BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Ekim Prof. Nermin Gözükırmızı. Hazırlayan: Deniz Gürle Yalçın

Transkript

1 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Ekim 2011 Prof. Nermin Gözükırmızı Hazırlayan: Deniz Gürle Yalçın

2 İÇİNDEKİLER Giriş Totipotensi Mikropropagasyonun Avantajları Mikropropagasyon yoluyla tüm bitki rejenerasyonu Doku Kültürünün Uygulamaları Mikropropagasyonun Dezavantajları Doku Kültüründe Temel Teknikler Doku Kültürü Sistemlerinin Tipleri Mikropropagasyonda Gelişimsel Aşamalar Birinci Aşama: Stabilizasyon Laboratuardaki İmkanlar Besin ortamının hazırlanması Besin ortamlarının bileşenleri Doku kültürü ortamının kontrolu İkinci Aşama: Multiplikasyon Üçüncü Aşama: Köklendirme Dördüncü Aşama: İklime alıştırma Organogenez İndirekt ve Direkt Organogenez Adventif Sürgün Oluşumu / Diploid Bitki Rejenerasyonu Somatik Embriyogenez Direkt ve İndirekt Somatik Embriyogenez Protoplast kültürü ve Somatik Melezleme Haploid Bitki Üretimi ve Anter Kültürü

3 Giriş Doku kültürü, genel olarak aseptik koşullarda bitki hücre ya da organlarını elde etmek ve büyütmek için kullanılan yöntemleri tanımlayan bir kavramdır. Kimyagerler, patologlar, moleküler biyologlar ve birçok başka bilim dalındaki araştırmacıların kullandığı bir yöntemdir. Propagasyonda (Çoğaltma) Genotip modifikasyonu, genetik mühendisliğinde Sekonder bileşiklerin üretiminde (biyomas) Bitki patolojisinde Bitkisel gen kaynaklarının muhafazasında Ve birçok çeşitli araştırma alanlarında kullandıkları bir yöntemdir.

4 Totipotensi Her canlı hücrenin tüm organizmayı yeniden üretebilme yeteneği vardır.

5 Mikropropagasyonun Avantajları özgün klonların çok miktarda eldesi patojensiz bitkilerin üretilmesi hibrid tohum üretimi için ebeveyne ait stoktan klon propagasyonu tüm yıl boyunca (mevsime bağlı olmaksızın) fidanlık/fidelik üretimi bitkisel gen kaynaklarının muhafazası

6 Mikropropagasyon yoluyla tüm bitki rejenerasyonu

7 Doku Kültürünün Uygulamaları bitki rejenerasyonu genetik mühendisliği yeniden ağaçlandırma sekonder ürünler pazar değeri yüksek kultivarlar (türün yeni varyeteleri) kök vermesi zor olan ya da tipik olarak bölünmüş bitkilerin propagasyonu

8 Mikropropagasyonun Dezavantajları Yüksek maliyet ve eğitimli araştırıcı/personel gerekliliği Türe özgünlük Üretim programlama Kontaminasyon Değişkenlik (Variability) İklime alıştırma (klimatize etme)

9 Doku Kültüründe Temel Teknikler 1) Uygun bir laboratuvar düzeninin kurulması, 2) Kullanılacak bitki parçalarının ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu, 3) Kallus ve hücre süspansiyonlarının oluşturulması, 4) Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun teşvik edilmesi (organogenez, somatik embriyogenez veya meristem çoğaltımı yoluyla), 5) Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların olgunlaştırılması, 6) Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi, 7) Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması (aklimatizasyon).

10 Sterilizasyon Çalışma ortamının sterilizasyonu Besin ortamlarının, alet ve ekipmanların sterilizasyonu Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu

11 Doku kültürünü etkileyen çevresel koşullar vitrifikasyon (camlaşma) patojenler eksudasyon (terleme, gözeneklerden dışarı sızma) habituasyon (alıştırma) varyasyon (çeşitlenme, dönüşme, sapma)

12 Doku Kültürü Sistemlerinin Tipleri Bitkicikler (genç bitkiler) Fideler Kallus Somatik embriyolar Yapı Rejenerasyon Explant Kaynağı Bitkicik (genç bitki) Aksiller kök Meristem ya da filiz ucu Adventif sürgün Yaprak parçaları, gövde internodları Fide Tohum kültürü Tohumlar Embriyo kültürü Olgun ya da olgunlaşmamış embriyo Kallus Kallus kültürü Vejetatif doku Protoplast kültürü Tek hücre Somatik embriyo Direkt ya da indirekt Embriyo, fide ya da yaprak

13 Başka bazı kaynaklarda ise, doku kültür sistemleri 4 tip altında incelenmektedir: Embriyo Organ Kallus Hücre (protoplast)

14 Mikropropagasyon Yöntemleri sürgün kültürü sürgün organogenezi Non-zigotik embriyogenez Bitkilerin rejenere edilmesi aksiller kök oluşumu meristem kültürü, aksiller sürgün kültürü adventif sürgün oluşumu direkt indirekt

15 Mikropropagasyonda Gelişimsel Aşamalar 1. aşama: kurulma (donörün seçilmesi ve doku kültürünün kurulması) 2. aşama: multiplikasyon (çoğalma) 3. aşama: kök oluşumu 4. aşama: iklime alışma (aklimatizasyon)

16 Birinci Aşamada Amaçlar Bir eksplantı stabil sürgün üretimini teşvik eden aseptik bir kültüre ya da in vitro çevreye başarılı bir şekilde yerleştirmektir. eksplant kaynağının seçimi eksplantın temizlenmesi kültür ortamının hazırlanması stabilizasyonun sağlanması

17 Eksplantın seçilmesi, doku kültürünün kurulması ve stabilizasyonu

18 Laboratuardaki İmkanlar Laminar flow hood (hava akışlı kabin) Otoklav Besiyeri hazırlama odası Kültür odası

19 Hava akışlı kabin

20 Otoklav

21 Besiyeri hazırlama odası

22 Kültür odası

23 Besin ortamının hazırlanması Besin ortamları Özellikleri MS (Murashige ve Skoog, 1962) B5 (Gamborg ve ark., 1968) LS (Linsmaier ve Skoog, 1965) WH (White, 1963) SH (Shenk ve Hildebrandt, 1972) NN (Nitsch ve Nitsch, 1969) tütün için, yüksek tuz oranı soya kallus kültürleri için, yüksek nitrat azotu organik bileşikler açısından MS in bir versiyonu domates kök kültürleri için, düşük tuz oranı monokotiledon ve dikotiledonlar için uygun anter kültürleri için, tuz oranı MS - WH arasında

24 Besin ortamlarının bileşenleri İnorganik bileşikler (Amonyum (NH 4 ), nitrat (NO 3 ) ve o o Makroelementler: fosfor, sodyum, magnezyum, kükürt ve kalsiyum Mikroelementler: demir, manganez, çinko, bor, bakır, molibden, kobalt ve iyot Organik bileşikler o Şekerler (sakkaroz, glikoz, maltoz, rafinoz ve fruktoz) o Vitaminler (thiamin (B1), niasin (B3, nikotinik asit), pridoksin (B6), myoinositol ve d-biotin (H)) o Hormonlar (oksin, sitokinin, gibberellin, absisik asit ve etilen) o Amino asitler o Organik asitler Jel yapıcı maddeler /destekler o Agar, membran ayakları, sellüloz tıpalar

25 Bitki Büyüme Düzenleyicileri (Bitki hormonları) Oksinler (Doğal oksin IAA ve sentetik oksinler ise, NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T ve Pikloram) Sitokininler (Doğal sitokinin formları zeatin ve zeatin ribozid. En çok kullanılan adenin (aminopurin) türevi olan BAP) Gibberellinler Absisik asit Etilen (CEPA (Etrel, Etefon, 2 kloroetilfosfonik asit), BOH (ß-hidroksietil hidrazin), NIA )

26 Bitki hormonları

27 Amino asitler, Organik asitler, Antibiyotikler/biyositler ve Jel yapıcı maddeler Amino asitler glisin, arginin, glutamin, prolin ve aspartik asit Organik asitler fumarik asit, malik asit, sitrik asit ve sodyum piruvat Antibiyotikler ve biyositler karbenisillin, sefotaksim, eritromisin, genetisin, higromisin, kanamisin ve streptomisin PPM (plant preservative mixture / bitki koruma solüsyonu) Jel yapıcı maddeler değişik tipte agarlar, agaroz, Sea-Kem agaroz, aljinat, Phytagel (Gelrite), silikajel, jelatin ve nişasta

28 Besin ortamı kapları

29 Doku kültürü ortamının kontrolu Sıcaklık (kullanım amacına göre 18±2, 22±2 ve 25±2ºC ye ayarlanır) Işık yoğunluğu Hava değişimi Ticari olarak permeabl kapaklar tasarlanmıştır. Böylece fotosentez için CO2 girişi sağlanır. ( μe/m 2 /s ye ayarlanabilmelidir.) Fotoperiyod (ışık süresi) (sürekli ışık, 16 h fotoperiyod, sürekli karanlık uygulanabilir) Işık kalitesi (beyaz, serin floresan) Nem (% arasında ayarlanır) Hava değişimi

30 İkinci aşamada amaç: Multiplikasyon

31 Altkültürleme

32 Altkültürleme

33 Üçüncü aşamada amaç: Köklendirme

34 Köklendirme

35 Dördüncü aşamada amaç: İklime alıştırma Avrupa kestanesi nde (Castanea sativa Mill.) sekonder embriyogenez ve bitki rejenerasyonu A ve B, Somatik embriyo eksplantlarından 6 haftalık proliferasyon besin ortamı kültüründe hypokotil kök ekseninden direkt sekonder embriyo gelişimi. C, Kotiledonlar üzerinde nodular kallus dokusundan farklılaşan somatik embriyolar. D, proliferasyon besin ortamında 6 haftalık kültürden sonra bir embriyogenik kallus eksplantından gelişen somatik embriyolar. E and F, Sadece sürgün gelişimi gösteren (E) ve sürgüne ek olarak kök gelişimi gösteren somatik embriyolar (F), 0 1 mg IBA içeren çimlenme besin ortamında 8 haftalık kültürden sonra. G, Sadece sürgün oluşumu gösteren somatik bir embriyodan çıkarılan sürgünün köklenmesini takiben bitki rejenerasyonu.

36 İklime alıştırma

37 Organogenez Hücrelerden ya da dokulardan, yapraklar, sürgünler ya da kökler gibi organların oluşumu. Kallus oluşumuna bağlı olarak iki farklı gelişim süreci vardır. İndirekt organogenez ve direkt organogenez Direkt Organogenez Eksplant Sürgün veya Kök Bitki İndirekt Organogenez Eksplant Kallus Sürgün veya Kök Bitki

38 In vitro organogenezde, etkin bir organ oluşumunun yerine getirilebilmesi için gerekli olan en önemli şartlar; uygun eksplantın seçilmesi büyümede aktif maddeleri içeren uygun bir besin ortamı ve fiziksel çevre koşullarının kontrolüdür.

39 İndirekt Organogenez Kallus oluşumu içeren organ gelişim sürecine indirekt organogenez adı verilir. Somaklonal Varyasyon: Kültürdeki hücre populasyonundan üretilmiş bitkilerde oluşan genetik varyasyon Primer eksplant Kallus Organ primorduyumu

40 Direkt Organogenez Dedifferentiation: değişime uğramamış ya da özelleşmemiş duruma yeniden dönüş süreci (tersine farklılaşma ya da aynılaşma olarak adlandırılabilir) Differentiation: özel işlevleri olan yeni ve değişmiş doku ve organların büyümesinin başlaması süreci (farklılaşma) Yeterlilik Kararlılık + + Eksplant Organ Dedifferentiation İnduksiyon Differentiation (Tersine Farklılaşma (Organogenik (Farklılaşma) Aynılaşma) Uyarılma)

41 Yaprak parçaları Adventif Sürgün Oluşumu / Diploid Bitki Rejenerasyonu İnce tabaka epidermal şeritler Parçalara ayrılmış sürgün uçları Kotiledonlar ve hipokotiller Genç iğne demetleri Çiçek saplarında olgunlaşmamış çiçeklenmeler Soğan zarları/kabukları adventif sürgün oluşumu için kullanılan bitki parçalarıdır. Sitokinin ve Oksinin Etkileri Aşırı oksin kök, aşırı sitokinin sürgünlerin oluşumunu artırır. Yani eğer ortamda oksin oranı sitokinin oranından fazlaysa kök oluşumu, sitokinin oranı oksin oranından fazlaysa sürgün oluşumu, eğer arada bir oran varsa kallus oluşumu desteklenir.

42 Kallus Farklılaşmamış parenkima hücrelerinin hücre bölünmesi In vitro koşullarda eksplantlar üzerinde, yaralanmaya ve büyüme hormonlarının besin ortamına katılmasına yanıt olarak ürerler. Tohumlar, gövdeler, kökler, yapraklar, depo organları ya da meyveler kesip çıkarılıp dezenfekte edilebilir ve kallus oluşumu için teşvik edilebilir.

43 Somatik embriyogenez Dişi ve erkek gametlerin birleşmesi yerine vejetatif hücrelerden embriyo gelişimi (non-zigotik)

44 Somatik Embriyo Rejenerasyonu Direkt ve İndirekt Somatik Embriyogenez E. camaldulensis te (Ökaliptus) direkt ve indirekt somatik embriyogenez a hipokotil eksplantın radiküla ucundan doğrudan oluşan somatik embriyo b hipokotil eksplanttan gelişen somatik embriyonun boyuna kesiti c e embriyogenik kallustan gelişen somatik embriyolar f somatik embriyoların değişik zamanlarda kaydedilmiş, olgunlaşma ve çimlenme evreleri (bar = 2 mm)

45 İndirekt Somatik Embriyogenez Kallus Kallustan oluşan Kotiledonlar ve Embriyo

46 Primer kallus Somatik embriyolar Embriyo oluşumu Sürgün gelişimi

47 Protoplast kültürü ve Somatik Melezleme (a) sıvı besin ortamında yeni izole edilmiş mezofil protoplastları (40 µm çap) (Petunia hybrida) (b) Kültür hücrelerinden çıkan protoplastlar (60 µm çap). Merkezde yer alan nukleus sitoplazmik iplerle çevrilidir. (Parthenocissus tricuspidata) (c) kloroplast içeren bir mezofil (m) protoplastıyla, hücre süspansiyonundan izole edilmiş renksiz bir protoplastın (c) sodyum nitratla uyarılmış füzyonu. Plastidler renksiz protoplastın sitoplazmasına girerken görülüyor. (d) yeni izole edilmiş bir mezofil protoplastının elektron mikrografı (n=nukleus; ch=kloroplast; cv=merkezi vakuol; p =plazmalemma) (e) bir protoplastın sitoplazmasının içindeki vesikülün içerisine Rhizobium un (r) alınması (p=plazmalemma)

48 Protoplast Kültürü Tekniği

49 Protoplast Kültürü Tekniği (devam)

50 Haploid Bitki Üretimi ve Anter Kültürü Arpa polen kültürü

51 Anter Kültürü ve Polen Kültürü Anter kültürü ve haploid ve diploid bitkileri in vitro üretme yöntemleri.

52 Anter kültürü ve haploid bitki rejenerasyonu (a) kültüre alınan anter (b) kültürde anter, 6 gün sonra (c, d) 30 gün sonra anterlerden oluşan embriyolar/kök (c) ve sürgün (d) oluşumu (e g) büyüme besin ortamında altkültürlenmiş kotiledonlu (e) ve yapraklı (f, g) bitkicikler (h) anter kültüründen rejenere olmuş 80-günlük haploid bitki (solda) ve aynı yaşta diploid kontrol bitki (sağda) Ölçüm çubukları (a d), 2.5 mm; (e h), 5 mm.