Antibiyotik Duyarlılık Testlerinde Etest Prensibi, Önemi ve Saklama Koşulları

Transkript

1 Antibiyotik Duyarlılık Testlerinde Etest Prensibi, Önemi ve Saklama Koşulları E.İnci TUNCER S.Ü.Selçuklu Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,KONYA 1

2 Tarihçe Penisilin İlk keşfedilen antibiyotik 1929, Alexander Flemming Penicillum türü küflerin Stafilokok kolonilerinin üremesini durdurduğu fark etti 2

3 Tarihçe Howard Florey ve Ernst Chain-1946 Stafilokok, Streptokok infeksiyonlarının tedavisinde Penisilini kullandı Penicillium notatum 3

4 Tarihçe (direnç gelişimi) 1940-Penisiline 1950-M.tuberculosis de Streptomisine 1953-Shigella da Çoklu ilaca 1965-E.coli de Ampisiline 1970-P.aeruginosa, Klebsiella da Çoklu ilaca 1983-K.pneumoniae de 3.Kuşak Sefalosporinlere Son yıllarda tüm Dünyada Birçok mikroorganizmada gözlenen direnç genleri 4

5 Duyarlılık test yöntemleri 1. Fenotipik test yöntemleri Antimikrobiyal aktivite ve breakpoint temeline dayananlar a. MİK belirleyenler (sıvı, agar, gradient) b. Disk difüzyon (Kirby-Bauer) c. Otomatize sistemler 2. Genotipik test yöntemleri Bir direnç geninin veya onun ürününün tanımlanması temeline dayanır a. mec A, Van A, Van B PBP2, diğer beta-laktamaz 3. Gözlenen sonuçdan rapora a. mec A geni pozitif yada GSBL pozitif ise Tüm beta-laktam antibiyotikleri dirençli rapor ediniz b. Eritromisin direnci var ise Azitromisin ve klaritromisini dirençli rapor ediniz 5

6 Duyarlılık test yöntemleri 2 1. Fenotipik test yöntemleri Göreceli (test sonuçlarını etkileyen değişimler) Duyarlılık veya direnci tahmin etmek Duyarlılık homojendir veya ölçülemez Direnç heterojendir ve ölçülebilir 2. Genotipik test yöntemleri Direnç tahmin edilebilir- direnç yoksa sonucun duyarlı olduğunu göstermez Direnç kesindir 3. Gözlenen sonuçdan rapora Duyarlılık ve direnç kesindir 6

7 Etest (=Epsilometer test) Temel Prensipler 7

8 Etest Agar difüzyon ve MİK değerini kantitatif olarak belirleme esasına dayanır Kantitatif sonuç verir Gittikçe artan konsantrasyonlarda antibiyotik içeren inert plastik şeritler kullanılır 35 C de saat inkübasyon Elips seklindeki inhibisyon alanının stripi kestiği nokta MİK değerini verir 8

9 9 Etest - Antibiyotik Duyarlılık Stripleri ve gereçler

10 Seçici Antibiyotik Gradiyent Bölmeleri Gradientler Sabit dalgalanmalarla ilerlemektedir Antibiyotik difüzyonu ile üreme arasında Dinamik bir bağ var 10

11 11 Konsantrasyon Gradiyentlerinin Şematik Gösterimi

12 Disk difüzyonu ile Gradiyent Stabilitesinin karşılaştırılması Kons/ zon Disk - UNSTABİL Etest - STABİL Zaman saat

13 Disk Difüzyon için Kısıtlamalar Yavaş üreyen narin organizmalar ve anaeroblar o Pneumococcus, Streptococcus vb. Değişken üreme oranları o Gram negatif fermentatif, mantarlar vb. Düşük inokülum miktarı o Hatalı geniş zonlar Zayıf agar besiyeri (besleyici madde eksikliği) yavaş üreme Büyük moleküllü antibiyotiklerin difüzyon oranları (glikopeptidler) 13

14 MİK ile dirençli Disk ile Duyarlı!! P. aeruginosa - Gentamisin 14

15 Yüksek Molekül Ağırlıklı Antibiyotikler Büyük Moleküller Disk e karşı önceden tanımlanmış gradiyentler Vankomisin 15

16 Strip üzerinde MİK! 16

17 Etest Stabil MİK gradiyenti olup Patentli GRADİYENT teknolojisi Kesin ÖLÇEKLİ değerler 15 dilüsyonlu GENİŞ KONSANTRASYON ARALIĞI Mikrooganizma ve İlaç SAYISI YÜKSEK Makrometod taki ekim miktarını TOLERE EDER AGAR formatının avantajları Direnç tespitinde FLEKSİBİLİTE sağlar Çok sayıda REFERANS a sahiptir 17

18 Tüp dilüsyon ve Etest dilüsyon aralıkları 18

19 Etest MİK de İnovasyon mudur? C Tek bir plastik strip üzerinde 16 buyyon tüp veya agar dilüsyon petrisi!

20 Etest İhtiyaçları karşılıyor mu? Kritik vakalar MİK Kritik türler OTOMASYON MİK i basitleştirmek 1990 DİRENÇ Yeni oluşan mekanizmalar ORGANİZMA Narin organizmalar için güvenilir

21 Organizma Kapsamı Narin Mikroorganizmalar H.influenzae N.gonorrhoeae N.meningitidis H.pylori Anaeroblar Pneumococcus Streptococcus Abiotrophia vb. H.influenzae, MHC/ 5% CO 2

22 Clostridium difficile 21. Yüzyılın Nozokomiyal patojeni?

23 Zor üreyen mikroorganizmalar Arcanobacteria Bordetella Bartonella Brucella HACEK Franciscella Listeria Legionella Nocardia Mycobacteria Mycoplasma Diğerleri. N.asteroides, MHA/ 1McF/ saat

24 Mikobakteri için Etest M.Fortuitum Kanlı agar M.avium intracellular Kanlı agar M.Tuberculosis Middle Brook

25 Etest - Maya, Küf, Dermatofitler A.flavus A.terreus A.fumigatus 25

26 Etest İhtiyaçları karşılıyor mu? Kritik vaka 2000 OTOMASYON MİK i basitleştirmek 1995 MİK Kritik türler 1990 DİRENÇ Yeni oluşan mekanizmalar ORGANİZMA Narin organizmalar için güvenilir

27 Antimikrobiyal Direnç Tespiti Hetero-direnç MİK indüklenebilir-direnç Hiper-mutatörler Yavaş mutatörler Küçük koloni varyantları İnokülum artışına tolerans Fizyolojik direnç P.aeruginosa Broth dil 0.06 Agar dil Etest MİK >32 27

28 İnokulum Direnç Tespiti (disk difüzyon ile karşılaştırmalı) İdeal test Az dan çok a inokulum miktarı Duyarlı izolat S S Dirençli İzolat - heterojen S/I R - alt-popülasyon S R - homojen R R

29 İnokulum Toleransı E. coli ATCC 25922/Gentamisin CFU/mL

30 Yüksek İnokulum da Direnç S.aureus ATCC ( ß-laktamaz pozitif) CFU/mL

31 Etest Makrometod* GISA/ hgisa testi! Zengin besiyeri = BHI Yüksek inokulum = 2McF Uzatılmış inkübasyon = 48h 31

32 Etest Çift taraflı gradiyent ile Direnç Tespiti Fenotipik direnç markırları: ESBL, MBL, GRD, AmpC

33 ESBL için Etest Ceftazidime ND Cefotaxime ND Cefepime ESBL + K. pneumoniae 915

34 MBL için Etest Acinetobacter spp. (IMP-1 genotip) RISK - IsoSensitest Üzerinde Yalancı Negatif! Zn Mueller Hinton da pozitif Zn 2+ physiologic

35 AmpC için Etest E. coli DHA-1 E. coli CMY-2

36 Etest İhtiyaçları karşılıyor mu? Kritik vaka MİK Kritik türler OTOMASYON MİK i basitleştirmek 1990 DİRENÇ Yeni oluşan mekanizmalar ORGANİZMA Narin organizmalar için güvenilir

37 MİK in Klinikte kullanım alanları KRİTİK İNFEKSİYONLAR Menenjit Endokardit Bakteremi, fungemi Pnömoni ve VİP İntra abdominal infeksiyonlar Kistik fibrozis KRİTİK HASTALAR Yoğun bakım üniteleri Transplant Onkoloji Yanıklar Yenidoğan ve pediyatrik hastalar Hematoloji

38 MİK nasıl kullanılır? Her Kritik Hasta Farklıdır! - MİK e karşı ilaç seviyeleri, MİK e karşı breakpoint - Seçim, doz, rejim Direncin erken tespiti ile - Testi doğrula (inokulumu azaltarak tekrar et, modifiye et) ve tedaviyi değiştir Tuhaf, kuşkulu Antibiyogram sonuçlarını doğrulamada Yoğun bakım ünitesi empirik rejimlerini doğrulamada kullanılmaktadır

39 İNOKULUM TOLERANSI Etest ÖZET Çeşitli inokulum yoğunluğu kabul edilir Agar-bazlı: tek veya çoklu mikrobiyal kontaminantları gözlemleme Kromojenik agar ve aynı gün okuma (4-6saat) Referanslar: - Kan (Gram pozitif ve negatifler, anaeroblar, maya) - BOS, diğer steril sıvılar/dokular - Kistik fibrözis: balgam, diğer bronşiyal sıvılar - VİP: balgam, bronşiyal aspirasyonlar, Bronkoalveolar lavaj (BAL) 39

40 Ciddi hastalarda kategorize edilmiş duyarlılık sonuçlarından çok, gerçek MİK in bulunması infeksiyonların yönetiminde laboratuvarların önemli bir görevidir! Antibiotic resistant infections in the critically ill adult. Paterson et al, 2004, CLM

41 Etest (=Epsilometer test) Okuma 41

42 Etest Okuma Etest Teknik ve Okuma Klavuzları na Başvurunuz Endpoint kriterleri şunlarla ilişkilidir Teknik konuların bilinmesi İlaç ve mikroorganizma spesifik olması Direnç mekanizmalarının bilinmesi 42

43 Etest Okuma Üremenin strip ile kesiştiği noktada MİK i okuyun Eğer değerler arasındaysa bir üstteki MİK değerini okuyun Sidal ilaçlar için üremenin tümüyle inhibe edildiği (bulanık, mikro ve makrokoloniler) noktayı okuyun Statik ilaçlar için %80 inhibisyonu okuyun Sidal/Statik ilaç listesi, keskin ve bulanık endpoint ler için kılavuzlara başvurunuz 43

44 Etest Okuma Algoritması Endpoint in keskin sınırları varmı? Evet Hayır İlaç bakteriyostatik mi bakterisid mi? Üremenin strip ile kesiştiği değeri okuyun Eğer değerler arasında ise bir sonraki MİK değerini okuyun BAKTERİSİDAL İLAÇLAR %100 İnhibisyonu okuyun Üremenin olduğu alandaki tüm inhibisyonu okuyun (Bulanıklık, mikro ve makrokoloniler) BAKTERİYOSTATİK İLAÇLAR %80 İnhibisyonu okuyun Üremenin inhibe olduğu en belirgin ilk noktayı okuyun İzleri ve mikrokolonileri görmezden gelin 44

45 Taşıyıcı üzerindeki bölge sınırında olan kesişme MİK i verir S.marcescens, İmipenem 45

46 Değerler Arası Üst değeri okuyun 46

47 S, I, R nin Kategorizasyonu MİK breakpoint leri CLSI, EUCAST veya kabul ettiğiniz otoritenin en güncel kılavuzlarından kontrol edilmeli Eğer mevcut değilse, literatürlerden bakılmalı Etest 2-kat dilüsyonlar arasındaki değerleri vermektedir S, I, R den önce bir sonraki değere yuvarlayabilirsiniz Sadece kesin MİK i ve S, I, R yi raporlayınız 47

48 Ara Dilüsyonu Yorumlama S: I: R: 2 MİK 1.5, MİK 2 µg/ml olur Kategori = R R I S 48

49 Çok fazla inokulum dan kaçının 49

50 Strip boyunca oluşan üreme tünelini değerlendirmeyin 50

51 Eğer tek taraflı bir kesişme varsa Dilüsyon 1 ise bir sonraki değeri okuyun Dilusyon > 1 ise test tekrarlanmalıdır 51

52 Molekül Boyutu Küçük molekül, daha geniş elips Büyük molekül, daha küçük elips 52

53 Proteus Yığını okumayın! 53

54 Hemolizi okumayın! 54

55 Bakterisidal İlaçlar Tüm inhibisyonu okuyun Bulanıklığa, mikro ve makrokolonilere bakın β-laktamlar Karbapenemler Sefalosporinler Etambutol Glikopeptitler Fosfomisin İzoniyazid Aminoglikozidler Kinolonlar Metranidazol Rifampisin Amfotericin B 55

56 Pneumococcus - Pen G Mikrokolonilere ve bulanıklığa dikkat edin MİK: 4.0 µg/ml 56

57 Dipteki kolonilere dikkat edin 57

58 8 den 32 ye kadarki mikrokolonilere bakın %100 inhibisyon yapan ilaçtır Mikrokolonileri gözardı etmeyiniz 58

59 Kinolonlarda bulanıklığı okuyun 59

60 Paradoks etki Antimikrobiyal in yüksek konsantrasyonlarında tekrar üreme indüklenmektedir En yüksek değeri okuyunuz 60

61 Bakteriyostatik İlaçlar %80 inhibisyon okuyunuz önemli değişimin olduğu ilk noktayı gözle belirleyin Tetrasiklinler Streptograminler Oksazolidinonlar Makrolidler Azoller Linkomisinler Kloramfenikol Sülfonamidler Trimetoprim 61

62 Bakteriyostatik ilaçlar için %80 i okuyunuz Bakteriyostatik ilaçlar Endpoint kuralı: %80 inhibisyon MİK: µg/ml Yorum: önemli değişimin olduğu ilk noktayı gözle belirleyin 62

63 Linezolid Bu ilaç için özel %90 inhibisyonun olduğu statik endpoint S.aureus ATCC MİK: 1 µg/ml İzlem: µg/ml 63

64 MRSA Düşük seviye heterodirenç 64

65 Olası hatalar! Etest için kullanılan Agarın 1. Muller Hinton, kanlı vb. yüzeyinin ıslak olması 2. Kalın veya ince dökülmüş olması Etkene karşı test edilecek antibiyotik striplerinin 1. Yanlış seçilmesi 2. Uygunsuz saklama koşulları 65

66 Acinetobacter baumannii Kurutulmamış MHA Kurutulmuş MHA 66

67 Klebsiella pneumoniae 4 mm kalınlığında MHA 6 mm kalınlığında MHA 67

68 Etest striplerinin saklama koşulları Üretici firmanın saklama talimatlarına uyulmalıdır Etest stripleri için saklama ortamı sıcaklığı Örneğin; C de ila+8 C de (oda derecesi) Isı kadar nemde önemli olup Nemi önleyici düzeneklerle birlikte saklayınız 68

69 Sonuç olarak; Etest Agar difüzyon esasına dayanan MİK değerini kantitatif olarak belirleyen Bir çok direnç mekanizması hakkında fikir veren Her klinik mikrobiyoloji laboratuvarında uygulanabilen Klinikte birçok hastalığın sağaltımı için yönlendirici olan bir yöntemdir 69