ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Duygu AYVAZ SÖNMEZ RUBYGEM ve FESTİVAL ÇİLEK ÇEŞİTLERİNDE REJENERASYONUN OPTİMİZASYONU BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2011

2 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ RUBYGEM VE FESTİVAL ÇİLEK ÇEŞİTLERİNDE REJENERASYONUN OPTİMİZASYONU Duygu AYVAZ SÖNMEZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Ebru KAFKAS Yıl: 2011, Sayfa: 77 Jüri : Doç. Dr. Ebru KAFKAS : Prof.Dr. Sevgi PAYDAŞ KARGI : Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA Çileklerde son yıllarda dünyada ve ülkemizde özellikle virüs ve hastalıklardan ari olması, çoğaltma katsayısının yüksek olması, bitki karantinasında kolaylık sağlaması bakımından in vitro koşullarda üretim büyük önem arz etmektedir. Bu tezde; ülkemizde ticari öneme sahip olan Rubygem ve Festival çilek çeşitlerinin yaprak diskleri ve stipulleri kullanılarak söz konusu çeşitlere ait en uygun rejenerasyon protokollerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yaprak diskleri ve stipullerin rejenerasyonuna ışık (16 saat ışık, 8 saat karanlık) ve 15 gün sürekli karanlık uygulamaları ile farklı konsantrasyonlarda oksin (Indol butrik asit), sitokinin (Thidiazuron) gibi bitki büyüme düzenleyicileri ile gümüş nitrat(agno 3 ) içeren ortamların etkileri amaçlanmıştır. Söz konusu çeşitler kullanılan ortam ve farklı ışık rejimlerinde eksplant başına sürgün sayısı, rejenerasyon yüzdesi, kallus oranı (%), kallus çapı ve kallus dokusunun rengi bakımından değerlendirilmişlerdir. Çeşitler ve eksplantlar arasında gerek kullanılan ortam içerikleri gerekse ışık rejimleri bakımından farklar olduğu saptanmıştır. En fazla eksplant başına sürgün sayısı Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından IBA nın 0.4 mg/l, TDZ nin 3 mg/l ve AgNO 3 ın 1 mg/l kullanıldığı ortamlardan elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Çilek, TDZ, AgNO 3, doku kültürü, stipul. I

3 ABSTRACT MSc THESIS THE OPTIMIZATION OF REGENERATION IN RUBYGEM AND FESTİVAL STRAWBERRY VARIETIES Duygu AYVAZ SÖNMEZ ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Ebru KAFKAS Year : 2011, Pages: 77 Jury : Assoc. Prof. Dr. Ebru KAFKAS : Prof. Dr. Sevgi PAYDAŞ KARGI : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA In recent year, in vitro plant propagation of strawberries become very important in the worldwide also in our country due to the having virus and disease free, high multiplication coefficient and convenience for plant quarantine traits. The effects of light (16 hrs photoperiod, 8 hrs dark) and continuously dark (15 days) on leaf disks and stipules regeneration and using various concentration of including indole group auxin (Indol butyric acid), cytokinin (Thidiazuron) plant growth regulators and silver nitrate (AgNO 3 ) were tested on plant regeneration. Shoot numbers per explants, regeneration percentage, percentages of calli (%), diameter of calli, color of calli on various media implantation and various light regimes were also evaluated. Among the explants types and strawberry varieties based on media contents and light rejimes. The highest shoot numbers was obtained from stipule explants of Festival variety using 0.4 mg/l IBA, 3 mg/l TDZ and 1 mg/l AgNO 3 media. Key Words: Strawberry, TDZ, AgNO 3, tissue culture, stipule. II

4 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez konumun belirlenmesinde, yürütülmesinde ve çalışmamın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen yapıcı ve yönlendirici fikirleri ile bana daima yol gösteren çok değerli danışman hocam Sayın Doç. Dr. Ebru KAFKAS a sonsuz saygılarımı ve teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarım sırasında Biyoteknoloji merkezinin imkanlarından yararlanmamı sağlayan Sayın Prof. Dr. Salih KAFKAS a, istatistiksel çalışmalarımda yönlendirici ve olumlu tavrıyla yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Sevgi PAYDAŞ KARGI ya ve deneylerim esnasında çok değerli önerileriyle her zaman yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya teşekkür ederim. Tezim süresince bana destek veren Yaltır Tarım ve Çukurova Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi çalışanlarına ve özellikle Yaltır Tarım Müdürü M.Ali ÜNLÜ ye yardımlarından ve desteklerinden dolayı teşekkür ederim. Tüm çalışmalarım sırasında bana destek olan Ziraat Mühendisi Kader ERÇİK, Ziraat Mühendisi Aslı ÇOTALA, Biyolog Murat GÜNEY, Ziraat Mühendisi Cemile GÖKSAL, Biyolog Meltem BERBER, meristem çıkarma çalışmalarıma yardımcı olan Ziraat Mühendisi Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU, istatistiksel çalışmalarıma yardımcı olan Araştırma Görevlisi Berken ÇİMEN e ve Şenay BEHLÜL e ve manevi desteklerinden dolayı arkadaşım Makine Müh. Ece KARA ya teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans tezim sırasında maddi destek veren Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ne (Proje no:zf2010yl57 )ve Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu (TUBİTAK) na (Proje no: ) içten teşekkürlerimi sunarım. En son olarak tüm öğrenim hayatım boyunca her zaman yanımda olan maddi ve manevi yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen sevgili annem Hatice AYVAZ, babam Fahrettin AYVAZ, ablam Burcu AYVAZ KIZILRAY a ve özellikle sabrı için eşim Eray Cihan SÖNMEZ e şükranlarımı sunarım. III

5 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER.....IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII SİMGELER VE KISALTMALAR...X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Festival Çilek Çeşidi Rubygem Çilek Çeşidi Metod Materyallerin Sterilizasyonu ve Hazırlık Aşaması Besin Ortamının İçeriği ve Hazırlanması Yaprak Diskleri ve Stipullerin Rejenerasyonuna Işık Rejimi ve Bitki Büyüme Düzenleyicilerin Etkisi Yaprak Diskleri ve Stipüllerin Rejenerasyonuna Gümüş Nitratın (AgNO 3 ) Etkisi Sonuçların Değerlendirilmesi ve İstatiksel Analizler BULGULAR VE TARTIŞMA Festival Çilek Çeşidinin Stipul Eksplantlarına IBA ve TDZ Kombinasyonunun Etkisi Festival Çilek Çeşidinin Yaprak Eksplantlarına IBA ve TDZ kombinasyonun Etkisi Rubygem Çilek Çeşidinin Stipul Eksplantlarına IBA ve TDZ Kombinasyonunun Etkisi IV

6 4.4. Rubygem Çilek Çeşidinin Yaprak Eksplantlarına IBA ve TDZ Kombinasyonunun Etkisi IBA ve TDZ Kombinasyonun Kallus Oluşumuna Etkisi Festival Çilek Çeşidinin Stipul Eksplantlarına AgNO 3 ın Etkisi Festival Çilek Çeşidinin Yaprak Eksplantlarına AgNO 3 ın Etkisi Rubygem Çilek Çeşidinin Stipul Eksplantlarına AgNO 3 ın Etkisi Rubygem Çilek Çeşidinin Yaprak Eksplantlarına AgNO 3 ın Etkisi SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

7 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge g çileğin besin maddesi içeriği... 2 Çizelge 3.1. McCown Woody Plant besin ortamının içeriği Çizelge 4.1. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen eksplant başına sürgün sayıları Çizelge 4.2. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge 4.3. Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge 4.4. Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge 4.5. Rubygem çilek çeşidinin stipul eksplantlarından olarak elde edilen eksplant başına sürgün sayıları Çizelge 4.6. Rubygem çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge 4.7. Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen eksplant başına sürgün sayıları Çizelge 4.8. Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen rejenerasyon yüzdeleri Çizelge 4.9. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen kallus oluşum yüzdeleri Çizelge Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen kallus oluşum yüzdeleri Çizelge Rubygem çilek çeşidinde stipul eksplantlarından elde edilen kallus oluşum yüzdeleri Çizelge Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen kallus oluşum yüzdeleri Çizelge Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları VI

8 Çizelge Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarında elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayısı Çizelge Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Festival çilek çeşidinde yaprak eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Rubygem çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge Rubygem çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Rubygem çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge Rubygem çilek çeşidinin stipul eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri Çizelge Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen eksplant başına ortalama sürgün sayıları Çizelge Rubygem çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından elde edilen sürgün rejenerasyon yüzdeleri VII

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Türkiye çilek üretim ve ihracat grafiği...3 Şekil 3.1. Sürgün uçlarının yüzey sterilizasyonu aşaması ile mikroskop altında meristemlerin çıkarılması aşamasından bir görünüm...18 Şekil 3.2. Denemede kullanılan TDZ ve AgNO 3 ın soğuk sterilizasyon aşaması ile ortamların cam petrilere aktarılması aşamasından bir görünüm Şekil 3.3. Denemede yer alan explantların hazırlanması aşamasından bir görünüm Şekil 3.4. Denemede yer alan Festival çilek çeşidinin yaprak diski ve stipüllerinin eksplant olarak ortamlara aktarılması aşamasından bir görünüm Şekil 3.5. Denemede yer alan Festival çilek çeşidinin stipüllerinin eksplant olarak kullanıldığı 4 farklı AgNO 3 ın ortamlara aktarılması aşamasından bir görünüm Şekil 3.6. Denemede kullanılan materyaller ile uygulanan yöntemlerin şeması Şekil 4.1. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarından bir görünüm Şekil 4.2. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarının elde edilen sürgünlerden bir görünüm Şekil 4.3. Festival çilek çeşidinin yaprak eksplantlarından genel bir görünüm Şekil 4.4. Rubygem çilek çeşidinin stipul ve yaprak eksplantlarından oluşan kallusların görüntüsü Şekil 4.5. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarının AgNO3 çalışmalarından oluşan bitkilerin görünümü Şekil 4.6. Rubygem çilek çeşidinde AgNO 3 ın etkisiyle oluşmuş bitkilerden görünüm Şekil 4.7. Rubygem çilek çeşidinin stipul ve yaprak eksplantlarından oluşan kallusların görüntüsü Şekil 4.8. Festival çilek çeşidinin stipul eksplantlarının AgNO3 çalışmalarından oluşan bitkilerin görünümü VIII

10 Şekil 4.9. Rubygem çilek çeşidinde AgNO 3 ın etkisiyle oluşmuş bitkilerden görünüm...65 IX

11 SİMGELER VE KISALTMALAR TDZ : Thidiazuron IBA : Indole-3-butyric acid AgNO 3 : Gümüş Nitrat IAA : Indole Asetic Asid GA 3 : Giberellic acid BAP : Benzylaminopurin NAA : Naphtalene Asetic Acid FAO : Food and Agriculture Organization C : Santigrat derece g : Gram mg : Miligram l -1 MS KOH 2,4-D DNA : Litre : Murashige and skoog : Potasyum Hidroksit : Dichlorophenoxyacetic acid : Deoksiribonükleik asit µm : Mikromolar BSAA : Benzo[b]selenienyl acetic acid X

12 XI

13 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ 1. GİRİŞ Çilek, botanik olarak sınıflandırıldığında Rosales takımı, Rosaceae familyası, Fragaria cinsine girer. Anavatanı Güney Amerika-Şili olan çileğin, M.S yıllarında Avrupa da kültürünün yapıldığı bilinmektedir. Bugünkü modern çileklerin büyük bir bölümü Güney Amerika kökenli F.chiloensis ile Kuzey Amerika kökenli F. virginia Duch. çilek türlerinin melezlenmesi ile elde edilen Fragaria ananassa Duchense, türüne girer (Martinelli, 1992). Çilek yetiştiriciliği ticari olarak tarıma uygun ılıman, Akdeniz iklimi, subtropik ve semi-tropik iklim gibi farklı ekolojiler olmak üzere dünyanın hemen hemen her yerinde yapılabilmektedir (Hancock ve ark., 1991).Amerika Birleşik Devletleri (ABD), Rusya, İspanya, Türkiye, Kanada, Avrupa, Güney ve Doğu Afrika, Yeni Zelanda, Avustralya ve Japonya en çok çilek yetiştiren ülkelerdir. Avrupa da M.S yıllarında başlayan çilek tarımı Türkiye de modern anlamda 1970 li yıllarda başlamıştır. (Anonymous, 2008) Çilek, meyvesinin sahip olduğu kendine özgü hoş kokusu, tadı ve çileğin insan sağlığı beslenme açısından içermiş olduğu besin içerikleri nedeniyle dünyada yaklaşık 37 ülkede 20 den fazla tür ve oldukça fazla sayıda çeşit ile yapılmaktadır (Gaafar ve Saker, 2006). Çilek C vitamini ile, B1 ve B2 vitaminleri, protein, kalsiyum, potasyum, bakır, demir ve birçok insan sağlığı ve beslenme için gerekli besleyici elementlerce zengindir (Çizelge 1.1) (Chien-Ying Ko ve ark., 2009). Ayrıca, çilek sindirimin kolaylaştırılmasında önemli rolü olan selüloz bakımından da zengindir. Günümüzde çileğin elajik asit içeriğinin yüksek olması nedeniyle kanseri önleyici etkiye sahip olduğu bilinmektedir (Koşar ve ark., 2004). Son yıllarda yapılan araştırmalarda çilek meyvelerinin düşük kalori ve yüksek lif içerikleri yanında, karotenoid, vitaminler, fenoller, flavonoidler, glutathionin gibi doğal antioksidanlar ile hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri gibi serbest radikallere karşı yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır. Ayrıca meyvelerinin özellikle yüksek antioksidan özelliğe sahip olması, insanlarda kanser oluşum riskini azaltması, tümör gelişimini engellemesi, kronik hastalıkların engellenmesi, kalp ve damar hastalıklarının riskini azalttığı bildirilmiştir (Wang ve Jiao, 2000; Chung ve ark., 2002; Kresty ve ark., 2001). Yetiştiriciliği yapılan çilek çeşitleri irilik, renk, 1

14 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ aroma, şekil, verim, olgunlaşma zamanı, hastalıklara dayanım bakımından büyük oranda farklılık gösterirler (Hancock ve ark., 2002) Çizelge g çileğin besin maddesi içeriği (Kılıçel, 2005). 100 g çileğin besin maddesi içeriği Su %89.9 Enerji 37 cal. Protein 0.7 g. Yağ 0.5 g. Karbonhidrat (lifli) 1.3 g Karbonhidrat(toplam) 8.4 g. Kül 0.5 g. Ca 21 mg. P 21 mg. Fe 1 mg. Na 1 mg. K 164 mg. Vitamin A 60 IU Thiamine 0.03 mg. Riboflavin 0.07 mg. Niasin 0.6 mg. C Vitamini 59 mg. Ülkemizde çilek üretim ve ihracatı giderek artış göstermektedir (Şekil 1.1). Çilek üretimi dünyada 52 ülkede yapılmaktadır. FAO verilerine göre 2008 yılında dünyada 253 bin 900 hektar alanda 4 milyon 132 bin 352 ton çilek üretilmiştir. ABD, 1 milyon 270 bin 694 tonluk üretimde dünya çilek üretiminde lider durumdadır. ABD yi sırasıyla; Türkiye ( ton), İspanya ( ton), Mısır ( ton), Polonya ( ton) ve Rusya ( ton) izlemektedir. Dünya çilek üretiminde ikinci sırada yer alan Türkiye, Avrupa Birliği ülkeleri arasında ilk sıradadır. 2

15 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ YIL 2000/' /' /' /' /' /' /' /' /' /'10 ÜRETİM İHRACAT ( Şekil 1.1. Türkiye çilek üretim ve ihracat grafiği. Çileklerde fide üretiminde son yıllarda özellikle virüslerden ari olması ve çoğaltma katsayısının yüksek olması, bitki karantinasında kolaylık sağlaması özellikle yurt dışından ülkemize yeni getirilen çilek çeşitlerinin toprak hastalıkları ve zararlılar ile öteki hastalıklardan ari olması bakımından in vitro koşullarda üretimi büyük önem taşımaktadır. Bu durum uluslararası materyal değişiminde olduğu kadar ülke içinde bölgeler arası fide taşınmasında da büyük yararlar sağlamaktadır. Meristem kültürü ile yapılan çoğaltmalarda özellikle bitkilerin büyüme ucu dokularında bulunan meristematik hücreler virüsten ari olmaları nedeniyle ana bitkiler virüsle bulaşık olsa bile, bitkilerin büyüme ucu meristematik dokuları ayrılıp bu dokular kültür ortamında bitkiye dönüştürüldüğünde, elde edilen yeni bitkiler virüsten ari olabilmektedirler. Son yıllarda gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde asma, çilek, enginar, sarımsak, karnabahar, kuşkonmaz ve patates gibi birçok bahçe bitkisinin fide ve fidan üretiminin ilk aşamasında damızlık materyal olarak meristem kültüründen elde edilmiş sağlıklı bitkiler kullanılmaktadır. Doku kültürü ile çoğaltmada, adından da anlaşılacağı gibi, materyal olarak küçük bitki dokuları kullanılmakta ve bu dokular dezenfekte edildikten sonra, steril koşullarda hazırlanmış besi ortamlarına dikilmektedirler. Bitki doku kültürü; aseptik 3

16 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları; eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir. İklim odalarına alınan kültürler, yapay ışık altında ve belirli sıcaklık rejimlerinde geliştirilmekte ve köklenmeleri sağlanmaktadır. Cam deney tüpleri, petri kapları ve kavanozlar içinde gelişen köklü, yapraklı ve gövdeli genç bitkiler daha sonra yine steril ortamla (toprak, torf vb.) doldurulmuş saksılara şaşırtılmakta ve daha sonra serada, nemli ortamda yavaş yavaş dış koşullara alıştırılmaları sağlanmaktadır. Doku kültürü ile vegetatif çoğaltmada meristematik dokular yanında, sürgün uçları, küçük gövde parçacıkları, yaprak parçaları veya değişik dokularda yine besin ortamlarında elde edilen kallus dokuları kullanılabilir. In vitro çoğaltma tekniği bitki türlerinin çoğaltma sistemleri içerisinde en hızlı olanıdır (Babaoğlu ve ark., 2001). Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır (Babaoğlu ve ark., 2001). Doku kültürü tekniklerinin, bahçecilikte de birçok pratik ve ticari uygulamaları vardır. Bitkisel çoğalmanın geleneksel metotlarına ilginç bir alternatif oluşturur, çünkü büyük miktarda bitki materyalinin kısa zamanda elde edilmesine imkan sağlar (Fasolo ve Predieri,1988). Bitki doku kültürü işlemlerinde ve genetik iyileştirmelerde kullanılan temel sistem bitki rejenerasyonu yani bitkinin hücre, doku ve organlarından klonlanmasıdır. Bitki rejenerasyonu, kültürü yapılan hücrelerin özellikleri itibariyle üç kısımda incelenebilir; 1) organize olmuş meristematik hücreleri ihtiva eden somatik dokulardan rejenerasyon, 2) meristematik olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon ve 3) mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon. Birinci tip rejenerasyonda uç ve yan meristemlerden bitkiler çoğaltılır. Buna meristem kültürü yoluyla klonal çoğaltım denir. Elde edilen hücreler tamamen donör bitkiye benzerler. İkinci tip rejenerasyon; doğrudan bir bitki parçasının (eksplant) kesilmiş yüzeylerindeki belirli somatik hücrelerin bir kısmının 4

17 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ genellikle besin ortamına ilave edilen bitki büyüme düzenleyicilerinin (özellikle oksin ve sitokininler) etkisiyle bölünerek ve organize olarak, organları ve daha sonra da bitkiyi (direkt organogenesis) veya bir somatik hücrenin sürekli bölünerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluşturması şeklinde olabilir. Ayrıca her iki durum, belirli bir kallus veya hücre süspansiyonu oluşumu devresinden sonra da ortaya çıkabilir (indirekt rejenerasyon). Ortaya çıkan bitkilerde bazı kalıtsal veya geçici varyasyonlar oluşabilir. Son olarak normal kromozom sayısının yarısını ihtiva eden hücrelerden de direk veya dolaylı yollarla bitki rejenerasyonu olabilmektedir. Doku kültürlerinde kullanılan besin ortamları makro ve mikro besin elementleri, vitaminler, aminoasitler, enzimler, büyümeyi düzenleyiciler, şekerler ve katılaştırıcı olarak agardan oluşmaktadır. Doku kültürü ile çoğaltmada dört aşama izlenmektedir. Bu aşamalar; Hazırlık aşaması, sürgün aşaması, köklendirme ve toprağa şaşırtma aşamalarından oluşur. In vitro mikroçoğaltma tekniği, bitki ıslahında özellikle yeni çeşit geliştirilmesinde büyük öneme sahip olup, somaklonal varyasyonların yaratılması için ideal bir tekniktir. Somaklonal varyasyon in vitro koşullarda rejenere edilen bitkiler arasından varyasyonların olması anlamına gelmektedir. Somaklonal varyasyonlara kromozom sayılarının değişmesi (poliploidi yada anueploidi), kromozomların zarar görmesi (eklenmesi, çıkarılması, taşınması, mutasyonlar v.b.), yada kromatindeki metilasyondaki değişimler neden olmaktadır. Kromozomlar; krossing-over, heterokromatik bölgede geç replikasyon, elementlerin yerlerinin değişmesi, nokta mutasyonları yada kromozom tekrar dizilimlerinde değişiklik gösterebilmektedir (Biswas ve ark., 2009). In vitroda büyüme ve rejenerasyon karmaşık olup, büyüme ve gelişmeye birçok genetik ve çevresel faktörler etkilidir. Her türün ve hatta her çeşidin kendine özgü isteği olup, hücre farklılaşması için; farklı ortam ve temel besin ortamı vardır. Çilekte; hastalık ve zararlılara dayanım, meyve raf ömrünün uzatılması gibi istenen özelliklere sahip çeşit geliştirmek için bitki genetik mühendisliğinden yararlanılması kaçınılmazdır (Husaini ve Sirivastava, 2006). Çilekte direkt gen transferi en uygun ıslah metodlarından biridir. Zira çileğin poliploid olması ve heterozigoti oranının yüksek olması klasik ıslah çalışmalarında sorunlar yaratmaktadır. 5

18 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ In vitro teknikleri modern bitki ıslah programlarında kullanılan en önemli tekniklerden biri olmuştur (Taji ve ark., 2002). Debnath (2000), klasik ıslah ve modern ıslah tekniklerinin birlikte kullanılmasıyla yeni çeşit geliştirmenin daha kısa sürede gerçekleşebileceğini bildirmiştir. In vitro yöntemlerde başarının en önemli unsuru bitki parçacıklarının rejenerasyon yeteneklerinin yüksek olmasıdır (Cao ve Hammerschlag, 2000). Sürgün rejenerasyon sistemi transgenik bitkilerin geliştirilmesinde, bitki hücrelerine genin aktarılmasında ve somakolonal varyasyonların belirlenmesi veya teşvikinde kullanılmaktadır. TDZ, fenil üre yerine geçirilen, ilk kez pamuk tohum kabuklarının hasat edilmesi sırasında kullanıldığı, son zamanlarda daha çok doku kültürü ortamlarında rejenerasyonu teşvik için kullanıldığı ve birkaç türde hem organogenesiste hem de somatik embriyogenesiste oksin ve sitokinin ihtiyaçlarının yerine kullanılabildiği bildirilmiştir (Murthy et al.,1998). TDZ, sitokinin biyosentezinden ve bitki dokularında endojenöz (içsel) hormonların korunmasından sorumludur (Capella et al.,1983; Thomas ve Katterman,1986). Önceki yıllarda yapılan çalışmalar incelendiğinde çileklerde çoğaltma metodunun bitki büyüme ve gelişmesini önemli ölçüde etkilediği belirtilmiştir. Özellikle in vitro koşullarda çoğaltılan bitkilerin konvansiyonel olarak çoğaltılanlara oranla gerek vegetatif aksam bakımından gerekse salkım sayısı bakımından artışlar olduğu, bu bitkilerden çok fazla sayıda kol ve gövde elde edilmesi yanında, CO 2 asimilasyonu ve stomatal (in vivo koşullara göre) işlevlerinin yüksek düzeyde gerçekleştirdikleri bildirilmiştir (Boxus ve ark., 1984; Cameron ve ark., 1989). Somaklonal varyasyonlarla elde edilen rejenerantların çoğalmalarında problemler yaşanmasına rağmen, somaklonal varyasyonların tahmini doğada oldukça zor olup, bunlar hem genetik hem de epigenetik olabilir. Mikro çoğaltma teknikleri ile çoğaltılan çileklerde gizli morfolojik değişimler olduğu belirlenmiştir (Swartz ve ark., 1981). Somaklonal varyasyonların hızlı ve doğru bir şekilde teşhisinde moleküler markör tekniklerinden yararlanılabilmektedir. DNA ya dayalı markör teknikleri farklı genetik materyallerin çevreden bağımsız olarak karşılaştırılmasını sağlamaktadır. Nitekim, her bir marker sisteminin kendine özgü etkinliği, kısıtlamaları olup, uygun marker sisteminin karar verilmesi gerekmektedir. 6

19 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ Intersimple sequence repeat (ISSR) marker tekniği çoğu bahçe bitkileri türlerinde kullanılabilen ve mikro tekniklerle çoğaltılan bitkilerin ismine doğruluğunun karşılaştırılmasında kullanılan bir tekniktir. Bu tezde; ülkemizde ticari öneme sahip olan Rubygem ve Festival çilek çeşitlerinin yaprak diskleri ve stipulleri kullanılarak en uygun rejenerasyon protokollerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yaprak diskleri ve stipullerin rejenerasyonunda ışık (16 saat ışık, 8 saat karanlık) ve 15 gün sürekli karanlık uygulamaları ile farklı konsantrasyonlarda oksin (IBA) ve sitokinin (TDZ) gibi bitki büyümeyi düzenleyicileri ile AgNO 3 içeren ortamların etkileri araştırılmıştır. 7

20 1. GİRİŞ Duygu AYVAZ SÖNMEZ 8

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Çileklerde ilk in vitro çalışmaları; Boxus (1974), tarafından başlatılmış ve özellikle yaprak diskleri çok fazla kallus oluşturma özelliğine sahip olduğu için bu konu ile ilgili olarak sürgün ve adventif sürgün oluşumu üzerine farklı temel besin ortamı ve bitki büyümeyi düzenleyiciler kullanılarak çok sayıda araştırmalar yapılmıştır (Liu ve Sanford, 1988; Nehra ve ark., 1990; Passey ve ark., 2003; Yonghua ve ark., 2005; Kafkas ve ark., 2002). Ayrıca, Rugini ve Orlando (1992) ile Yonghua ve ark. (2005), yaprak sapından, Graham ve ark.(1995), gövdeden, Jemmali ve ark., (1994); Passey ve ark. (2003); Kafkas ve ark., (2002) yaprak disklerinden, Rugini ve Orlando (1992) ile Passey ve ark. (2003); köklerden, Liu ve Sanford (1988) ise; kollardan sürgün rejenere etmişlerdir. Maas (1998), dünya çilek üretiminde verim kayıplarının en büyük nedeninin; hastalıklar olduğunu ve bu hastalıklar içerisinde de Colletotrichum acutatum hastalık etmeninin neden olduğu antraknoz hastalığı olduğunu bildirilmiştir. Antraknoz; özellikle meyvede çürüklük, kollarda ve yaprak sapında lezyonlar ile gövde çürüklüklerine neden olmaktadır. Antraknoza karşı fungusitler kullanılmasına rağmen, fungusitlerin; insan sağlığına, çevreye olumsuz etkileri özellikle ruhsatlı ilaçlar bulunmaması dayanıklı çeşit kullanılmasını gerektirmektedir (Legard ve ark., 2002). Bir çok antraknoz hastalığının neden olduğu Colletotrichum acutatum isolatlarının in vitro koşullarda benomyle (fungusit) dayanım gösterdiği bildirilmiştir. Ayrıca, çilekte, zaman ve sınırlı sayıda germplasmının olması hastalığa yüksek dayanım gösteren çeşit ıslahının konvansiyonel ıslah programları ile zor olduğu bilinmektedir (Hancock ve Luby, 1995). Bu nedenle; doku kültürü tekniklerinden yararlanılarak, somaklonal varyasyonların hastalıklara dayanıklı genotip geliştirilmesinde kullanılabilecek bir yöntem olduğu ve sonuca daha kısa sürede ulaşılabileceği bildirilmiştir (Larkin ve Scowcroft, 1981). Hammerschlag ve ark., (2006), antraknoz hastalığına karşı Chandler, Delmarvel, Honeoye, Latestar, Pelican ve Sweet Charlie çeşitlerinin in vitro koşullarda ve yaprak eksplantlarının rejenere edilmesiyle elde edilen sürgünlerde Colletotrichum acutatum un en virülent izolatı kullanılarak tarama yapılmıştır. Rejenerasyonla hastalığa dayanım arasında kuvvetli 9

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ bir ilişki bulunmuştur. Araştırıcılar, somaklonal varayasyonların antraknoza dayanımda kullanılabilecek iyi bir teknik olduğunu bildirmişlerdir. Araştırılan diğer bir hastalıkta Botrytis cinerea fungusunun neden olduğu gri küf hastalığıdır. Bu hastalık meyve gelişiminin herhangi bir safhasında ortaya çıkabilir. Hasat veya çiçeklenme döneminde uzun süren kapalı ve nemli hava koşulları ile yüksek hava sıcaklığı birleştiğinde taç yapraklar, çiçek sapları, meyve çanak yaprakları ve meyve çok kolay bir şekilde enfekte olur. Enfeksiyona en hassas organ genç çiçeklerdir (Yılmaz, 2006). Seuo ve ark.(2008) yaptıkları çalışmada Festival çeşidinin Botrytis cinerea ya oldukça hassas olduğunu bildirmişlerdir. Nehra ve arkadaşları (1992) Redcoat çilek çeşidinde, bitki büyüme düzenleyicileri konsantrasyonu, kallus boyutunun yaşı ve kallus kültür rejenantları arasındaki doğal varyasyonları incelemişlerdir. Bitki büyüme düzenleyicilerinin etkisi fizyolojik etkisinden dolayı kallus kültüründen elde edilen bitkilerde bitki kuvvetinde azalma, daha kısa petiol uzunluğu ve daha küçük yapraklar oluşturduğu, fakat sera koşullarında yaprak ve kol sayısının daha fazla olduğu gözlenmiştir. Araştırıcılar; 1, 5, 10, 20 µm konsantrasyonlarında BA ve 2,4- D içeren ortamlar kullanmışlardır µm konsantrasyonlardaki kombinasyonda farklı fenotipik değişken gözlenmezken, bu kombinasyonun en yüksek konsantrasyonunda (her biri için 20 µm ) yüksek frekanslı (10%) bodur tip varyanslar geliştirilmiştir. Tüm kültürler 26±2 o C sıcaklıkta, 16/8 saatlik fotoperiyotta inkübe edilmişlerdir. Sorvari ve arkadaşları (1993), yaptıkları çalışmada Hiku ve Jonsok çeşitlerini hormonlu ve hormonsuz ortamlar kullanarak çoğaltmışlardır. Daha sonra elde ettikleri bitkilerden aldıkları yaprak disklerinin değişik ortamlardaki tepkilerini test etmişlerdir. Stok bitkilerin, 0.5 mg/l BAP, 0.5 mg/l IBA, 0.2mg/L GA 3 ilaveli mikroçoğaltım ortamında sürgün rejenerasyon teşviki incelenmiştir. 4 hafta sonra çoğaltılan bitkilerden mantar delici(cork-borer) yardımıyla 4 mm çapında yaprak diskleri elde etmişlerdir. Yaprak disklerini farklı kombinasyonlardaki değişim ortamlarında karşılaştırmışlar ve sonuçları değerlendirmişlerdir. Hiku çeşidinde hormon içeren ortamından elde edilen bitkiler, MS+2000 mg/l KNO3+400 mg/l CH (kazein hidrolizat)+3 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA kullanılan rejenerasyon ortamında en yüksek oranda (9.9) toplam sürgün sayısı belirlenmiştir. Jonsok 10

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ çeşidinde ise 600 mg/l, CH+3 mg/l, BAP+0.1 mg/l IBA içeren ortamda ve en fazla sürgün rejenerasyon oranı 12.8 olarak belirlenmiştir. Bhatt ve Dhar (2000), Fragaria indica da yaptıkları çalışmada eksplantların hayatta kalma oranlarının arttırılması ve fenol kahverengileşmesinin azaltılmasına dayanan etkili bir mikroçoğaltım yöntemi geliştirmişlerdir. Nodal segmentler 4.0 µm BA ve 0.1µM NAA ilaveli MS ortamında kültüre alınmışlar ve 24, 48 ve 96 saatllik aralıklarla aynı içeriğe sahip taze ortamlara aktarılmışlardır. Eksplantların sürekli aktarılmasıyla hayatta kalma oranlarının %94.4 olması sağlanmıştır. Eksplant başına sürgün sayısı 22,3 ile en iyi sonucu vermiştir. Bu araştırma ile sitokinler arasında BA nın N6-( dimethylallyamino) purin ve kinetinden daha etkili olduğu saptanmıştır. Sürgünler 1.0 µm NAA içeren ½ agar-jel ortamında köklendirilmiş ve dışarıdaki iklim koşullarına başarıyla alıştırılmıştır. Dış ortamda bitkilerin hayatta kalma oranları %70 olarak belirlenmiştir. Adak ve arkadaşları (2001), Oso Grande çilek çeşidinin meristem kültürü ile çoğaltılması üzerine araştırmalar yapmışlardır. Araştırıcılar, farklı konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri kullanılarak çoğaltma ve köklendirme aşamalarındaki en iyi sonuç veren konsantrasyon kombinasyonunu tespit etmişlerdir. Çoğaltma aşamasında a) değişik BAP konsantrasyonları (0, 0.5, 1.0, 1.5 ve 2 mg/l) ile kombinasyon oluşturan 1 mg/l IAA, b) değişik GA 3 konsantrasyonlarının (0, 0.1, 0.4, 0.8 ve 1.0 mg/l) 1 mg/l BAP ve 1 mg/l IAA ile oluşturduğu kombinasyon ve (c) değişik IAA konsantrasyonlarının (0, 0.4, ve 1.2 mg/l) 1 mg/l BAP ile olan kombinasyonlarını denemişlerdir. Köklendirme aşamasında ise (a) değişik IBA (0, 0.1, 0.4, 0.8 ve 1 mg/l), (b) değişik NAA (0, 0.1, 0.4, 0.8 ve 1 mg/l) (c) değişik aktif kömür (0, 1.0, 2.5 ve 5.0 g/l) konsantrasyonları kullanılmıştır. Sonuçlara bakıldığında; çoğaltma aşamasında sürgün sayısı ve sürgün kalitesi bakımından 1mg/L BAP ın 1 mg/l IAA ile olan kombinasyonunda en iyi sonuç alınmıştır. Köklendirme aşamasında ise aktif kömürün 5 g/l düzeyi, 1 g/l ve 2.5 g/l düzeylerine göre köklenme açısından daha başarılı bulunmuştur. Kafkas ve ark. (2002), İsrail de meyve büyüme ve gelişmesi özellikle oksin sentezinden sorumlu TPRP-F1::rol B genini yaprak diski ve yaprak sapına Agrobacterium tumefecians aracılığıyla aktararak transgenik bitkiler elde etmişlerdir. 11

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ Passey ve ark. (2003), farklı büyüme düzenleyicileri kullanarak yedi ticari çilek çeşidinin yaprak, stipul, petiol gibi farklı eksplantların rejenarasyon seviyelerini testlemişlerdir. Calpso, Emily, Bolero ve Elsanta çilek çeşitleri için; 1 mg/l TDZ+ 0.2 mg/l 2.4-D, Pegasus ve Tango çeşitleri için; 2 mg/l BA+ 0.5 mg/l TDZ+ 0.2 mg/l 2.4-D en yüksek seviyede rejenerasyon elde etmişlerdir. Qin ve Zhang(2005), çilekte gümüş nitratın farklı konsantrasyonlarının ve bitki büyüme düzenleyicilerinin sürgün rejenerasyonuna etkilerini araştırmışlardır. Araştırmacılar, TDZ (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/l ), IBA (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/l) ve 2.4-D (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/l) oranlarında kullanarak onbeş faktoriyel kombinasyonda sürgün rejenerasyonun tepkilerini test etmişlerdir. Yaprak diskleri 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/l konsantrasyonlarda AgNO 3 içeren sürgün rejenerasyon ortamında kültüre alınmışlardır. En yüksek rejenerasyon (%87.38) ve en fazla sürgün sayısı (11.67), 1.5 mg/l TDZ, 0.4 mg/l IBA ve 1.0 mg/l AgNO 3 içeren sürgün rejenerasyon ortamında başarıyla sağlanmıştır. Köklenme için en uygun ortamın 1.0 mg/l AgNO 3 içeren ½MS ortamı olduğu belirtilmiştir. AgNO 3 ın ortama ilavesiyle; kök gelişimi, kök uzunluğu, kuru ağırlığı ve faaliyette artış gözlendiğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar, ayrıca düşük konsantrasyondaki AgNO 3 ın etilen üretimini engellerken, sürgün rejenerasyonu ve büyümeyi teşvik ettiğini bildirmişlerdir. AgNO 3 ın klorofil, çözülebilen protein içeriği ve antioksidan enzim aktivitesinde önemli teşvik etkisi olduğu bildirilmiştir. AgNO 3 varlığında ve maksimum oranı 1.0 mg/l ye ulaştığında klorofil, çözülebilir protein içeriği, peroksidaz ve katalaz aktiviteleri arttığı belirtilmiştir. Önceleri çileklerde başlangıç materyali olarak yaprak diskleri kullanılırken, daha sonraları çanak yaprakların da çileklerde adventif sürgün rejenarasyonu sağladığı saptanmıştır. Debnath, (2005), Kanada da ticari olarak yetiştirilen Bounty çilek çeşidinin çanak yaprak ve yaprak saplarından elde edilen disklerden rejenarasyon ile çilek bitkilerinin elde edildiğini bildirmiştir. Araştırmacı, çanak yaprakları 2-4 µm TDZ içeren 4-5 haftalık kültüre almış, genç çanak yapraklar 14 gün boyunca karanlıkta en iyi rejenerasyon sonucunu vermişlerdir. Aynı araştırıcı, sepallerin; yaprak disklerinden ve petiollerden daha iyi performans gösterdiğini belirtmiştir. Araştırıcı ayrıca, adventif sürgünlerin uzamasında farklı 12

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ konsantrasyonlarda iki sitokinin TDZ (0, 0.5,2.0, 4.0 µm ) ve zeatin (2.0 ve 4.0 µm) etkilerini karşılaştırmış ve TDZ içeren ortamın kallus formasyonunu ve sürgün uzamasını arttırdığını belirtmiştir. Debnath (2005), sitokinin olarak bilinen ve aynı zamanda oksine benzer etki gösteren Thidiazuron un üzümde, kivide, pek çok odunsu bitkide rejenerasyonu başarılı bir şekilde sağladığı, ancak TDZ nin bir çok odunsu bitkide sürgün uzamasını engellediği belirlenmiştir. Ayrıca, sürgün uzamasının engellenmesinin sitokininin artmasına neden olan sitokinin oksidaz enziminin faaliyet gösterememesinden kaynaklandığı saptanmıştır.. Debnath (2006), yaptığı bu çalışmada Bounty çileğinde TDZ ve zeatinin etkileri üzerine çalışmıştır. Araştırmacı sürgün rejenerasyonunda TDZ konsantrasyonlarının etkilerini ve sitokinin konsantrasyonlarının adventif sürgünlerin köklenme ve çoğalmadaki etkilerini araştırmıştır. Sepaller (çanak yaprak), petioller (yaprak sapı) ve yaprak diskleri, dört farklı TDZ konsantrasyonu ( 0, 2, 4 ve 8 µm) içeren ortamda kültüre almışlar, yaprak diskleri ve sepaller adaksial olarak, petioller ise horizantal şekilde ortama yerleştirilmiştir. Tüm kültürler 20±2 C de 14 gün karanlıkta inkübe edilmiştir. Sepallerin sürgün rejenerasyonunda, yaprak disklerinden ve petiol segmentlerinden daha etkili olduğu kanıtlamıştır. Diğer deneyinde ise, sepalleri çıkarılan adventif sürgünlerde, köklenme ve sürgün çoğaltımında, 0, 0.5, 1, 2, 4 µm konsantrasyonlarda TDZ ve zeatinin etkileri karşılaştırılmıştır. Genelde TDZ içeren ortam sürgünlerin köklenmesini, kallus oluşumunu ve uzamayı daha da arttırmıştır. Sürgün çoğaltımı ve kök gelişimi, 1 ve 2 µm zeatin içeren ortamda kültüre alınan bitki eksplantlarında en iyi gözlenmiştir. Landi ve Mezzetti (2006), yaptıkları çalışmada farklı Fragaria spp. genotiplerinde kollardan alınan sürgünlerin 30 günlük çoğaltımdan sonra, yaprak tabakalarından orta damar boyunca enine kesip ve 4 farklı kombinasyonda; 4.54 μm 1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) üre (thidiazuron; TDZ) yalnız ve 0.98 μm indole- 3-butyric acid (IBA), 0.84 μm3-benzo[b]selenienyl acetic acid (BSAA) ve 0.90 μm2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) 3 farklı oksin kombinasyonundaki MS ortamında kültüre alınmıştır. Kültürler iklim odalarında 25±2 C sıcaklık altında, 16/8 saatlik fotoperiyot (16 saat 250 μmols m 2 s 1 ışıkta, 8 saat karanlık) ve devamlı 13

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ karanlık olmak üzere iki farklı inkübasyon koşullarında inkübe edilmişlerdir. Yapılan çalışmada, TDZ/BSAA ve TDZ/2,4-D kombinasyonları sadece bazı genotiplerde yüksek rejenerasyon verimliliğini teşvikini sağladığı,tdz/iba neredeyse tüm genotiplerin yapraklarında yüksek sürgün rejenerasyonu verimliliğinin teşvikini sağladığı bildirilmiştir. Karanlıkta sürgün rejenerasyonu yüzdesi yüksek iken, 16/8 saatlik fotoperyotta kallus oluşumu ve köklenme oranının yüzdesi daha yüksek oranda olduğu gözlenmiştir. Husaini ve Abdin (2007), Chandler çilek çeşidini kullanarak ışık, sıcaklık ve farklı konsantrasyonlarda TDZ kullanarak, yaprak disklerinin rejenerasyonuna etkilerini araştırmışlardır. Araştırıcılar, Chandler çilek çeşidinin yaprak disklerinden hem somatik embriyogenesis hem de sürgün tomurcuk oluşumu aynı anda başarılmıştır.yaprak diskleri MS tuzları+b5 vitamini+%2 glikoz µm TDZ, düşük sıcaklık ve karanlık uygulamalarından (2 hafta 4 o C ve 25±2 o C, 3 hafta 16 saat ışıklanma) sonra MS tuzları+b5 vitamini+%2 glikoz ve 16 saat ışıklanma periyodunda 25±2 o C alt kültüre alınarak büyüme ve gelişmeleri sağlanmıştır. Araştırıda, 4.54, 6.81, 9.08, 11.35, 13.62, ve µm olmak üzere yedi farklı konsantrasyonda TDZ kullanılmıştır. Sürgün organogenesisi en iyi 9.08 µm TDZ konsantrasyonunda saptanırken, somatik embriyogenesis ise en iyi µm TDZ konsantrasyonunda belirlenmiştir. Ayrıca, 3 farklı ışıklanma (24, 16, 12 saatlik fotoperiyotlar) süresi ile, karanlık uygulamaları ve soğuk uygulamalarının somatik embriyogenesisi artırdığı ancak soğuk uygulamalarının sürgün organogenesisi engellediğini bildirmişlerdir. Miranda ve arkadaşları (2007), in vitro koşullarda yetiştirilen çileklerde galakturonik asit kullanımının etkisini araştırmışlardır. Trifloroasetik asidin hidrolizi ile oluştuğu bilinen galakturonik asit 0.1 mm ve 1.0 mm konsantrasyonlarının ortama Benzil Adenin eklenmesiyle birlikte sürgün ve yaprak sayısında artış olduğunu bildirmişlerdir. Ortama Benzil Adenin eklenmediğinde galakturonik asidin etkinliğinin azaldığı saptanmıştır. Bunun tam tersi ise; ortama BA eklenmediği durumda kök uzamasında artış olduğu dikkati çekmiştir. Biswas ve arkadaşları (2009), yaptıkları çalışmada çilekte somoklonal varyasyonların gelişimini araştırmışlardır. Varyasyonlar için birkaç doku kültürü 14

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ tekniği kullanılmıştır. Bu çalışmada doku kültür teknikleri arasından; meristem kültürü ile somoklonal varyasyonu en etkili şekilde gözlemlemeyi başarmışlardır. Fragaria ananassa Duch. kültürlerinin kollarından alınan eksplantların yüzey sterilizasyonu yapıldıktan sonra %3 sakkaroz ve %0.8 agar içeren yarı-katı MS ortamında kültüre almışlar ve 16/8 saatlik fotoperiyotta 25±2 o C inkübe etmişlerdir. Meristemler 2 haftalık bitkilerden elde edilerek önce 0.5 mg/l GA 3 ilaveli MS ortamında, 3-4 hafta sonra 0.5 mg/l GA3 ve 0.1 mg/l IBA içeren MS ortamında altkültüre alınmışlar, mikroçoğaltımda 2.0 mg/l BAP ve 0.5 mg/l kinetin, yapraktan sürgün organogenesisinde ise 6.0 mg/l BAP, kallus oluşumu için ise 3 mg/l 2,4-D, somatik embriyogenesisde 1.0 mg/l 2,4-D, 0.5 mg/l BAP ve %25 prolin içeren ortamlarda kültüre alınmışlardır. Bu çalışmaya göre; BAP ın yüksek konsantrasyonun somoklonal varyasyonu başarılı bir şekilde sonuçlandırdığı gözlenmiştir. Chine-Ying Ko ve arkadaşları (2009), yaptıkları çalışmada çilekte dezenfeksiyon protokolünün etkili yöntemi ve mikroçoğaltımla geliştirilmiş eksplantların hayatta kalma oranları ve azalmış fenol teşvikiyle kahverengileşme durumunu incelemişlerdir. 3 Farklı çilek çeşidinden alınan yapraklar cm lik parçalara ayrıldıktan sonra Tween 20 damlatılmış %10.5 sodyumhipoklorit solüsyonunda 7 dk. bekletilmiş, 4-5 kez saf steril sudan geçirilerek durulanmıştır. Daha sonra elde edilen sürgün uçları ise; Tween 20 damlatılmış, %0.25 lik sodyumhipoklorit solüsyonunda 1 dk. bekleterek yüzey sterilizasyonu yapılmış ve hormonsuz MS ortamında, loş ışık altında (500 lüx) kültüre almayı başarılmıştır. Loş ışık altında (500 lux) 3 genotipin hayatta kalma oranı % arasında gözlenmiştir. Kardeşlenme ortamı olarak iki ortam kullanılmıştır. M1 ortamı (MS mg/l BA mg/l NAA +7 g/l agar) ve M2 ortamının (MS +1.0 mg/l BA mg/l NAA + 7g/L Agar), lux ışık altında inkübe edilerek sürgün çoğaltımı üzerine etkileri karşılaştırılmıştır. Sonuçlarda ışık yoğunluğunun hayatta kalma oranlarını ve fenol teşvikini önemli şekilde etkilediği görülmüştür. Haddadi ve ark. (2010), Camarosa çilek çeşidinde etkili bir mikroçoğaltım yöntemi geliştirmiştir. Sürgün uçlarını 0, 2, 4 ve 8 µm TDZ ve 0, 4, 9, 18 ve 27 µm 15

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Duygu AYVAZ SÖNMEZ BAP ilaveli MS ortamına sürgün başlatmak için almışlardır. Sonuçlara göre en iyi sürgün çoğaltma 2 µm TDZ ve 4 µm BAP ilaveli MS ortamından elde edilmiştir. Pallavi ve ark.(2011), Sweet Charlie çilek çeşidinin petiol segmetlerinden somatik embriyogenesiz üzerine çalışmışlardır. Yaptıkları çalışmada 1 mg/l TDZ ve 2.4-D kullanarak, petiol segmentlerinden ufak embriyonik kalluslar elde etmişlerdir. 16

29 3.MATERYAL VE METOD Duygu AYVAZ SÖNMEZ 3. MATERYAL VE METOD 3.1.Materyal Bitkisel materyal olarak YALTIR A.Ş nin araştırma ve deneme seralarında yetiştirilen Rubygem ve Festival çilek çeşitleri kullanılmıştır. Söz konusu çeşitlere ait bitkilerden meristem kültürü ile doku kültüründe üretilen bitkilerin yaprakları ile stipulleri (yaprak sapının gövdeye bağlandığı bölgede bulunan yapı) eksplant olarak kullanılmıştır. Bu araştırma, Çukurova Üniversitesi Biyoteknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi Doku Kültürü Laboratuvarları ile Yaltır A.Ş ye ait doku kültürü laboratuvarlarında yürütülmüştür Festival Festival çilek çeşidi Avrupa Birliğinde Florida Festival olarak kayıtlı olup, Florida Üniversitesi Dover Araştırma İstasyonundan Dr. Craig Chandler tarafından ıslah edilmiştir yılının mayıs ayından beri uluslararası çilek endüstrisine önemli bir katkı sağlamıştır. Oso Grande ve Rosa Linda melezidir. Kısa gün çeşididir. Konik meyve şekline sahip olup, meyve eti rengi açık kırmızı, meyve dış rengi ise koyu ve parlak kırmızıdır. Meyve eti renginin bir örnek kırmızı renge sahip olması, dondurularak satılan ürünler piyasası için mükemmel bir aday olmasını sağlamıştır. Bitkinin açık yapıda olması tozlanmayı, meyve saplarının uzun olması meyve hasadını kolaylaştırmaktadır. Meyveleri tatlı olduğu, aromasının Sweet Charlie çilek çeşidi kadar yüksek olmasa da Camarosa çilek çeşidinden yüksek olduğu bildirilmiştir. Erkencilik bakımından Sweet Charlie den 10 gün sonra ürün verirken, Camarosa dan 2-3 hafta erken ürün verir. Bu çeşidin meyve kalitesi, verimi ve raf ömrü bakımından Camarosa ya çok benzer, ilk meyvelerdeki şekil bozukluğu Camarosa dan çok düşüktür (Chandler ve ark., 2000). Ayrıca, Seuo ve ark.(2008), Festival çeşidinin Colletotrichum acutatum neden olduğu antraknoz hastalığına karşı orta derecede dirençli, Botrytis cinerea ya oldukça hassas olduğunu belirtmişlerdir. 17

30 3.MATERYAL VE METOD Duygu AYVAZ SÖNMEZ Rubygem Rubygem, kısa gün çeşidi olup, erkenciliği ve çok beğenilen tadı ile tanınmaktadır. Festival den daha erkencidir. Tatlı meyvelere sahip olan bu çeşidin meyve eti sert olup, yola dayanımı iyidir. Yüksek aromalı ve orta irilikte meyvelere sahiptir. Meyve eti kırmızı iken, dış rengi parlak koyu kırmızıdır. İri ve albenili çanak yapraklara sahiptir. Aromalı ve şeker asit dengesine sahip, meyveleri suludur. Yağmur zararlarına karşı orta derecede hassasiyet gösterir. Rubygem çeşidi külleme hastalığına duyarlı, Fusarium solgunluğuna ve antraknoza karşı töleransının iyi olduğu bilinmektedir Metod Materyallerin Yüzey Sterilizasyonu ve Hazırlık Aşaması Alınan bitki kolları öncelikle musluk suyunda yıkandıktan sonra yüzey sterilizasyonu için %70 lik etanolde 30 saniye kadar bekletilmiştir. Ardından içerisine birkaç damla Tween 20 damlatılmış %6 lık sodyumhipoklorit solüsyonunda 8-10 dk bekletildikten sonra, steril saf sudan birkaç kez geçirilerek sterilizasyon aşaması tamamlanmıştır. Tüm örnekler steril filitre kağıtları üzerinde kurutulmuştur ve meristemler Nikon SMZ800 markalı stereomikroskop altında çıkarılmıştır (Şekil 3.1). Şekil 3.1. Sürgün uçlarının yüzey sterilizasyonu aşaması ile mikroskop altında meristemlerin çıkarılması aşamasından bir görünüm. 18

31 3.MATERYAL VE METOD Duygu AYVAZ SÖNMEZ Besin Ortamının İçeriği ve Hazırlanması Denemede temel besin ortamı olarak McCown Woody Plant Medium (Çizelge 3.1), 20 g/l sakaroz ve katılaştırıcı olarak 7.5 g/l agar kullanılmıştır. ph 5.8 olacak şekilde 1 N lik HCl ve 1 N lik KOH kullanılarak ayarlanmıştır. 121 C de 20 dk. otoklavda steril edilmiştir. Oda sıcaklığında yaklaşık C ye kadar soğutulan ortam aseptik koşullarda cam steril petri kaplarına her kapta 10 ml. olacak şekilde konulmuştur. Oksin olarak kullanılan IBA besin ortamına otoklavlanma işleminden önce eklenmiştir. Sitokinin olarak kullanılan TDZ ve rejenerasyon teşvik hızını artırdığı bilinen AgNO 3 ise steril filtrelerle aseptik koşullarda soğuk sterilizasyonu yapılarak ortamlara eklenmiştir (Şekil 3.2). Rejenerasyon ortamında temel besin ortamına ek olarak farklı dozlarda TDZ (0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mg/l), IBA (0, 0.2,0.4 mg/l) ve AgNO 3 (0, 1.0, 2.0, 3.0 mg/l) uygulaması yapılmıştır. Ancak denemeler iki aşamada yapılmıştır. Öncelikle ilk aşamada optimum ışık rejimi ve bitki büyüme düzenleyicilerinin (TDZ ve IBA) kombinasyonu belirlenmiştir, ikinci aşamada karanlık uygulaması ve AgNO 3 konsantrasyonun optimizasyonu yapılmıştır. Denemeler üç kez tekrarlanmış olup, her tekerrürde 40 eksplant kullanılmıştır (Şekil 3.3). 19

32 3.MATERYAL VE METOD Duygu AYVAZ SÖNMEZ Şekil 3.2. Denemede kullanılan TDZ ve AgNO 3 ın soğuk sterilizasyon aşaması ile ortamların cam petrilere aktarılması aşamasından bir görünüm. Şekil 3.3.Denemede yer alan explantların hazırlanması aşamasından bir görünüm. 20

33 3.MATERYAL VE METOD Duygu AYVAZ SÖNMEZ Çizelge 3.1. Denemede temel besin ortamı olarak kullanılan McCown Woody Plant ortamının içeriği Mikroelementler mg/l CuSO 4.5H 2 O 0.25 FeNaEDTA H 3 BO MnSO 4.H 2 O Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 ZnSO 4.7H 2 O 8.60 Makroelementler mg/l CaCl Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O KH 2 PO K 2 SO MgSO NH 4 NO Vitaminler mg/l Glycine 2.00 Myo- Inositol Nicotinic acid 0.50 Pyridoxine HCl 0.50 Thiamine HCl Yaprak Diskleri ve Stipullerin Rejenerasyonuna Işık Rejimi ve Bitki Büyümeyi Düzenleyicilerin Etkisi Bu aşamada, Festival ve Rubygem çilek çeşidinden alınan meristemler temel besin ortamına dikildikten sonra elde edilen çilek bitkilerinin alt kültürlere alınarak çoğaltılan bitkilerin yaprak ve stipulleri materyal olarak kullanılmıştır (Şekil 3.4). Bu eksplantlar temel besin ortamına ek olarak farklı dozlarda TDZ (0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mg/l) ve IBA (0, 0.2, 0.4 mg/l) içeren farklı besin ortamlarında kültüre alınmışlardır. Farklı dozlarda bitki büyüme düzenleyiciler uygulanan ortamlar ışık (16 saat ışık, μmol/sn -1 m -2 /8 saat karanlık) ve karanlık (15 gün devamlı) olmak üzere iki farklı koşulda inkübe edilmişlerdir. Böylece, çeşitlerin eksplant başına sürgün sayısı, rejenerasyon yüzdesi (%), kallus oranı (%), kallus çapı, kallus dokusunun rengi belirlenerek en iyi tepki veren bitki büyümeyi düzenleyicilerin dozları belirlenmiştir. Denemenin bu aşaması 2 farklı ışık rejimi, 3 farklı oksin, 5 farklı sitokinin dozlarını içeren toplam 30 uygulama ve her uygulamada 40 eksplant olacak şekilde 3 kez tekrarlanarak yapılmıştır. 21

34 3.MATERYAL VE METOD Duygu AYVAZ SÖNMEZ Şekil 3.4. Denemede yer alan Festival çilek çeşidinin yaprak diski ve stipüllerinin eksplant olarak ortamlara aktarılması aşamasından bir görünüm Yaprak Diskleri ve Stipüllerin Rejenerasyonuna Gümüş Nitrat (AgNO3) Konsantrasyonunun Etkisi Bu aşamada, birinci denemeye göre en iyi sonuç veren TDZ ve IBA içeren ortam kullanılmıştır. Çeşitler arasında sonuçlar farklılık göstermiştir. Bu ortamlara ek olarak gümüş nitratın (AgNO 3 ) 4 farklı dozu (0, 1.0, 2.0, 3.0 mg/l) 2 farklı ışık rejimi uygulamaları denenmiştir (Şekil 3.5). Böylece çeşitlerin eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün rejenerasyon yüzdesi değerlendirilerek AgNO 3 uygulaması belirlenmiştir. Denemenin bu aşaması 2 farklı ışık rejimi ile, 4 farklı AgNO 3 uygulamasını içermekte olup, bu aşamada toplam 8 uygulama ve her uygulamada 3 yineleme olarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.6 da izlenen prosedür ile yapılan çalışmalar kısaca şematize edilmiştir. 22