annealing sıcaklığının üzerindeki sıcaklıklarda enzimi denatüre eden bir monoklonal antibody ile enzimatik aktivitenin inhibisyonuyla ya da birkaç dakika 90 C nin üzerinde inkübe edilerek aktive edilebilecek inaktif bir enzim kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bir diğer metot PCR bileşenlerini 0 C de karıştırmaktır. Bu sıcaklıkta DA denatüre olmayacaktır ve Taq polimeraz aktif

39 26 değildir. Örnek önceden ısıtılmış thermal cyclera (94-96 C) doğrudan yerleştirildiğinde spesifik olmayan amplifikasyonun önüne geçilmiş olur- bu yöntem cold-start PCR olarak adlandırılır (Lisby, 1998). ot start PCR ı gerçekleştirmek için çeşitli stratejiler vardır; en ucuz prosedür DA polimeraz olmaksızın tüm reaksiyonları kurmaktır ve 90 C den yüksek sıcaklıkda başlangıç denatürasyon aşamasını tamamlamak için termal cyclerda tüpleri inkübe etmektir. ndan sonra tüpleri, 70 C nin üzerinde tutarken DA polimerazın uygun miktarı reaksiyon karışımına ilave edilir fakat mineral yağ kullanılıyorsa öncelikle pipet ucu mineral yağ tabakasının içinden geçirilerek polimeraz reaksiyon karışımına ilave edilmeli ki polimeraz yağın üstünde kalmayıp reaksiyona girebilsin. Bu yaklaşım göreceli olarak az sayıda reaksiyonun gerçekleştirildiği araştırma laboratuarında kullanılabilir. Ancak bu çok sayıda örnek prosesi için uygun değildir çünkü: her bir tüpe enzim ilavesi zaman alır bir ya da daha fazla tüpe enzim ilavesini başaramamanın yol açtığı problem olabilir. tüpleri açma ihtiyacından dolayı kontaminasyon riski oluşabilir. Çeşitli ticari reagentlar günümüzde hot startı kolaylaştırmak için temin edilebilir ve böyle ürünler rutin hot start uygulamaları için tavsiye edilmektedir (McPherson ve Moller, 2007) ested PCR PCR spesifitesi çok çok düşük olduğunda bir nested PCR metodu PCR ürün verimini artırabilir. ested PCR iki aşamalı amplifikasyon reaksiyonları gerektirir. Birinci-aşama PCR, standart PCR protokolüne göre gerçekleştirilir. Sonradan birinci-aşama PCR ürününün bir aliquatı, örneğin de bir lik bir dilüsyonun (1/10 3-1/10 4 lik bir dilüsyon) 1µl si ikinci aşama PCR da amplifiye edilir. İkinci-aşama PCR, birinci-aşama primer-kalıp dizilerinin içindeki dizilere hibridize olan iki yeni pirimerlerle gerçekleştirilir (Anonim, 2005). Böylece eğer birinci PCR döngüsünde yanlış bir dizi kopyalandı ise (primerler DA da birden fazla diziyi tanıyabilir), bu ürünün, ikinci set

40 27 primerler tarafından tanınma olasılığı düşük olacaktır ve yalnızca spesifik birinci-aşama PCR ürünleri ikinci aşamada amplifiye olacaktır (İşcan, 2003) Siklüs sayısı ve uzunluğu Genelde PCR ın cycle (siklus) sayısı sonraki analizler ya da DA manipülasyonlarında kullanılmak üzere yeterli ürün elde etmek için ihtiyaç duyulan minumum düzeyde tutulmalıdır. Bu, nonspesifik ürünlerin birikme ve hataların ortaya çıkma olasılığını azaltır. Temel protokol, yeterli ürün vermezse başlangıçta kalıp miktarını artırmak denenebilir. Alternatif olarak PCR ın cycle (siklus) sayısı arttırılabilir. 40 siklüslük bir reaksiyon süresince her 5 siklüsde bir yani 25., 30. ve 35. siklüsde 0.1 lik hacimde (50µl lik hacmin 5 µl si gibi) bir aliquatı alarak PCR ları örneklemek mümkündür. ndan sonra örnekler uygun sayıda siklusu belirleyebilmek için agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Bu sayı, tek bir ürünün yüksek verimle eldesi için gerekli olan minimum sayıdır (McPherson ve Moller, 2007). PCR spesifitesini etkileyebilen bir diğer husus PCR süresince sıcaklıklar arası geçiş zamanıdır. Genellikle sıcaklık artışı ne kadar kısa sürede gerçekleşirse (faster ramping rates) spesifite o denli yüksek olur (McPherson ve Moller, 2007) PCR katkı maddeleri Çeşitli enhancer bileşiklerin PCR ın spesifitesini ve etkinliğini artırdığı bilinmektedir. Bunlar reaksiyonun etkin annealing sıcaklığını artıran kimyasalları, DA bağlayıcı proteinleri ve ticari olarak elde edilebilir reagentları içerir. Böyle katkı maddeleri, primer annealing spesifitesini artırmak, primerlerin bağlanma olasılığını artırmak, özellikle GC ce zengin diziler gibi zor kalıplar söz konusu olduğunda PCR verimini artırmak, ürün uzunluğunu artırmak, ürün spesifitesini artırmak, enzim stabilitesine katkıda bulunmak için PCR lara ilave edilebilir. Ayrıca enhancerlar sıklıkla PCR ın ticari optimizasyon ve enhancer kitlerinin bileşenleri olarak kullanılırlar. Baz eşleşmesinin destabilizasyonuna yol açan katkı maddeleri özellikle GC ce zengin diziler gibi zor kalıplar söz konusu olduğunda PCR ı artırabilir ve yanlış eşleşen primer-kalıp komplekslerinin göreceli olarak daha fazla destabilize olmasını sağlayarak

41 28 spesifiteyi de artırabilir. Bu bileşikler optimal olmayan PCR şartlarını iyileştirmek için bazı durumlarda yararlı olabilmesine rağmen bazıları, kalıpların ve primer kombinasyonlarının geniş bir aralığına uygulanamaz. er PCR da başarıyı kesinleştirecek olan büyülü bir katkı maddesi yoktur ve annealing sıcaklığı gibi farklı şartlar altında farklı katkı maddelerini test etmek gerekli olabilir. Farklı annealing sıcaklıklarının otomatik testine izin veren bir gradient termal cycler kullanımı ile böyle bir test kolaylaştırılır (McPherson ve Moller, 2007). Enhancerlar kullanıldığında, herbir PCR analizine bağlı olarak aşağıdaki etkiler gözlemlenebilir; (1) Enhancer önceden başarısız olan bir reaksiyonu amplifiye edebilir; (2) Enhancer belirli primer kalıp sistemlerinde PCR spesifitesini artırabilir; (3) Enhancer PCR performansı üzerine etki etmez; (4) Enhancer önceden başarıyla gerçekleştirilmiş amplifikasyon reaksiyonunun verimini düşürebilir ya da onu başarısız kılabilir. Enhancerlar kullanıldığında yukarıda belirtilen dört durumla da karşılaşılabileceğinden belirli bir primer-kalıp çifti için ilk kez bir enhancer kullanıldığında her zaman enhancerlı ve onsuz paralel reaksiyonlar gerçekleştirilmelidir. Enhancerların polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri, enhancer olarak Q-çözeltisi kullanılarak ve kullanılmayarak gerçekleştirilen reaksiyon ürünlerine ait aşağıda yer alan jel fotograflarında görülmektedir.

42 29 -: Q-çözeltili +: Q-çözeltisiz M: Markör Şekil 2.8. Q çözeltinin (solution) polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri Durum A: Q-çözeltisi önceden başarısız olan bir reaksiyonu amplifiye edebilir. Durum B: Q-çözeltisi belirli primer kalıp sistemlerinde PCR spesifitesini artırabilir. Durum C: Q-çözeltisi PCR performansı üzerine etki etmez Durum D: Q-çözeltisi önceden başarıyla gerçekleştirilmiş amplifikasyon reaksiyonunun verimini düşürebilir ya da onu başarısız kılabilir. Bu durumda Q çözelti ilavesi önceki optimal primer-kalıp annealingini bozmuş olabilir (Anonim, 2005).

Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 3. Hafta (01.10.2013)

Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 3. Hafta (01.10.2013) Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 3. Hafta (01.10.2013) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 1 DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler

Detaylı

PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi

PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi Hafta V PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi Doç. Dr. Hilâl Özdağ F Đ Z Đ K Đ A L T Y A P I Reaksiyonda kullanılanlar: P C R I. Kalıp DNA a) PCR degrade

Detaylı

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP)

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) Deney: M 1 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) a) PCR yöntemi uygulaması b) RPLF sonuçları değerlendirilmesi I. Araç ve Gereç dntp (deoksi Nükleotid

Detaylı

T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PCR İLE GSBL POZİTİF Klebsiella pneumonia MİKROORGANİZMASININ TANISI Gülden NASUHBEYOĞLU Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Prof. Dr. İsa GÖKÇE

Detaylı

RT-PCR. (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) Dr Gülnur Güler

RT-PCR. (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) Dr Gülnur Güler RT-PCR (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) Dr Gülnur Güler RT-PCR (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) mrna ekspresyon seviyelerini belirlemek için sensitiv bir metod

Detaylı

Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D

Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D 1 Enfeksiyonun Özgül Laboratuvar Tanısı Mikroorganizmanın üretilmesi Mikroorganizmaya

Detaylı

RNA DNA. Nükleosit Baz + Şeker Riboz (RNA) Deoksiriboz (DNA) Ribonükleozitler : Adenozin, Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında

RNA DNA. Nükleosit Baz + Şeker Riboz (RNA) Deoksiriboz (DNA) Ribonükleozitler : Adenozin, Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında Bazlar : Nükleik Asitlerin karakteristik Özellikleri DNA RNA Yasin EREN Recep LiMAN Muhsin KONUK Nükleik Asitlerin Yapısı Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında TU T,U ve Sdışında d bazı theobromin, kafein,

Detaylı

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03. Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.2014) 1 5. Haftanın Ders İçeriği DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonunun amacı

Detaylı

III-Hayatın Oluşturan Kimyasal Birimler

III-Hayatın Oluşturan Kimyasal Birimler III-Hayatın Oluşturan Kimyasal Birimler MBG 111 BİYOLOJİ I 3.1.Karbon:Biyolojik Moleküllerin İskeleti *Karbon bütün biyolojik moleküllerin omurgasıdır, çünkü dört kovalent bağ yapabilir ve uzun zincirler

Detaylı

NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ

NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ T.C. FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Venhar ÇELİK Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK NÜKLEİK ASİTLERİN

Detaylı

PCR İLE Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa MİKROORGANİZMALARININ ÇEŞİTLİ BİYOLOJİK SIVILARDAN TANISI

PCR İLE Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa MİKROORGANİZMALARININ ÇEŞİTLİ BİYOLOJİK SIVILARDAN TANISI T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PCR İLE Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa MİKROORGANİZMALARININ ÇEŞİTLİ BİYOLOJİK SIVILARDAN TANISI Ergül MUTLU ALTUNDAĞ Yüksek Lisans

Detaylı

Protein Ekstraksiyonu

Protein Ekstraksiyonu Protein Ekstraksiyonu Dr.Gaye Güler Tezel Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli makromoleküllerden biridir. Bazıları yapısal komponentleri

Detaylı

Kromozom, DNA ve Gen. Allel Segregasyonu. DNA çift sarmalı. Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar. Hastalık yapan mutasyonlar

Kromozom, DNA ve Gen. Allel Segregasyonu. DNA çift sarmalı. Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar. Hastalık yapan mutasyonlar Temel Genetik Kavramlar DNA izolasyon yöntemleri Kromozom, DNA ve Gen Hücre Nukleus Kromozomlar Gen Prof.Dr.Uğur ÖZBEK Protein DNA çift sarmalı Allel Segregasyonu Şeker Fosfat omurga Bazlar Baz çifti A

Detaylı

Hücre Neden DNA sını Replike Eder? ÇÜNKİ Mitoz Bölünmenin Gerçekleşmesi İçin S Evresinde DNA nın 2 Katına Çıkması Gerekmektedir

Hücre Neden DNA sını Replike Eder? ÇÜNKİ Mitoz Bölünmenin Gerçekleşmesi İçin S Evresinde DNA nın 2 Katına Çıkması Gerekmektedir DNA REPLİKASYONU Hücre Neden DNA sını Replike Eder? ÇÜNKİ Mitoz Bölünmenin Gerçekleşmesi İçin S Evresinde DNA nın 2 Katına Çıkması Gerekmektedir Hücre yaşam döngüsü G 1, S, G 2, Mitoz,evreleri ile tamamlar.

Detaylı

1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mm EDTA. 100 mm Tris-HCl (ph 8)

1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mm EDTA. 100 mm Tris-HCl (ph 8) KONU-7. MOLEKÜLER BĠYOLOJĠDE TEMEL TEKNĠKLER BĠTKĠDEN GENOMĠK DNA ĠZOLASYONU Kullanılan Tamponlar: 1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol,

Detaylı

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 DNA parçalarının agaroz jelden geri kazanımı ve PZR ürünlerinin saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09009050

Detaylı

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ T.C. FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Abdullah ASLAN Danışman:

Detaylı

Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kandolaşımı Enfeksiyonları %10 Kandidemi Ölüm hızı : % 50 (YBÜ) Erken tanı (?), tedavinin önemi Etken: Candida allbicans

Detaylı

Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir.

Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir. METABOLİZMA ve ENZİMLER METABOLİZMA Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir. A. ÖZÜMLEME (ANABOLİZMA) Metabolizmanın yapım reaksiyonlarıdır. Bu tür olaylara

Detaylı

Genetik materyal: DNA replikasyonu

Genetik materyal: DNA replikasyonu Genetik materyal: DNA replikasyonu Umut Fahrioglu, PhD MSc DNA Replikasyonu DNA replikasyonu genomların ve içerdikleri genlerin nesilden nesile aktarılmasında çok önemli bir rol oynar. Hücreden hücreye

Detaylı

1. ÜNİTE : HÜCRE BÖLÜNMESİ VE KALITIM

1. ÜNİTE : HÜCRE BÖLÜNMESİ VE KALITIM 1. ÜNİTE : HÜCRE BÖLÜNMESİ VE KALITIM 1 DNA (Deosiribo Nükleik Asit) Kalıtım maddesi hücre çekirdeğinde bulunur. Kalıtım maddesi iğ ipliği (Yumak) şeklinde bir görünümdedir. İğ ipliğindeki kalıtım maddesi

Detaylı

www.demiraylisesi.com

www.demiraylisesi.com YÖNETİCİ MOLEKÜLLER C, H, O, N, P atomlarından meydana gelir. Hücrenin en büyük yapılı molekülüdür. Yönetici moleküller hücreye ait genetik bilgiyi taşır, hayatsal faaliyetleri yönetir, genetik bilginin

Detaylı

Protokolü PD S001 01. 50 Reaksiyon

Protokolü PD S001 01. 50 Reaksiyon Salmonella sp. Real time PCR Tespit Kiti Protokolü PD S001 01 50 Reaksiyon REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen

Detaylı

REAKSİYON PRENSİPLERİ

REAKSİYON PRENSİPLERİ REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen izole edilen DNA örneği Polimerase Chain Reaction (PCR): Son yıllarda

Detaylı

KARBON ve CANLILARDAKİ MOLEKÜL ÇEŞİTLİLİĞİ

KARBON ve CANLILARDAKİ MOLEKÜL ÇEŞİTLİLİĞİ KARBON ve CANLILARDAKİ MOLEKÜL ÇEŞİTLİLİĞİ Karbonun önemi Hücrenin % 70-95ʼ i sudan ibaret olup, geri kalan kısmın çoğu karbon içeren bileşiklerdir. Canlılığı oluşturan organik bileşiklerde karbon atomuna

Detaylı

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 9. MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 9. MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 9 MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara WORLD HEALTH ORGANIZATION

Detaylı

Hafta VIII Rekombinant DNA Teknolojileri

Hafta VIII Rekombinant DNA Teknolojileri GENETĐK 111-503 Hafta VIII Rekombinant DNA Teknolojileri Doç.Dr. Hilâl Özdağ Rekombinant DNA Teknolojisi Amaç Spesifik DNA dizilerinin yerlerinin belirlenmesi. DNA nın belirli noktalardan kesilmesi Belirli

Detaylı

MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ. Doç. Dr. Funda BAĞCIGİL

MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ. Doç. Dr. Funda BAĞCIGİL MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ Doç. Dr. Funda BAĞCIGİL Biyoteknoloji; Genetik materyallerde moleküler düzeyde yapılan manipulasyonlarla yeni ve istenilen fenotipte organizmalar ve faydalı ürünler elde etmektir

Detaylı

DNA REPLİKASYONU. Yrd.Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu

DNA REPLİKASYONU. Yrd.Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu DNA REPLİKASYONU Yrd.Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu DNA REPLİKASYONU Replikasyon genetik materyelin tamamen kendi benzeri yeni bir molekül oluşturma işlemidir. DNA kendini eşleyebilen yegane biyomoleküldür

Detaylı

NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI

NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI Dr. Zafer KÜÇÜKODACI GATA HEH Patoloji Servisi 22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ 7 Kasım 2012 Manavgat DNA ve RNA NIN KANTİTASYONU Spektrofotometrik ölçüm Floresans teknik

Detaylı

I. YARIYIL TEMEL BİYOKİMYA I (B 601 TEORİK 3, 3 KREDİ)

I. YARIYIL TEMEL BİYOKİMYA I (B 601 TEORİK 3, 3 KREDİ) T.C. İSTANBUL BİLİM ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS PROGRAMI 2014-2015 EĞİTİM-ÖĞRETİM YILI DERS İÇERİKLERİ I. YARIYIL TEMEL BİYOKİMYA I (B 601 TEORİK 3, 3

Detaylı

REAKSİYON PRENSİPLERİ

REAKSİYON PRENSİPLERİ REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen izole edilen DNA örneği Polimerase Chain Reaction (PCR): Son yıllarda

Detaylı

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA İçerik Giriş...2 Deney İçin Gerekli Olan Malzemeler...3 Deneyin Yapılışı... 4-9 Genomik DNA Kalıbının Hazırlanması...4 PCR Amplifikasyonu... 4-5 DNA Miktarının Belirlenmesi...6 Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması...7

Detaylı

SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER

SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER Doç. Dr. Gülsen YILMAZ 2009 BAŞLIKLAR 1 Tanım ve Prensip 22 Santrifüj teknikleri 33 Santrifüj tipleri 44 Santrifüj kullanım alanları Laboratuvarı ilgilendiren Süreç

Detaylı

AVRASYA ÜNİVERSİTESİ

AVRASYA ÜNİVERSİTESİ Ders Tanıtım Formu Dersin Adı Öğretim Dili Moleküler Biyoloji Lab. Türkçe Dersin Verildiği Düzey Ön Lisans () Lisans (X) Yüksek Lisans( ) Doktora( ) Eğitim Öğretim Sistemi Örgün Öğretim (X) Uzaktan Öğretim(

Detaylı

Nükleik asitler. Deoksiribonükleik asit Ribonükleik asit 18.11.2008. DNA nın YAPISI ve ÖZELLİKLERİ

Nükleik asitler. Deoksiribonükleik asit Ribonükleik asit 18.11.2008. DNA nın YAPISI ve ÖZELLİKLERİ Nükleik asitler Sıcaklıkla öldürülmüş S suşları Canlı R suşlarını canlı S suşuna dönüştürür a) Farelere virulan S suşu enjekte edildiğinde ölür b) R suşu enjekte edildiğinde yaşar c) Isıyla öldürülmüş

Detaylı

Moleküler Nematoloji. Eğitim Süresi: 6 ay (29 Aralık 2013 29 Haziran 2014) Eğitim Yeri: Kaliforniya Üniversitesi, Davis Bitki Bilimleri Bölümü

Moleküler Nematoloji. Eğitim Süresi: 6 ay (29 Aralık 2013 29 Haziran 2014) Eğitim Yeri: Kaliforniya Üniversitesi, Davis Bitki Bilimleri Bölümü Moleküler Nematoloji 27.08.2014 Eğitim Süresi: 6 ay (29 Aralık 2013 29 Haziran 2014) Eğitim Yeri: Kaliforniya Üniversitesi, Davis Bitki Bilimleri Bölümü Dr. Gülden HASPOLAT gulden.haspolat@gthb.gov.tr

Detaylı

RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti

RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 Bakteri örneklerinden plazmid DNA izolasyonu ve saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09007050 50 test 09007100

Detaylı

KABUKLULAR FINDIK WHEAT BUĞDAY YUMURTA YER PEANUT FISTIĞI SOYA

KABUKLULAR FINDIK WHEAT BUĞDAY YUMURTA YER PEANUT FISTIĞI SOYA ET ÜRÜNLERİNDE TAĞŞİŞ Tağşiş; gıda maddesinin mevzuata veya izin verilen özelliklerine aykırı olarak üretilmesi hali olarak tanımlanmaktadır. Gıda ürünlerinde; tağşiş bir çok şekilde yapılabilmektedir.

Detaylı

TOPRAK TOPRAK TEKSTÜRÜ (BÜNYESİ)

TOPRAK TOPRAK TEKSTÜRÜ (BÜNYESİ) TOPRAK Toprak esas itibarı ile uzun yılların ürünü olan, kayaların ve organik maddelerin türlü çaptaki ayrışma ürünlerinden meydana gelen, içinde geniş bir canlılar âlemini barındırarak bitkilere durak

Detaylı

HLA Tiplendirmesi PCR-SSP. Türker Duman PhD

HLA Tiplendirmesi PCR-SSP. Türker Duman PhD HLA Tiplendirmesi PCR-SSP Türker Duman PhD Büyük Doku Uygunluk Kompleksi (Major Histocompatibility Complex - MHC) İlk olarak farklı fare suşlarında deri naklinin reddiyle tanımlanan genetik bölgedir Alloreaktiviteden

Detaylı

5.111 Ders Özeti #12. Konular: I. Oktet kuralından sapmalar

5.111 Ders Özeti #12. Konular: I. Oktet kuralından sapmalar 5.111 Ders Özeti #12 Bugün için okuma: Bölüm 2.9 (3. Baskıda 2.10), Bölüm 2.10 (3. Baskıda 2.11), Bölüm 2.11 (3. Baskıda 2.12), Bölüm 2.3 (3. Baskıda 2.1), Bölüm 2.12 (3. Baskıda 2.13). Ders #13 için okuma:

Detaylı

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 IVD Bakteri örneklerinden genomik nükleik asit izolasyonu ve saflaştırılması için In vitro tanı amaçlı kullanım için Yalnızca

Detaylı

ayxmaz/biyoloji 2. DNA aşağıdaki sonuçlardan hangisi ile üretilir Kalıp DNA yukarıdaki ana DNAdan yeni DNA molekülleri hangi sonulca üretilir A B C D

ayxmaz/biyoloji 2. DNA aşağıdaki sonuçlardan hangisi ile üretilir Kalıp DNA yukarıdaki ana DNAdan yeni DNA molekülleri hangi sonulca üretilir A B C D 1. DNA replikasyonu.. için gereklidir A) sadece mitoz B) sadece mayoz C) mitoz ve mayoz D) sadece gamet oluşumu E) sadece protein sentezi 2. DNA aşağıdaki sonuçlardan hangisi ile üretilir Kalıp DNA yukarıdaki

Detaylı

SALGIN ARAŞTIRMASINDA KULLANILAN TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ

SALGIN ARAŞTIRMASINDA KULLANILAN TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ SALGIN ARAŞTIRMASINDA KULLANILAN TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ Prof.Dr. Meltem Yalınay Çırak Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji A.D. fenotipik yöntemler genotipik yöntemler

Detaylı

PEG-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI. Gazi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Maltepe, Ankara

PEG-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI. Gazi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Maltepe, Ankara PE-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI E.DİLAN ve U.ÜNDÜZ azi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Mepe, Ankara 1.ÖZET Model protein olarak seçilen Bovine

Detaylı

MANTAR ENFEKSİYONLARININ MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TANISI

MANTAR ENFEKSİYONLARININ MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TANISI MANTAR ENFEKSİYONLARININ MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TANISI Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 1 İnvazif Mantar Enfeksiyonları (İME) Bağışıklık sistemi Morbidite-mortalite

Detaylı

MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİ MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİ DNA dizi analizleri ya da sekanslama; DNA birincil (temel) yapılarının belirlenmesinde kullanılan yöntemlerdir, DNA nın nukleotid dizilerinin saptanması anlamına gelir.

Detaylı

ATOMLAR ARASI BAĞLAR Doç. Dr. Ramazan YILMAZ

ATOMLAR ARASI BAĞLAR Doç. Dr. Ramazan YILMAZ ATOMLAR ARASI BAĞLAR Doç. Dr. Ramazan YILMAZ Sakarya Üniversitesi, Teknoloji Fakültesi, Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Bölümü Esentepe Kampüsü, 54187, SAKARYA Atomlar Arası Bağlar 1 İyonik Bağ 2 Kovalent

Detaylı

Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile identifikasyonu

Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile identifikasyonu Maya ve maya benzeri mantarların sekans analizi ile identifikasyonu Dr. Ayşe KALKANCI Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara 24-25 Şubat 2011, İzmir Sunum Planı Teorik

Detaylı

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI Bir hücre ve dokudan istenilen bir proteinin saf halde izole edilmesi oldukça güç bir olaydır. Bu proteinin konsantrasyonu düşük ise binlerce farklı protein arasından ayırmak

Detaylı

DİZİ ANALİZİ (SEKANS) TEKNİKLERİ

DİZİ ANALİZİ (SEKANS) TEKNİKLERİ DİZİ AALİZİ (SEKAS) TEKİKLERİ DA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır. erhangi bir organizmadan çok miktarda saf DA elde edilmesini sağlayan

Detaylı

Rekombinant DNA Teknolojisi-I

Rekombinant DNA Teknolojisi-I BYM613 Genetik MühendisliM hendisliği Rekombinant DNA Teknolojisi-I Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik BölümüB 2012-2013 2013 Güz G z DönemiD Dr. Eda Çelik-AKDUR edacelik@hacettepe.edu.tr İçerik (2

Detaylı

PROTEİN ANALİZ YÖNTEMLERİ

PROTEİN ANALİZ YÖNTEMLERİ PROTEİN ANALİZ YÖNTEMLERİ Protein analizleri, fen bilimleri araştırmaları ve farmosötik endüstrisinde önemli bir araç olarak karşımıza çıkar. Protein Analizinin Amaçları: Hastalıkların Kesin Tanısının

Detaylı

İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III

İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III İÇİNDEKİLER... V 1. LABORATUVARDA KULLANILAN MALZEME VE ALETLER... 1 1.1. Tüpler... 1 1.2. Beher... 1 1.3. Erlenmeyer... 2 1.4. Balonlar... 2 1.5. Mezur... 3 1.6. Pipetler...

Detaylı

HÜCRE ZARINDA TAŞINIM

HÜCRE ZARINDA TAŞINIM HÜCRE ZARINDA TAŞINIM Yrd. Doç. Dr. Aslı AYKAÇ YDÜ TIP FAKÜLTESİ BİYOFİZİK AD Küçük moleküllerin zardan geçişi Lipid çift tabaka Polar moleküller için geçirgen olmayan bir bariyerdir Hücre içindeki suda

Detaylı

TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİYE GİRİŞ

TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİYE GİRİŞ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİYE GİRİŞ Bitki Doku Kültürü Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 4. Hafta (08.10.2013) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü

Detaylı

Temel Kimya Eğitim İçeriği

Temel Kimya Eğitim İçeriği Temel Kimya Eğitim İçeriği Konu Alanı KA 1 Malzeme Bilgisi KA 2 Kimyasal Karışımların Ayrılması KA 3 Kimyasal Yapıların Araştırılması ve Özellikleri KA 4 Fotomoketrik ve Kromatografik Analizler KA 5 Preparatif

Detaylı

DNA ONARIMI VE MUTASYON. Merve Tuzlakoğlu Öztürk Bakteri genetiği dersi Sunum-2 18.11.2005

DNA ONARIMI VE MUTASYON. Merve Tuzlakoğlu Öztürk Bakteri genetiği dersi Sunum-2 18.11.2005 DNA ONARIMI VE MUTASYON Merve Tuzlakoğlu Öztürk Bakteri genetiği dersi Sunum-2 18.11.2005 *DNA nın dölden döle değişmeden aktarımı için 2 süreç önemlidir: DNA ONARIMI 1. Replikasyon sürecinin doğru yapılması

Detaylı

Çekirdek 4 bölümden oluşur Çekirdek zarı: karyolemma Kromatin: Chromatin Çekirdekcik: Nucleolus Çekirdek sıvısı: karyolymph

Çekirdek 4 bölümden oluşur Çekirdek zarı: karyolemma Kromatin: Chromatin Çekirdekcik: Nucleolus Çekirdek sıvısı: karyolymph NUKLEUS Bir hücrenin tüm yapılarının ve etkinliklerinin kodlandığı kromozomu Ayrıca, DNA sını dublike edecek ve 3 tip RNA yı ribozomal (rrna), haberci (mrna) ve transfer (trna)-sentezleyecek ve işleyecek

Detaylı

ELEMENT VE BİLEŞİKLER

ELEMENT VE BİLEŞİKLER ELEMENT VE BİLEŞİKLER 1- Elementler ve Elementlerin Özellikleri: a) Elementler: Aynı cins atomlardan oluşan, fiziksel ya da kimyasal yollarla kendinden daha basit ve farklı maddelere ayrılamayan saf maddelere

Detaylı

Artan bilgi ile birlikte hasta ve ailelerin bilinçlendirilmesi

Artan bilgi ile birlikte hasta ve ailelerin bilinçlendirilmesi Bugün gelinen noktada genetik Artan bilgi ile birlikte hasta ve ailelerin bilinçlendirilmesi «Genetik bilgiden hastaların ve ailelerin yararlanması için tüm sağlık çalışanları insan genetiğinin temelinde

Detaylı

RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-05 IVD İnsan kan örneklerinden in vitro tanı amaçlı genomik nükleik asit izolasyon ve saflaştırması için In vitro tanı amaçlı

Detaylı

Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi. Prof. Dr. Müjgan Cengiz

Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi. Prof. Dr. Müjgan Cengiz Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi Prof. Dr. Müjgan Cengiz Canlı Hücrelerdeki Moleküllerin İzlenmesi Mikroskopla inceleme hücrede belli düzeyde

Detaylı

Farmakogenetikte Kullanılan Temel Yöntemler

Farmakogenetikte Kullanılan Temel Yöntemler Farmakogenetikte Kullanılan Temel Yöntemler Dr. Melih Ö. Babaoğlu Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji A.D. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 1 Hastalık derecesi Fizyolojik durum İlaç etkileşmeleri

Detaylı

Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 12. Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi

Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 12. Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 12 Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi Prof. Dr. Hilal Özdağ A.Ü Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Tel: 2225826/125 Eposta: hilalozdag@gmail.com Gen İfadesi

Detaylı

CANLILARIN KİMYASAL İÇERİĞİ

CANLILARIN KİMYASAL İÇERİĞİ CANLILARIN KİMYASAL İÇERİĞİ Prof. Dr. Bektaş TEPE Canlıların Savunma Amaçlı Kimyasal Üretimi 2 Bu ünite ile; Canlılık öğretisinde kullanılan kimyasal kavramlar Hiyerarşi düzeyi Hiyerarşiden sorumlu atom

Detaylı

ÖĞRENME ALANI : MADDE VE DEĞİŞİM ÜNİTE 4 : MADDENİN YAPISI VE ÖZELLİKLERİ

ÖĞRENME ALANI : MADDE VE DEĞİŞİM ÜNİTE 4 : MADDENİN YAPISI VE ÖZELLİKLERİ ÖĞRENME ALANI : MADDE VE DEĞİŞİM ÜNİTE 4 : MADDENİN YAPISI VE ÖZELLİKLERİ E BİLEŞİKLER VE FRMÜLLERİ (4 SAAT) 1 Bileşikler 2 Bileşiklerin luşması 3 Bileşiklerin Özellikleri 4 Bileşik Çeşitleri 5 Bileşik

Detaylı

VİRAL TANI KİTLERİ (GFJ-480)

VİRAL TANI KİTLERİ (GFJ-480) VİRAL TANI KİTLERİ (GFJ-480) CMV PCR Tanı Kiti Cytomegalovirus un Konvensiyonel PCR yöntemiyle tanınması. HHV-5 olarak da bilinen Sitomegalovirüs, herpes virus ailesinin bir üyesidir. Oldukça sık görülen

Detaylı

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar AMAÇ: - Moleküler Biyoloji laboratuvarında kullanılan çözeltileri ve hazırlanışlarını öğrenmek. - Biyolojik tamponların kullanım amaçlarını,

Detaylı

Mikrobiyal Gelişim. Jenerasyon süresi. Bakterilerde üreme eğrisi. Örneğin; (optimum koşullar altında) 10/5/2015

Mikrobiyal Gelişim. Jenerasyon süresi. Bakterilerde üreme eğrisi. Örneğin; (optimum koşullar altında) 10/5/2015 Mikrobiyal Gelişim Tek hücreli organizmalarda sayı artışı Bakterilerde en çok görülen üreme şekli ikiye bölünmedir (mikroorganizma sayısı) Çok hücreli organizmalarda kütle artışı Genelde funguslarda görülen

Detaylı

(ZORUNLU) MOLEKÜLER İMMÜNOLOJİ I (TBG 607 TEORİK 3, 3 KREDİ)

(ZORUNLU) MOLEKÜLER İMMÜNOLOJİ I (TBG 607 TEORİK 3, 3 KREDİ) T. C. İSTANBUL BİLİM ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS PROGRAMI 2015-2016 EĞİTİM-ÖĞRETİM YILI DERS İÇERİKLERİ I. YARIYIL (ZORUNLU) MOLEKÜLER

Detaylı

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) M. Somma, M. Querci

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) M. Somma, M. Querci Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 6 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) M. Somma, M. Querci WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE

Detaylı

Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemleri

Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemleri Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemleri Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemlerine Giriş Doç. Dr. Bahar Tunçtan ME.Ü. Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Ab.D. ME.Ü. Tıp Fakültesi

Detaylı

BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ. Doç. Dr. Nurettin YÖREK

BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ. Doç. Dr. Nurettin YÖREK BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ Doç. Dr. Nurettin YÖREK DNA ile çalıģırken göz önünde bulundurmanız gereken temel özellikler: DNA basit bir moleküldür. Gerçekten! Sadece A, T, C ve G nükleotidlerini

Detaylı

KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR?

KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR? KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR? Prof. Dr. METİN ATAMER Dr. EBRU ŞENEL ANKARA ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ SÜT TEKNOLOJİSİ BÖLÜMÜ Kaliteli süt üretimi için sağlanması gereken koşullar; Sağlıklı inek Özenli

Detaylı

SU ve ÇEVRENİN CANLILAR İÇİN UYGUNLUĞU

SU ve ÇEVRENİN CANLILAR İÇİN UYGUNLUĞU SU ve ÇEVRENİN CANLILAR İÇİN UYGUNLUĞU Suyun polaritesinin etkileri Su molekülünün polar olması hidrojen bağlarının oluşmasına neden olur. 2 Su molekülü Oldukça basit yapılıdır. Tekli bağla bağlı olup

Detaylı

2+ 2- Mg SO 4. (NH 4 ) 2 SO 4 (amonyum sülfat) bileşiğini katyon ve anyonlara ayıralım.

2+ 2- Mg SO 4. (NH 4 ) 2 SO 4 (amonyum sülfat) bileşiğini katyon ve anyonlara ayıralım. KONU: Kimyasal Tepkimeler Dersin Adı Dersin Konusu İYONİK BİLEŞİKLERİN FORMÜLLERİNİN YAZILMASI İyonik bağlı bileşiklerin formüllerini yazmak için atomların yüklerini bilmek gerekir. Bunu da daha önceki

Detaylı

On-line Oksijen Tüketiminin Ölçülmesiyle Havalandırma Prosesinde Enerji Optimizasyonu

On-line Oksijen Tüketiminin Ölçülmesiyle Havalandırma Prosesinde Enerji Optimizasyonu On-line Oksijen Tüketiminin Ölçülmesiyle Havalandırma Prosesinde Enerji Optimizasyonu Speaker: Ercan Basaran, Uwe Späth LAR Process Analysers AG 1 Genel İçerik 1. Giriş 2. Proses optimizasyonu 3. İki optimizasyon

Detaylı

BENZENİN NİTROLANMASINDA GRAFİTİN KATALİZÖR OLARAK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

BENZENİN NİTROLANMASINDA GRAFİTİN KATALİZÖR OLARAK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI TÜBİTAK-BİDEB KİMYA BİLİM DANIŞMANLIĞI ÇALIŞTAYI ORGANİK KİMYA GRUBU BENZENİN NİTROLANMASINDA GRAFİTİN KATALİZÖR OLARAK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Proje Raporu Proje Ekibi Rebi BARIN İbrahim ŞEN Proje Danışmanı

Detaylı

FLORESAN İN SİTU HİBRİDİZASYON

FLORESAN İN SİTU HİBRİDİZASYON FLORESAN İN SİTU HİBRİDİZASYON Sağlık Teknikeri Hande ÇOLAKOĞLU Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Patoloji AD SIVI ve DOKULARIN FISH UYGULAMASI ÖNCESİ HAZIRLIK İŞLEMLERİ FISH Çalışmalarında Ön Uygulama

Detaylı

AVRASYA ÜNİVERSİTESİ

AVRASYA ÜNİVERSİTESİ Ders Tanıtım Formu Dersin Adı Öğretim Dili Moleküler Biyolojide Kullanılan Teknikler Türkçe Dersin Verildiği Düzey Ön Lisans () Lisans (X) Yüksek Lisans( ) Doktora( ) Eğitim Öğretim Sistemi Örgün Öğretim

Detaylı

DÖNEM 1- A, 3. DERS KURULU (2015-2016)

DÖNEM 1- A, 3. DERS KURULU (2015-2016) DÖNEM 1- A, 3. DERS KURULU (2015-2016) DERS SAATİ DERS ADI DERS KONUSU DERSİ VEREN ÖĞRETİM ÜYESİ 4. DK 1. Hafta 07 Aralık Pazartesi Mikrobiyoloji Mikrobiyolojinin tarihçesi ve mikroorganizmalara genel

Detaylı

A- LABORATUAR MALZEMELERİ

A- LABORATUAR MALZEMELERİ 1- Cam Aktarma ve Ölçüm Kapları: DENEY 1 A- LABORATUAR MALZEMELERİ 2- Porselen Malzemeler 3- Metal Malzemeler B- KARIŞIMLAR - BİLEŞİKLER Nitel Gözlemler, Faz Ayırımları, Isısal Bozunma AMAÇ: Karışım ve

Detaylı

SSO Yöntemiyle HLA Tiplendirmesi. Gürbüz POLAT

SSO Yöntemiyle HLA Tiplendirmesi. Gürbüz POLAT SSO Yöntemiyle HLA Tiplendirmesi Gürbüz POLAT SSO Diziye özgü oligonükleotid problarıyla PCR da çoğaltılmış DNA nın hibridizasyonu ile HLA allellerini saptamak için kullanılan moleküler tipleme yöntemidir.

Detaylı

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 6. Hafta (20.03.

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 6. Hafta (20.03. Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 6. Hafta (20.03.2014) 1 6. Haftanın Ders İçeriği DNA izolasyonu DNA hakkında 2 DNA İzolasyonu

Detaylı

Deney 1 HĐDROKSĐL GRUBU: ALKOL VE FENOLLERĐN REAKSĐYONLARI. Genel prensipler

Deney 1 HĐDROKSĐL GRUBU: ALKOL VE FENOLLERĐN REAKSĐYONLARI. Genel prensipler Deney 1 ĐDKSĐL GUBU: ALKL VE FENLLEĐN EAKSĐYNLAI Genel prensipler Alkol ve fenoller su benzeri organik yapılardır. - yapısındaki nin yerine; alkollerde alifatik grup(-),fenollerde ise aromatik grup(ar-)

Detaylı

MOLEKÜLER BİYOLOJİ ANABİLİMDALI

MOLEKÜLER BİYOLOJİ ANABİLİMDALI MOLEKÜLER BİYOLOJİ ANABİLİMDALI Biyoloji bilimini klasik ve modern olmak üzere iki kategoriye ayırmak mümkündür. Klasik biyoloji içerisinde Zooloji ve Botanik alt bilim dalları yer alırlar ve daha genel

Detaylı

FEN ve TEKNOLOJİ / GENETİK MÜHENDİSLİĞİ ve BİYOTEKNOLOJİ. GENETİK MÜHENDİSLİĞİ ve BİYOTEKNOLOJİ

FEN ve TEKNOLOJİ / GENETİK MÜHENDİSLİĞİ ve BİYOTEKNOLOJİ. GENETİK MÜHENDİSLİĞİ ve BİYOTEKNOLOJİ GENETİK MÜHENDİSLİĞİ ve BİYOTEKNOLOJİ 1 Genetik mühendisliği canlıların kalıtsal özelliklerinin değiştirilerek onlara yeni işlevler kazandırılmasına yönelik araştırmalar yapan bilim dalıdır. Genetik mühendisleri

Detaylı

Kimya Bilim Danış ışmanlığı Çalıştayı Farklı Kaynaklardan Elde Edilen Sütlerin S Mayalanma Sürelerinin S ve ph Değişimlerinin imlerinin Karşı şılaştırmalı Olarak İncelenmesi PROJE EKİBİ: : Nurdan Yavuz

Detaylı

BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ. Doç. Dr. Nurettin YÖREK

BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ. Doç. Dr. Nurettin YÖREK BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ Doç. Dr. Nurettin YÖREK DNA Manipüle Edici Enzimler DNA manipüle edici enzimler, katalizledikleri reaksiyonların tipine göre 5 ana sınıfa ayrılabilirler: 1) Nükleazlar

Detaylı

ENZİMLERİN GENEL ÖZELLİKLERİ - II. Doç Dr. Nurzen SEZGİN

ENZİMLERİN GENEL ÖZELLİKLERİ - II. Doç Dr. Nurzen SEZGİN ENZİMLERİN GENEL ÖZELLİKLERİ - II Doç Dr. Nurzen SEZGİN bstrate Enzyme substrate Enzyme substrate Enzyme substrate Enzyme substrate Enzyme substrate Enzyme substrate Enzyme substrate Enzyme substrate

Detaylı

Zeyfiye TEZEL Mehmet KARACADAĞ

Zeyfiye TEZEL Mehmet KARACADAĞ PROJENİN ADI: POLİMER KATKILI ASFALT ÜRETİMİNİN ARAŞTIRILMASI Zeyfiye TEZEL Mehmet KARACADAĞ ( Kimya Bilim Danışmanlığı Çalıştayı Çalışması 29 Ağustos-9 Eylül 2007) Danışman: Doç.Dr. İsmet KAYA 1 PROJENİN

Detaylı

ayxmaz/biyoloji Adı: 1.Aşağıda verilen atomların bağ yapma sayılarını (H) ekleyerek gösterin. C N O H

ayxmaz/biyoloji Adı: 1.Aşağıda verilen atomların bağ yapma sayılarını (H) ekleyerek gösterin. C N O H Adı: 1.Aşağıda verilen atomların bağ yapma sayılarını (H) ekleyerek gösterin. C N O H 2.Radyoaktif izotoplar biyologları için önemlidir? Aşağıda radyoakif maddelerin kullanıldığı alanlar sıralanmıştır.bunlarla

Detaylı

ZİRAAT MÜHENDİSİ (TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ)

ZİRAAT MÜHENDİSİ (TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ) TANIM Tarımsal Biyoteknoloji, bitki, hayvan ve mikrobiyal organizmaların genleri, hücreleri, proteinleri, kültürleri ve dokuları üzerinde çalışarak, tarımsal üretimi, kaliteyi, verimi arttırmayı amaçlayan

Detaylı

GENETİK ALGORİTMALAR. Araş. Gör. Nesibe YALÇIN BİLECİK ÜNİVERSİTESİ

GENETİK ALGORİTMALAR. Araş. Gör. Nesibe YALÇIN BİLECİK ÜNİVERSİTESİ GENETİK ALGORİTMALAR Araş. Gör. Nesibe YALÇIN BİLECİK ÜNİVERSİTESİ GENETİK ALGORİTMALAR Genetik algoritmalar, Darwin in doğal seçim ve evrim teorisi ilkelerine dayanan bir arama ve optimizasyon yöntemidir.

Detaylı

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ KİMYA ANABİLİM DALI

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ KİMYA ANABİLİM DALI İlaç Tasarımında Yeni Yazılımların Geliştirilmesi: Elektron Konformasyonel-Genetik Algoritma Metodu ile Triaminotriazin Bileşiklerinde Farmakofor Belirlenmesi ve Nicel Biyoaktivite Hesabı; ERCİYES ÜNİVERSİTESİ

Detaylı

EVDE KİMYA SABUN. Yağ asitlerinin Na ve ya K tuzuna sabun denir. Çok eski çağlardan beri kullanılan en önemli temizlik maddeleridir.

EVDE KİMYA SABUN. Yağ asitlerinin Na ve ya K tuzuna sabun denir. Çok eski çağlardan beri kullanılan en önemli temizlik maddeleridir. EVDE KİMYA SABUN Yağ asitlerinin Na ve ya K tuzuna sabun denir. Çok eski çağlardan beri kullanılan en önemli temizlik maddeleridir. CH 3(CH 2) 16 COONa: Sodyum stearat (Beyaz Sabun) CH 3(CH 2) 16 COOK:

Detaylı

Proteinlerin Primer & Sekonder Yapıları. Dr. Suat Erdoğan

Proteinlerin Primer & Sekonder Yapıları. Dr. Suat Erdoğan Proteinlerin Primer & Sekonder Yapıları Dr. Suat Erdoğan Sunum planı Proteinlerin moleküler yapılarını hangi kimyasal güçler belirler? Proteinlerin moleküler yapıları Primer yapı Sekonder yapı α-heliks

Detaylı