Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. İsa GÖKÇE 2008 Her hakkı saklıdır

Transkript

1 T.C. GAZİSMAPAŞA ÜİVERSİTESİ FE BİLİMLERİ ESTİTÜSÜ PCR EACER LARAK YEİ KİMYASALLARI KULLAABİLİRLİĞİİ ARAŞTIRILMASI Sema BİLGİ Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. İsa GÖKÇE 2008 er hakkı saklıdır

2 T.C. GAZİSMAPAŞA ÜİVERSİTESİ FE BİLİMLERİ ESTİTÜSÜ KİMYA AABİLİM DALI YÜKSEK LİSAS TEZİ PCR EACER LARAK YEİ KİMYASALLARI KULLAABİLİRLİĞİİ ARAŞTIRILMASI Sema BİLGİ TKAT 2008 er hakkı saklıdır

3 Doç. Dr. İsa GÖKÇE danışmanlığında, Sema BİLGİ tarafından hazırlanan bu çalışma 13/08/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalı nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan: Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ İmza: Üye : Doç. Dr. İsa GÖKÇE İmza: Üye : Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ İmza: Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü

4 TEZ BEYAI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Sema BİLGİ

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi PCR EACER LARAK YEİ KİMYASALLARI KULLAABİLİRLİĞİİ ARAŞTIRILMASI Sema BİLGİ Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. İsa GÖKÇE Moleküler biyoloji alanında önemli yer tutan ve bir in vitro DA parçaları çoğaltma metodu olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) geniş uygulama alanına sahip bir tekniktir. PCR, DA nın istenilen bir parçasını çoğaltmada duyarlı, seçici ve son derece hızlı bir yol sağlayan çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen genelde düşük verim ve spesifite problemleriyle sıkça karşılaşılır. Böyle problemli PCR reaksiyonlarının optimizasyonu için yaygın bir yaklaşım, reaksiyon karışımına bazı kimyasalların küçük miktarlarının ilavesidir. Yapılan bu çalışmayla, PCR ın verimini ve spesifitesini artırmada etkili olan PCR enhancerlarından oluşan bir enhancer kombinasyonu oluşturularak bu kombinasyonun değişik parametrelerde nasıl etkinlik gösterdiği, hangi şartlarda etkin bir PCR enhancer olarak kullanılabileceği ortaya konulmaya çalışıldı. Yapılan bu çalışmayla, son yıllarda genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan tekniklerden olan PCR ın verimini ve spesifitesini arttırmayla, moleküler biyolojik teşhise yönelik amaçlar için ticari enhancerlara alternatif daha ekonomik enhancer kombinasyonlarının oluşturulması hedeflendi. 2008, 75 sayfa Anahtar kelimeler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), Enhancer, Plazmit DA i

6 ABSTRACT Master Thesis IVESTIGATI F EW CEMICALS AS EACERS F PCR Sema BİLGİ Gaziosmanpaşa University Graduate School of atural and Applied Sciences Department of Cemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. İsa GÖKÇE The polymerase chain reaction (PCR) is an in vitro DA fragment amplification method that has an important place in molecular biology and it is highly versatile process. PCR is an effective, very fast and selective method for required DA fragment amplification but usually it encounters with low yield and specificity problems. The most common way of optimisation of these PCR reactions is to add very little amount of some chemicals into the reaction mix. In this work, effective enhancer combinations formed for increasing yield and specificity of PCR and it has been tried to reveal to fact that how efficient these combinations in different parameters and in what conditions they can be used as an effective PCR enhancer. In this study it is aimed to achieve to obtain alternative economic enhancer combinations for molecular biologic diagnosis by increasing yield and specificity of PCR that recently become one of the most commonly used technique in genetics and molecular biology. 2008, 75 pages Anahtar Kelimeler: Polimerase chain reaction (PCR), Enhancer, Plasmid DA ii

7 TEŞEKKÜR Öncelikle her zaman her konuda yanımda olan bana güç veren sevgili aileme ve çalışmam süresince bilgi ve tecrübesiyle bana rehberlik eden saygıdeğer hocam Doç. Dr. İsa GÖKÇE ye, deneysel çalışmalarım süresince laboratuarlarını bana açan sayın Doç. Dr. Şaban Tekin ve grubuna, Sayın Yrd. Doç. Dr. İskender Parmaksız a, manevi desteklerinden dolayı tüm çalışma arkadaşlarıma, lisansüstü eğitimim süresince 2210-Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı çerçevesinde verdiği bursla gerek bilimsel aktivitelere katılarak gerekse zengin bir kütüphane oluşturarak kendimi yetiştirmeme maddi katkılarından dolayı TÜBİTAK a sonsuz teşekkürler. iii

8 İÇİDEKİLER Sayfa ÖZET..i ABSTRACT..ii TEŞEKKÜR.iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİİ...vi ŞEKİLLER DİZİİ viii TABLLAR DİZİİ ix 1. GİRİŞ 1 2. KURAMSAL TEMELLER Deoksiribonükleik Asit Yapısı Ve Özellikleri Pürin ve Pirimidin Bazları ükleositler ükleotidler ükleik Asitler (DA) DA Çift Sarmal Yapıdadır ükleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu DA nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Çoğaltılması Polimeraz Zincir Reaksiyonunun luşum Mekanizması PCR nın Temel Bileşenleri Kalıp DA Polimerazlar Primerler dtp Tamponlar ve MgCl PCR Engelleyicileri (İnhibitörleri) ve Artırıcıları PCR nin İşleyişi PCR Ürünlerinin Belirlenmesi Ve Analizi PCR ptimizasyonu ve PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması Magnezyum İyonları Taq DA polimeraz konsantrasyonu Sıcaklıklar.23 iv

9 Touchdown PCR ot start PCR ested PCR Sillüs sayısı ve uzunluğu PCR katkı maddeleri MATERYAL ve YÖTEM Materyal Kullanılan Malzemeler ve Kimyasal Maddeler Cihazlar Tampon ve Çözeltilerin azırlanışı ,5 M EDTA Çözeltisi X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu Etidium Bromür X Bromophenol Blue FSB LB ve LB Agar Primerlerin azırlanışı mm lık dtp Mixin azırlanışı Kalıp DA nın azırlanışı Enhancer Çözeltilerinin azırlanışı Yöntem ücre kültürü ve Transformasyon Kalıp DA nın üretimi ve izolasyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonları Thermal Cycler ın Program Ayarı Agaroz Jel Elektroforezi BULGULAR ve TARTIŞMA SUÇ...70 KAYAKLAR...73 ÖZGEÇMİŞ...74 v

10 Simgeler g L M o o C s SİMGE ve KISALTMALAR DİZİİ Açıklamalar Gram Litre Molar Derece Santigrat Derece Saniye Kısaltmalar Açıklama µl Mikrolitre µm Mikromolar A Adenin AIDS Kazanılmış immün yetmezlik sendromu AP-PCR Arbitrarily Primed PCR Ark. Arkadaşları AT Adenin timin bç Baz Çifti BSA Bovine (sığır) serum albümin C Sitozin C-2 İkinci karbon cda Komplamenter DA datp Deoksiadenozin trifosfat dctp Deoksisitidin trifosfat dd 2 Deiyonize destile su (ultra saf su) dgtp Deoksiguanozin trifosfat dk Dakika DMS Dimetilsülfoksit DA Deoksiribonükleik Asit dtp Deoksiribonükleosid Trifosfat dsda Çift zincirli DA DTT Ditiotrietol dttp Deoksitimidin trifosfat E.coli Escherichia coli vi

11 EDTA G GC kb ma mg MgCl 2 ml mm mm nm nmol D 260 PAGE PCR Pfu pmol RAPD RA Rase rpm RT-PCR SDS ssda T TAE TE Tm TMAC UV v/v w/v Etilendiamintetraasetik Asit Guanin Guanin Sitozin Kilobaz Miliamper Miligram Magnezyum klorür Mililitre Milimetre Milimolar anometre anomol 260 nm deki optik dansite Poliakrilamid jel elektroforezi Polimeraz Zincir Reaksiyonu Pyroccoccus furiosus Pikomol Random Amplified Polymorphic DA Ribonükleik Asit Ribonükleaz Rotation Per Minute Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu Sodyum dodesil sülfat Tek zincirli DA Timin Tris-Asetat EDTA Tris-EDTA Erime sıcaklığı (melting temperature) Tetrametilamonyum klorid Ultraviyole acim/hacim Ağırlık/hacim vii

12 ŞEKİLLER DİZİİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Pürin ve pirimidin bazlarının kimyasal yapısı 3 Şekil 2.2. ükleositlerin kimyasal yapısı 4 Şekil ükleotitlerin kimyasal yapısı...5 Şekil 2.4. DA nın kimyasal yapısı...6 Şekil 2.5. DA nın yapısı...7 Şekil 2.6. PCR ın oluşum mekanizması 10 Şekil 2.7. PCR sıcaklık döngüleri:1.aşama:denatürasyon; 2.aşama:primerin bağlanması; 3.aşama:sentez..19 Şekil 2.8. Q solutionın polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri 29 Şekil 4.1. Test edilen compatible solutelerin kimyasal yapıları 46 Şekil 4.2. Test edilen düşük moleküler ağırlıklı amitlerin kimyasal yapıları...48 Şekil 4.3. Test edilen düşük moleküler ağırlıklı sülfonların kimyasal yapıları 51 Şekil 4.4. Test edilen sülfoksitlerin kimyasal yapıları..53 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jelelektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü 59 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü...60 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü 61 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü...62 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü...63 Şekil C lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü..65 Şekil C lik annealing sıcaklığında kalıp olarak plazmit DA saflaştırılmaksızın doğrudan e.coli kullanılarak gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü.66 Şekil Çalışmamızda test edilen enhancerların kimyasal yapıları...68 viii

13 TABLLAR DİZİİ Tablo Sayfa Tablo 2.1. Termostabil DA polimerazlar ve kaynakları...13 Tablo 2.2. PCR da sıklıkla kullanılan DA polimerazların özellikleri..13 Tablo 2.3. PCR artırıcıları..18 Tablo 2.4. PCR optimizasyonunda önemli değişkenler.21 Tablo 3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonlarında kullanılan enhancer konsantrasyonları ve hacimleri..39 Tablo 3.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonlarında kullanılan enhancer kombinasyonlarının bileşenleri..40 ix

14 1. GİRİŞ Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), spesifik bir DA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), DA nın istenilen bir dizisini çoğaltmada duyarlı, seçici ve son derece hızlı bir yol sağlar. Moleküler biyoloji alanında önemli yer tutan ve bir in vitro nükleik asit çoğaltma metodu olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) geniş uygulama alanı olan bir tekniktir. PCR ın kullanım alanları, (1) orak hücre anemisi, AIDS, lösemi vb. birçok hastalığın DA ve RA temeline dayalı tanısı için klinik tıpta; (2) Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında; (3) Doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde; (4) Allelik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde; (5) Arkeolojik örnekler kullanılarak evrimin incelenmesi alanlarında; (6) Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında; (7) Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde; (7) Probe'ların oluşturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında; (8) DA dizi analizinde, büyük miktarda DA örneklerinin oluşturulmasında; (9) Tarımda tohum saflığının belirlenmesinde kullanılabilir. Kısacası, PCR, çok geniş kullanım alanı olan ve modern genetikte çok yönlü kullanılabilen tekniklerden biridir. PCR çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen, PCR ile DA amplifikasyonunda, özellikle hedef dizinin veya primerin GC muhtevası yüksek olduğunda düşük verim ve spesifite problemleriyle sıkça karşılaşılır ve bu durum ya PCR ürününün oluşmaması veya birden fazla fragmentin ortaya çıkmasına yol açar. Böyle reksiyonların optimizasyonu için yaygın bir yaklaşım, reaksiyon karışımına dimetilsülfoksit (DMS), betaine, polyethylene glycol ve formamit gibi belirli organik kimyasalların küçük miktarlarının ilavesidir. Betaine, dimetil sülfoksit gibi küçük sülfoksitler, formamit gibi küçük amidler ya da β-merkaptoetanol gibi indirgeyici bileşikler son yıllarda kullanılan en önemli PCR arttırıcı katkı maddeleri (enhancerlar) olmakla beraber yüksek işlem hacimli deneyler için yeterince etkin değillerdir. Q-solution gibi ticari enhancerlar yukarıda sözü edilen enhancerlara göre daha etkin sonuçlar verirler ancak maliyetlerinin

15 2 yüksek olması, kimyasal bileşimlerinin tam olarak bilinememesi gibi başlıca iki dezavantaja sahiptirler (Ralser ve ark., 2006). Bu çalışmada, GC ce zengin kalıpların ya da problemli PCR ürünlerinin amplifikasyonunun optimizasyonunda etkili olan PCR arttırıcı bileşiklerin (enhancerların) değişik parametrelerde nasıl etkinlik gösterdiği, hangi şartlarda etkin bir PCR enhancer olarak kullanılabileceği ortaya konulmaya çalışıldı. Bu kapsamda, projemizde yapılan çalışmalar ile önce, literatür çalışması yapılarak enhancer olma (PCR da amplifikasyonu etkili bir şekilde artırabilme) potansiyeline sahip olan kimyasal maddeler belirlendi ve bunlar içinden amacımıza uygun olanlar seçildikten sonra standart PCR reaksiyonları için optimum şartlarda bu kimyasalların çeşitli kombinasyonlarının enhancer olarak kullanılabilirliği araştırıldı. Çalışmamız son yıllarda genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan tekniklerden olan PCR ın verimini ve spesifitesini arttırmaya yönelik çalışmalara katkıda bulunacak olması ayrıca Q-çözeltisi (Q-solution) gibi ticari enhancerlara alternatif olarak kullanılabilecek daha ekonomik enhancerların tespit edilmesi yönüyle önem taşımaktadır.

16 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1. Deoksiribonükleik Asit Yapısı ve Özellikleri Pürin ve Pirimidin Bazları DA da başlıca iki sınıf baz vardır: Pürin ve pirimidin bazları. Bütün bazlar pürin ve primidin türevleridir. Pürin ve pirimidin bazlarının her ikisi de aromatik karakterdedir. Pürin, bir pirimidin ve ona bitişik bir imidazol halkasından oluştuğundan pirimidin türevi olarak da düşünülebilir. ükleotitlerde en çok bulunan azotlu bazlar; urasil, timin ve sitozin pirimidinleri ile adenin ve guanin pürinleridir (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). 2 2 Adenin Guanin 2 Sitosin Timin Urasil Şekil 2.1. Pürin ve pirimidin bazlarının kimyasal yapısı

17 ükleositler Pürin ve pirimidin bazlarının, bir 2-deoksi-D-riboza bağlanmasıyla nükleositler oluşur. Bir nükleositte pentozun anomerik 1 no lu karbonu, primidinin 1 no lu, pürinin ise 9 nolu azotuna -glikozid bağı ile bağlanmıştır (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). Başlıca deoksiribonükleositler deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksitimidin ve deoksisitidindir. 2 2 Deoksiadenozin Deoksiguanozin 2 Deoksisitidin Deoksitimidin Şekil 2.2. ükleositlerin kimyasal yapısı

18 ükleotidler ükleotidler, nükleositlerin fosfat esterleridir. Biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DA da bulunan esterleşme 5 nolu karbon atomu üzerindedir. Böyle bir bileşik 5 - nükleotid olarak gösterilir. Üstlü sayı pentoz şekerindeki bir karbon atomunu belirler. Üstsüz sayı ise, pürin ve pirimidin bazlarının halka atomlarından birisine işaret eder P - Deoksiadenilat - P - Deoksiguanilat 2 - P - P - - Deoksisitidilat Deoksitimidilat Şekil ükleotitlerin kimyasal yapısı

19 ükleik Asitler (DA) DA deoksiribonükleotitlerin kovalent bağlanmış zincirlerinden meydana gelmiştir. Zincirler, bir nükleotidin 5 hidroksil grubu ile bunu takip eden nükleotidin 3 -hidroksil grubu arasında fosfodiester köprüsü ile oluşturulur. ükleik asit zincirinde 5 ve 3 uçları bulunur. Bu zincirlerin baz dizlişleri verilirken 5 3 yönü kullanılır (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). P Baz C 2 P Baz C 2 P Baz C 2 DA Şekil 2.4. DA nın kimyasal yapısı

20 DA Çift Sarmal Yapıdadır Birbirini izleyen deoksiriboz ve fosfat gruplarının hidrofilik omurgası dış yüzeyde olup, yapıyı çevreleyen suyla ilişkidedir. er bir deoksiribozun furanoz halkası, C-2 iç taraf yapısındadır. er bir iplikçiğin pürin ve pirimidin bazları çift sarmalın iç tarafına yığılmıştır. Ayrıca hemen hemen düzlemsel ve hidrofobik olan halkasal yapılar birbirine çok yakın ve uzun eksene dik pozisyondadır (elson ve Cox, 2005). DA ikili sarmalı, nonpolar iç bölgedeki baz çiftlerinin etkileşimi sonucu oluşan hidrofobik ilişkilerle stabilize edilir. idrojen bağları, doğru baz çiftleşmesinin oluşumunun yanında DA kararlılığına da katkıda bulunurlar. Stabilizasyonda ayrıca katyonik ilişkiler ve bazlar arasında van der Waals etkileşimleri de önemlidirler. DA stabilitesi, sahip olduğu GC baz miktarından etkilenir. GC baz eşleşmesi, AT eşleşmelerinden farklı olarak iki yerine üç hidrojen bağı ile gerçekleştirildiğinden GC bakımından zengin bölgeler daha kararlıdır (Topçu, 2007). DA omurgasının fosfatları negatif yüklere sahip olduklarından birbirlerini iterler. Bu durum DA kararlılığını azaltıcı bir olgudur. Yüksek tuz konsantrasyonu bu etkiden kaynaklanan kararsızlığı azaltır. Etidyum bromid gibi hidrofobik, planar yapıdaki moleküller DA sarmalının merkezindeki baz çiftlerinin arasına girerek heliksin genişlemesine neden olurlar (Topçu, 2007). Şekil 2.5. DA nın yapısı 1. DA nın formülü 2. Çift zincirli DA

21 ükleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu İkili sarmal DA nın denatürasyonu sonucu -bağları kopar, çiftli yapı çözülür ve zincirler birbirinden ayrılır. Ancak, kovalent bağlar kırılmaz. Isı ya da kimyasal yolla uyarılabilen zincirlerin ayrılması sırasında DA nın akışkanlığı azalır, UV absorpsiyonu ve denge yoğunluğu artar. Isı sonucu oluşan denatürasyona bazen erime (melting) denir. Isıtılan DA çözeltisinin UV absorpsiyonundaki artış, hiperkromik kayma olarak adlandırılır ve ölçümü çok kolaydır (Klug ve Cummıngs, 2003). G C baz çifti, A=T ye göre bir fazla hidrojen bağı içeriğinden, ısıya karşı daha dayanıklıdır. Bu nedenle, A=T ye göre daha fazla G C çifti içeren DA ların tamamen denatüre olması için daha yüksek sıcaklıklar gereklidir. Eğer erime sırasında, DA nın 260 nm deki absorpsiyonu (D 260 ) izlenir ve sıcaklığa karşı grafiğe geçirilse, bir erime profili elde edilir. Bu profilin ya da eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir ve DA zincirinin %50 sinin açılmış ya da denatüre olduğu noktayı gösterir. Eğrinin platosu maksimum optik yoğunluğa (.D) ulaştığında, denatürasyon tamamlanmıştır ve ortamda sadece iki tek zincir bulunmaktadır (Klug ve Cummıngs, 2003). Isı ile denatüre edilen DA yavaşça soğutulursa, tamamlayıcı zincirler arasındaki rastgele çarpışmalar sonucu zincirler tekrar bir araya gelir. Uygun sıcaklıkta, zincirlerin ikili yapısını kazanmasını sağlayacak şekilde hidrojen bağları tekrar kurulur. Soğuma zamanıyla birlikte oluşan ikili sarmal sayısı artacaktır. Duruma göre, ikili sarmal oluşumu için bazlar arasında tam bir uygunluk gerekli değildir, ancak bir araya gelen zincirlerde, en azından yer yer baz eşleşmesinin olduğu bölgeler bulunmalıdır (Klug ve Cummıngs, 2003). 2.2.DA nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Çoğaltılması ücrelerde DA doğal olarak, replikasyon ile çoğalır. DA çift sarmalında birbirinden ayrılan ipliklerin tamamlayıcıları sentezlenerek bir DA molekülünden onunla aynı olan iki yavru molekül meydana gelir. Buna göre de hücre bölünmesiyle yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen geçerler. er yeni hücre jenerasyonunda genlerin kopya sayılarının iki katına çıkması nedeniyle jenerasyonlar boyunca DA miktarı başlangıca

22 9 göre üssel olarak artar. Örneğin 30 jenerasyon sonra hücre ve gen sayısında milyarlarca kez artış olur. In vitro koşullarda istenilen bir genin ya da özgün bir DA dizisinin çok sayıda kopyasının elde edilmesi için rekombinant DA yöntemleri ile DA klonlamasına ek olarak, 1980 li yıllardan itibaren Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) da kullanılmaya başlanmıştır (Temizkan ve Arda, 2004). PCR ilk kez Kaliforniya da Berkeley yakınlarında, Cetus Firmasında çalışan Kary Mullis tarafından 1985 yılında icat edilmiştir. İlk PCR da E.coli DA polimeraz I in Klenow fragmanı kullanılmıştır (Mullis,1990). Bu enzim, DA dupleksinin denatüre olduğu ısıya erişmeden denatüre olup aktivitesini kaybediyordu. Bu nedenle her döngüde reaksiyon ortamına ilave ediliyordu. Ayrıca, reaksiyon ortamı, işlemler için gerekli olan farklı ısılarda su banyoları arasında dolaştırılıyordu. Bu şekilde yapılan PCR reaksiyonu son derece zahmetliydi. Daha sonra iki önemli aşama kaydedildi: 1. Isıya dayanıklı bir DA polimeraz, Yellowstone Ulusal Parkındaki bir sıcak su kaynağından izole edilen Thermus aquaticus bakterisinden elde edildi. Bu bakteri 85 C nin üstündeki bir sıcaklıkta kendi DA sını replike etmekteydi. 2. tomatik ısı kontrollü, ısıyı çok süratle azaltıp, artırabilen cihazlar yapıldı (İşcan, 2003). PCR ile istenilen genlerin ya da DA dizilerinin jenerasyonlara bağlı replikasyonu, hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. Aynen doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30 jenerasyon sonra seçilmiş bir DA dizisinin aşağı yukarı milyar katını kopyalar (Temizkan ve Arda, 2004) Polimeraz Zincir Reaksiyonunun luşum Mekanizması Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler, kalıp DA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenirler. Primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfat (dtp) varlığında primerin 3 hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DA ipliğine tamamlayıcı olan yeni

23 10 DA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin bağlanması (annealing) ve primerlerin uzatılması (extension) olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Ardarda tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve primerlerin uzaması evreleriyle DA parçaları üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır (Temizkan ve Arda, 2004). PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu 3 aşamadan oluşan siklüs: 1.Aşama: denatürasyon 94 C de 1dakika 2.Aşama: primerlerin bağlanması 54 C de 45 saniye Sens ve Revers Primerler!!! 3.Aşama: primerlerin uzatılması 72 C de 2 dk yalnızca dtp ler Andy Vierstracte 1999 Şekil 2.6. PCR ın oluşum mekanizması

24 PCR nın Temel Bileşenleri PCR ın temel bileşenleri, kalıp olarak kullanılan DA molekülü, DA polimeraz enzimi, primerler, dtp karışımı, tampon ve MgCl 2 dür Kalıp DA PCR da genomik DA lar, plazmid ve faj DA ları, çeşitli genler ve hatta herhangi bir DA parçası kalıp olarak kullanılabilir. Bu kalıp DA molekülleri amaca göre cda, genom kitaplıkları halinde, ya araştırma laboratuarları ve kliniklerden ya da ticari olarak elde edilir (Temizkan ve Arda, 2004). Kalıp olarak kullanılacak DA temiz olmak zorunda değildir. Kurumuş kan veya semen gibi adli tıp örnekleri, tek bir saç teli, uzun süre saklanmış tıbbi örnekler, mumya kalıntıları ve fosil gibi değişik kaynaklardan, genomik DA elde edilebilir (İşcan, 2003). PCR de kalıp olarak tek ya da çift iplikli DA nın yanı sıra RA da kullanılabilir. Kalıp olarak RA kullanılacaksa total RA ya da poli (A) + RA dan önce klasik yolla cda elde edilir ya da Thermus thermophilus kaynaklı rekombinant Tth DA polimeraz enzimi kullanımıyla aynı tüpte RA dan DA ürününün elde edilmesi tek kademeli olarak yapılabilir. Eğer yüksek molekül ağırlıklı genomik DA kalıp olarak kullanılacaksa, DA kısmi kesim yapan otl ya da Sfil gibi restriksiyon enzimleriyle kesildikten sonra kullanılmalıdır. Genellikle kalıp DA da hedef dizinin konsantrasyonu bilinmediğinden, PCR nın pozitif kontrol DA ile optimizasyonu faydalıdır. ptimizasyon çalışmalarında normalde klonlanmış bir DA parçası için nanogram, genomik DA için ise mikrogram düzeyindeki miktarlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004). Eğer çoğaltılacak kalıp DA dizisi hakkında bilgi mevcut değilse, bu durumda gelişigüzel başlatılmış (Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR)) veya gelişigüzel çoğaltılmış polimorfik DA (Random Amplified Polymorphic DA (RAPD)) yöntemleri kullanılarak genomik parmak izleri çıkartılabilir (İşcan, 2003).

25 12 En iyi kalıplar, DA sentezini durdurabilen ya da nükelotit bazlarının yanlış birleşmesine neden olabilen çentikler, kırıklar ve kontamine edici proteinler içermeyen kalıplardır. Yüksek GC muhtevasına ve sekonder yapıya sahip kalıpların amplifikasyonunu optimize etmek oldukça zordur (Buckingham ve Flaws, 2007) Polimerazlar DA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz ederler. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5 uçtan 3 uca doğru olup, primerin serbest 3 hidroksil ucuna ortamdaki dtp lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır (Temizkan ve Arda, 2004). Termostabil (sıcaklığa dayanıklı) DA polimeraz enziminin PCR de kullanılmaya başlanması araştırma ve klinik laboratuarlarında rutin olarak yapılan deneylere teknolojik olarak büyük bir avantaj sağlamıştır. Önceleri kullanılan Escherichia coli nin DA polimeraz I enziminin Klenow fragmenti sıcaklığa dayanıklı olmadığı için, her PCR döngüsünde denatürasyon aşamasından sonra yeniden enzim ekleme zorunluluğu duyulmaktaydı. Ancak günümüzde kullanılan termostabil DA polimerazlarla bu sorun ortadan kalktığından enzimin amplifikasyonun başlangıcında tüplere konulması yeterli olmaktadır (Temizkan ve Arda, 2004).

26 13 Günümüzde PCR de yaygın bir şekilde kullanılan bazı termostabil DA polimerazların adları ve kaynakları Tablo 2.1 de, bu enzimlerin özellikleri Tablo 2.2 de verilmiştir. Tablo 2.1 Termostabil DA polimerazlar ve kaynakları DA polimeraz Doğal/Rekombinant Kaynak Taq Amplitaq Amplitaq (Stoffel fragment) ot Tub TM Pyrostase TM Vent TM Deep Vent TM Tth Pfu UITma TM Doğal Rekombinant Rekombinant Doğal Doğal Rekombinant Rekombinant Rekombinant Doğal Rekombinant Thermus aquaticus T. aquaticus T. aquaticus Thermus flavis T. flavis Thermococcus litoralis Pyrococcus GB-D Thermus thermophilus Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima Tablo 2.2. PCR da sıklıkla kullanılan DA polimerazların özellikleri Taq/ Stoffel Vent TM Pfu Tth Amplitaq fragment UITma TM Termostabilite > >50 * 95 C deki yarılanma ömrü (dakika) 5 3 ekzonükleaz var yok yok yok var Yok aktivitesi 3 5 ekzonükleaz yok yok var var yok Var aktivitesi Processivity * * * * * * * * Kalıbı uzatma oranı 75 >50 >80 60 >33 * * * (ükleotid/saniye) Revers transkriptaz zayıf zayıf * * * * * * var * * * aktivitesi luşan DA ucu 3 A 3 A >%95 * * * 3 A Küt küt *97,5 C de ölçülmüştür. * * Enzimin DA kalıbından ayrılmaksızın kalıba eklediği ortalama nükleotid sayısı. * * *Bilgi bulunmamaktadır.

27 Primerler Gen çoğaltılması dâhil PCR ın birçok uygulaması için kalıp DA ya tamamen tamamlayıcı olan primerlere gereksinim vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler nükleotid uzunluğundadır. ligonükleotid primerler, primer sentezi yapan laboratuarlardan ya da ticari olarak elde edilebilirler. Primer tasarımı yapılırken çoğaltılması istenen DA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere tamamlayıcı olan primerler tasarlanır. Primer tasarımı yapmak için bilgisayar programları da geliştirilmiş olmakla beraber, çoğu zaman araştırıcılar ilgilendikleri genleri ya da DA parçalarını çoğaltmak için kendileri primer tasarımı yapmak durumundadırlar. Tasarım yapılırken mümkün olduğunca dört bazın eşit sayıda kullanımına dikkat edilir. Primerin Tm değeri, amplifikasyon reaksiyonunun spesifitesi için kritik bir aşama olan optimal annealing sıcaklığının belirlenmesi için başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Dolayısıyla forward ve revers primerler benzer Tm değerine sahip olacak şekilde tasarlanmalıdır ki her ikisi de aynı annealing sıcaklığında optimal olarak hibridize olabilsin. Tm primerlerin uzunlukları arttırılarak ya da kalıp üzerinde daha çok ya da daha az G ve C lere sahip bölgelere yerleştirilerek ayarlanabilir (Buckingham ve Flaws,2007). Sonucu olumsuz etkileyici istenmeyen oluşumları en aza indirgemek için önem verilmesi gereken bazı noktalar: primerlerin polipürün, poliprimidin ya da tekrarlı bölgeler içermemesi, primer çiftlerinin 3 uçlarının birbirine ya da primer içindeki bir bölgeye tamamlayıcı olmaması (Temizkan ve Arda, 2004), primerin dimer oluşturmasını engellemek için 3 ucunda G ve C ler bulunmamasıdır (İşcan, 2003). Spesifik bir primerin 5 ucuna, genellikle primer annealinginin spesifitesini etkilemeyecek şekilde restriksiyon enzimi tarafından tanınacak bir diziden oluşan tail (kuyruk), bir capturing dizi ya da radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bir etiket (label) ilave edilebilir (Lisby, 1998).

28 dtp Deoksiribonükleozid trifosfatlar (datp,dgtp, dttp, dctp) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Taq DA polimeraz düşük dtp konsantrasyonlarında (10-100µM) kalıba uygun, doğru bazları seçmede daha başarılı olmakla birlikte, normal koşullarda PCR 100 µm dtp konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Ayrıca optimal dtp konsantrasyonu; (1) MgCl 2 konsantrasyonuna, (2) reaksiyon koşullarına, (3) primer konsantarsyonuna, (4) çoğaltılmış ürünün boyuna, (5) PCR döngü sayısına bağlıdır. Yapılacak PCR için en uygun dtp konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir (Temizkan ve Arda, 2004) Tamponlar ve MgCl 2 PCR tamponları enzim aktivitesi için optimal şartlar sağlar. KCl (20-100mM), amonyum sülfat (15-30 mm) ya da tek değerli katyonların diğer tuzları önemli tampon bileşenleridir. Bu tuzlar DA nın denatürasyon ve annealing sıcaklıklarını ve enzim aktivitesini etkiler. Tampon/tuz şartlarının etkisi farklı primerler ve kalıplar için değişiklik gösterir. PCR da kullanılan çeşitli tamponlar arasında en çok kullanılanı Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur. Diğer enzimler için de benzeri tamponlar bulunmakta ve bunlar çoğunlukla satın alınan enzimle birlikte 10 konsantrasyonda sağlanabilmektedir. Mg +2 iyonları dtp ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar, polimeraz aktivitesini uyarırlar ve çift iplikli DA nın Tm değerini artırırlar, ayrıca primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu nedenle MgCl 2 ün PCR ın özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCl 2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mm lık değerler tercih edilir. Düşük Mg +2 konsantrasyonu, enzim etkinliğini düşürerek ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg +2 konsantrasyonu ise yanlış birleşmeleri destekleyerek spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl 2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl 2 kullanımına gerek yoktur (Temizkan ve Arda, 2004) PCR Engelleyicileri (İnhibitörleri) ve Artırıcıları. PCR çeşitli maddeler ile engellenebildiği gibi aynı zamanda bu maddelerin kullanımıyla artırılabilir. Birçok faktör PCR nin engellenmesine yol açar, burada sadece

29 16 optimizasyon çalışmaları için sıklıkla kullanılanlardan söz edilecektir. Çeşitli tipteki maddelerin engelleme için tehlike oluşturması PCR de kullanılan biyolojik örneklerin çeşitliliğinden ve DA izolasyonunda kullanılan yöntem ve maddelerden kaynaklanmaktadır. Çok sayıda değişik biyolojik örnek (hayvan dokuları ve vücut sıvıları, bakteri örnekleri, adli ve arkeolojik materyaller) PCR de DA kaynağı olarak kullanılır. Örneğin insan DA sı, periferal kan hücrelerinden, idrardan, feçesden, hücre döküntülerinden, saç kökünden, semenden, serebrospinal sıvıdan, biyopsi materyallerinden, amniyon sıvısından, plasenta ve koriyonik villus gibi değişik biyolojik kaynaklardan izole edilir. Bu doğal kaynaklar çok çeşitli bilinmeyen engelleyicileri içerirler. Bu nedenle inhibisyonun olmadığına ilişkin olarak PCR kontrolleri yapılmalıdır. DA izolasyonu için en sık kullanılan materyallerden biri kandır. Kanın pıhtılaşmasını engellemek için EDTA lı ya da heparinli tüpler kullanılır. Ancak heparin PCR için potansiyel bir inhibitördür. Bunun dışında kanda bulunan porfirin gibi diğer maddeler de PCR için kuvvetli inhibitör etki gösterirler, bu nedenle DA izolasyonu sırasında lizis ve santrifüjleme aşamalarında uzaklaştırılırlar (Temizkan ve Arda, 2004). Biyolojik örneklerin çeşitliliği nedeniyle, bu farklı kaynaklardan DA izolasyonu yöntemleri de birbirlerinden oldukça farklıdır ve bu durum izolasyon işlemleri sırasında farklı inhibitörlerin uzaklaştırılmasını zorlaştırır. Farklı kaynaklardan da olsa DA izolasyonu işlemlerinde hücre parçalanması ve denatürasyon için deterjanlar kullanılır. DA izolasyonunda çoğunlukla kullanılan Triton X-100, Tween 20, onidet P40 gibi iyonik olmayan deterjanların %5 in altındaki konsantrasyonları genellikle PCR yi engellemezler. Diğer yandan sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi iyonik deterjanlar sadece son derece düşük konsantrasyonlarda kullanıldıklarında tolere edilebilirler. Bu nedenle PCR den önce fenol ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi ile uzaklaştırılmalıdırlar. Bu deterjanlar normal olarak PCR de tolere edilebildikleri konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonlarda kullanılırlar. Örneğin SDS %1-2 (w/v) konsantrasyonda kullanılır, ancak Taq DA polimeraz %0,01 (w/v) den yüksek konsantrasyonlarda inhibe olur. SDS in düşük konsantrasyonlarının inhibitör etkisi iyonik olmayan belli deterjanların (%0,5 Tween 20 ve onidet P40 gibi) kullanımıyla ortadan kaldırılabilir (Temizkan ve Arda, 2004; Gelfand, 1989).

30 17 Deterjanların kullanıldığı izolasyon işlemlerinin çoğu, denatürasyona uğramış proteinleri parçalayan proteinaz K nın varlığında gerçekleştirilir. Taq DA polimeraz, protein yıkımına duyarlı olduğundan proteinaz K uzaklaştırılmalı ya da inhibe edilmelidir. 95 C de termal denatürasyon bu inhibisyon için yeterlidir. Sıcaklık uygulamasını genellikle proteinaz K yı da denatüre edecek fenol ekstraksiyonu izler. Ardışık olarak uygulanan santrifüjleme DA nın sıvı fazda kalmasını sağlarken, proteazı da fenol fazına ayırır. Fenolün çok düşük miktarları bile PCR yi engelleyeceğinden, kalan fenol, kloroform: izoamil alkol (49:1) veya eter ekstraksiyonu ya da DA nın etanol ile çöktürülmesi ile uzaklaştırılabilir (Temizkan ve Arda, 2004). Birçok araştırıcı çeşitli maddelerin eklenmesinin PCR etkinliği ya da özgünlüğünü artırdığını belirlemişlerdir. Bu maddelerin etkilerini nasıl gösterdikleri tam olarak belirlenmemiş olmasına rağmen, konu ile ilgili çeşitli açıklamalar vardır. Örneğin, Bovine serum albumin ( µg/ml) inhibitörleri bağlar ve enzimi stabilize eder. Dithiothreitol (0.01 mm) enzim aktivitesini artırabilen indirgeyici şartlar sağlar. Reaksiyon karışımına ilave edilen formamit ( 1%-10%) yüksek sekonder yapıya sahip DA nın denatürasyon sıcaklığını düşürerek primerlerin bağlanma olasılığını artırır. 1%-10% luk konsantrasyonlarda ilave edilen dimetil sülfoksit, gliserol ve triton X-100 gibi kaotropik ajanlar (chaotropic agents) sekonder yapıları azaltabilir böylece zor bölgeler boyunca polimerazın zinciri uzatmasına imkan verir. Bu ajanlar bir de enzim stabilitesine katkıda bulunurlar (Buckingham ve Flaws, 2007). Bu arttırıcı maddelerin kullanımındaki en önemli güçlük, başarılı bir sonuç almak için hangi maddenin hangi tip PCR de kullanılacağının belirli olmamasıdır. Artırıcılar belirli bir konsantrasyonda kullanıldıklarında PCR ı olumlu olarak etkilerler, ama aynı koşullar bir başka PCR da aynı etkiyi göstermeyebilirler. Bu maddelerin bazıları Tablo 2.3 de verilmiştir. Bu PCR artırıcılarının (enhancerların) yüksek konsantrasyonlarının Taq DA polimerazı inhibe ettiği düşünüldüğünden optimum konsantrasyonları deneysel olarak belirlenmelidir (Temizkan ve Arda, 2004).

31 18 Tablo 2.3. PCR artırıcıları Madde Konsantrasyon Formamid %5 Dimetil sülfoksit (DMS) <%10 Tetrametilamonyum klorid (TMAC) µM Polietilen glikol 6000 (PEG) %5-15 Gliserol %10-15 Tween 20 % deaza-dgtp Kullanılacak toplam dgtp nin %75 i PCR nin İşleyişi Termostabil DA polimerazların ve farklı sıcaklık derecelerini istenilen süreler için otomatik olarak ayarlanabilen PCR aletlerinin (thermal cycler) kullanıma sunulması, PCR nin verimi ve kullanımında önemli gelişmelere yol açmıştır. Verimli bir PCR için; (1) denatürasyon, (2) primerlerin bağlanması, (3) primerlerin uzaması, (4) döngü sayısı, (5) PCR makinesinin sıcaklık iniş ve çıkış süreleri önemlidir (Temizkan ve Arda, 2004). Polimeraz zincir reaksiyonu mikrotüplerde gerçekleştirilir. Amaca göre farklı PCR tüpleri ve değişik sıcaklık dereceleri kullanılabilir. PCR de bir döngüyü oluşturan aşamaların sıcaklık değerleri ile süreleri Şekil 2.7 de verilmiştir. PCR çift zincirli DA ile başlar. İlk aşamada (denatürasyon aşamasında) çift zincirli DA replike edilebilmesi için iki tek zincire denatüre edilir. Bu kalıba bağlı olarak birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar C de örnek ısıtılarak gerçekleştirilir. Başlangıç denatürasyon aşaması genomik ya da diğer büyük DA kalıp fragmentleri için uzatılabilir. Sonraki denatürasyonlar daha kısa olabilir. Bir sonraki aşama PCR ın spesifitesi açısından çok büyük önem taşıyan annealing aşamasıdır. Annealing sıcaklığının primerler ve reaksiyon şartları ile optimize edilmesi önemlidir. Annealing sıcaklıkları C arasında olup genellikle deneysel olarak belirlenir. Başlangıç noktası primer dizilerinin Tm si kullanılarak belirlenebilir. Reaksiyon şartları, tuz konsantrasyonu, yanlış eşleşmeler, kalıp durumu ve sekonder yapı reaksiyondaki primerlerin gerçek Tm sini etkileyecektir. Primerlerin Tm değerinin hesaplanması için çeşitli formüller ve bilgisayar programları kullanılmaktadır.

32 19 Çoğu zaman hesaplanan Tm değerinin 3-5 C altındaki sıcaklıklar bağlanma sıcaklığı olarak seçilir ve daha sonra optimum sıcaklık değeri denenerek saptanır (Temizkan ve Arda, 2004). Primerlerin uzaması aşamasında genellikle Taq/Amplitaq DA polimerazların polimerizasyon aktivitesi için en uygun sıcaklık derecesi olan 72 C kullanılır. Uzama aşaması için çoğu zaman iki dakika yeterli olmakla birlikte, eğer uzun amplikonlar (PCR ile çoğaltılan DA parçası) çoğaltılıyorsa süre artırılır. PCR ürünü olan tüm moleküllerde reaksiyonun tamamlanmasını garanti altına almak için son döngünün uzama süresi çoğunlukla uzun (10-15 dakika) tutulur (Temizkan ve Arda, 2004). Toplam döngü sayısı genellikle arasındadır. Döngü sayısının artırılması halinde istenmeyen ürünler fazlalaşırken, istenen ürünlerde herhangi bir artış meydana gelmez. Bu yüzden 40 dan fazla sayıda döngüden oluşan PCR reaksiyonları genellikle başarılı sonuçlar vermez (Temizkan ve Arda, 2004). Şekil 2.7. PCR sıcaklık döngüleri:1. aşama: denatürasyon; 2. aşama: primerin bağlanması; 3. aşama: sentez

33 PCR Ürünlerinin Belirlenmesi ve Analizi PCR ürünleri (amplikonlar) boyları primerlerle sınırlandırılmış DA parçası ya da parçaları dır. PCR ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi edinilebilir: (1) edef DA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi (2) Başlangıç materyali olarak kullanılan DA ya da RA nın kabaca ya da kesin miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi (3) Dizi analizi PCR tamamlandıktan sonra ürünler başka bir aşamada kullanılmadan önce, ürün kalitesi kontrol edilmelidir. Çünkü PCR bazen çeşitli nedenlerden dolayı başarılı olmayabilir. Örneğin, kullanılan DA kaliteli değildir, seçilen primerler uygun değildir veya birden fazla tanıma dizisi vardır. Ürün doğru boyutlarda değildir. Bazen ürün oluşmuştur ancak çoğaltılacak gen uzunluğunda değildir. Bu durumda primerlerden birisi diğer primere yakın bir bölgeye yerleşmiştir ya da primerler yanlışlıkla tamamen farklı bir geni tanımıştır. Jelde birden fazla bant gözlemlenebilir, bu durumda primerlerin bazısı doğru yerlere yerleşmiştir, ancak bazıları yanlış yerleşerek, farklı dizilerin çoğaltılmasına neden olmuştur (İşcan, 2003). Fragmante edilmiş DA moleküllerinin ayrıştırılmasında, tanımlanmasında ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemler poliakrilamid (PAGE) ve agaroz jel elektroforezleridir (Sambrook, 1989). Bu metodların ilkesi; yapısındaki fosfat grubu nedeniyle negatif yüklere sahip olan DA moleküllerinin elektriksel alanda pozitif elektroda doğru hareket etmesidir. Bu işlemde jel porları nedeniyle küçük DA molekülleri daha hızlı hareket ederler. Yöntem basit olması, kısa zamanda yapılabilmesi ve yoğunluk gradienti gibi diğer yöntemlerle ayrıştırılamayan fragmanların analizine olanak sağlaması bakımından moleküler biyolojide sıklıkla kullanılmaktadır. Standart agaroz jeller genellikle PCR ürünlerinin (200 bç-50 kb büyüklüğündeki DA moleküllerinin) analizi için yeterli ayırma gücüne sahiptir. Poliakrilamid jeller ise daha çok bç büyüklüğündeki DA moleküllerinin analizlerinde kullanılmaktadır (Topçu, 2007). Agaroz ya da poliakrilamid jellerde, bir flouresan boya olan ve DA zincirlerinin arasına giren, etidyum bromür (EtBr) boyaması ile ürünler görülür. Boyamadan sonra DA, jelde bir UV transilüminatörden yararlanılarak görülebilir hale gelir. Jelin kalıcı görünümü fotograflanarak elde edilir. Boyutu bilinen işaret DA lar

34 21 ve kontrol PCR ürünleri de aynı elektroforez jeline uygulanır, böylece çoğaltılmış ürünün boyutu hakkında fikir edinilir (Temizkan ve Arda, 2004) PCR ptimizasyonu ve PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması PCR nin etkinliği ve özgünlüğünde etkili olan çeşitli faktörler vardır. Bunlardan kalıp DA nın kalitesi, primer tasarımı, MgCl 2 konsantrasyonu, DA polimeraz ve tampon koşulları özellikle önemli olanlardır (Grunewald, 2003). Bu faktörlerin hepsi Tablo 2.4. de verilmiştir. Tablo 2.4. PCR optimizasyonunda önemli değişkenler 1. PCR de sıcaklık profili (primerlerin bağlanması, uzama, denatürasyon, bir evreden diğerine geçiş zamanı, döngü sayısı) 2. Magnezyum iyonunun konsantrasyonu 3. Primer tasarımı ve konsantrasyonu 4. Kalıp kalitesi ve konsantrasyonu 5. PCR tamponu 6. dtp konsantrasyonu 7. PCR arttırıcı eklenmesi 8. PCR inhibitörleri 9. ested primerlerle sekonder PCR 10. ot-start PCR PCR amplifikasyonunun başarısına bağlı olarak optimize şartlara ihtiyaç duyulabilir. Test örnekleri ile paralel kontrol reaksiyonları gerçekleştirmek, herhangi bir spesifite ya da kontaminasyon problemlerinin olup olmadığını göstermek için önemlidir (McPherson and Moller, 2007). Bu nedenle her PCR uygulamasına uygun kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontroller enzimin aktif olduğundan, tamponun optimal olduğundan, primerlerin doğru dizilere bağlandığından ve termal cyclerın (PCR aletinin) uygun biçimde çalıştığından emin olmak için yapılmalıdır. DA sız bir negatif kontrol (kontaminasyon kontrolü ve reagent blank olarak da adlandırılır), reaksiyon karışımının kalıp DA ya da önceki uygulamadan kaynaklı amplifiye edilmiş ürünlerle kontamine edilmediğinden emin olmak için kullanılmalıdır. edef dizinin bulunmadığı DA kullanılarak gerçekleştirilen negatif bir kontrol (negative template control)

35 22 primerlerin DA nın istenmeyen dizilere bağlanmadığından emin olmak için gerçekleştirilir. Bazı PCR uygulamalarında internal kontrol gerçekleştirilir. Kontrolün bu türünde (amplifikasyon kontrolünde) primerlerin ikinci bir seti ve ilgisiz bir hedef (unrelated target), test örneği amplifiye edilmese bile reaksiyonun çalıştığını göstermek için reaksiyon karışımına ilave edilir. Özdeş bir örnek üzerinde amplifikasyon kontrolünü gerçekleştirmek kabul edilebilir olmasına rağmen, amplifikasyon kontrolleri tercihen test reaksiyonu ile aynı tüpte gerçekleştirilir. Bu tür kontrol PCR sonuçları pozitif ya da negatif olarak rapor edildiğinde ki negatif hedef dizilerin mevcut olmadığı anlamına gelir, çok önemlidir. Amplifikasyon kontrolü, örnek için doğru negatif ve amplifikasyon başarısızlığı (false-negatif) arasında ayrım yapmak için önemlidir (Buckingham ve Flaws, 2007) Magnezyum İyonları Magnezyum iyon konsantrasyonu PCR spesifitesi açısından önemlidir. dtp-mg 2+ kompleksleri nükleik asitlerin şeker-fosfat omurgası ile etkileşir ve Taq DA polimeraz aktivitesini etkiler. Bu yüzden MgCl 2 konsantrasyonunun değişimi aynı şartlar altında bir diğerinden önemli ölçüde farklı davranan bir primer/template çiftine yol açabilir. Mg 2+ iyon konsantrasyonunun etkisini analiz etmek için genel strateji, standart tamponu ayarlamaktır ki MgCl 2 konsantrasyonu genellikle 0.5 ya da 1mM lık aşamalarla 0.5 ve 5mM arasında değişir. Genelde konsantrasyonlardan biri, önemli ölçüde artmış PCR ürün örneği gösterecektir. Reaksiyonda dtp lerin konsantrasyonu değiştirildiğinde Mg 2+ konsantrasyonunun değiştirilmesi gerektiği hatırlanmalıdır (McPherson ve Moller, 2007). Ayrıca enzimatik DA sentezi için optimal Mg +2 konsantrasyonu kullanılan DA polimerazın özellikleri tarafından belirlenir. Örneğin Taq ve Klentaq DA polimerazlar için optimal Mg +2 konsantrasyonu sırasıyla 1,5-2 ve 3-4 mm dır. Bu nedenle kullanılan DA polimeraza bağlı olarak PCR karışımında doğru Mg +2 konsantrasyonunun kullanıldığından emin olmak gerekir. Çok yüksek Mg 2+ konsantrasyonu, DA polimerazın aktivitesini artırarak DA sentezinin verimini artırırken non-spesifik ürünlerin amplifikasyonuna yol açabilir. Çok düşük Mg 2+ konsantrasyonu ise PCR spesifitesini artırırken amplifikasyon veriminin düşmesine neden olacaktır (Ignatov ve ark., 2002).

36 Taq DA polimeraz konsantrasyonu Eğer hiç ürün bandı elde edilemediyse ya da zayıf bandlar elde edildiyse çok az Taq DA polimeraz kullanılmış olabilir. Taq DA polimerazın farklı versiyonları çeşitli spesifik aktivite ve konsantrasyonlarda sağlanabilir. Termostabil proofreading DA polimerazlar Taq DA polimerazdan daha düşük processivitye sahip olabilir ve bu nedenle başarılı amplifikasyon için daha fazla enzime ihtiyaç duyulabilir. Termostabil polimerazların yüksek sıcaklıklarda inaktive olacağını hatırlamak da önemlidir çünkü polimerazların inaktivasyonu ürün miktarının azalmasına yol açabilir. Mümkün olduğunca düşük denatürasyon sıcaklığı kullanarak 90 C nin üzerinde enzimin geçireceği zamanı sınırlandırmaya çalışmak önemlidir. Örneğin birçok protokolde tavsiye edilen 94 C den ziyade 90 C ya da 92 C lik bir sıcaklıkda çalışmak ve/ya da denatürasyon aşaması için süreyi kısaltmak önemlidir (McPherson ve Moller, 2007) Sıcaklık Denatürasyon PCR için tek zincirli kalıpları sağlamak üzere kalıbın etkin olarak denatüre edilmesi önemlidir. Eğer bu aşama verimsiz olursa kısmen denatüre olmuş duplex moleküller, etkin primer bağlanmasını ve DA nın uzatılmasını önleyecek biçimde hızla yeniden birleşecektir. er bir siklüsün başlangıcında kısa bir denatürasyon aşaması vardır. Birçok protokol bu aşamada 94 C lik bir sıcaklık kullanırken GC ce zengin olanlar daha yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyabilmelerine rağmen birçok kalıp için C lik bir sıcaklık kullanmak yeterli olabilir. Reaksiyonda en yüksek DA polimeraz aktivitesini kaybetmemek için etkin en kısa süre ve en düşük etkin sıcaklık kullanmaya çalışmak yararlıdır (McPherson ve Moller, 2007). Annealing PCR ın başarısı şiddetle spesifiteye bağlıdır ki bu, primerin yalnızca hedef dizisine bağlanması anlamına gelir bu nedenle bu moleküler etkileşimi optimize etmek önemlidir. Primerin yalnızca onun mükemmel komplementerine bağlanıp bağlanmadığı önemli ölçüde annealing sıcaklığına bağlıdır. Genellikle daha yüksek annealing

37 24 sıcaklığı primerin kalıp üzerindeki komplementer dizisine daha spesifik bağlanmasını sağlar ve böylece yalnızca hedef dizi amplifikasyonu daha büyük bir olasılıkla gerçekleşir. Daha düşük sıcaklık, kalıp ve primer arasında daha fazla yanlış eşleşmelere neden olabilir ki bu, hedef olmayan dizilerin amplifikasyonunun artmasına neden olur. Pratikte annealing aşamasına 55 C gibi bir sıcaklıkda başlamak genellikle uygundur. Eğer ürünün zayıf kazanımı ve nonspesifik ürünlerin amplifiyesi söz konusu olursa optimal annealing sıcaklığının deneysel olarak belirlenmesi gerekli olabilir ayrıca bu durum MgCI 2 konsantrasyonunun optimizasyonu ile ilişkilendirilebilir. Annealing için genellikle yaklaşık 30-60s lik bir süre önerilir ve daha kısası daha iyidir. Polimeraz, annealing sıcaklığında kısmi aktiviteye sahip olacağından bu sıcaklıkda reaksiyonun daha uzun tutulması nonspesifik ürünlerin amplifikasyon riskini artıracaktır (McPherson ve Moller, 2007). Ayarlanan annealing sıcaklık aşaması kalıp ve primer arasındaki eşleşmenin spesifitesini değiştirebilir. Eğer hiç ürün yoksa sıcaklığın çok yüksek olduğu düşünülüp azaltılabilir, örneğin başlangıçta 55 C olan sıcaklık 50 C ye azaltılabilir. Yeni sıcaklıkda primerler daha etkin olabilir. Eğer yalnızca bir primerin bulunduğu kontrol lane larında ürünler varsa bu, tek primerin kalıbın bir bölgesinden daha fazlasına bağlandığını ve ürünleri ürettiğini gösterir. Bu durumda annealing sıcaklığı arttırılmalıdır. Çalışılan annealing sıcaklığı optimal değilse ne olur? Kaç sıcaklık denenmeli ve ne aşamada sıcaklık ayarlanmalıdır? Daha da önemlisi böyle bir optimizasyon deneyini gerçekleştirmek için kaç tane termal cyclera sahip olmak gerekir? Günümüzde bir reaksiyonda optimal annealing sıcaklık profillerinin eş zamanlı olarak belirlenmesi gerektiğinde, buna imkan veren bir gradient bloğa sahip olan termal cyclerlar kullanılmaktadır. Gradient bloğa sahip PCR cihazlarında PCR şartlarının optimizisyonu süresince önceden belirlenen 8 ya da 12 farklı sıcaklığı eş zamanlı test eden tek bir blok kullanılmaktadır. Böylece farklı annealing sıcaklıklarına ihtiyaç duyulan bağımsız deneylerin eş zamanlı olarak gerçekleştirilmesi mümkün olmaktadır. Ancak her laboratuvar böyle bir cihaza sahip değildir. Primer/template annealingini optimize etmek için, annealing sıcaklığını başlangıçta 2-5 C lik ayarlamalarla test etmek uygun bir yoldur (McPherson ve Moller, 2007).

38 Touchdown PCR Touchdown PCR, başlangıçta primerlerin Tm sinden daha yüksek annealing sıcaklığı ile başlar ve ondan sonra PCR ın ilk siklüsleri süresince annealing sıcaklığı Tm nin altına kademeli olarak düşürülür. Bu, herhangi bir nonspesifik annealing olayı gerçekleşmeksizin primerlerin yalnızca doğru hedef dizilerine spesifik olarak bağlanmalarını sağlar. Böylece elde edilen ilk ürünler spesifik olduğundan PCR ın ilk siklüslerinde doğru hedef dizilerin konsantrasyonu artar. Don ve ark. tarafından tanımlanan thumb kuralına göre yaklaşık 20 nükleotit uzunluğunda primerler kullanıldığında ilk 20 siklüs süresince annealing sıcaklığı 65 C den 55 C ye her iki siklüsde bir 1 C düşürülürek gerçekleştirilir. ndan sonra reaksiyon 55 C lik bir annealing sıcaklığında bir 10 siklüs daha gerçekleştirilerek tamamlanır (McPherson ve Moller, 2007). Ya da başlangıç siklüsünde annealing sıcaklığı, primerlerin Tm değerine eşit ya da 2-5 C altında bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar 1-2 C/siklüslük aşamalarla düşürülür. Touchdown PCR, başlangıç primer-kalıp çift zincir oluşumunun spesifitesini ve böylece final PCR ürününün spesifitesi artırır (Anonim, 2005) ot start PCR DA bir örnekden ekstrakte edildiğinde kaçınılmaz biçimde birkaç DA tek zincirli formda olacaktır. PCR analizinin bileşenleri oda sıcaklığında karıştırılırsa primerler tek zincirli DA ya spesifik olmayacak biçimde bağlanabilirler. Taq polimeraz oda sıcaklığında bir miktar aktiviteye sahip olduğu için örnek thermal cyclera konulmadan önce spesifik olmayan DA sentezlenebilir. Bunu engellemek için uygulanabilecek metotlardan biri, sıcaklık optimal primer annealing sıcaklığına ya da üzerine çıkıncaya kadar reaksiyonun temel bileşenlerinden birini (Taq polimeraz ya da MgCl 2 gibi) reaksiyon ortamına koymamaktır-bu yöntem hot-start PCR olarak adlandırılır. Bu, spesifik olmayan primer annealing sıcaklığının üzerindeki sıcaklıklarda enzimi denatüre eden bir monoklonal antibody ile enzimatik aktivitenin inhibisyonuyla ya da birkaç dakika 90 C nin üzerinde inkübe edilerek aktive edilebilecek inaktif bir enzim kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bir diğer metot PCR bileşenlerini 0 C de karıştırmaktır. Bu sıcaklıkta DA denatüre olmayacaktır ve Taq polimeraz aktif

39 26 değildir. Örnek önceden ısıtılmış thermal cyclera (94-96 C) doğrudan yerleştirildiğinde spesifik olmayan amplifikasyonun önüne geçilmiş olur- bu yöntem cold-start PCR olarak adlandırılır (Lisby, 1998). ot start PCR ı gerçekleştirmek için çeşitli stratejiler vardır; en ucuz prosedür DA polimeraz olmaksızın tüm reaksiyonları kurmaktır ve 90 C den yüksek sıcaklıkda başlangıç denatürasyon aşamasını tamamlamak için termal cyclerda tüpleri inkübe etmektir. ndan sonra tüpleri, 70 C nin üzerinde tutarken DA polimerazın uygun miktarı reaksiyon karışımına ilave edilir fakat mineral yağ kullanılıyorsa öncelikle pipet ucu mineral yağ tabakasının içinden geçirilerek polimeraz reaksiyon karışımına ilave edilmeli ki polimeraz yağın üstünde kalmayıp reaksiyona girebilsin. Bu yaklaşım göreceli olarak az sayıda reaksiyonun gerçekleştirildiği araştırma laboratuarında kullanılabilir. Ancak bu çok sayıda örnek prosesi için uygun değildir çünkü: her bir tüpe enzim ilavesi zaman alır bir ya da daha fazla tüpe enzim ilavesini başaramamanın yol açtığı problem olabilir. tüpleri açma ihtiyacından dolayı kontaminasyon riski oluşabilir. Çeşitli ticari reagentlar günümüzde hot startı kolaylaştırmak için temin edilebilir ve böyle ürünler rutin hot start uygulamaları için tavsiye edilmektedir (McPherson ve Moller, 2007) ested PCR PCR spesifitesi çok çok düşük olduğunda bir nested PCR metodu PCR ürün verimini artırabilir. ested PCR iki aşamalı amplifikasyon reaksiyonları gerektirir. Birinci-aşama PCR, standart PCR protokolüne göre gerçekleştirilir. Sonradan birinci-aşama PCR ürününün bir aliquatı, örneğin de bir lik bir dilüsyonun (1/10 3-1/10 4 lik bir dilüsyon) 1µl si ikinci aşama PCR da amplifiye edilir. İkinci-aşama PCR, birinci-aşama primer-kalıp dizilerinin içindeki dizilere hibridize olan iki yeni pirimerlerle gerçekleştirilir (Anonim, 2005). Böylece eğer birinci PCR döngüsünde yanlış bir dizi kopyalandı ise (primerler DA da birden fazla diziyi tanıyabilir), bu ürünün, ikinci set

40 27 primerler tarafından tanınma olasılığı düşük olacaktır ve yalnızca spesifik birinci-aşama PCR ürünleri ikinci aşamada amplifiye olacaktır (İşcan, 2003) Siklüs sayısı ve uzunluğu Genelde PCR ın cycle (siklus) sayısı sonraki analizler ya da DA manipülasyonlarında kullanılmak üzere yeterli ürün elde etmek için ihtiyaç duyulan minumum düzeyde tutulmalıdır. Bu, nonspesifik ürünlerin birikme ve hataların ortaya çıkma olasılığını azaltır. Temel protokol, yeterli ürün vermezse başlangıçta kalıp miktarını artırmak denenebilir. Alternatif olarak PCR ın cycle (siklus) sayısı arttırılabilir. 40 siklüslük bir reaksiyon süresince her 5 siklüsde bir yani 25., 30. ve 35. siklüsde 0.1 lik hacimde (50µl lik hacmin 5 µl si gibi) bir aliquatı alarak PCR ları örneklemek mümkündür. ndan sonra örnekler uygun sayıda siklusu belirleyebilmek için agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Bu sayı, tek bir ürünün yüksek verimle eldesi için gerekli olan minimum sayıdır (McPherson ve Moller, 2007). PCR spesifitesini etkileyebilen bir diğer husus PCR süresince sıcaklıklar arası geçiş zamanıdır. Genellikle sıcaklık artışı ne kadar kısa sürede gerçekleşirse (faster ramping rates) spesifite o denli yüksek olur (McPherson ve Moller, 2007) PCR katkı maddeleri Çeşitli enhancer bileşiklerin PCR ın spesifitesini ve etkinliğini artırdığı bilinmektedir. Bunlar reaksiyonun etkin annealing sıcaklığını artıran kimyasalları, DA bağlayıcı proteinleri ve ticari olarak elde edilebilir reagentları içerir. Böyle katkı maddeleri, primer annealing spesifitesini artırmak, primerlerin bağlanma olasılığını artırmak, özellikle GC ce zengin diziler gibi zor kalıplar söz konusu olduğunda PCR verimini artırmak, ürün uzunluğunu artırmak, ürün spesifitesini artırmak, enzim stabilitesine katkıda bulunmak için PCR lara ilave edilebilir. Ayrıca enhancerlar sıklıkla PCR ın ticari optimizasyon ve enhancer kitlerinin bileşenleri olarak kullanılırlar. Baz eşleşmesinin destabilizasyonuna yol açan katkı maddeleri özellikle GC ce zengin diziler gibi zor kalıplar söz konusu olduğunda PCR ı artırabilir ve yanlış eşleşen primer-kalıp komplekslerinin göreceli olarak daha fazla destabilize olmasını sağlayarak

41 28 spesifiteyi de artırabilir. Bu bileşikler optimal olmayan PCR şartlarını iyileştirmek için bazı durumlarda yararlı olabilmesine rağmen bazıları, kalıpların ve primer kombinasyonlarının geniş bir aralığına uygulanamaz. er PCR da başarıyı kesinleştirecek olan büyülü bir katkı maddesi yoktur ve annealing sıcaklığı gibi farklı şartlar altında farklı katkı maddelerini test etmek gerekli olabilir. Farklı annealing sıcaklıklarının otomatik testine izin veren bir gradient termal cycler kullanımı ile böyle bir test kolaylaştırılır (McPherson ve Moller, 2007). Enhancerlar kullanıldığında, herbir PCR analizine bağlı olarak aşağıdaki etkiler gözlemlenebilir; (1) Enhancer önceden başarısız olan bir reaksiyonu amplifiye edebilir; (2) Enhancer belirli primer kalıp sistemlerinde PCR spesifitesini artırabilir; (3) Enhancer PCR performansı üzerine etki etmez; (4) Enhancer önceden başarıyla gerçekleştirilmiş amplifikasyon reaksiyonunun verimini düşürebilir ya da onu başarısız kılabilir. Enhancerlar kullanıldığında yukarıda belirtilen dört durumla da karşılaşılabileceğinden belirli bir primer-kalıp çifti için ilk kez bir enhancer kullanıldığında her zaman enhancerlı ve onsuz paralel reaksiyonlar gerçekleştirilmelidir. Enhancerların polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri, enhancer olarak Q-çözeltisi kullanılarak ve kullanılmayarak gerçekleştirilen reaksiyon ürünlerine ait aşağıda yer alan jel fotograflarında görülmektedir.

42 29 -: Q-çözeltili +: Q-çözeltisiz M: Markör Şekil 2.8. Q çözeltinin (solution) polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri Durum A: Q-çözeltisi önceden başarısız olan bir reaksiyonu amplifiye edebilir. Durum B: Q-çözeltisi belirli primer kalıp sistemlerinde PCR spesifitesini artırabilir. Durum C: Q-çözeltisi PCR performansı üzerine etki etmez Durum D: Q-çözeltisi önceden başarıyla gerçekleştirilmiş amplifikasyon reaksiyonunun verimini düşürebilir ya da onu başarısız kılabilir. Bu durumda Q çözelti ilavesi önceki optimal primer-kalıp annealingini bozmuş olabilir (Anonim, 2005).