ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI EKSTREM TERMOFİL BAKTERİLERİN AMİLAZLARININ ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Gülay FUKARA Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri En

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI EKSTREM TERMOFİL BAKTERİLERİN AMİLAZLARININ ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ GÜLAY FUKARA GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI EKSTREM TERMOFİL BAKTERİLERİN AMİLAZLARININ ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Gülay FUKARA Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ Bu çalışmada, çeşitli su ve toprak örneklerinden izole edilmiş olan bazı ekstrem termofil anaerobik bakteriler amilolitik aktiviteleri bakımından incelenmişlerdir. Test edilen 19 suştan, P/2, P/4, 70/2 ve CRK olarak isimlendirilen dört bakteri, eksraselüler α-amilaz ve ekstraselüler ve intraselüler α-glikozidaz üretim kapasitelerinin ve bu enzimlerin bazı özelliklerinin belirlenmesi amacıyla seçilmiştir. P/2, P/4, 70/2 ve CRK logaritmik gelişimlerini inkübasyonun sırasıyla 55., 48., 31. ve 31. saatlerinde tamamlamışlardır. Gelişme sırasında maksimum α-amilaz aktivitesi P/2 için 55. saatte U/ml olarak, P/4 için 30. satte U/ml olarak, 70/2 için 78. satte olarak ve CRK için 55. satte olarak belirlenmiştir. Enzimlerin sıcaklık ve ph optimumları; P/2 nin α-amilazı için 90 o C ve ph 7.0, P/4 ün α-amilazı için 70 o C ve ph 7.0, 70/2 ve CRK nın α-amilazları için 70 o C ve ph 6.0 olarak belirlenmiştir. 70 o C de 1 saat inkübasyondan sonra P/2, P/4, 70/2 ve CRK α-amilazları aktivitelerinin sırasıyla %30, %32, %25 ve %20 ini kaybetmişlerdir. Bakteriler, karbon kaynağı olarak nişasta ve azot kaynağı olarak tripton bulunan besiyerlerinde maksimum gelişme göstermişlerdir. Maksimum α-amilaz üretimi P/2 için, maltoz ve tripton, P/4 için nişasta ve tripton, 70/2 için sakkaroz ve tripton ve CRK için fruktoz ve pepton içeren besiyerlerinde meydana gelmiştir. α-amilaz aktivitesi, Mn +2 ve Ca +2 artırmış, Mg +2, Zn +2,Fe +2, Cu +2, Hg +2 ve EDTA ise azaltmıştır. Bakterilerde, ekstraselüler ya da intraselüler α-glikozidaz enzim aktivitesi belirlenememiştir. 2007, 57 Sayfa Anahtar Kelimeler : Ekstrem termofil, anaerob, termostabil, α-amilaz, α-glikozidaz, ekstraselüler, intraselüler, amilolitik aktivite i

3 ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF THE SPECIFICATIONS OF THE AMYLASES OF SOME EXTREMELY THERMOPHILIC BACTERIA Gülay FUKARA Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ In this study, some extremely thermophilic anaerobic bacteria isolated from various water and soil samples, were examined for amylolytic activity. Of the 19 strains tested, four bacteria called P/2, P/4, 70/2 and CRK were selected for determination of thermostable extracellular α-amylase and extracellular and intracellular α-glucosidase production capabilities and properties of these enzymes. P/2, P4, 70/2 and CRK finished the logarithmic growth at 55th, 48th, 31th and 31th hours of incubation, respectively. During the growth, maximum α-amylase activity was established as U/ml at 55th hour for P/2, at 31th hour for P/4, U/ml at 78th hour and U/ml at 55th hour for CRK. Temperature and ph optima were determined as 90 o C and 7.0 ph for P/2 s α-amylase, 70 o C and 7.0 ph for P/4 s α-amylase and 70 o C and 6.0 ph for 70/2 and CRK s α-amylases. After 1 hour incubation at 70 o C and 6.0 ph α-amylases of P/2, P4, 70/2 and CRK lost 32%, 30%, 25% and 20% of their activities, repectively. Bacteria exhibited maximum growth in mediums that include starch as a carbon source and tyrptone as a nitrogen source. Maximum α-amylase production was occured in a medium containing maltose and tryptone for P/2, starch and tyrptone for P/4, sucrose and tyrptone for 70/2 and fructose and peptone for CRK. Mn +2 and Ca +2 increased, Mg +2, Zn +2,Fe +2, Cu +2, Hg +2 and EDTA decreased the α-amylase activity. Extracellular or intracellular α-glucosidase enzyme activity could not be determined in these bacteria. 2007, 57 pages Key Words : Extremely thermophilic, anaerobic, thermostable, α-amylase, α-glucosidase, extracellular, intracellular, amylolytic activity ii

4 TEŞEKKÜR Bana araştırma olanağı sağlayan ve çalışmamın her aşamasında yakın ilgi ve önerilerini ile beni yönlendiren danışmanım Sayın Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ (Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü) e, desteklerini gördüğüm Arş. Gör. Safiye KARAAĞAÇ (Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü) ve sevgili aileme teşekkürlerimi sunarım. Gülay Fukara Ankara, Nisan 2007 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii ŞEKİLLER DİZİNİ...v ÇİZELGELER DİZİNİ...vi 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Ekstrem Termofil ( Ekstremofil) Mikroorganizmaların Genel Özellikleri Termofil Mikroorgazimalar Termofillerin yüksek sıcaklık direnci Termostabil Enzimler Amilazlar Amilazların Sınıflandırılması Termostabil Amilaz Kaynakları MATERYAL ve YÖNTEM Deneyde Kullanılan Mikroorganizmalar Besiyeri ve Çözeltiler Besiyeri Analizlerde kullanılan çözeltiler Mikroorganizmaların Geliştirilmesi ve Muhafazası Mikroorganizma Gelişmesinin İzlenmesi Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi α-amilaz aktivitesi α-glikozidaz aktivitesi Sıcaklık Optimumunun Belirlenmesi Termal Stabilitenin Belirlenmesi Enzimlerin ph Optimumunun Belirlenmesi Karbon Kaynaklarının Bakteri Gelişimi ve Enzim Aktivitesine Etkisinin Belirlenmesi...23 iv

6 3.10 Azot Kaynaklarının Bakteri Gelişimi ve Enzim Aktivitesine Etkisinin Belirlenmesi Bazı Metallerin Enzim Aktivitesine Etkisini Belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI Mikroorganizmaların Gelişimlerinin İzlenmesi Mikroorganizmaların Enzim Aktiviteleri Enzimlerin Sıcaklık Optimumları Enzimlerin Termal Stabiliteleri Enzimlerin ph Optimumları Farklı Karbon Kaynaklarının Bakteri Gelişmesi ve Enzim Üretimine Etkisi Azot Kaynaklarının Bakteri Gelişmesi ve Enzim Üretimine Etkileri Bazı Metallerin Enzim Aktivitesine Etkileri SONUÇ VE TARTIŞMA...36 KAYNAKLAR...49 ÖZGEÇMİŞ...57 v

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Amilolitik enzimlerin nişastayı hidroliz şekilleri ve oluşturdukları ürünler...13 Şekil 4.1 a. P/2, b. P/4, c. 70/2 ve d. CRK izolatlarının 65 o C de inkübasyon sırasındaki optik yoğunluk (OD) ve ph değişimi...25 Şekil 4.2 (a) P/2, (b) P/4, (c) 70/2 ve (d) CRK izolatlarının 65 o C de inkübasyon sırasındaki α-amilaz aktiviteleri...27 Şekil 4.3 (a) P/2, (b) P/4, (c) 70/2 ve (d) CRK izolatlarının α-amilazlarının farklı sıcaklıklardaki oransal aktiviteleri...28 Şekil 4.4 (a) P/2, (b) P/4, (c).70/2 ve (d) CRK izolatlarının α-amilazlarının 70 o C ve ph 6.0 daki termal stabiliteleri...29 Şekil 4.5 (a) P/2, (b) P/4, (c) 70/2 ve (d) CRK izolatlarının α-amilazlarının farklı ph değerlerindeki oransal aktiviteleri...30 vi

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Mikrobiyal enzimlerin yıllık kullanım değerleri...2 Çizelge 2.1 Ekstremofiller ve bulundukları ekstrem çevre koşulları...4 Çizelge 2.2 Bazı ekstremozimler ve uygulama alanları...5 Çizelge 2.3 Türkiye de ithalat yoluyla sağlanan toplam enzim miktarları ve ödenen para değerleri...10 Çizelge 2.4 Bazı amilazların Ca iyonu gereksinimleri...11 Çizelge 2.5 Termostabil amilaz üreten bazı mikroorganizmaların doğadaki kaynakları...14 Çizelge 2.6 Nişasta hidroliz eden enzimlerin kaynak mikroorganizmaları ve özellikleri...16 Çizelge 4.1 P/2 ve P/4 izolatlarının farklı karbon kaynağı içeren besiyerindeki gelişimleri ve α-amilaz aktiviteleri...31 Çizelge /2 ve CRK izolatlarının farklı karbon kaynağı içeren besiyerindeki gelişimleri ve α-amilaz aktiviteleri...31 Çizelge 4.3 P/2 ve P/4 izolatlarının farklı azot kaynağı içeren besiyerindeki gelişimleri ve α-amilaz aktiviteleri...33 Çizelge /2 ve CRK izolatlarının farklı azot kaynağı içeren besiyerindeki gelişimleri ve α-amilaz aktiviteleri...33 Çizelge 4.5 Metallerin P/2, /4, 70/2 ve CRK α-amilazlarının aktivitesine etkileri...35 vii

9 1. GİRİŞ Endüstride kullanılan enzimler, genellikle mikroorganizmalardan elde edilmekte, çok az bir kısmı ise bitkisel ve hayvansal kaynaklardan sağlanmaktadır. Mikroorganizmaların enzim kaynağı olarak kullanılmasının nedeni, aktivitelerinin yüksek olması, daha az yan ürün oluşturmaları, daha stabil ve ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta üretilebilmeleridir (Kıran ve Çömlekçioğlu 2003). Mikrobiyal enzimlerin biyoteknolojik süreçlerle daha ekonomik olarak üretilmesi, ayrıca suda çözünmeyen matrikslere bağlanarak immobilize edilerek daha uzun süre kullanılabilmesi, endüstriyel enzim kullanımındaki artışın temel nedenleri arasındadır. Enzimler, canlı hücrelerdeki tüm metabolik olayları yöneten spesifik katalizörlerdir. Organik kimyanın alışılmış yöntemleri ile gerçekleştirilmesi zor olan pek çok reaksiyonun, uygun enzimin varlığında, büyük bir özgünlükle (spesifiklik) ve kolayca başarılabilmesi, çeşitli enzimlerin canlı hücrelerden izolasyonu ve canlı dışında çeşitli amaçlar için kullanılabilmesi konusundaki araştırmaların güncelliğini sağlamaktadır. Enzimatik proseslerin geleneksel proseslere göre daha az atık oluşturması, daha az çevre kirliliğine yol açması, daha ılımlı koşullarda ve ekonomik olarak gerçekleştirilebilmesi, enzim kullanımını giderek artırmaktadır (Gümüşel 2002). Mikrobiyal enzimlerin yıllık kullanım değerlerinin verildiği çizelge1.1 de dünyada kullanılan tüm enzimler içerisinde alkali proteazların %25, diğer proteazların %21, amilazların %18, bir protez olan rennini %10, tripsin in %3, lipaz ın %3, diğer karbonhidrat parçalayan enzimlerin %10 oranında kullanıldığı görülmektedir yılında yapılan bir değerlendirmede, dünyadaki enzim satışının 450 milyon doları bulduğu belirtilmiştir, günümüzde ise bu değerin 2-3 katı olduğu bilinmektedir ( Kıran ve Çömlekçioğlu 2003). 1

10 Çizelge 1.1 Mikrobiyal enzimlerin yıllık kullanım değerleri (Kıran ve Çömlekçioğlu 2003) Enzim Proteaz 25 Diğer Proteazlar 21 Amilaz 18 Rennin 10 Tripsin 3 Lipaz 3 Yıllık Kulanım Oranı(%) Endüstriyel önemli birçok kimyasal proses, yüksek sıcaklık ve basınç gibi sert koşullarda gerçekleştiğinden, bunlara alternatif yöntemler için bu ekstrem koşullara dayanıklı enzimlere gerek duyulmaktadır. Günümüzde endüstriyel enzimlerin büyük çoğunluğu mezofilik mikroorganizmalardan sağlanmakta ve bir çok avantaja sahip olmalarına karşın, proseslerdeki ekstrem ph, sıcaklık ve iyon konsantresi v.b. uygulamalarına dayanıksız olmaları nedeni ile kullanımları sınırlı kalmaktadır. Öte yandan, ekstrem termofil (ekstremofil) mikroorganizmalardan elde edilen enzimler (ekstremozimler) ekstrem koşullara daha dayanıklıdırlar. Bu nedenle son 20 yılda ekstremofil ve ekstremozimlere olan ilgi artmış ve ektremozimler endüstriyel biyoteknolojik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Yaklaşık olarak son 40 yıldır, sert endüstriyel proseslere daha uygun olmaları nedeni ile ekstremozimler endüstriyel ve biyolojik uygulamalarda ilgi çekmektedirler. Bu enzimler ayrıca, protein mühendisliğinde termostabilitenin ve termoaktivitenin anlaşılabilmesi için yapılan çalışmalarda model olarak da kullanılmaktadır (Kumar and Nussinov 2001, Sterner and Lieble 2001). Bugüne kadar, ekstremofil ve hipertermofil mikroorganizmalardan polisakkarit parçalayan bir çok enzim (selülaz, amilaz, pullulanaz, lipaz, esteraz,fitaz v.d.) karakterize edilmiş ve endüstriyel prosesler için yeni olanaklar sağlanmıştır (Haki and Rakshit 2003). 2

11 Termofilik organizmalardan elde edilen termostabil enzimlerin, çok yüksek termostabiliteleri nedeni ile bir çok ticari uygulaması bulunmaktadır. Örneğin, termostabil enzimlerin bir çoğu deterjan, gıda, yem, nişasta, tekstil, deri, kağıt ve ilaç v.b. endüstrilerde kullanılmaktadırlar. Günümüzde endüstriyel üretimlerde en çok kullanılan termostabil enzimler, nişasta endüstrisinde kullanılan amilazlar dır ve bunlar endüstriyel enzimlerin %25 ini oluşturmaktadır (Poonam and Dalel 1995, Crab and Mitchinson 1997, Rao et al. 1998, Sarıkaya et al. 2000). Nişasta endüstrisi, nişastanın glikoz ve diğer ürünlere parçalanması ve modifikasyonu için termostabil amilolitik enzimlerin (amilaz, glikoamilaz, izoamilaz ve pullulanaz) en yoğun kullanıldığı alandır. Nişasta endüstrisinde ekonomik proseslerin sağlanabilmesi için kullanılan amilazların, nişastanın jelatinizasyonu ( o C) ve sıvılaştırma (80-90 o C) sıcaklıklarına dayanıklı olmaları gerekmekte, bu nedenle termofilik ve termostabil amilazlara gerek duyulmaktadır (Shindhu et al. 1997). Amilazlar ayrıca tekstil, gıda, içki, kağıt ve bira v.d. endüstrilerde yaygın olarak kullanıldığı gibi klinik, medikal ve analitik kimya alanlarında da kullanılmaktadırlar (Pandey et al. 2000). Ekstremofillerden ekstremozimlerin üretimleri ile ilgili pekçok problem bulunmakta ve bunların çoğu ekstrem termofil genlerinin mezofilik hücrelere aktarılması ile aşılabilmektedir. Bu yolla bazı ekstremofillerde düşük düzeylerde bulunan bazı enzimlerin mezofilik mikroorganizmalarda daha yüksek oranlarda üretilmeleri sağlanmaktadır. Yeni ekstremofil mikroorganizmaların keşfi ve genetik mühendisliği yöntemleri ile biyokataliz ve biyotransformasyon reaksiyonlarında yeni fırsatlar sağlanacağı belirtilmektedir (Gomes and Steiner 2004). Bu çalışmada çeşitli kaynaklardan izole edilen Thermoanaerobacter cinsine ait bazı bakterilerin endüstriyel açıdan önemli olan termostabil amilaz enzimlerinin ve bu enzimlerin biyoteknolojik üretim potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır.bu yolla özellikle gıda endüstrisinde enzim kullanımı ile proseslerde kolaylık sağlanacı gibi üretim maliyetleri de ucuzlayacaktır. 3

12 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Ekstrem Termofil Mikroorganizmaların ( Ekstremofiller) Genel Özellikleri Gelişmeleri için ekstrem çevre koşullarına gerek duyan mikroorganizmalara ekstremofiller ve bu mikroorganizmaların ürettiği enzimler ekstremozim ler olarak adlandırılmaktadır.ekstremofiller, diğer bir çok mikroorganizmanın yaşayamayacağı ortamlarda gelişebilen mikroorganizmalardır.ekstrem çevre koşulları; çok yüksek ( o C) ya da çok düşük (-2-20 o C) sıcaklık, yüksek tuzluluk (2-5 M NaCl) ve çok yüksek alkali (ph > 8) ya da çok yüksek asitli( ph < 4) koşullardır. Çeşitli ekstremofiller, yüksek basınç, yüksek radyasyon ya da toksik bileşik içeren ortamlarda, yeryüzünden çok derinde bulunan kayalarda ya da su seviyesi ve besin miktarı çok düşük olan kuru ortamlarda yaşamlarını sürdürebilen mikroorganizmalardır. Ekstrem termofilik mikroorganizmalar genellikle Arke lere dahil bakterilerdir (Madigan and Marrs 1997, Rothschild and Manicinelli 2001). Ekstremofillerin optimum gelişme sıcaklıkları ve bulunabildikleri çevreler çizelge 2.1 de gösterilmektedir. Çizelge 2.1 Ekstremofiller ve bulundukları ekstrem çevre koşulları (Woese et al. 1990) Fenotip Ortam Mikroorganizma Termofilik o C Methanobacterium, Thermoplasma, Thermus ve bazı Bacillus türleri Hipertermofilik o C Aquifex, Archaeoglobus, Hydrogenobacter, Methanothermus, Pyrococcus, Pyrodictium, Pyrolobus, Sulfolobus, Thermococcus, Thermoproteus, Thermotoga Psikrofilik o C Alteromonas, Psychrobacter Halofilik 2-5 M NaCl Haloarcula, Halobacterium, Haloferax, Halorurum Asidofilik ph < 4 Acidianus, desulfurolobus, Sulfolobus, Thiobacillus Alkafilik ph> 9 Natronobacterium, Natronococcus ve bazı Bacillus türleri Son yıllarda ekstremofillere duyulan ilginin başlıca nedeni bunların ekstrem koşullarda gelişmeleri ve biyoteknolojik uygulamalarda kullanılan enzimleri üretebilmeleridir (Wiegel 1998). Ekstremofillerin ekstrem koşullarda yaşamlarını sürdürebilmelerinden sorumlu olan enzimleri ve yapısal proteinleri üzerinde geniş kapsamlı araştırmalar yapılmaktadır. Ekstremozimler, ekstrem ph, sıcaklık, iyonik kuvvet gibi uygulamalara 4

13 dayanıklılık gösteren enzimlerdir. Yapılan son araştırmalar, endüstriyel uygulamalar için kullanılabilecek ekstremozimler üzerine yoğunlaşmıştır.bu enzimler; esterazlar, lipazlar, amilazlar, aldolazlar, nitrilazlar, amidazlar, fosfatazlar ve rasemazlardır. Çizelge 2.2 de endüstriyel uygulamalarda kullanılan ekstremozimler gösterilmektedir. Çizelge 2.2 Bazı ekstremozimler ve uygulama alanları (Demirjian et al. 2001). Ekstremofil Enzim Endüstriyel uygulamalar Termofil ( o C) Psikrofil (-2-20 o C) Amilazlar Ksilanazlar Proteazlar DNA polimerazlar Proteazlar Dehidrogenzlar Amilazlar Tatlandırıcılar için glikoz ve fruktoz Kağıt beyazlatma Fırıncılık, bira, deterjan Genetik mühendisliği Peynir olgunlaştırılması, süt üretimi Biyosensörler Deterjanlarda polimer degradasyonu Asidofil (ph< 3) Sülfür oksidasyonu Kömür desülfürizasyonu Alkafil (ph> 8) Selülazlar Deterjanlarda polimer degradasyonu Halofil (2 5 M NaCl) - Poli (α-glutamik asit )(PGA) üretimi Poli (β-hidroksi butirik asit)(phb) üretimi Barofil (Yüksek basınç) Tüm mikroorganizma Jellerin ve nişasta granüllerinin oluşturulması Metalofil (Yüksek metal Tüm mikroorganizma Maden cevheri elde edilmesi, konsantrasyonu) biomineralizasyon Psikrofilik enzimler, düşük sıcaklıklarda etkinliklerini sürdürebilmektedirler ve çeşitli endüstriyel uygulamalarda kullanılmaktadırlar.yüksek tuz konsantrasyonlarına dayanıklı halofilik enzimler düşük su içeriğine sahip ortamlardaki biyokataliz reaksiyonlarında model olarak kullanılmaktadırlar. Termofilik enzimler proteazlara, deterjanlara ve organik çözücülerin etkilerine karşı dayanıklıdırlar (Sellek and Chaudhuri 1999). 2.2 Termofil Mikroorgazimalar Son yıllarda yapılan bir çok çalışmada, ekstremofil mikroorganizmalar içinde en çok termofilik bakteriler dikkat çekmektedir ve bunların biyokatalitik potansiyelleri ve enzimleri üzerinde birçok araştırma yapılmıştır (Gomes and Steiner 2004). Termofilik mikroorganizmaların mezofilik mikroorganizmalara göre, yüksek üreme hızları, son ürünün kolay kazanılması, yüksek proses stabilitesi ve verimi, nişasta selüloz gibi doğal polimerleri doğrudan fermente edebilmeleri gibi önemli avantajları vardır 5

14 Yüksek sıcaklıklarda ( o C) gelişebilen termofilik mikroorganizmalar, volkanik ve jeotermal kaynaklar örneğin, solfatarik alanlar, nötral sıcak su kaynakları ve deniz dibi sıcak su kaynakları v.b. yüksek sıcaklığa sahip deniz ve karasal ortamlarında doğal olarak bulunurlar o C arasındaki sıcaklıklarda optimum olarak çoğalabilen bu mikroorganizmalar ılımlı termofillerdir, bu mikroorganizmaların bir çoğu; fungi, protozoa, alg, streptomycetes ve cyanobacter gibi çeşitli prokaryotik ve ökaryotik taksonomik gruplara dahildirler o C arasındaki sıcaklıklarda gelişebilen ekstrem termofiller genellikle Bacillus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Thermus, Fervidobacterium, Thermotoga ve Aquifex cinslerine aittirler o C arasındaki sıcaklıklarda gelişebilen hipertermofiller; Aquifex ve Thermotoga cinsi bakteriler ile arke bakterilerden; Desulfurococcus, Sulfolobus, Pyrodictium, Pyrobaculum, Thermoproteus, Methanopyrus, Pyrococcus, Thermococcus, Methanococcus ve Archaeoglobus u içermektedir. Bazı termofil aerobik ve anaerobik sporlu bakteriler, 1940 lardan önce sıcak karasal ortamlarından izole edilmişlerdir (Brock 1986). Yaklaşık 20 yıl önce, termal kaynaklardan spor oluşturmayan aerobik bakteriler elde edilmiştir ve ilk termofil organizma olan ve 80 o C de optimum gelişme gösteren Sulfolobus acidocaldarius (arke bakteri) izole edilmiştir (Brock et al. 1972). İlk olarak tanımlanan, spor oluşturmayan termofil anaerob bakteri Methanobacterium thermoautotrophicum dur (Zeikus and Wolfe 1972). Hyperthermus butylicus ve Fervidobacterium islandicum gibi bazı mikroorganizmalar max. gelişme gösterdikleri sıcaklıklardan daha yüksek sıcaklıklardaki kaynaklardan elde edilebilirken, Archaeoglobus profundus gibi bazı mikroorganizmalar da gelişme sıcaklıklarından daha düşük sıcaklıklardaki kaynaklardan izole edilmişlerdir (Burggraf et al. 1990, Zillig et al. 1990). Anaerobik termofiller, aerobik termofillere göre daha çok çeşitlilik göstermektedir ve ekstrem yüksek sıcaklıklarda geliştirilmeleri daha kolaydır. Zorunlu anaerobik mikroorganizmalar yüksek tuz konsantrasyonu ve düşük ph da adaptasyon göstermektedirler (Lowe et al. 1993). Anaerobik termofil bakterilerin çoğunun kemoorganotrof olduğu, genel olarak, anaerobik bakterilerin çevresel strese adaptasyonlarının aerobik bakterilerden farklı faktörlerin etkisi ile olduğu anlaşılmıştır. 6

15 Bunlardan birincisi; anaerobik bakterilerin kemoorganotrofik gelişme boyunca enerjilerinin kısıtlı olması, ikincisi ise bir çok kemoorganotrof anaerobik bakterinin (methanojenler hariç) gelişmesi sonucu toksik ürünler (organik asit, alkol, H 2 S gibi) meydana getirmesi ve bu ürünlere tolerans gösterebilmeleri için çeşitli adaptasyon mekanizmaları geliştirmek zorunda olmalarıdır.. Termofillerin en ilgi çeken grubu hipertermofillerdir çünkü, bu organizmaların izolasyonu, mikroorganizmalar için uygun habitatların yeniden değer kazanmasına ve yaşamın bilinen sıcaklık limitlerinin yükselmesine neden olmuştur. Hipertermofiller metabolizmaları açısından oldukça çeşitlidirler; metanogenler, sülfat indirgeyenler, nitrat indirgeyenler ve hatta aerobik solunum yapanlar olmak üzere gruplara ayrılırlar. Günümüzde bilinen hipertermofillerin büyük çoğunluğu anaerob heteretrofik sülfat indirgeyen türlerdir. Arkeler içinde üç grup dikkat çekmektedir, bunlar karasal solfatarik alanlarda bulunan asidofil ekstremofiller; kok şeklinde, zorunlu ve fakültatif aerobiktirler ve asidik ph ya (optimum ph 3.0) ihtiyaç duyarlar. Filogenetik olarak, Sulfolobus, Metallosphaera, Acidianus ve Desulfurolobus cinslerine aittirler. Öte yandan, ılımlı asidofil ve nötrofil termofiller solfatarik alanlar ve deniz hidrotermal kaynaklarında bulunurlar ve hepsinin de zorunlu anaerob olduğu bilinmektedir.. Bu tür ekstrem bölgelerde bulunan Thermoproteus, Pyrobaculum, Thermophilum, Desulfurococcus ve Methanothermus cinslerine ait bakteriler izole edilmiştir (Kengen et al. 1996, Stetter 1996) Termofillerin yüksek sıcaklık direnci Mikroorganizmalar, diğer tüm canlılar gibi yaşamak zorunda oldukları ortama uyum sağlar ve yaşamlarını sürdürürler. Termofil mikroorganizmaların diğer canlılar gibi aynı enzimleri içerirdikleri ancak bunların enzimlerinin daha termostabil, proteoliz ve denatürasyona dayanıklı olduğu anlaşılmıştır (Kumar and Nussinova 2001). Termofillerin hücre membranlarındaki doymuş yağ asitlerinini oranının fazla olduğu, yağ asitlerinin hücre için hidrofobik bir ortam oluşturduğu ve yüksek sıcaklıklarda yaşayabilmek için hücreyi daha dayanıklı hale getirdikleri anlaşılmıştır (Herbert and Sharp 1992). Bir çok hipertermofilik bakteri içeren arkelerin hücre duvarlarında eter 7

16 bağı ile bağlanmış yağ asitleri bulunmakta, bu yapı doymuş yağ asitleri içeren membranlara göre daha yüksek sıcaklıklarda bile bozulmadan kalabilmektedir (De Rosa et al. 1994). Termofillerin DNA larının pozitif süper sarmallar oluşturan ters DNAgiraz içerdiği ve bu yapının, DNA nın erime noktasını yükselttiği ve böylece mikroorganizmayı daha yüksek sıcaklıklara dayanıklı hale getirdiği saptanmıştır. Termofillerin ayrıca, disülfit bağları ve hidrosfobik etkileşimler ile sıcaklığa dayanıklı hale gelebildiği belirlenmiştir (Lopez 1999, Kumar and Nussinov 2001). 2.3 Termostabil Enzimler Termostabil enzimler, ekstremozimler içindeki en önemli enzimlerdir, bunlar protein stabilitesinin anlaşılması için model olarak kullanılmalarının yanında çok önemli biyoteknolojik potansiyellere de sahiptirler. Ekstremozim lerin bu kadar önemli olmalarının diğer nedeni ise yüksek sıcaklıklardaki biyoteknolojik proseslerin avantajlarıdır. Örneğin, organik solvent içerisinde kimyasal reaksiyonların hızlarındaki artış, yüksek sıcaklıklarda ortam viskozitesindeki azalma ve difüzyon katsayısındaki artıştan kaynaklanmaktadır (Becker et al. 1997, Krahe et al ). Çözünürlüğü düşük olan hidrofobik bileşiklerin katıldığı çeşitli proseslerde, sıcaklığın yükseltilerek çözünürlüğün artırılması ile reaksiyon hızının artması sağlanmakta ayrıca yüksek sıcaklık, biyolojik hidroliz reaksiyonlarının hızlarını artırmakta ve kontaminasyon riskini de azaltmaktadır. Termofilik enzimlerin, etki mekanizmalarının mezofilik olanlarla benzer oldukları belirtilmiştir (Adams 1993, Cowan 1992, Danson and Hough 1998). Bazı termostabil enzimlerin mezofilik konak hücrede ekspresyonu ile termostabilitelerinin bozulmadığı (Niehaus et al. 1999), bu nedenle termofilik enzimlerin yüksek sıcaklıklara adaptasyon için geliştirdikleri moleküler stratejilerin genetik bir özellik olduğu belirtilmiştir (Jaenicke and Bohm 1998). Termofilik mikroorganizmalardan elde edilebilen termostabil enzimlerin, mikroorganizmaların gelişme sıcaklıklarından daha yüksek sıcaklıklarda bile stabil oldukları ve termofil enzim proteinlerinin daha sağlam oldukları belirlenmiştir (Saboto 8

17 et al. 1999). Fitter ve arkadaşları (2001) mezofilik ve termofilik amilazların yapısal farklılıklarının aktiviteye etkisi üzerine yaptıkları çalışmada, termofilik proteinin mezofilik proteine göre daha yüksek yapısal esneklik gösterdiğini belirlemişler ve termofilik enzimin yüksek termostabiliteden sorumlu olduğunu kabul etmişlerdir. 2.4 Amilazlar Amilazlar bilinen en önemli ve eski endüstriyel enzimlerdir. Nişasta molekülünü hidroliz ederek dekstrin ve glikoz birimlerinden meydana gelen bir karışım oluştururlar. Bu enzimler günümüzde büyük bir öneme sahiptirler ve gıda, fermentasyon, tekstil ve kağıt v.b endüstrilerinde kullanılmaktadırlar. Endüstriyel alanda kullanılan amilazlar bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan elde edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, büyük miktarda ve yüksek saflıkta elde edilebilmeleridir. Amilazların, toplam enzim pazarının %30 unu oluşturduğu belirtilmiştir (Van Der Maarel et al. 2002). Nişastanın enzimatik dönüşümü; çirişlenme (jelatinizasyon), sıvılaşma (liquefaction) ve şekerlenme (sakkarifikasyon) olmak üzere üç aşamada meydana gelir. Jelatinizasyon; nişasta granüllerinin çözünmesi ve viskoz bir süspansiyon oluşturması, sıvılaşma; nişastanın kısmi hidroliz ile viskozitenin azalması olayıdır. Şekerlenme ise nişastadan glikoz ve fruktoz oluşmasıdır. Jelatinizasyon, nişastanın su ile ısıtılması ile oluşur ve nişasta, sadece yüksek sıcaklıkta suda çözünebilir (Rakshit 1998). Amilaz uygulamalarında, nişastanın hidrolizinin jelatinizasyondan sonra hızla olabilmesi için kullanılan enzimin termostabil özellikte olması gerekmektedir. Amilazların tarihi 1811 yılında Kirchhoff tarafından nişasta parçalayıcı enzimlerin bulunması ile başlamaktadır. Bunu takiben sindirim amilazları ve malt amilazları ile ilgili çalışmalar yapılmış, 1930 yılında Ohlsson maltta nişasta parçalayan enzimleri, reaksiyonda ürettikleri şeker tipine göre α ve β- amilazlar olmak üzere ikiye ayırmıştır (Ohlsson 1930). 9

18 Amilazlar, endoamilazlar ve ekzoamilazlar olmak üzere iki gruba ayrılabilirler, endoamilazlar nişasta molekülünün iç kısmını rastgele noktalardan parçalar ve değişik zincir uzunluğunda düz ve dallanmış oligosakkaritleri oluştururlar. Ekzoamilazlar, ise,nişasta molekülünü indirgen olmayan ucundan parçalarlar. Günümüzde nişastayı değişik ürünlere parçalayan birçok enzim bilinmektedir ( Gupta et al. 2003). Amilazlar, asidik ve bazik koşullarda etki etmelerine göre asidik ve bazik karakterli olabilmekte, bunlardan bazik ph da aktivite gösterenler deterjan endüstrisinde önem kazanmaktadırlar. Bazı basillerin ph 10 veya daha yukarısında aktivite gösteren α- amilazları olduğu belirtilmiştir (Gupta et al. 2003). Endüstriyel proseslerde örneğin, dekstroz üretiminde ph 4-5 aralığında etkili olabilen asidik amilazlar kullanılmaktadır. Farklı kaynaklardan izole edilen bakteri endoamilazlarının optimum o C de ve ph aralığında aktivite gösterdikleri saptanmıştır (Buonocore et al. 1976). Amilaz üretimi ile ilgili teknik bilgiler, geniş boyutlarda araştırılmış ise de üretim teknolojisi çoğunlukla patent altına alındığından yeterince açıklanmamıştır. Ülkemizde giderek gelişen gıda sanayii, amilaz enzimi gereksinimini giderek artırmıştır (Üstünes ve Güvenç 1985). Türkiye de ithalat yoluyla sağlanan çeşitli enzimlerin toplam miktarları ve dolar değerleri çizelge 2.3 de gösterilmektedir. Amilaz enzimleri de bu enzimler içinde yer almakla beraber, bu enzimlerle ilgili yeterli bilgi edinilememiştir (Dış Ticaret Müsteşarlığı). Çizelge 2.3 Türkiye de ithalat yoluyla sağlanan toplam enzim miktarları ve ödenen para değerleri (Dış Ticaret Müsteşarlığı) Yıl Miktar (kg) Dolar değeri $ $ 2006 (ocak-mart) $ Hacmi giderek artan enzim tüketimine karşın ülkemizde enzim üretimi yapan sadece bir kuruluş vardır (Orba A.Ş.). Kuruluş orta ölçekli bir işletme olup tümüyle araştırma ve geliştirme çalışmaları sonucu tasarımlanmış ve faaliyete geçirilmiştir. Gıda ve tekstil sektörü için amilaz enzimini ürettiği bildirilmektedir ( 10

19 Dünyada amilaz ve diğer mikrobiyal enzimlerin üretimini yapan yüzlerce kuruluş bulunmakla beraber, her ülke kendi gereksinimlerinin en az belirli bir bölümünü üretmeye çalışmakta ve bu hemen hemen her zaman ithal edilene göre daha ekonomik olmaktadır (Üstünes ve Güvenç 1985). Nişasta endüstrisindeki problemlerden biri α-amilaz enzimlerinin Ca iyonu gereksinimleridir ve bu koşullarda da kalsiyum okzalat oluşmasıdır. Kalsiyum okzalat, reaksiyon borularını ve ısı değiştiricilerini tıkayabilmekte ve bunun yanında bira gibi bazı ürünlerde bulunması istenmemektedir. Kalsiyum okzalatın oluşumunun, enzimlerin Ca iyonu gereksinimlerinin azaltılması ve üretim prosesinin düşük ph da yapılması ile önlenebileceğii belirlenmiştir. Ca iyonundan bağımsız ve asit stabil α-amilazların üretimi günümüzde protein mühendisliği ile başarılmış ve mutasyon ile yüksek Ca iyonu bağımsızlığı gösteren Termamil LC TM üretilmiştir. Endüstriyel olarak önemli olan bazı amilazların Ca iyonu gereksinimleri çizelge 2.4 de gösterilmektedir (Haki and Rakshit 2003). Çizelge 2.4 Bazı amilazların Ca iyonu gereksinimleri (Haki and Rakshit 2003) Enzim Mikroorganizma Uygulama sıcaklığı ( o C) Uygulama ph sı Minimum Ca miktrarı (ppm) Bakteriyel mezofilik Bacillus subtilis α-amilaz Bakteriyel termofilik Bacillus licheniformis α-amilaz Fungal α-amilaz Aspergillus oryzae Amiloglikozidaz Aspergillus niger Pullulanaz Bacillus acidopolluticus Amilazların Sınıflandırılması Amilazlar nişastayı parçalama mekanizmasına göre sınıflara ayrılırlar; α-amilazlar: α-amilazlar nişasta molekülündeki amiloz zincirinin α 1,4 bağlarına gelişi güzel etki ederek son ürün olarak 1/10 u glikoz ve 9/10 u maltoz olan bir karışımı oluşturur. α-amilazlar 1,6 glikozidik bağ ile karşılaştığında bu bağa etki etmeden geçer. Amilopektin hidrolizi sonucunda glikoz ve maltoza ek olarak bir dizi dallı sınır 11

20 dekstrinler oluşmaktadır. Dört veya daha fazla glikoz içerikli bu dekstrinler orijinal yapının 1,6 glikoz bağlarını içermektedirler. Belirli sayıda glikoz ünitesi kalınca dallanma noktasına amilazlar etki edemediğinden bu dekstrinlere sınır dekstrin (limit dekstrin) denilmektedir. Nişastanın enzimatik hidrolizi sonunda oluşan ürünler α-optik konformasyonu gösterdiğinden bu enzimlere α-amilazlar denilmektedir. Ayrıca bu enzimler nişastanın iç kısımlarındaki α-1,4 bağlarına etki yaptıkları için endoenzimlerdir. β-amilazlar: β-amilazlar, nişasta molekülünün indirgen olmayan ucunda ardarda gelen maltoz birimlerini uzaklaştıran enzimlerdir. Etkileri, α-1,6 bağlarına gelince durur. Böylece sınır dekstrinler meydana gelmektedir. Hidroliz sonucu açığa çıkan ürünler β- optik konformasyonu gösterdiğinden bu enzimlere de β-amilazlar adı verilmiştir.genel olarak β-amilazlar nişastanın dış kısmındaki 1,4 bağlarına etki ettikleri için ekzoenzimlerdir. Amiloglikozidazlar (Glikoamilazlar): Nişasta zincirinin ucundaki indirgen olmayan kısımdan, ardışık olarak glikoz birimlerini uzaklaştıran bir ekzoenzimdir. Amiloglikozidazların ürün olarak sadece glikoz oluşturması bu enzimleri, α ve β- amilazdan ayırmaktadır. Hem α-1,4 bağlarını etkiler hem de yavaş bir hızla da olsa α-1,6 bağlarını hidroliz eder. Pullulanazlar: Substrat molekülünün sadece α-1,6 bağları üzerinde spesifik aktivite gösterdikleri için sınır dekstranazlar olarak da adlandırılırlar. α- glukozidazlar: Amiloz ve amilopektinin parçalanma ürünleri olan kısa zincirli oligosakkaritlerdeki α-1,4 bağlarını hidroliz ederek serbest glikoz birimleri oluşturan enzimlerdir. 12

21 Şekil 2.1 Amilolitik enzimlerin nişastayı hidroliz şekilleri ve oluşturdukları ürünler (Bertoldo and Antranikan 2002) CGTazlar: Nişastayı, siklodekstrin adı verilen ve 6,7 veya 8 glikoz ünitesinden oluşan siklik D-glikozil birimleri oluşturan enzimlerdir. Bacillus macerans amilazları bunlara örnektir (Aiyer 2005). Şekil 2.1 de amilazların nişastayı hidroliz şekilleri ve oluşturdukları ürünler görülmektedir. 13

22 2.6 Termostabil Amilaz Kaynakları Termostabil amilazlar, termofilik ve mezofilik bakterilerden ve funguslardan elde edilebilirler ancak yüksek sıcaklıklardaki termostabiliteden termofil mikroorganizmalar sorumludur. Bazı termostabil amilaz üreten mikroorganizmaların yaşam alanları çizelge 2.5 de gösterilmektedir. Çizelge 2.5 Termostabil amilaz üreten bazı mikroorganizmaların doğadaki kaynakları (Haki and Rakshit 2003) Kaynak Mikroorganizma Enzim Sıcak su kaynağı Thermus sp. α-amilaz Sıcak su kaynağı Bacillus sp. WN.11 α-amilaz Derin deniz hidrotermal kaynağı Staphilothermus marinus α-amilaz Deniz solfatarik alanı Thermococcus litoralis Pullulanaz Kore tuzlu fermente ançüez Bacillus sp. KYJ963 β-amilaz Sıcak su kaynaklarının sedimentleri Bacillus sp α- amilaz Derin deniz hidrotermal kaynaklarında nişasta bulunmamasına karşın bu bölgelerdeki bazı mikroorganizmalardan nişasta parçalayan enzimlerin izolasyonu bu mikroorganizmaların glikojeni hidroliz ettiklerini göstermektedir. Glikojen, hayvan hücreleri ve bazı mikroorganizmalarda depo bileşiği olarak bulunur. Bazı arke bakterilerinde, glikojen hücrede depo materyali olarak işlev görür, nişasta parçalayan enzimlerin termofil bakterilerde fazla miktarda bulunması çok önemli role sahip olduklarını gösterir. Polisakkaritlerin enzimatik hidrolizi ve modifikasyonları biyoteknolojide çok ilgi görmektedir. Amilaz, pullulanaz ve glikoamilaz gibi termostabil nişasta hidroliz eden enzimler gıda, kimya ve ilaç endüstrisinde bir çok amaçla kullanılmaktadır. Birçok hipertermofilik mikroorganizmada bulunan amilazların miktarı biyoteknolojik uygulamalar için düşük düzeydedir ancak termofillerden mezofillere amilolitik enzim kodlayan genlerin aktarılması ile bu enzimlerin miktarının önemli ölçüde arttığı belirlenmiştir. Bir çok durumda mezofilik hücrelerde üretilen bu termostabil enzimler termostabilitelerini devam ettirirler ve düşük sıcaklığa rağmen termostabilitelerinde artış gözlenir. Bu enzimler konak hücrenin proteolizine karşı dirençlidirler ve ısıl denatürasyon ile konak hücrenin mezofilik enzimlerinden kolaylıkla ayrılabilirler. Enzimin saflık derecesi birçok endüstriyel uygulama için uygundur (Bertoldo and Antranikian 2002). 14

23 Nişasta endüstrisinin gereksinimlerini karşılamak amacıyla, değişik kaynaklardan amilolitik enzimlerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir çok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalardan elde edilen bazı amilolitik enzimler ve bazı özellikleri çizelge 2.6 da verilmiştir. Termostabil α- amilazlar çok önceleri Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ve Bacillus amyloliquefaciens den ve 60 o C ye kadar katalitik aktiviteye sahip olan β- amilazlar çeşitli Bacillus türlerinden izole edilmişlerdir. Bu enzimler saf maltoz şuruplarını elde etmek için pullulanazlarla birlikte gıda endüstrisinde çeşitli amaçlarla kullanılabilirler. Bacillus licheniformis, Myceliophthora thermophila, Pyrococcus wosei, Pyrococcus furiosus ve Thermococcus aggreganes α-amilazları termofilik α-amilazlardır ve optimum sıcaklıkları 100 o C dir, ayrıca mezofillerin aksine Pyrococcus enzimleri Ca iyonu varlığına da ihtiyaç duymamaktadırlar. Bir anaerobik bakteri olan Thermococcus profoundus 80 o C de aktivite gösteren termostabil α-amilaz üretmektiği ve bu amilazın maksimum termostabilite için Ca iyonlarına gerek duyan S amilaz ya da daha asidik koşullarda etkili olan L amilaz olduğu saptanmıştır. Bunlara ek olarak o C arasında aktivite gösteren bir amilaz enziminin Thermoproteales, Thermococcales ve Pyrodictiales ta bulunduğu belirtilmiştir (Eichler 2001). Termostabil bir β-amilaz enzimi için optimum sıcaklığın o C ve ph nın arasında olduğu, en termostabil β-amilazın C. thermosulphurogenes den elde edildiği ve 75 o C de stabil olduğu belirlenmiştir (Haki and Rakshit 2003). Termostabil pullulanaz enzimi için optimum sıcaklık aralığının o C ve optimum ph aralığının ise olduğu, Pyrococcus wosei, Pyrococcus furiosus, Thermococcus aggregans ve Thermococcus litoralis pullulanazları en termofil pullulanazlar olduğu saptanmıştır (Haki and Rakshit 2003). 15

24 Çizelge 2.6 Nişasta hidroliz eden enzimlerin kaynak mikroorganizmaları ve özellikleri (Eichler 2001, Bertoldo and Antranikian 2002, Haki and Rakshit 2003) Enzim α-amilaz β-amilaz Pullulanaz α-glikosidaz Glikoamilaz CGTaz Organizma Enzim Özellikleri Opt. Sıcaklık ( o C) Opt. PH Bacillus amyloliquefaciens Bacillus licheniformis Bacillus stearothermophilus Bacillus stearothermophilus 70 - Bacillus subtilis Pyrodictium abyssi Lactobacillus manihotivorans Myceliophthora thermophila Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Staphylothermus marinus Sulfolobus solfataricus - - Thermococcus aggreganes Thermococcus celer Thermococcus fumicolans Thermococcus hydrothermalis Thermomyces lanuginosus Thermococcus profoundus Aspergillus oryzae Bacillus circulans 60 - Bacillus cereus var. mycoides 50 - Bacillus sp. 50 7,5 Clostridium thermosulphurogenes Clostridium thermosulfurogenes Bacillus sp Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesi Thermococcus aggregans Thermus caldophilus GK Thermococcus celer Thermococcus hydrothermalis Thermococcus litoralis Thermotoga maritima MSB Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesi Sulfolobus solfataricus 98/ Thermococcus strain AN Sulfolobus solfataricus MT Thermoplasma acidophilum Picrophilus torridus Picrophilus oshimae Aspergillus niger Thermococcuc sp Anaerobranca gottschalkii

25 Pyrococcus wosei ve Pyrococcus furiosus α-glikosidazlarının en yüksek sıcaklık derecesine sahip olan α-glikozidazlar olduğu, enzimin optimum aktivite sıcaklığının o C olduğu ve ayrıca metal iyonlarının varlığına gereksinim duyduğu belirlenmiştir. İntraselüler bir α-glikosidazın Sulfolobus solfataricus 98/2 den elde edildiği, enzimin optimum sıcaklığının mikroorganizmanın gelişme sıcaklığından yaklaşık 20 o C fazla olan 105 o C olduğu bulunmuştur. Ayrıca Thermococcus AN1 dentermostabil ekstraselüler bir α-glikozidaz elde edilmiştir (Eichler 2001). Thermoplasma acidophilum, Picrophilus torridus ve Picrophilus oshimae nin termostabil ve asit stabil bir glikoamilaz ürettiği, bu termostabil glikoamilazın optimum aktivitesinin ph: 2.0 de ve 90 o C de olduğu anlaşılmıştır (Bertoldo and Antranikian 2002). Termostabil CGTaz ların bazı Thermoanaerobacter türlerinden, Thermoanaerobacterium thermosulfirigens ve Anaerobranca gottschalkii den üretildiği, A. gottschalkii CGTaz ının geniş bir ph aralığında (ph ) ve optimum 65 o C de aktif olduğu saptanmıştır. Nişastanın substrat olarak kullanıldığında bu enzimin, α-siklodekstrin ve uzun süre inkübasyondan sonra β ve γ- siklodektrin oluşturduğu, optimum 100 o C de aktivite gösteren bir CGTazın, yeni izole edilmiş bir arke olan Themococcus sp. den elde edildiği açıklanmıştır (Bertoldo and Antranikian 2002). 17

26 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Kullanılan Mikroorganizmalar Bu çalışmada, çeşitli toprak ve su örneklerinden izole edilerek, gliserin içinde 65 o C de saklanan ekstrem termofil anaerob bakteri izolatları kullanılmıştır. Optimum olarak 65 o C de gelişebilen 19 bakteri izolatı içerisinden amilaz aktivitesi en yüksek olan ve P/2, P/4, CRK ve 70/2 olarak kodlanan Thermoanaerobacter cinsine ait bakteriler kullanılmıştır. P/2 ve P/4 G(+), sporsuz ve basil; 70/2 ve CRK G(-), sporsuz ve basil şeklindeki ekstrem termofil anaerobik bakterilerdir. 3.2 Besiyeri ve Çözeltiler Besiyeri Bu çalışmada, mikroorganizma gelişimi ve enzim üretimi için Thermoanaerobacterium lar için uygun olan ve aşağıda bileşimi verilen besiyeri kullanılmıştır ( DSMZ-Medium 144). Bileşiminde litrede; NH 4 Cl, 0.9 g; NaCl, 0.9 g; MgCl 2.H 2 O, 0.4 g; KH 2 PO 4, 0.75 g; K 2 HPO 4, 1.5 g; FeSO 4.7H 2 O, 1.0 ml (3.0 mg/ml); resazurin, 1.0 ml (1mg/l); Na 2 S.9H 2 O, 1.0; maya özütü, 3.0 g; tripton, 10.0 g, karbon kaynağı olarak son konsantrasyonu %1 (ağ/h) olacak şekilde glikoz ve 1000 ml distile su içermektedir ancak bu çalışmada glikoz yerine nişasta ve tripton yerine bacto pepton kullanılmıştır Besiyerine soğuk sterilize edilmiş 5 ml/l vitamin çözeltisi ve 9 ml/l iz element çözeltisi eklenmiştir. Sterilizasyondan önce besiyeri ph sı 1.0 N NaOH ile e ayarlanmıştır. Vitamin çözeltisi (mg/l demineralize su); Biyotin, 2.0; folik asit, 2.0; piridoksin-hcl, 10.0; tiyamin-hcl.2h 2 O, 5.0; riboflavin, 5.0; nikotinik asit, 5.0; D-kalsiyum pantotenat, 5.0; vitamin B 12, 1.0, p-aminobenzoik asit, 5.0, lipoik asit, 5.0. İz element çözeltisi (g/l demineralize su); FeCl 2.7H 2 O, 1.0; nitrilotriasetik asit, 1.5; MgSO 4.7H 2 O, 3.0; MnSO 4.2H 2 O, 0.5; NaCl. 1.0; CoSO 4.7H 2 O, 0.18; CaCl 2.2H 2 O, 0.1; 18

27 ZnSO 4.7H 2 O, 0.18; CuSO 4.5H 2 O, 0.01; KAl (SO 4 ).12H 2 O, 0.02; H 3 BO 3, 0.01; Na 2 MO 4.2H 2 O, 0.01; NiCl 2.6H 2 O, 0.025; Na 2 SeO 3.5H 2 O, 0.3x10-3. Nitrilotriasetik asit belirli miktarda saf suda çözünmüş ve ph KOH la 6.5 e ayarlanmıştır. Daha sonra diğer mineraller de eklenerek, ph, KOH ile 7.0 a ayarlanmıştır (DSMZ-Medium 141). Besiyeri, bir redoks inkibatörü olan resazurinden ileri gelen mavi renk pembe renge dönüşünceye kadar kaynatılmış ve N 2 atmosferi altında soğutulduktan sonra Hungate tüplerine (Bellco Inc ) 7.0 ml dağıtılmış ve tüpler kapatıldıktan sonra 121 o C de 15 dakika sterilize edilmiştir Analizlerde kullanılan çözeltiler Sodyum fosfat tampon: 0.1 M, ph 6.0 sodyum fosfat tamponu α-amilaz aktivitesi tayininde; 0.1 M, ph 7.0 sodyum fosfat tamponu α-glikozidaz aktivitesi tayininde; 0.1 M ph 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 olan sodyum fosfat tamponları α-amilaz enziminin ph optimumunun belirlenmesi amacıyla kullanılmıştır. Sodyum fosfat tamponu; 0.1 M Na 2 HPO 4.2H 2 O çözeltisi (15.6 g Na 2 HPO 4.2H 2 O ml destile su ) ile 0.1 M NaH 2 PO 4.2H 2 O çözeltisinin (17.8 g NaH 2 PO 4.2H 2 O ml destile su) belirli oranlarda karıştırılması ile hazırlanmıştır. Glisin- NaOH tampon: Glisin-NaOH tamponu α-amilaz enziminin ph optimumunun belirlenmesi amacıyla kullanılmıştır. PH sı 9.0 ve 10.0 olan 0.2 M glisin-naoh tamponları, 0.2 M glisin ile 0.2 N NaOH çözeltilerinin belirli oranlarda karıştırılmasıyla hazırlanmıştır. Tris-HCl tampon: 25 mm, ph 7.5 Tris-HCl tampon, EDTA ve metal çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılmıştır g Tris-HCl ml saf suda çözüldükten sonra 1.0 N NaOH ile ph 7.5 e ayarlanmıştır. DNS (3,5-Dinitrosalisilik asit) çözeltisi: α-amilaz aktivitesi belirlenmesi sırasında indirgen şeker tayininde kullanılmıştır. 1.0 g DNS (Sigma D-1510) 50.0 ml saf suda çözüldükten sonra üzerine yavaş yavaş 30.0 mg sodyum potasyum tartarat (Merck) ilave 19

28 edilmiştir. Daha sonra 20.0 ml 2 N NaOH eklenerek son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlanmış ve hazırlanan çözelti en fazla 2 hafta süreyle kullanılmıştır (Worthington 1988). Na 2 CO 3 çözeltisi: α-glikozidaz aktivitesi tayininde kullanılmıştır. Çözelti; 21.2 g Na 2 CO 3 ün 1000 ml saf suda çözülmesi ile hazırlanmıştır. 3.3 Mikroorganizmaların Geliştirilmesi ve Muhafazası Bakterilerin izolasyonları, DSMZ-144 sıvı besiyerinde 65 o C de geliştirilen kültürlerin anaerobik ortamda petri kutularındaki DSMZ-144 besiyerine yayılması ve 65 o C de inkübasyon sonucu oluşan tek kolonilerin tekrar sıvı besiyerine inoküle edilmesi ile yapılmıştır. Sıvı besiyerinde geliştirilen kültürler her üç günde bir taze besiyerine aktarılarak çalışma süresince oda sıcaklığında muhafaza edilmişlerdir. 3.4 Mikroorganizma Gelişmesinin İzlenmesi Mikroorganizma gelişmesi, 600nm dalga boyu ışıkta absorbans (O.D) ölçümü ile izlenmiştir. Örnekler 15 ml lik Hungate tüplerindeki 7.0 ml besiyerinde 65 o C de 48 saat süreyle geliştirildikten sonra 50 ml besiyeri içeren 100 ml lik serum şişelerine % 10 (h/h) oranında inoküle edilmiş ve tekrar 65 o C de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sırasında belirli aralıklarla alınan örneklerin optik yoğunlukları spektrofotometrede (Shimadzu UV-1208) 600nm de ve tanık olarak taze besiyerine karşı ölçülmüştür. ph ölçümü ise ph metre (GP-353 ATC) ile yapılmış, optik yoğunluk ve ph değerleri, zamana karşı grafiklenerek gelişme eğrileri oluşturulmuştur. 3.5 Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi α-amilaz aktivitesi Geliştirilen bakterilerden belirli aralıklarla alınan 1.5 ml lik örneklerin rpm de 5 dakika süre ile santrifüjlenmesiyle (Heraus Biofuge B) elde edilen berrak sıvı, hücre dışı 20

29 enzim aktivitesi tayininde enzim çözeltisi olarak kullanılmıştır. Hücre dışı α-amilaz aktivitesinin tayin edildiği karışım 0.5 ml enzim çözeltisi ve 0.1 M, ph 6.0 sodyum fosfat tamponu içerisinde hazırlanmış 0.5 ml %0.1 lik çözünür nişasta (Merck F ) çözeltisi içermektedir. Substrat kontrolü, 0.5 ml enzim çözeltisi ile 0.5 ml sodyum fosfat tamponu; enzim kontrolü ise 0.5 ml sodyum potasyum tamponu ile 0.5 ml çözünür nişasta solüsyonu içermektedir. Reaksiyon, 70 o C de 30 dakika süreyle gerçekleştirilmiş ve süre sonunda tüpler buz banyosuna içerisine alınarak durdurulmuştur. 1 ml DNS eklendikten sonra tüpler 100 o C de 5 dakika tutulmuş, soğutulmuş ve gerekli seyreltme yapıldıktan sonra spektrofotometrede 540 nm de okuma yapılarak standart glikoz eğrisine göre glikoz oranı belirlenmiştir. Standart eğrinin hazırlanmasında, sodyum fosfat tamponu içinde hazırlanan ve konsantrasyonu %0-0.1 (ağ/h) aralığında glikoz çözeltileri ve tanık olarak sodyum fosfat tamponu kullanılmıştır Enzim aktivitesi 3 paralel olarak belirlenmiş ve elde edilen sonuçların ortalaması alınmıştır (Çoral ve Çolak 1998, Legin et al. 1998). Bir α-amilaz enzim ünitesi (1U); 1 dakikada 1 µmol indirgen şeker (glikoz) oluşturan enzim miktarı olarak tanımlanmış ve enzim aktivitesi aşağıdaki gibi hesaplanmıştır (Çoral ve Çolak 1998, Legin et al. 1998). Enzim aktivitesi (U/ml) = Serbestleşen glikoz miktarı (µmol) Örnek miktarı (ml) x inkübasyon süresi (dk) α-glikozidaz aktivitesi α-glikozidaz aktivitesi yukarıdaki reaksiyona dayanarak saptanmış hücre dışı (ekstraselüler) α-glikozidaz aktivitesi için enzim çözeltisi α-amilazda olduğu gibi hazırlanmıştır. Hücre içi (intraselüler) enzim aktivitesi için enzim çözeltisi aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır. 21

30 48 saatlik sıvı kültürden alınanan 1.5 ml örnek, soğutmalı santrifüjde (Hettich D-78532) 4 o C de rpm de 10 dakika süreyle santrifüj edilmiştir. Elde edilen hücre peleti, 7.0 ph da 0.1 M sodyum fosfat tamponu ile yıkanarak tekrar santrifüjlenmiştir ve aynı tampon içerisinde çözündürülmüştür. Soğuk su banyosu içinde 5 dakika sonifikasyon (Sonics Vibra-cell VC 130) uygulaması ile hücreler parçalanmış ve örnek tekrar santrifüjlenerek üstteki berrak sıvı kısmı enzim çözeltisi olarak kullanılmıştır (Suzuki et al. 1975, Kocabaş ve Dizbay 1997). Hücre içi ve hücre dışı enzim aktivitesinin ölçüldüğü karışım 0.5 ml enzim çözeltisi, 0.5 ml 20 mm PNPG (p-nitrophenyl-α-d-glucoside, sigma) çözeltisi (603 mg PNPG / 100 ml saf su) ve 1.0 ml 0.1 M sodyum fosfat tamponu (ph 7.0) içermektedir. Enzim kontrolünde reaksiyon karışımındaki 0.5 ml PNPG çözeltisi yerine 0.5 ml saf su ; substrat kontrolünde ise reaksiyon karışımındaki 0.5 ml enzim çözeltisi yerine 0.5 ml sodyum fosfat tamponu konulmuştur. Reaksiyon, 70 o C de 30 dakika sürmüş ve 2.0 ml 0.2 M Na 2 CO 3 eklenerek durdurulmuştur. Kalan PNP miktarı, 400 nm de tanığa (1.5 ml tampon ml saf su) karşı O.D ölçülerek ve hazırlanan standart PNP (p-nitrophenyl) eğrisi kullanılarak belirlenmiştir. Standart PNP eğrisinin hazırlanmasında, saf su içinde hazırlanan ve konsantrasyonu % (ağ/h) aralığında olan PNP çözeltileri ve tanık olarak saf su kullanılmıştır. Enzim aktivitesi 3 paralel olarak belirlenmiş ve elde edilen sonuçların ortalaması alınmıştır. Bir α-glikozidaz enzim ünitesi (1U), 1 dakikada 1 µmol PNP oluşturan enzim miktarı olarak tanımlanmış ve enzim aktivitesi aşağıdaki gibi hesaplanmıştır (Çoral ve Çolak 1998, Legin et al. 1998, Toyobo enzymes AGH-201). Enzim aktivitesi (U/ml) = Serbestleşen PNP miktarı (µmol) Örnek miktarı (ml) x inkübasyon süresi (dk) 3.6 Sıcaklık Optimumunun Belirlenmesi Bakterilerin α-amilazlarının sıcaklık optimumları, 50, 60, 70, 80, 90 ve 95 o C de α- amilaz enzim aktivitesi ölçülerek belirlenmiştir (Saha et al. 1990). 22

31 3.7 Termal Stabilitenin Belirlenmesi Bakterilerin α-amilazlarının termal stabilitelerini belirlemek amacıyla, enzim çözeltileri ph 6.0 da ve 70 o C de 1 saat süreyle su banyosunda inkübe edilmiş, inkübasyon sırasında belirli aralıklarla alınan örneklerin enzim aktiviteleri ölçülerek termal stabiliteleri belirlenmiştir (Hyun and Zeikus 1985). 3.8 Enzimlerin ph Optimumunun Belirlenmesi Bakterilerin α-amilazlarının optimum ph değerlerini belirlemek amacıyla 0.1M, ph 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 de sodyum fosfat ve 0.2 M ph 9.0, 10.0 da glisin-naoh tampon çözeltilerinde hazırlanan nişasta çözeltisi substrat olarak kullanılmış ve enzim aktiviteleri ölçülmüştür (Kligeberg et al. 1995). 3.9 Karbon Kaynaklarının Bakteri Gelişimi ve Enzim Aktivitesine Etkisinin Belirlenmesi Bu amaçla, besiyerine karbon kaynağı olarak %1 (ağ/h) oranında nişasta, fruktoz, laktoz, ksiloz, maltoz, galaktoz, dekstrin, riboz, glikoz ve sakkaroz ilave edilmiştir (Goyal et al. 2005). Değişik karbon kaynağı içeren besiyerlerinde 48 saat süreyle geliştirilen bakterilerin 600 nm deki optik yoğunlukları ve enzim aktiviteleri ölçülmüştür Azot Kaynaklarının Bakteri Gelişimi ve Enzim Aktivitesine Etkisinin Belirlenmesi Bu amaçla, besiyerine azot kaynağı olarak %1 (ağ/h) oranında pepton, tripton, maya özütü ve amonyum sülfat ilave edilmiştir (Lin et al. 1998). Değişik azot kaynağı içeren besiyerlerinde 48 saat süreyle geliştirilen bakterilerin gelişmeleri ve enzim aktiviteleri saptanmıştır. 23