YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı

Transkript

1 UYGULAMA 6 MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: BASİT BOYAMA 1. GİRİŞ Mikroorganizmaları tanımlama yollarından birisi, onları boyayarak incelemektir. Boyama, kimyasal bir olaydır. Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görünmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hâle getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine mikroorganizmaların boyanması denir. 2-MİKROORGANİZMALARI BOYAMA YÖNTEMLERİ Kullanılan kimyasal boyaların ana amacı boyanan biyolojik kısımların daha net bir şekilde mikroskobik incelemelerinin gerçekleştirilebilmesidir. Mikroorganizmaların boyanabilmesi için mikroorganizma içeren sıvının lam üzerine bir öze yardımıyla yayılması (smear) ve fiksasyon işleminin yapılması gereklidir. Mikroorganizmaları boyamanın başlıca avantajları şunlardır: Mikroorganizmalar ve zemin arasında kontrast oluşturarak onları daha kolay incelemek Bakterinin hücre duvarı, vakuolleri gibi yapılarını daha kolay incelemek Değişik morfolojik tipler arasındaki farklılığı ortaya çıkarmak Boyama işleminde çeşitli boyalar kullanılır. Bunlar doğal ve sentetik boyalar olarak ikiye ayrılmaktadır. a) Doğal boyalar: Doğal boyalar bitkisel ve hayvansal orijinli olabilirler. Bunlardan bitkisel orijinli olanlara hematoksilen ve orcein, hayvansal orijinli olanlara ise carmen örnek gösterilebilir. Doğal boyalar daha ziyade histolojide kullanılmaktadır. b) Sentetik boyalar: Bunların sayıları oldukça çoktur. Eosin, asit fuksin, asit pikrik, oranj gelb, eritrosin, kongo kırmızısı, light green, metilen mavisi, toluidin 1

2 mavisi, bazik fuksin, jansiyan viyole, azocarmen, safranin gibi birçok boya sentetik boyalara örnek gösterilebilir. Sentetik boyalar; Ehrlich tarafından bazik, asid ve nötr boyalar diye üç gruba ayrılmıştır. Serbest asid ve bazlar suda çok az eridiklerinden sentetik boyalar daima nötr tuzlar halinde kullanılırlar. Nötr tuzlar hem asit köke (anion) hem de bazik köke (kation) sahiptirler. i. Bazik boyalar: Bazik boyaların kromofor grubu pozitif yüke sahiptir. Yani, yukardaki açıklamanın ışığında, bu nötr tuzu meydana getiren bazik kısım (kation, +) renkli buna karşın asid kısım (anion, -) ise renksizdir. Bu tür boyalara katyonik boyalar da denir. (Örneğin; metilen mavisi bazik bir boyadır ve terkibi tetramethhyl-thionin-chlorhydrate tır. Bu terkipte tetramethyl-thionin baz ı hidroklorik asit ile nötr bir tuz meydana getirecek şekilde birleşmiştir. Tetramethylthionin bazı renklidir ve metilen mavisi boyasına rengini verir, anion kökü olan hidroklorik asit ise renksizdir.) Bismarck brown y, crystal violet, methyl green, pararosanilin ( basic fuchsin), resorcin blue diğer bazik boyalara örnek verilebilir. Bir doğal boya olan hematoksilen de bazik boya tarzında davranır. Bakterilerin yüzeyi negatif olduğu için ayrıca DNA da bulunan fosfatların da negatif yüklü olması nedeniyle katyonik özelliğe sahip olan bazik boyalarla boyanırlar. ii. Asid boyalar: Asid boyaların boyayıcı kısımları negatif elektriksel yüke sahiptir. Yani burada tuzun baz kısmı renksiz asid kısmı ise renklidir. Bu tür boyalara anyonik boyalar da denir. Asitik boyalar zemini boyamak için kullanılmaktadır. Örneğin; sodium eozinat da eozinat negatif yüklü olup kromofor özelliktedir. Diğer asidik boyalara acid fuchsin, anilin blue, kongo red, fast green, light green, erytrosin, orange G, acid pikrik, Phyloxine, alizarin red S, çini mürekkebi, nigrosin, malaşit yeşili gibi boyalar örnek gösterilebilir. iii. Nötr boyalar: Nötr boyalar iyonik olmayan boyalardır. Bunlar suda çözünen renkli organik bileşiklerdir. Burada nötr tuzu meydana getiren asid ve bazın her ikiside renklidir. Hematoloji ve mikrobiyolojide sık kullanılan bu boyalara Giemsa boyası en güzel örnektir.bu boyalar parazitlerin incelenmesinde, rikettsiya ve klamidyaların boyanmasında kullanılmaktadırlar.wright ve Leisman boyalarıda bu tip boyalara örnektir. 2

3 Boyama işlemi basit boyama veya komplex boyama yöntemleri kullanılarak yapılır. Bu uygulama dersinde basit boyama teknikleri kullanılacaktır. 3 - BASİT BOYAMA YÖNTEMLERİ Bu yöntemlerde genellikle tek bir boya eriyiği kullanılarak boyama yapılır. Mikroorganizmaların morfolojisinin incelenmesi amaçlanır. Basit boyalar genellikle birçok amaç ve biyolojik materyal için kullanılabilir. Tuzla birlikte boya veren bir pozitif iyondan meydana gelirler. Birçok basit boya negatif yüklü hücre zarlarının boyanmasını sağlar. Fazla boya yıkanarak atıldıktan sonra mikroskop ile inceleme gerçekleştirilebilir. a) Negatif Boyama: Bu yöntemde asidik boya kullanılarak zeminin boyanması amaçlanır. Bu preparatta mikroorganizma boya almaz. Mikroorganizmanın büyüklüğü ve morfolojisi hakkında bilgi edinmek ve spiroketler gibi zor boyanan bakterilerin gözlenmesi amacıyla kullanılır. Çini mürekkebi ya da Nigrosin eriyiği kullanılır. Bir damla çini mürekkebi lamın bir kenarına konur. Bir damla bakteri süspansiyonu ile homojenize edilir ve lama yayılır. Preparat iyice kurutulur. Tespit işlemi yapılmaz ve immersiyonla mikroskopta incelenir. b) Löfflerin Metilen Mavisi kullanılarak yapılan basit boyamada Corynebacterium diphtheriae da daha koyu boyanan metakromatik cisimcikler gözlenebilir. Herhangi bir bazik boya kullanılarak yapılan basit boyamada bakterin morfolojisi ve büyüklüğü hakkında bilgi edinmek yanında özellikle direkt materyalden hazırlanan preparatın incelenmesiyle materyalin uygun alınıp alınmaması hakkında da fikir edinilir. Bol epitel hücresi varlığı materyalin uygun olmadığını gösterir. Gram boyama kadar etkili olmasa da mikroorganizmaların morfolojisi ve mikroskop sahasındaki dizilimi göz önüne alınarak hangi besiyerine ekim yapılacağı hakkında bilgi edinilir. 4. TEMEL BAKTERİ ŞEKİLLERİ Kok: Küresel şekilli hücrelerdir. 3

4 Basil (Çubuksu): Çubuk şekilli bakterilerdir. Kırılgan görünümlü silindir şeklinde hücrelerdir. Virgül: Virgül şekilli bakterilerdir. Çubuksu bakterilere benzerler ama yarım daire kadar kıvrılmışlardır. Spiral: Spiral şekilli bakterilerdir. Çubuksu fakat kıvrımlı ve dönüşleri olan bakterilerdir. Bu bakterilerin haricinde farklı veya ara formlarda görülebilir (coccobacillus, Spirochete Aynı zamanda kok bakterilerinin çoğul formları da farklı isimler alabilir. Örneğin ip gibi yan yana dizilen kok şekilli bakterilere streptokok denirken, kümelenen üzümsü koklara stafilokok adı verilir. Şekil 1- Bakterilerin Hücre Morfolojisi 4

5 İki tane kok bakterisinin bir arada görülmesi diplokok olarak adlandırılır. Kok şekilli bakterilere örnek olarak Neisseria ve Branhamella cinslerinin yanı sıra (diplokok), Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterecoccus ve Lactobacilluslar verilebilir. Şekilsel olarak farklı kok formlarının bulunması bölünme planı ile ilişkilendirilmektedir. İki farklı planda bölünen hücreler dörtlü sayıda tetrad adını alırken, 8 li sayıda sarcinae olarak adlandırılmaktadır. Çubuksu bakteriler incelendiği zaman, ikili formları diplobacilli, ya da uc uca eklenen tipleri streptobacilli ya da yan yana gelenleri palisade olarak adlandırılır. Diphteroids, deri ve üst solunum yolları florasında sıklıkla görülen Corynebacterium ların morfolojik şeklidir. Esasen basit streptobacilli şeklindedirler ancak bir araya gelerek kümeler meydana getirirler ve palisade tipli formları meydana getirirler. Virgül ve spiral şekilli bakteriler genellikle tek bulunan hücrelerdir. Morfolojik farklılıklar genellikle yapmış oldukları kıvrımlardan ötürüdür. Klinik mikrobiyoloji de sık görülen türlerdendirler. UYGULAMA Materyal: Lam Lamel Pastör pipeti Öze İğne Fizyolojik Serum Metilen mavisi Metot: Lamların hazırlanması: Lamı hazırlamadan önce temiz olduklarından emin olun. Temizlemek için sabun ve su ile bolca yıkayıp toz kalmayacak şekilde silerek kurutabilirsiniz. Etil alkol sıkıp daha sonra kuruması için beklenen lamlar kullanım için uygundur. Lamın üzerine cama yazar kalem ile üç tane daire çizin. 5

6 Smear hazırlanması: Her bir daire içerisine bir damla bakteri örneği aktarın. Aktardığınız damlanın küçük olmasına dikkat edin. Eğer yatık agardan örnek alıyorsanız bir damla su veya serum fizyolojik içerisine örnek aktarılabilir. Havada örnek kurutulur. Ateşten birkaç kez geçirilen lamın üzerindeki bakteriler cama sabitlenir. Örneklerinin boyanması: Boyama için bir tepsi veya kutu kullanılmalıdır. Her bir boya 1 dk boyunca lamlara uygulanır. Daha sonrasında soğuk su ile yıkanan örnekler havada kurutulur. Sırasıyla 4x, 10x ve 40x büyütme oranlarında mikroskopta incelenir. Gerekli görülen örnekleri immersiyon yağı ile 100x te incelenir. Sonuçlar rapora kaydedilir. 6