TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU TEKNİK RAPOR COXIELLA BURNETII'NİN KENELERDEN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR) VE PCR-RFLPİLE SAPTANMASI

Transkript

1

2

3 TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU TEKNİK RAPOR COXIELLA BURNETII'NİN KENELERDEN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR) VE PCRRFLPİLE SAPTANMASI 00

4 TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU 690 sayılı kanım ile kurulmuş olan Türkiye Atom Enerjisi Kurumu'nun ana görevi; atom enerjisinin barışçıl amaçlarla ülke yararına kullanılmasında izlenecek ulusal politikanın esaslarmı ve bu konudaki plan ve programları belirlemek; ülkenin bilimsel, teknik ve ekonomik kalkınmasında atom enerj isinden yararlanılmasını mümkün kılacak her türlü araştırma, geliştirme, inceleme ve çalışmayı yapmak ve yaptırmak, bu alanda yapılacak çalışmaları koordine ve teşvik etmektir. Bu çalışma TAEK personeli tarafından gerçekleştirilmiş araştırma, geliştirme ve inceleme sonuçlarmm paylaşımı amacıyla Teknik Rapor olarak hazırlanmış ve basılmıştır. Teknik Rapor 00/ Türkiye Atom Enerjisi Kurumu yayınıdır. /t: _. % İzin alınmaksızın çoğaltılabilir. >Si & Referans verilerek kullanılabilir. TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU Adres : Eskişehir Yolu 9. km 060 Ankara/Türkiye Tel :+90 () Fax :+90 () Web :

5 ONSOZ Co^iella 6umetü, Q humması hastalığının etiyolojik, etkeni olup, obligat intraselüler bir bakteridir. (Doğada yaygın olarak^ bulunur ve çeşitti hayvanlarda (sığır, koyun, kgçi) ve insanlarda (^humması enfeksiyonunu oluşturur, C. burnetii sütlerden, Senelerden ve akut veya kronik^ Q humması ile enfeste insanlardan izole edilmiştir, "Keneler, C burnetii'nin rezervuarı ve birincilvektörleridir. Kırktanfazla kgne türünün C burnetii ile enfeste olduğu saptandığından Seneler doğada enfeksiyonun belirleyicisi olarak^görülmektedirler, (Bu çalışmada, Türkiye'nin 8 ilinden toplam 47 (446 dişi, 0 erkekj, nymph) adet kene toplanmıştır, (Bu keneler toplandığı ile, tür ve cinsiyetine göre 7 adedi bir araya getirilerekgruplandırılmışve gruplar (DNA ekştrakşiyonu sonrasında C(B ve C(B primerleri kullanılarakjpc ( Rjle C. burnetii'nin varlığı yönünde incelenmiştir, (Bu teknik^ rapor, TA'EK stratejisi çerçevesinde 007/ nolu Çenelgede belirtilen formata uygun olarak^ V'E TübitakıOlfVKflÇ^lOO) "Coxjella. burnetii'nin "Kenelerden (polimeraz Zincir Reaksiyonu ((PC%) ve ( PC c Rz c RTL ( P ile Saptanması (projesi" sonucunda elde edilen bilgilerin ve çalışma metodunun gerek^yayın olarak^ gerek,çeşitli kuruluşlarda düzenlenen bilimsel toplantılarda yapılan sunular çerçevesinde bilim dünyasına sunulması hedeflenmektedir.

6

7 İÇİNDEKİLER Tablolar Dizini i Şekiller Dizini ii Yönetici Özeti iii Executive Summary iv Terimler ve Kısaltmalar. v. GİRİŞ. MATERYAL ve METOT. Kenelerin toplanması ve saklanması. Kenelerin tür ve cinsiyet tayini. Kenelerin gruplandırılması.4 Kenelerin DNA ekstraksiyonu için hazırlanması. Kenelerden DNA ekstraksiyonu.6 Pozitif kontrol DNA.7 Kullanılan primerler 6.8 Negatif kontrol 6.9 PCR için uygun primer seçimi 6.0 PCR amplinkasyonu 6. Ekstraksiyon kitinin kontrolü 7. Elektroforez ve görüntüleme 7. Restriction fragment length polymorrphism(rflp) 7. BULGULAR 8. Kenelerin tür ve cinsiyet tayini sonuçları 8. Ekstraksiyon kitinin kontrol sonucu. PCR standardizasyon bulguları.4 PCR bulguları. PCR ile C. burnetü pozitif bulunan kene gruplarının tür ve cinsiyet dağılımları 4.6 Restriction fragment length polymorrphism(rflp) bulguları TARTIŞMA ve SONUÇ 6. KAYNAKLAR 9

8

9 Tablolar Dizini Tablo. Toplanan kenelerin illere göre tür ve cinsiyet dağılımları 8 Tablo. Türkiye'nin 8 ilinden toplanan toplam 47 kenenin tür ve cinsiyet dağılımları Tablo. PCR ile C. burnetü pozitif bulunan kene gruplarının tür ve cinsiyet dağılımları ı

10

11 Şekiller Dizini Resim. Resim : Pozitif PCR ürünlerinin görüntüleri. 0M: 0'lik marker; P: Coxiella burnetii Nine Mile RSA49 susu; N: Negatif kontrol; 007: Denizli pozitif örnekler; 6 Ankara pozitif örnek; 00M:00'lük marker. 4 Resim. 7'lik pozitif PCR ürünlerinin restriksiyon profil analizi. 0 M: 0'lik marker; P: Coxiella burnetii Nine Mile RSA49 susu; N: Negatif kontrol; 007: Denizli pozitif örnekler; 6: Ankara pozitif örnek; 00M: 00'lük marker ıı

12

13 Yönetici Özeti Coxiella burnetii, Q humması hastalığının etiyolojik etkeni olup, obligat intraselüler bir bakteridir. Doğada yaygın olarak bulunur ve çeşitli hayvanlarda (sığır, koyun, keçi) ve insanlarda Qhumması enfeksiyonunu oluşturur. C. burnetii sütlerden, kenelerden ve akut veya kronik Q humması ile enfekte insanlardan izole edilmiştir. Keneler, C. burnetii 'nin rezervuarı ve birincil vektörleridir. Kırktan fazla kene türünün C. burnetii ile enfekte olduğu saptandığından keneler doğada enfeksiyonun belirleyicisi olarak görülmektedirler. Bu çalışmada, Türkiye'nin 8 ilinden toplam 47 (446 dişi, 0 erkek, nymph) adet kene toplandı. Bu keneler toplandığı ile, tür ve cinsiyetine göre 7 adedi bir araya getirilerek gruplandırıldı. Gruplar DNA ekstraksiyonu sonrasında CB ve CB primerleri kullanılarak PCR ile C. burnetii 'nin varlığı yönünde incelendi. Denizli'den toplam 6 kene toplanmış olup, bu keneler tür ve cinsiyetlerine göre gruba ayrılmışlardır. Bu gruplardan 6'sı PCR sonucunda pozitif bulunmuştur. Ankara'dan toplanan toplam 60 kene ise aynı şekilde gruba ayrılmış ve bu gruplardan sadece birinde PCR sonucunda pozitiflik saptanmıştır. PCR ürünlerinin spesifisitesi restriksiyon analizi ile değerlendirildi. Pozitif PCR ürünleri Taql enzimi ile kesildiğinde C. burnetii Nine Mile RSA49 susunda görüldüğü gibi yaklaşık 8, 7, 4 ve 9 bp'lik 4 bant ortaya konuldu.

14

15 Executive Summary Coxiella burnetii, as an obligate intracellular bacterium, is the etiologic agent of Q fever. It is widely distrubuted in nature and is responsible for infection in various animals (cattle, sheep, goat) and humans. C. burnetii has been isolated from milk, ticks and human patients with acute and chronic Q fever. Ticks are the principal vectors and reservoirs of C. burnetii. Since over 40 species of ticks have been found to be infected with C. burnetii, ticks can serve as indicators of infection in nature. In this study, total of 47 ticks (446 female, 0 male and nymphs) were collected from 8 provinces of Turkey. The ticks were gathered into groups of lto 7 ticks as to the provinces, species and gender for DNA extraction. Following DNA extraction, the groups were examined for the presence of C. burnetii by using the primers CB and CB. The ticks collected from the province of Denizli (6 in total) were gathered into groups according to the species and gender. From these groups, 6 were positive for C. burnetii. The ticks collected from Ankara province, total of 60 ticks, were grouped into as to their species and gender, and only one group was found to be positive for C. burnetii. The specificities of the PCR products were evaluated by restriction analysis. The positive PCR products were digested with the enzyme Taql and four bands in order of 8, 7, 4 and 9 bp's were appeared such as seen in the positive control DNA (C. burnetii Nine Mile RSA49). IV

16

17 Kısaltmalar ve Terimler Kısaltmalar PCR DNA OMP ddh0 TAE Bp PCRRFLP : Polımeraz zmcır reaksiyonu : Deoksiribonükleik asit : Dış membran proteini : Çift distile su : TrisAsetatEDTA solüsyonu : Baz çifti : Polimeraz zincir reaksiyonurestriksiyon enzim analizi Terimler PCR : Laboratuar ortamında spesifik DNA dizilerinin primer denilen sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla çoğaltılması işlemi. Transstadial bulaşma : Hastalık etkeninin parazitin bir gelişme aşamasından diğer gelişme aşamasına aktarılması. Örn: Kenenin nymf aşamasından ergin keneye aktarılması. Transovarial bulaşma : Anneden yavruya bulaşma yolu.

18

19 . GİRİŞ Q humması, obligat intrasellüler bir mikroorganizma olan Coxiella burnetifnm neden olduğu zoonotik bir enfeksiyondur. Etken insana öncelikli olarak aerosol yolla bulaşır ve rüzgar aracılığıyla yayılabilir. Diğer bulaşma yolları ise çok az öneme sahiptir. C. burnetü 'nin rezervuarları sayısızdır ve bunlar arasında evcil ve yabani memeliler, kuşlar ve artropodlar yer almaktadır [6,7]. Bunların içinde en önemli rezervuarlar sığır, koyun ve keçidir. Bu hayvanlarda enfeksiyonun sonucu olarak abortus oluşmasına karşın hastalık genellikle asemptomatik seyreder [ 9, ]. C. burnetü birçok fiziksel ve kimyasal faktörlere karşı dirençli olduğundan çevrede uzun süre canlı kalabilme yeteneğine sahiptir. Bu özellik hastalığın kontrolünde önemli bir engel oluşturmaktadır [6]. Keneler C. burnetü 'nin doğadaki vektörüdür. Keneler etkeni sadece dışkılarıyla veya ısırarak horizontal olarak bulaştırmazlar aynı zamanda transstadial ve transovarial olarak da aktarabilirler. Kene dışkıları doğada C. burnetivrim muhtemelen en yoğun kaynağıdır. C. burnetivmn konak hayvanlara bulaşması kenelerin ısırmasıyla ya da enfekte salgılarla temas aracılığıyla olmaktadır [9]. Kırktan fazla kene türünün C. burnetü ile infekte olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle keneler doğada enfeksiyonun belirleyicisi olarak görülmektedir. Örneğin; Slovakya'nm farklı bölgelerinden toplanan Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Dermacentor marginatus, Haemaphysalis concinna ve Haemaphysalis inermis türlerinden 0 C. burnetü susu izole edilmiştir [7]. C. burnetü çeşitli kene türlerinden izole edilebilmesine karşın, insanlarda kene aracılığıyla enfeksiyon yaygın değildir. Çünkü enfeksiyon kontamine aerosollarm inhalasyonundan, taze çiftlik ürünlerinin tüketiminden ve enfekte hayvanlarla temastan sonra oluşmaktadır. Enfeksiyon insanlarda akut ve kronik olmak üzere iki formda ortaya çıkar. Akut formda; pnömoni, ateş, granülamatöz hepatitis ve nadiren meningoensefalitis görülmektedir. Kronik formda ise endokarditis oluşmaktadır. Farklı ülkelerden elde edilen veriler, hastalığın klinik görünümünün ve epidemiyolojisininbölgeden bölgeye değiştiğini göstermektedir [9]. Kenelerin bu etkenin çevrede canlılığını devam ettirmesinde önemli bir rol oynadığı görülmektedir. C. burnetü önceden bir riketsiyal etken olarak sınıflandırılmıştır. Daha sonra 6 S rrna geninin moleküler sekansına dayanarak proteobacteria kategorisinin

20 y altbölümüne yerleştirilmiştir. C. burnetii 'nin Rickettsid'dan ziyade Legionella ve Franciseüa türleri ile daha yakın ilişkili olduğu görülmüştür [4, 6]. C. burnetii küçük pleomorfik çomakcıklar şeklindedir ve zorunlu hücre içi parazitidir. Gram negatif bakterilerinkine biraz benzeyen membrana sahiptir. Etken bazı ayırıcı özelliklere sahiptir ve bu da patojenitelerine katkıda bulunur. Etken sporulasyona benzer bir süreç geçirir ve bu dış çevreden korunmasını ve dolayısıyla uzun süre canlı kalmasını sağlar. C. burnetii 4. ph'daki fagolizozomlar içerisinde bile canlı kalabilir, çoğalabilir ve metabolizmalarını devam ettirebilir [4]. Memeli konakçılarda, C. burnetii makrofajları infekte eder ve konak hücresi olarak buralara yerleşir. Etken büyük vakuollerde (fagolizozom) çoğalır ve makrofajlar bu etkenleri öldüremezler. C. burnetivmn çeşitli lipopolisakkarit presantasyonlarının olduğu ve faz varyasyonları denilen antijenik varyasyon tiplerinin bulunduğu görülmektedir. Faz antijen insan veya hayvandan izole edildiğinde etken tarafından ekspresse edilir. Bu formdaki etken enfeksiyözdür. Bir mikroorganizma bile insanların enfekte olması için yeterli olabilir. Etkenin hücrelerde veya embriyolu yumurtada subkültüründen sonra antijenik yapı faz antijenine dönüşür [4]. En azından 0 farklı C. burnetii genotipi identifiye edilmiştir. Farklı suşlar arasında lipopolisakkarit kompozisyonunda değişiklik saptanabilir. Buna karşın, C. burnetivnin farklı suşları arasında fazla genetik farklılık bulunmaz. Etkenin genomu integre olmuş plazmid sekansı içerebilir. Dört farklı plazmid tipi tanımlanmıştır [4]. C. burnetivmn saptanmasına yönelik olarak uygulanan moleküler biyolojik metotlarda keneler, taze dokular, dondurulmuş örnekler, parafinde saklanan klinik örnekler, formalinde fikze edilen dokular, serum örnekleri ve sütler materyal olarak kullanmaktadır [7]. Spyridaki ve ark. [8], C. burnetii ile enfekte olduğundan şüphelenilen 00 hastanın kan serumlarını indirekt immunofluoresan antikor tekniği ile etkenin faz II antijenlerine karşı antikorların varlığı açısından incelediklerinde, serumların 'sini pozitif olarak tespit etmişlerdir. 7 hastadan aldıkları kan örneklerini patojenin izolasyonu için santrifugasyon shell vial tekniği ile kültüre ettiklerinde, 8 suş izole etmişlerdir. Bu suşlarm C. burnetii olduğunun doğrulamasını nested PCR ile yapmışlardır. Çalışmalarının sonucunda C. burnetivnin Yunanistan'da endemik bir hastalık olduğunu ve enfeksiyonun teşhisinin nestedpcr ile hızlı bir şekilde yapılabildiğini bildirmişlerdir. Masala ve ark. [], Sardinya adasında bulunan 67 koyun ve 8 keçi çiftliğinden 949 serumu ELISA ile ve 7 atık materyalini (4 fötus ve 9 plesanta) de PCR ile C. burnetii yönünden incelemişlerdir. Koyun çiftliklerinden 'inde ve

21 keçi çiftliklerinden de 9'unda ELISAile antikor saptarlarken, 40 koyun fötusu ve keçi fötusunu PCR ile pozitif bulmuşlardır. Koyunlarda C.burnetü enfeksiyonunun seroprevalansı Hollanda'da [9] %,, Japonya'da [0] %8,, Türkiye'de [] % 0,, Sudan'da [6] ise % 6, bulunmuştur. Kalender [], Elazığ ve komşu illerden yavru atmış koyunlardan aldığı 84 serum örneğinin 7(%8,9)'ini ve yavru atmamış koyunlardan aldığı 7 serum örneğinin (%ll,0)'ini indirekt flouresan antikor testi ile C. burnetü pozitif bulmuştur. Elazığda %0, Malatya'da %0, Bingöl'de % 7,9 ve Muşta %7,7 oranında pozitiflik saptamıştır. Psaroulakiveark. [],nestedpcrile 4 kenenin (00Rhicephalussanguineus ve 4 Hyalomma spp.) 'ini C. burnetü yönünden pozitif bulmuşlardır. Spitalska ve Kocianova [7], yılları arasında Slovakya ve Macaristan'dan topladıkları adetyetişkinkeneyipcrile C. burnetüyömmden incelemişlerdir. Ixodes ricinus, Dermacentor marginatus ve Haemaphysalis concinna türlerine ait 6 keneyi pozitif olarak saptamışlardır. Spitalska ve Kocianova [7], C. burnetifnm com geni için CBCOS (GCT GTT TCT GCC GAA CGT AT) ve CBCOE (AGA CAA CGC GGA GGT TTT TA) primerlerini kullanmışlardır. Com geni, hem akut hem de kronik hastalık izolatlarmdan saptanan dış membranilişkili immunoreaktif proteini kodlar. Araştırıcılar, kullandıkları primerlerin spesifik olduğunu çünkü birçok bakteriden elde ettikleri DNA'ları bu primerlerle reaksiyona soktuklarında C. burnetü dışında hiçbir amplinye bant görmediklerini bildirmişlerdir. Zhang ve ark. [], OMP İve OMP primer setini kullanarak PCR uygulamışlardır. OMP ve OMP primerleri Nine Mile susunun coml gen sekansından elde edilmiştir. Spyridaki ve ark. [9], ezilmiş kenelerden C. burnetü 'nin direkt saptanmasında nested PCR uygulamışlardır. Nested PCR'nin kenelerden patojenleri çabuk, sensitif ve spesifik olarak saptadığını bildirmişlerdir. Aynı zamanda, sahadan çok fazla miktarda toplanan kenelerin alkolde veya formaldehitte nkzasyondan sonra kültürünün mümkün olmamasına karşın, PCR ile test edilme imkanı bulunmaktadır. Araştırıcılar, ilk PCR'da Hfragl/ Hfrag primerlerini ve ikinci PCR'da ise HF/HF primerlerini kullanmışlardır. Kıbrıs izolatlarmm DNA amplinkasyonunu yapmak ve referans suşlar ile karşılaştırmak için CB/CB genomik primerlerini kullanmışlardır. Bernasconi ve ark. [], keneye ait mitokondriyal S rdna geninin 8 9 bp parçası için TA (' AATGAGAGCGACGGGCGATGT ') ve TB (' AAACTAGGATTAGATTAGATACCCT ')primerlerini kullanmışlardır. Rickettsia'larm sitrat sentezini kodlayan genin(glta) 80 bp parçasının

22 amplifikasyonu için Cs.Rp877p ve Cs.Rpl8n primerlerlerinden OmpA geninin 6 bp parçasının amplifikasyonu için ise Rr 90.70p ve Rr 9070 primerlerinden yararlanmışlardır. C. burnetü 'nin 6S rdna geninin 484 bp parçasını ampmye etmek için ise fdl (' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ') ve rp (' ACGGCTACCTTGTTACGACTT ') primerlerini kullanmışlardır, fdl primerinde 44 bp Rickettsia ve 64 bp Coxiella içindir. Zhang ve ark. [], sığır, kene ve insanlardan izole edilen 0 suş ile adet referens susun com gen sekans analizini yapmışlar ve buna göre com geninin bütün suşlarda bulunduğunu; ancak, nükleotidte bazı farklılığın olduğunu, amino asit sekanslarının deduce olduğunu ve adet susun 4 gruba ayrıldığını tespit etmişlerdir. İnsanlarda Q hummasının klinik tanısı semptomlarının spesifik olmaması nedeniyle son derece zordur. Bu nedenle tanısı esas olarak serolojik testlere dayanmaktadır. Serolojik tanıda sık kullanılan testler; indirekt immunfloresan tekniği, komplement nkzasyon, ELISA ve mikroaglutinasyon teknikleridir. immunfloresan tekniği Q ateşinin serolojik tanısında referans test olarak kabul edilmektedir []. Ancak, serolojik testler retrospektif teşhise imkan verdiklerinden şimdiki veya daha önce gerçekleşen bir enfeksiyonun ayrımı kesin olarak yapılamaz. Bunun yanı sıra enfeksiyonun erken dönemlerinde antikorların kanda bulunmayışı bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir [], Akgün ve ark. [], 00 yılının NisanAğustos ayları arasında C.Ü. Araştırma Hastanesi'nde Q humması şüphesi ile gözlem altına alınmış hastaların kan ve serum örneklerinde C. burnetifnm saptanması için nestedpcr yöntemini kullanmışlardır. C. burnetifmn dış membran proteinini kodlayan com genini amplifıye etmek için OMP, OMP, OMP ve OMP4 primerlerinden yararlanmışlar ve 80 hastanın (%8,7)'inde C. burnetü saptamışlardır. Esen ve ark. [], 00 yılı MayısHaziran arasında Karadeniz bölgesinde ölüm olayının olduğu olası bir salgın tespit edildiğini, bu salgında 46 hastada görülen semptomların sıklık sırasına göre; karın ağrısı, bulantı, kusma, artralji/myalji, baş ağrısı, ateş, ishal ve döküntü olarak tespit edildiğini, bu olguların 8'inin Tokat ilinden, 4'ünün Sivas, 'ünün Yozgat ve birinin de Çorum ilinden çıktığını bildirmişlerdir. Bu vakaların hemen tümünün kırsal alanda yaşadığına dikkat çekmişlerdir. 4

23 . MATERYAL ve METOT. Kenelerin Toplanması ve Saklanması Türkiye'nin 8 ilinden toplam 47 (446 dişi, 0 erkek ve nymph) kene toplandı. İllerden toplanan keneler, içerisinde % 70'lik alkol bulunan şişelerde, tür ve cinsiyet tayinleri yapılıncaya kadar, +4 C'de saklandı.. Kenelerin Tür ve Cinsiyet Tayini Stereo mikroskop (NikonAFX) ile tür ve cinsiyet tayinleri yapılan keneler, ayrı ayrı, içlerinde % 70'lik alkol [7] bulunan şişelerde + 4 C'de muhafaza edildi.. Kenelerin Gruplandırılması Keneler alkolün uzaklaştırılması için distile sudan geçirilerek [7] toplandığı illere, tür ve cinsiyetlerine göre 7 adedi bir araya getirilerek gruplandırıldı ve numaralandırıldı..4 Kenelerin DNA Ekstraksiyonu İçin Hazırlanması Gruplandırılmış ve numaralandırılmış keneler alüminyum folyo içerisine konularak sıvı azot içerisinde dondurulduktan sonra bir havan eli yardımıyla toz haline gelinceye kadar iyice ezildi.. Kenelerden DNA Ekstraksiyonu Kenelerden total DNA ekstraksiyonu NucleoSpin Tissue kit (MachereyNagel GmbH, Düren, Almanya) kullanılarak gerçekleştirildi. Ezilmiş kenelerden ependorf tüplerine 0 mg kadar örnek aktarılarak, ekstraksiyon için kitte önerilen protokol izlendi. DNA ekstrakları çoğaltılmcaya kadar 0 C'de saklandı..6 Pozitif Kontrol DNA Coxiella burnetii Nine Mile RSA49 susuna ait DNA, Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere de JustusLiebigUniversitat Giessen'den Gf. Direktör Prof. Dr. Dr. Habil G Baljer'den sağlandı. Kullanılan pozitif DNA % 0.9 tuzlu suda. x 0 8 konsantrasyonunda kullanıldı.

24 .7 Kullanilan Primerler Hfragl Hfrag HF HF CB CB 8 SF 8 SR 'ATT GCT ATC ACT GAG GGT GAC G' 'CTG ACG AAG AAG CAG CAT TAG C' 'TCC TAAACAAGT GAT GGT CTC C' 'TTC GCA GAA GTC AGC TAT GC' 'ACT CAA CGC ACT GGA ACC GC' 'TAG CTG AAG CCA ATT CGC C' 'GAC TCT AGT CTG ACT CTG TG' 'GCC ACAAGC CAGTTATCC C'.8 Negatif Kontrol PCR reaksiyonunda kullanilan reagentlerin kontaminasyon kontrolii amaciyla, bir reagent kontrol tiipii kullamldi. Bu tiipe DNA yerine ddh 0 konuldu..9 PCR Igin Uygun Primer Segimi Uygun primerin seciminde pozitif ve negatif kontroller ile ilk turda Hfragl ve Hfrag ve ikinci turda da HF ve HF primer setleri kullamlarak nested PCR denendi. Daha sonra aym sekilde pozitif ve negatif kontrol kullamlarak CB ve CB primerleri denendi..0 PCR Amplifikasyonu PCR amplifikasyonu PTC00 thermal cycler (MJ Research, Watertown, MA) ile yapildi. DNA amplifikasyonu 0 ul hacimde gerceklestirildi. Her bir testte bir pozitif (Nine Mile RSA49) ve bir de negatif kontrol (distile su) kullamldi. Her bir reaksiyon icin; MgCl ( mm, Bioron),4 ul 0X reaksiyon buffer (Bioron),0 ul dntp Mix (0 mm, Fermentas) 0, ul Taq DNA polimeraz ( U/ul, Bioron) 0, ul CB 0, ul CB 0, ul DMSO (Fermentas),8 ul ddh 0 8,0 ul DNA ul kullamldi. CB ve CB primerleri kullamldi gmda PCR programi asagidaki gibi uygulandi. 6

25 94 C dk C 0 sn ^ 7 C dk V tur 94 C 4 sn J 0 C dk 7 C 0 dk NestedPCR'de ise her iki turda da aşağıdaki program uygulandı. 94 C dk C 0 sn ^ 7 C dk > tur 94 C 4 sn J 0 C ldk 7 C 0 dk. Ekstraksiyon Kitinin Kontrolü Kullanılan kitin DNA ekstraksiyonunu sağlayıp sağlayamadığının kontrolü için ekstrakte edilen DNA ile kenenin 8 S rrna geninin saptanmasına yönelik olan 8SR ve 8SF primerleri [] ile PCR yapıldı.. Elektroforez ve Görüntüleme PCR ürünleri Ethidium bromide ile boyalı %,'luk agaroz jelde (Ambresco) yürütüldü. Elektroforez tamponu olarak 0,X TAE (Fermentas) kullanıldı. DNA bantlarının görüntülenmesi ise görüntüleme cihazında (Vilbert Loumart) gerçekleştirildi.. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR ürünlerinin spesifîsitesi PCR ürünlerinin restriksiyon analizi ile değerlendirildi. PCR ürünleri Taql enzimi (Fermentas) ile kesildi. Restriksiyon fragmentleri %, agaroz jelde elektroforez ile incelendi. Örnekler Coxiella burnetü Nine Mile RSA49 susuna ait fragmentlerle karşılaştırıldı. 7

26 . BULGULAR. Kenelerin Tür ve Cinsiyet Tayini Sonuçları Toplanan kenelerin illere göre tür ve cinsiyet dağılımları tablo'de verilmiştir. Tablo. Toplanan kenelerin illere göre tür ve cinsiyet dağılımları. Coğrafi Bölge ve İller Dişi Erkek MARMARA BÖLGESİ Edirne () Rhipicephalus turanicus Rhipicephalus sanguineus Rhipicephalus bursa Hyalomma. anatolicum anatolicum Tekirdağ (69) H. a. anatolicum Hyalomma anatolicum excavatum Bursa (8) Çanakkale (04) R. sanguineus Balıkesir (07) R. sanguineus H. a. anatolicum EGE BÖLGESİ izmir (0) H. a. anatolicum H. a. excavatum Afyon (9) Hyalomma detritum detritum

27 Coğrafi Bölge ve İller Dişi Erkek Denizli (6) R. sanguineus Muğla (99) R. sanguineus H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum Kütahya (0) H. a. anatolicum H. d. detritum foodes ricinus foodes hexagonus Uşak (7) H. a. excavatum H. d. detritum Hyalomma marginatum marginatum I. ricinus Boophilus annulatus Manisa (7) H. a. anatolicum I. ricinus Dermacentor niveus AKDENİZ BÖLGESİ Antalya (9) H. a. anatolicum Nymph (Rhipicephalus) Adana (4) H. a. anatolicum Burdur (4) adet

28 Coğrafi Bölge ve İller Hatay (70) H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum H. m. marginatum Kahramanmaraş (6) H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum İÇ ANADOLU BÖLGESİ Ankara (60) R. sanguineus H. a. excavatum D. niveus Eskişehir (47) R. sanguineus H. m. marginatum I. ricinus Haemaphysalis sulcata Haemaphysalis punctata B. annulatus Dermacentor marginatus Sivas () R. sanguineus D. marginatus Konya () R. sanguineus H. d. detritum H. sulcata I. ricinus I. hexagonus D. niveus B. annulatus Dişi Erkek

29 Coğrafi Bölge ve İller Dişi Erkek Çankırı () R. sanguineus H. m. marginatum D. niveus D. marginatus B. annulatus Yozgat (8) Niğde (7) R. sanguineus KARADENİZ BÖLGESİ Kastamonu (4) R. sanguineus H. a. excavatum H. d. detritum Samsun (6) Ordu (7) Giresun (6) H. a. excavatum H. d. detritum Amasya (8) H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum H. m. marginatum H. sulcata H. punctata D. niveus Bolu () D. niveus D. marginatus Çorum (40)

30 Coğrafi Bölge ve İller R. sanguineus H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum DOĞU ANADOLU BÖLGESİ Malatya (86) R. sanguineus H. d. detritum H. m. marginatum Erzurum (8) H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum İğdır (44) H. a. excavatum H. d. detritum I. ricinus H. sulcata H. punctata D. niveus GÜNEYDOĞU ANADOLU BÖLGESİ Gaziantep () Şanlı Urfa ( 84 ) R. sanguineus H. a. anatolicum Diyarbakır (6) R. sanguineus Mardin (7) Dişi Erkek

31 Tablo. Türkiye'nin 8 ilinden toplanan toplam 47 kenenin tür ve cinsiyet dağılımları Tür Toplam (%) Dişi Erkek R. sanguineus H. a. anatolicum H. a. excavatum H. d. detritum 6 (4,8) 94(,9) 0 (4,) (,4) 04 (4,) 4 (,8) H. m. marginatum 9(,) 7 D. niveus D. marginatus H. sulcata H. punctata I. ricinus I. hexagonus B. annulatus Nymph 6(,) (0,) (0,4) 4 (0,9) 6(,) (0,) 8 (0,) (0,) Eksfraksiyon Kitinin Kontrol Sonucu Kullanılan kitin DNA ekstraksiyonunu sağlayıp sağlayamadığının kontrolü için ekstrakte edilen DNA ile kenenin 8 S rrna geninin saptanmasına yönelik olan 8SR ve 8SF primerleri ile PCR yapıldı. 449 bp'lik bir PCR ürününün görülmesi kenenin 8S rrna geninin PCR ile saptandığını ve dolayısı ile bu genin ekstrakte edilebildiğini ortaya koydu.. PCR Standardizasyon Bulguları PCR standardizasyonu pozitif ve negatif kontroller kullanılarak yapıldı. Nested PCR'nin Hfragl ve Hfrag primerleri ile yapılan ilk turunda vermesi gereken 08 bp'lik bant net olarak görüntülenirken, HF ve HF primerleri kullanılarak gerçekleştirilen. turunda vermesi gereken 8 bp'lik bant çok silik olarak görüntülenmiştir. Bu primerler kullanıldığında saha örneklerinde bulunması muhtemel olan Coxiella burnetü DNA'smm tespit edilemeyeceği ve yanlış negatiftik çıkabileceği düşünülerek PCR çalışmasında daha kuvvetli bantların elde edildiği CB ve CB primerlerinin kullanılmasına karar verilmiştir..4 PCR Bulguları Denizliden toplam 6 kene toplanmış olup, bu keneler tür ve cinsiyetlerine göre gruba ayrılmışlardır. Bu gruplardan 6'sı PCR sonucunda pozitif bulunmuştur.

32 Ankara'dan toplanan toplam 60 kene ise aynı şekilde gruba ayrılmış ve bu gruplardan birinde PCR sonucunda pozitiflik saptanmıştır. PCR çalışmaları pozitif ve negatif kontrollerle birlikte yürütülmüş olup, pozitiflik durumunda 7 bp'lik bir PCR ürünü elde edilmiştir. Resim. Pozitif PCR ürünlerinin görüntüleri. 0M: 0'lik marker; P Coxiella burnetii Nine Mile RSA49 susu; N: Negatif kontrol: 007: Denizli pozitif örnekler; 6: Ankara pozitif örnek: 00M: 00'lük marker.. PCR ile C. burnetii Pozitif Bulunan Kene Gruplarının Tür ve Cinsiyet Dağılımları PCR ile C. burnetii pozitif bulunan kene gruplarının tür ve cinsiyet dağılımları tablo'de verilmiştir. 4

33 Tablo. PCR ile C. burnetii pozitif bulunan kene gruplarının tür ve cinsiyet dağılımları. İl Denizli Grup no. 0 Grup no. 0 Grup no. 04 Grup no. 0 Grup no. 06 Grup no. 07 Ankara Grup no. 6 Tür H. a. excavatum Cinsiyet dişi dişi dişi dişi erkek erkek erkek Gruptaki kene sayısı.6 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Bulguları PCR ürünlerinin spesifisitesi PCR ürünlerinin restriksiyon analizi ile değerlendirildi. Pozitif PCR ürünleri Taq enzimi ile kesildiğinde, 8 ve 7 bp 'lik bantlar net olarak görülürken, 9 ve 4 bp'lik bantlar birbirine yakın olmaları nedeniyle Resim'de görüldüğü gibi kalın bir bant olarak görülmektedir ve bu iki bantm ayrı görüntülenebilmesi için özel agarozlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bantlar pozitif ve negatif kontrollerle kıyaslanarak değerlendirildi. 4 Resim. 7'lik pozitif PCR ürünlerinin restriksiyon profil analizi. 0 M: 0'lik marker; P: Coxiella burnetii Nine Mile RSA49 susu; N: Negatif kontrol; 007: Denizli pozitif örnekler; 6: Ankara pozitif örnek; 00M: 00'lük marker.

34 4. TARTIŞMA ve SONUÇ Q fever bütün coğrafik ve iklim zonlarında ortaya çıkabilen bir zoonozdur. 9'de, Q humması'nm beş kıtada ülkede görüldüğü bildirilmiş, 999'da hastalık 8 ülkede daha rapor edilmiştir. Üstelik, seroepidemiyolojik veriler başka ülkelerde de Q humması'nm varlığına işaret etmektedir. C. burnetü keneleri bütün yaşamları boyunca canlılıklarını, çok yüksek titrelerde sürdürebilmektedir ve yeni nesillere transovariyal olarak aktarılabilmektedir. Enzootik siklusta rodentler gibi keneler ve vertabrahlar önemli komponentlerdir. Her bir kene türü, Q humması yönünden endemik bir bölgede duyarlı bir konakçıya yapışabilir ve C. burnetifyi yayabilir. Kenelerin çevrede bu hastalığın yayılmasında merkezi bir rol oynadığı görülmektedir. Doğada C. burnetü evcil hayvanlara kene ısırmasıyla ya da enfekte kene salgılarıyla temas aracılığıyla bulaşabilmektedir. Kene dışkıları da C. burnetü 'nin en yoğun muhtemel kaynağıdır. Kırktan fazla kene türünün C. burnetü ile enfekte olduğu tespit edildiğinden dolayı keneler doğada enfeksiyonun indikatörü olarak görülmektedir. C. burnetü'nin tanısı esas olarak serolojik testlere dayanmaktadır. Serolojik tanıda sık kullanılan testler; indirekt immunfloresan tekniği, komplement fikzasyon, ELISA ve mikroaglutinasyon teknikleridir, immunfloresan tekniği Q hummasının serolojik tanısında referans test olarak kabul edilmektedir []. Ancak, serolojik testler retrospektif teşhise imkan verdiklerinden şimdiki veya daha önce gerçekleşen bir enfeksiyonun ayrımını kesin olarak yapamaz. Bunun yanı sıra enfeksiyonun erken dönemlerinde antikorların kanda bulunmayışı bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir [], C. burnetü izolasyonlarının tehlikeli, zaman alıcı ve güç olması ve ayrıca mikroorganizmanın zoonotik özelliğine bağlı olarak çalışmalar için biyogüvenlik düzeyi laboratuarları gerektirmesi etken izolasyonlarında sıkıntı yaratmaktadır [].Ayrıca, C. burnetü 'nin diğer bir çokbakterinin aksine kültürlerinin embriyolu yumurta ve doku kültüründe yapılması da teşhiste moleküler yöntemleri cazip kılmaktadır. Son dönemlerde PCR yöntemi bir çok örnekte hastalık etkenlerinin saptanması için oldukça kullanışlı bir yöntem olarak benimsenmiştir. PCR yöntemi, çok az miktardaki örneklerde dahi hedef DNA sekanslarının ortaya çıkarılabilmesini 6

35 sağladığından insan ve hayvan orijinli bir çok materyalden C. burnetii enfeksiyonlarının laboratuvar teşhisinde oldukça güvenli ve kullanışlı bir metot olarak karşımıza çıkmaktadır. Ayrıca, PCR yöntemi, sahadan toplanan alkol ve formaldehitte fikze edilen çok sayıda örneğin de test edilmesine imkan sağlamaktadır. Spitalska ve Kocianova [7], kenelerden PCR ile C. burnetii saptanmasına yönelik çalışmalarında, pozitifliği en yüksek D. marginatus kenelerinde bulurlarken, bunu /. ricinus, Haemaphysalis inermis, Haemaphysalis concinna türlerinin izlediğini; Dermacentor reticulatus ve H. punctata türlerinde ise hiç pozitiflik saptamadıklarını bildirmişlerdir. Bu çalışmada görüldüğü üzere sahadan toplanan kenelerin % 4, 'ünü, % 4,8'ini ve %,9'unu R. sanguineus oluşturmaktadır. Spitalska ve Kocianova [7]'nm C. burnetii pozitifliği saptadıkları kene türlerinden D. marginatus çalışmamızda % 0, oranında ve /. ricinus ise %, oranında tespit edilmiştir ve bu kenelerde Spitalska ve Kocianova [7]'nm aksine C. burnetii saptanmamıştır. Bu kenelerin sahada bulunma oranlarının düşük olması nedeniyle, C. burnetii taşıma olasılığı da doğal olarak düşmektedir. Bu çalışmada sahada % 0,9 oranında bulunan H. punctata kene türünde Spitalska ve Kocianova [7] 'nm bulgularına benzer şekilde C. burnetii tespit edilememiştir. Bernasconi ve ark. [], Güney İsviçre'de R. sanguineus ve varlığını ortaya koymuşlar ve test ettikleri 48 keneden adet R. sanguineus ve adet kenesinde Coxiella saptamışlardır. Bu çalışmada da sahadan R. bursa'dan sonra en fazla ve R. sanguineus tespit edilmiştir. Aynı şekilde kenelerde C. burnetii pozitifliği 'dan sonra 'da bulunmuştur. Psaroulaki ve ark. [], topladıkları 4 kenenin % 7,8'ini PCR ile C. burnetii yönünden pozitif bulmuşlardır. Pozitif kenelerin aynı bu çalışmada olduğu gibi Rhipicephalus ve Hyalomma genusuna ait olduklarını bildirmişledir. Bu çalışmada ise toplanan 47 kenenin PCR ile incelemesi sonucunda bir pozitiflik oranı verilmesi imkansızdır. Kenelerin tek tek incelenmemesi, 7 adedinin toplandıkları il, tür ve cinsiyetlerine göre bir araya getirilerek gruplandırılması ve bu grupların DNA ekstraksiyonları yapılarak PCR ile incelenmesi nedeniyle ancak grup bazında pozitiflik verilebilmektedir. Bu çalışmada kenelerin cinsiyeti ile C. burnetii pozitifliği arasında bir ilişki olmadığı görülmüştür. C. burnetii pozitif bulunan kene gruplarının yaklaşık yarısının dişi kene grubu yarısının da erkek kene grubu olması bu şekilde düşünülmesine neden olmuştur, bu konu ile ilgili literatür verilerine de rastlanmamıştır. C. burnetii'n\n isocitrate dehydrogenase geni [4], süperoksit dismutase geni [0] ve kromozomal transpozonbenzeri sekanslar [8] PCR targetleri olarak kullanılmaktadır ve C. burnetii suşlarmm identinkasyonunda yararlı olduğu 7

36 bulunmuştur. Masala ve ark. [], koyun ve keçi yavru atıklarında C. burnetifnm etkisini araştırdıkları çalışmalarında, C. burnetü DNA'smm varlığını saptamak için süperoksit dismutase genini hedefleyen PCR kullanmışlar ve bu amaç için de CB ve CB primerlerinden yararlanmışlardır. Bu çalışmada da kenelerden C. burnetü DNA'smm saptanmasında süperoksit dismutase geninin saptanmasına yönelik CB ve CB primerleri kullanılmıştır. Bu çalışmada öncelikle Hfragl ve Hfrag ve ikinci turda da HF ve HF primerlerinin kullanıldığı nestedpcr yapılması planlanmıştır. Ancak, yapılan standardizasyon çalışmalarında ilk turda elde edilmesi gereken 08 bp'lik bant net olarak elde edilirken, ikinci turda elde edilmesi gereken 8 bp'lik bant çok silik olarak görülmüş ve saha örneklerinde bulunması olası olan C. burnetü DNA'smm tespit edilemeyeceği anlaşılmıştır. Dolayısıyla, yalancı negatiftik durumu göz önünde bulundurularak, bu primerler ile kullanılarak yapılması planlanan nestedpcr'den vazgeçilmiştir. Spyridaki ve ark. [8], insanlardan aldıkları kan örneklerinden QIAmp blood kit kullanarak genomik DNA ekstraksiyonu yapmışlardır. NestedPCR'de ise plasmidik DNA'yı hedefleyen Hfrag Hfrag ile HFHF primerlerini kullanmışlardır. Bu şekilde nestedpcr ile C. burnetü enfeksiyonlarının çabuk ve başarılı olarak tespit edilebileceğini bildirmişlerdir. Benzer şekilde çalışmamızda genomik DNA ekstraksiyonuna yönelik NucleoSpin Tissue kit kullanılmış ve PCR sırasında başarılı olduğu belirtilen plasmidik HfraglHfrag ile HFHF primerleri denenmiştir. Literatürde belirtilen bulguların aksine başarılı sonuç elde edilememiş ve yine aynı literatürde verilen genomik primerler kullanılmıştır. Bu değişiklik ile istenilen bantlar, pozitif DNA örneğine paralel şekilde elde edilmiştir. Sonuç olarak, genomik DNA ekstraksiyonu yapıldığı zaman kullanılan primerlerin de genomik DNA'yı hedeflemesi gerektiği ortaya çıkmıştır. Nine Mile referens susu ABD'de kenelerden izole edilmiştir. Fransa'da [0] ve Yunanistan'da [8] Q humması hastalarından izole edilen C. burnetü suşlarmm da Nine Mile ile aynı profile sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada da pozitif bulunan 7 örneğin profilinin C. burnetü Nine Mile ile aynı profile sahip olduğu restriksiyon analizi sonucunda ortaya konmuştur. PCRRFLP analizinin kenelerden C. burnetü saptanması, izolasyonu ve identifikasyonu çalışmalarında faydalı olduğu belirtilmiştir [7, 8, 9]. Bulgularımız bu görüşü destekler nitelikte olmuştur. 8

37 . KAYNAKLAR. Akgiin, E., Yilmaz, M., Pmarbasj, E.: Qfever Siiphesi Olan Hasta Serum ve Kan OrneklerindeNestedPCR Yontemiyle Coxiella burnetii 'nin Saptanmasi. C.U. Tip Fakiiltesi Dergisi, 8(): 04, (006).. Bernasconi, M.V., Casati, S., Peter, O., Piffaretti, J.C.: Rhipicephalus Ticks Infected with Rickettsia and Coxiella in Southern Switzerland (Canton Ticino). Infection, Genetics and Evolution, ():0, (00).. Cetinkaya, B., Kalender, H., Erta, H.B., Muz, A., Arslan, N., Ongor, H., Giircay, M.: Seroprevalence of Coxiellosis in Cattle, Sheep and People in the East of the Turkey. Vet. Rec, 46: 6, (000). 4. Choi, E.: Tularemi and Q Fever. Medical Clinics of North America, 86(): 946, (00).. Esen, B., Gozalan, A., Akin, L.,Noyan,N., Buyurgan, V.: Bir Salgm ihbarmm Epidemiyolojik Ara tirmasi. Ayhk Epidemiyoloji Raporu, Cilt, Sayi 6, (00). 6. Fournier, P.E., Marrie, T.J., Raoult, D.: Diagnosis of Q Fever. J. Clin. Microbiol., 6(7): 884, (998). 7. Higgins, J.A., Azad, A.F.: Use of Polymerase Chain Reaction to Detect Bacteria in Arthropods: a Review. J. Med. Entomol, ():, (99). 8. Houver, A.T., Vodkin, M.H., Williams, J.C.: A Coxiella burnetii Repeated DNA Element Resembling a Bacterial Insertion Sequence. J. bacteriol., 74: 4048,(99). 9. Houwers, D.J., Richardus, J.H.: Infections with Coxiella burnetii in Man and Animals in the Netherlands. Zentr. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. A, 67:06, (987). 9

38 0. Htwe K.K., Amano, K., Sugiyama, Y., Yagami, K., Minamota, N., Hashimoto, A.,Yamaguchi, T., Fukushi, H., Hirai, K.: Seroepidemiology of Coxiella burnetii in Domestic and Companion Animals in Japan. Vet. Rec., : 490. Inokuma, H., Yoshizaki, Y, Shimada, Y, Sakata, Y, Okuda, M., Onishi, T.: Epidemiological Survey of Babesia species in Japan Performed with Specimens from Ticks Collected from Dogs and Detection of New Babesia DNA Closely Related to Babesia odocoilei and Babesia divergens DNA. J. Clin. Microbiol., 4(8): , (00).. Kalender, H.: Elazig ve Komsu Illerde Koyunlarda Coxiella burnetii Enfeksiyonunun Yaygmligi. Turk. J. Vet. Anim. Sci., :, (00).. Masala, G., Porcu, R., Sana, G., Chessa, G., Cillara, G., Chisu, V, Tola, S.: Occurence, Distrubition, and Role in Abortion of Coxiella burnetii in Sheep and Goats in Sardinia, Italy. Vet. Microbiol., 99: 00, (004). 4. Nguyen, S.V, Hirai, K.: Differentiation of Coxiella burnetii Isolates by Sequence Determination and PCRRestriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Isocitrate Dehydrogenase Gene. FEMS Microbiol. Lett, 80: 494, (999).. Psaroulaki, A., Hadjichristodoulou, C, Loukaides, F, Soteriades, E., Konstantinidis, A., Papastergiou, P., Ioannidou, M.C, Tselentis, Y. Epidemiological study of Q fever in Humans, Ruminant Animals, and Ticks in Cyprus Using a Geographical Information System. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis., : 7686, (006). 6. Reinthaler, F.F., Mascher, F., Sixl, W., Arbesser, C.H.: Incidence of Q Fever Among Cattle, Sheep and Goats in the Upper Nile Province in Southern Sudan. Vet. Rec., : 7, (988). 7. Spitalska, E., Kocianova, E.: Detection of Coxiella burnetii in Ticks Collected in Slovakia and Hungary. European Journalof Epidemiology, 8: 666,(00). 8. Spyridaki, I., Gikas, A., Kofteridis, D., Psauroulaki, A., Tselentis, Y: Q fever in the Greek Island of Crete: Detection, Isolation and Molecular Identification of Eight Strains of Coxiella burnetii from Clinical Samples. J. Clin. Microbiology. 6(7): 06067, (998). 0

39 9. Spyridaki, J., Psaroulaki, A., Loukaides, F., Antoniou,M.,Hadjichristod olou,c, Tselentis,Y.: Isolation of Coxiella Burnetii by a Centrifugation ShellVial Assay from Ticks Collected in Cyprus: Detection by Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) and by PCRRestriction Fragment Length Polymorphism Analyses. Am. J. Trop. Hyg., 66(): 8690, (00). 0. Stein, A., Raoult, D.: Detection of Coxiella burnetii by DNA Amplification Using Polymerase Chain Reaction. J. Clin. Microbiol., 0: 46466, (99).. Zhang, G.Q., To, H., Yamaguchi, T, Fukushi, H., Hirai, K.: Differentiation of Coxiella burnetii by Sequence Analysis of the Gene (com ) Enconding a 7kDa Outer Membrane Protein. Microbiol. Immunol., 4(): 87877, (997).

40

41 TAEK YAYIN BİLGİ FORMU Rapor Bilgileri. Rapor Başlığı Coxieîîa burnetii nin Kenelerden Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve PCR RFLP ile Saptanması I. Yayın Yılı/No 00/. Yay in Kur ulu Tarih (Gün/Ay/Yıl)No Yazarlar Dr. Gülay ALTAY, Doç. Dr. Zişan EMRE, Dr. Seyit CANPOLAT, Dr. Ali DÜZGÜN, Yusuf VATANSEVER, Hülya MERT 6. Çalışmayı Yapan Birim TAEK, SANAEM Uygulama Bölümü Hayvancılık Birimi. Yayın Türü Teknik Rapor 7. Destekleyen veya Ortak Çalışılan Kuruluşlar TAEK, TÜBİTAK 8. Özet Coxieîîa burnetii, Q humması hastalığının etiyolojik etkeni olup, obligat intraselüler bir bakteridir. Doğada yaygın olarak bulunur ve çeşitli hayvanlarda (sığır, koyun, keçi) ve insanlarda Qhumması enfeksiyonunu oluşturur. C. burnetii sütlerden, kenelerden ve akut veya kronik Q humması ile enfekte insanlardan izole edilmiştir. Keneler, C. burnetifmn rezervuan ve birincil vektörleridir. Kırktan fazla kene türünün C. burnetii ile enfekte olduğu saptandığından keneler doğada enfeksiyonun belirleyicisi olarak görülmektedirler. Bu çalışmada, Türkiye'nin 8 ilinden toplam 47 (446 dişi, 0 erkek, nymph) adet kene toplandı. Bu keneler toplandığı ile, tür ve cinsiyetine göre 7 adedi bir araya getirilerek gruplandınldı. Gruplar DNA ekstraksiyonu sonrasında CB ve CB primerleri kullanılarak PCR ile C. burnetifmn varlığı yönünde incelendi. Denizliden toplam 6 kene toplanmış olup, bu keneler tür ve cinsiyetlerine göre gruba ayrılmışlardır. Bu gruplardan 6'sı PCR sonucunda pozitif bulunmuştur. Ankara'dan toplanan toplam 60 kene ise aym şekilde gruba ayrılmış ve bu gruplardan sadece birinde PCR sonucunda pozitiflik saptanmıştır. PCR ürünlerinin spesifisitesi restriksiyon analizi ile değerlendirildi. Pozitif PCR ürünleri Taql enzimi ile kesildiğinde C. burnetii Nine Mile RSA49 susunda görüldüğü gibi yaklaşık 8, 7, 4 ve 9 bp'lik 4 bant ortaya konuldu. 9. Anahtar Kelimeler Coxieîîa burneti,kçnç, PCR GİZLİLİK DERECELERİ 0. Gizlilik derecesi Tasnif Dışı TASNİF DIŞI (UNCLASSIFIED): İçerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli bilgi taşımayan, ancak devlet hizmetiyle ilgili bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen en düşük gizlilik derecesidir. HIZMETE ÖZEL (RESTRICTED): İçerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli konular dışında olan, ancak güvenlik işlemine ihtiyaç gösteren ve devlet hizmetine özel bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir. ÖZEL (CONFIDENTIAL): İçerdiği konu itibanyla, izinsiz olarak açıklandığı takdirde, milli menfaatleri olumsuz yönde etkileyecek evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir. GİZLİ (SECRET): İzinsiz açıklandığı takdirde, milli güvenliği, milli prestij ve menfaatleri ciddi ve önemli bir şekilde zedeleyecek olan evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.