Çukurova Üniversitesi. Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü

Transkript

1

2

3 RNA TEK ZINCIRLIDIR Nükleik asitlerin ikinci çeşidi ribonükleik asit ya da RNA'dır; bu moleküller DNA'ya benzer ancak; RNA'da deoksiriboz yerine riboz şekeri Azotlu baz timin yerine urasil RNA'nın çoğunlukla tek-zincirli olduğunun düşünülmesidir Ancak, RNA molekülleri sentezlendikten sonra bazen kendi üstüne katlanarak ikili sarmal bölgeler oluşturur; Genetik materyali RNA olan bazı hayvan virüslerinde RNA ikili sarmal olarak bulunur.

4

5

6

7

8

9

10

11 GENETIK BILGININ IFADESINDE EN AZ ÜÇ HÜCRESEL RNA MOLEKÜLÜ IŞLEVSELDIR Ribozomal RNA (rrna), Habeci RNA (mrna) Taşıyıcı RNA (trna) Bu moleküller DNA' nın bir zincirinin tamamlayıcı (eşlenik) kopyası olarak transkripsiyon sonucunda sentezlenir. RNA nükleotit dizisi sentezlendikleri kalıp DNA nın deoksiribonükleotit dizisinin eşleniğidir.

12 RNA KARAKTERIZASYONU Değişik RNA'lar, merkezkaç alandaki çökelmelerine göre ayırt edilir. Çökelme özelliği, molekülün yoğunluğu, kütlesi ve biçimine bağlıdır ve Svedberg katsayısı (s) olarak ölçülür. Büyük S değeri çoğunlukla molekülün büyük olduğunu gösterse de, bağlantı doğrudan değildir; örneğin, molekül ağırlığındaki iki kat artış S değerini iki kat yükseltmez.

13 RNA KARAKTERIZASYONU RNA'ların içinde en büyük olanı genelde ribozamal RNA'dır. rrna'lar, translasyonda protein sentezinin özgül olmayan çalışma masası olarak rol alan ribozomların önemli yapısal bileşenleridir.. Haberci RNA molekülleri (mrna), DNA' daki genetik bilgiyi translasyonun cereyan ettiği ribozomlara taşır. Şifrelediği proteinin büyüklüğündeki ve aynı zamanda mrna'nın transkripsiyonunda kalıp olan genin büyüklüğündeki çeşitlilikleri yanslttığı için, mrna'ların uzunlukları oldukça farklıdır., RNA tiplerinin en küçüğü olan trna (taşıyıcı RNA), translasyon sırasında amino asitleri ribozama taşır. Diğer RNA lar; mrna'nın işlenmesinde rol alan küçük çekirdek RNA'sı (snrna) Telomeraz RNA, DNA'nın replikasyonunda görev alır, Antisens RNA işlevseldir.

14 TRANSKRIPSIYON Transkripsiyon bir DNA kalıbından RNA sentezlenmesidir. Genin son ürününün protein olduğu şifreyi aydınlatma çalışmalarında bulunmuştu. DNA zinciri a.a. oluşan protein zincirini nasıl belirler? Bu karışık işlem, DNA da depolanan genetik bilginin RNA ya aktarılması ile başlamaktadır. Bir DNA kalıbından RNA moleküllerinin sentezlenmesi işlemine Transkripsiyon (okuma) adı verilmektedir. Hücre içinde bilgi akışı işleminin ilk basamağı olduğu için transkripsiyon önemlidir.

15

16

17 RNA POLIMERAZ RNA SENTEZINI YÖNLENDIRIR 1959 yılında Samuel Wesis fare karaciğerinde RNA polymerazı saptadılar. DNA polimerazın aksine mrna sentezinin başlaması için primer gerekli değildir. DNA kalıbından RNA sentezini özetleyen reaksiyon aşağıdaki gibi ifade edilmektedir. n(ntp) DNA enzim (NMP)n + NTP (NMP)n + n(ppi) (NMP) n+1 + PPi

18 PROMOTORLAR, KALıBA BAĞLANMA VE SIGMA ALT BIRIMI DNA'nın transkripsiyona uğrayan zincirini kalıp zincir olarak ve onun tamamlayıcısı olan zinciri de eş (partner) zincir olarak adlandırılır. Bakteride, bu ilk bağlanma, RNA polimerazın sigma (σ) alt biriminin promotor denilen özgül DNA dizilerini tanımasıyla gerçekleşir. Promotor bölge genin transkripsiyonunun başlangıç noktasına göre daha yukarıda, 5'-bölgede yer almaktadır. Enzimin, promotor bölgeyi tanıyana kadar belli bir uzunluktaki DNA boyunca "keşif" yaptığı ve sarmal üzerinde, 40 nükleotiti transkripsiyonun başlangıç noktasından yukarıda yer alan 60 nükleotitlik bir bölgeye bağlandığı düşünülmektedir.

19 KALıBA BAĞLANMA VE SIGMA ALT BIRIMI Enzimin bu bağlanması gerçekleştikten sonra, sarmal bu bölgede denatüre olur yani açılır ve böylece, DNA kalıbı enzimin çalışmasına açık duruma gelir. Promotor ve RNA polimeraz arasındaki ilişki transkripsiyonu yönetmektedir. Bakterilerde, transkripsiyonun her 1-2 saniyede birden her dakikada bire kadar değişen oranlarda başlamasına neden olan güçlü ve zayıf promotorlar bulunmuştur. Promoter bölgesinde transkripsiyonun başlangıç noktasının 10 nükleotit yukarısında yer alan TATAAT dizisi (-10 bölgesi ya da Pribnow kutusu). noktasının 35 nükleotit yukarısında bulunan TTGACA dizisi (-35 bölgesi) bulunur.

20

21 SIGMA ALT BIRIMI Sigma alt biriminin ana formu, molekül ağırlığı 70 kilodalton (kda) olduğu için, σ 70 olarak gösterilir. Bakteriyel genlerin çoğunun promotorları bu formu tanımasına karşın, E.coli'de RNA polimerazın özgün σ alt birimleri: σ 28, σ 32, σ 38 ve σ 54 içeren çeşitli formları vardır. Bu formlar, değişik promotor dizilerini tanır ve transkripsiyonun başlama özgüllüğünü sağlarlar.

22 RNA POLIMERAZ PROMOTOR BÖLGESINE BAĞLANıR

23 RNA SENTEZININ BAŞLAMASı VE UZAMASı RNA polimeraz, promotoru tanıyıp bağlandıktan sonra, RNA polimerizasyonu, bir sonraki komplementer ribonükleotitin girmesi ve bir öncekine fosfodiester bağı ile bağlanması şeklinde devam eder. zincir uzaması 5' 3' yönünde devam eder ve zincirleri birbirine antiparalel olan geçici bir DNARNA dubleksi oluşur. Uzayan RNA zincirine birkaç ribonükleotit takıldıktan sonra σ alt birimi holoenzimden ayrılır ve uzama, core enziminin yönlendirmesi ile devam eder. E. coli'de, 30 o C'da, bu işlemin hızı 50 nükleotitf saniye'dir.

24 RNA sentezinin başlaması

25

26 TRANSKRIPSIYONUN SONLANMASı RNA polymeraz enzimi durdurma sinyali olarak görev yapan 40 baz çifti uzunluğunda nükleotit dizisi ile karşılaşana kadar tüm gen üzerinde yol alır. Bazı durumlarda, sentezin sonlanması sonlanma faktörü; Rho (ρ)'ya bağlıdır. Rho, uzayan RNA kopyası ile fıziksel ilişki kuran büyük bir hekzamerik proteindir. Rho faktörü bir RNA-DNA helikazdır. Sonlanma noktasında, RNA kopyası DNA kalıbını terk eder ve kor (çekirdek) polimeraz enzimi de kalıptan ayrılır. Bazı durumlarda, transkripsiyon sonucu birden fazla geni şifreleyen büyük bir mrna molekülü ortaya çıkar. Bakterideki genler bazen polisistran olarak adlandırıldığı için bu RNA'ya polisistronik mrna denir. Bu şekilde kopyalanan genlerin ürünlerinin hepsi aynı anda gerekli olduğu için, bu, transkripsiyon ve arkasından genetik bilginin translasyonu için uygun bir yoldur. Kural olarak ökaryotlarda monosistrocik mrna'lar bulunur.

27 İnverted tekrarlar RNA molekülüne kodlandığında, RNA hairpin denilen ikinçil yapı oluşturmaktadır. RNA-RNA yapısı (hairpin) DNA-RNA yapısından daha stabil yapıdadır ve RNA yı DNA hibrid yapısından ayırmaktadır. Şekil: (A) transkripsiyonun faktöre bağlı olmadan sonlanması. (B) RNA hairpin yapısının oluşması.

28

29 ÖKARYOTLARDAKI VE PROKARYOTIK TRANSKRIPSIYON FARKLARı 1. Prokaryotların aksine, ökaryotlarda RNA kopyası, transkripsiyon tamamlanmadan ribozomla ilişki kurmaz. mrna'nın translasyonu için çekirdekten sitoplazmaya taşınması gerekir. 2. Promotorun yanı sıra, başlama noktasından daha yukarıdaki 5' -düzenleyici (regülatör) bölgede enhansır (etki artırıcı) denilen kontrol elementleri de bulunabilir. Enhansırlar, 5' regülatör bölgenin yanı sıra, genin içinde ve hatta şifreleme dizisinin 3' aşağı bölgesinde de yer alabilir. 3. Sentezlenen ilk RNA kopyasından olgun ökaryotik mrna oluşması için, "işlenme" adı verilen birçok karmaşık basamak gereklidir. 5 cap ve 3 kuyruk takılması, Split genler ve splays

30 ÖKARYOTLARDA TRANSKRIPSIYONUN BAŞLAMASı Ökaryotlarda üç tip RNA polimeraz bulunur. Tip Ürün Yerleşimi I rrna Çekirdek II mrna Nükleoplazma III 5SrRNA trna Nükleoplazma Nükleoplazma Ökaryotik bir gende polimeraz Il'nin etkin bir biçimde transkripsiyonu başlatılmasına yardımcı olan en az üç tane "cisacting element" bulunur. 1. TATA kutusu olarak adlandırılırve transkripsiyonun başlama noktasından 30 nükleotit çifti kadar yukarıda (-30) bulunur. 2. CAA T kutusu olarak adlandırılan ve promotorun içinde, transkripsiyonun başlama noktasının 80 nükleotid yukarısında (-80) 3. Enhansırlar (Etki arttırıcılar) DNA üzerinde yer alan diğer "cis-acting" elementlerdir. Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji

31 TRANSKRIPSIYON FAKTÖRLERI Kalıp DNA ya bağlanmayı kolaylaştırarak, transkripsiyonun başlamasına yardımcı olan bu faktörler, transkripsiyon faktörleri olarak adlandırılan proteinlerdir. RNA polimeraz II, transkripsiyon faktörleri olmadan ökaryotik promotor bölgelerine doğrudan bağlanamaz ve transkripsiyonu başlatamaz. İnsanda, RNA polimeraz II'nin bağlanmasında rol alan transkripsiyon faktörleri oldukça iyi tanımlanmış ve TFIIA, TFIIB vs. şeklinde adlandırılmışlardır. Bunlardan TFIID doğrudan TATA kutusu dizisine bağlanır ve TATAbağlanma proteini (TBP) olarak adlandırılır. TFIID, 10 tane polipeptit alt birim içerir. DNA'ya ilk bağlanma gerçekleştikten sonra, en az yedi farklı transkripsiyon faktörü daha sırayla TFIID'ye bağlanarak, RNA polimerazın bağlanacağı büyük bir öncül başlama kompleksi oluşturulur.

32

33 HETEROJEN ÇEKIRDEK RNA' Sı VE IŞLENMESI: Bakteride, DNA ve RNA arasındaki ilişkinin oldukça dolaysız olduğu görülmektedir. DNA' deki baz dizisi önce bir mrna dizisi şeklinde kopyalanır ve bu mrna dizisinin daha sonra genetik şifreye göre amino asit dizileri şeklinde translasyonu (tercümesi) sağlanır. Ökaryotlardaki mrna'nın, translasyona katılmak için sitoplazmaya geçmeden önce karmaşık bir işlemden geçmesi gerekir. 1970'lere kadar elde edilen bulgular, ökaryotik mrna'nın başlangıçta, translasyona uğrayan molekülden daha büyük bir ilkin molekül olarak transkripsiyonunun yapıldığını göstermiştir. James Damell ve arkadaşlarının memeli çekirdeğinde, sitoplazmadaki küçük mrna molekülleri ile ortak nükleotit dizileri taşıyan heterojen çekirdek RNA'sını (hnrna) gözlemlemişlerdir. Bir genin ilk kopyasının (transkriptinin) büyük bir RNA'molekülü olduğunu ve olgun mrna olarak sitoplazmada görülmeden önce çekirdekte işlenmesi gerektiği önerisinde bulunmuşlardır

34 CAPING (ŞAPKA YAPıLARı) Ökaryotik RNA transkriptlerinin mrna olmaları yolundaki ilk transkripsiyon sonrası değişiklik (posttranskripsiyonel modifikasyon), bu moleküllerin 5'-ucuna, 7-metilguanozin (7mG) şapka (kep; cap) yapısının takılmasıdır. Transkript henüz tamamlanmadan takılan bu şapka yapısı, muhtemelen molekülün 5'-ucunu nükleazlara karşı korumaktadır. Bu yapı, olgun mrna'ların çekirdek zarından sitoplazmaya geçişinde de rol alabilir. Şapka yapısı oldukça karmaşıktır ve RNA'nın ilk ribonükleotiti ile şapka arasında kurulan özgün 5'-5' bağı belirleyici bir özelliktir. Ayrıca, bazı ökaryotlarda RNA'nın ilk iki ribonükleotitinin riboz şekerinin 2'-karbonunda bir metil grubu (-CH3) bulunur.

35 POLIADENILASYON RNA'nın işlenerek olgun mrna oluşturması ile ilgili bilgiler, hem hnrna'ların hem de mrna'ların, 3' -ucunda yaklaşık 250 tane adenilik asitten oluşan bir dizi içerdiklerinin bulunması ile pekişmiştir. İlkin transkriptin 3'- ucunda, son derece korunmuş AAUAAA dizisinden 10 ila 35 ribonükleotit ilerideki bir noktadan enzimatik kırılma meydana gelmektedir. Bundan sonra, adenilik asit moleküllerinin sırayla ilavesi ile poliadenilasyon gerçekleşir. AAUAAA dizisine bütün ökaryotik transkriptlerde rastlanmamasına rağmen, transkriptlerin bu dizisinde mutasyonlar varsa, yapıya poli A kuyruğu takılamaz. Poli A kuyruğu taşımayan mrna molekülü hızla parçalanır. Dolayısıyla, 5'-şapka ve 3'-poli-A kuyruğu daha ileri işlemlerden geçerek sitoplazmaya taşınacak bir RNA molekülü için önemlidir.

36

37

38 ÖKARYOTIK GENLERIN ŞIFRELEYICI BÖLGELERI ARAYA GIREN DIZILERLE KESINTIYE UĞRAR Moleküler genetikteki en çarpıcı buluşlardan biri, 1977'de Susan Berget, Philip Sharp ve Richard Roberts tarafından gerçekleştirilmiştir. Araştırmacılar, hayvan virüslerinin genlerinde, bu genlerin şifreledikleri prateinlerdeki amino asitlere dönüştürülmeyen dahili bazı nükleotit dizilerinin varlığını doğrudan kanıtlamışlardır. Bu dahili DNA dizileri ilkin RNA transkriptinde bulunmakta ancak, olgun mrna'nın translasyonundan önce yapıdan uzaklaştırılmaktadır. Bu tip nükleotit parçalarına araya giren (intervening) diziler denir ve yapısında bu dizileri içeren genler de parçalı genler (spiit genler) olarak bilinir. Son halini almış, olgun mrna ürününde bulunmayan bu diziler intronlar ("int" araya gireni, böleni belirtir) olarak da adlandırılır. mrna'da kalan ve ifade edilen DNA dizilerine ise, ekzon ("eks" terimi ekspresyonu: ifade edilmeyi be!irtir) denir.

39 SPLAYS MEKANIZMALARı: OTOKATALITIK RNA LAR İntronun kendisi, çıkarılması için gerekli enzimatik aktivitenin kaynağıdır. Beklenenin dışındaki bu şaşırtıcı buiuş, 1982'deThomas Cech ve arkadaşları tarafından protozoa Tetrahymena ile yapılan çalışmalarda ortaya çıkarılmıştır. Kimyasalolarak iki nükleofilik reaksiyon cereyan etmektedir. Birincisi, reaksiyonda kofaktör olarak rol alan guanozin ile primer transkript arasındadır. Guanozinin 3'-OH grubu intronun 5'-ucunun yanındaki nükleotite aktarılır. İkinci reaksiyon sol taraftaki ekzonun yeni kazandığı 3'-OH grubu ile sağdaki intronun 3' ucundaki fosfat grubu arasında cereyan eder İntron kesilip çıkarılır ve iki ekzon bölgesi birleştirilerek olgun RNAmeydana gelir

40

41 SPLYSOZOM Çekirdek kökenli öncül mrna da bulunur. Çok uzundurlar ve bp kadar çıkabilmektedirler. Başlangıç ve bitiş noktalarının yanındaki nükleotid dizileri çoğunlukla benzerdir ve 5 ucu GU dinukleotid dizisi ile başlar. 3 ucu GU di nukleotid dizisi ile sonlanır. U1, U2, U3 bölgeleri uridin bakımından zengindirler. U1 bölgesi snrnası 5 ucu ile homolog olan bir dizi içerir ve bu homoloji ile meydana gelen eşleşme splasyon oluşumunun ilk basamağıdır. Diğer unsurların (U2, U3, U4, U5, ve U6) ile splays işlemi başlar. Dallanma noktasındaki Adenin (A) 2 -OH splays noktasına saldırarak RNA zincirinin kopmasına neden olur.

42