BİYOMEDİKAL UYGULAMALAR İÇİN BİYOUYUMLU İLETKEN FİLM ELDESİ

Transkript

1 BİYOMEDİKAL UYGULAMALAR İÇİN BİYOUYUMLU İLETKEN FİLM ELDESİ Büşra Selmi, Esra Kelel, Tuğba Yıldırım, Neslihan Alemdar* Marmara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği, İstanbul, Türkiye ÖZET: İletken polimerler, biyouyumlu olmaları, biyolojik moleküllerin kontrollü salınımına olanak vermeleri ve özellikle kalp doku mühendisliğinde önemli bir avantaj olarak görülen sinyal iletimine katkıda bulunabilmeleri sebebiyle biyosensörler, yapay doku mühendisliği, yapı iskeleleri ve ilaç salınımı alanlarında son zamanlarda oldukça dikkat çekmektedirler. Yapılan bu çalışmada; jelatin (Jel), sodyum aljinat (SA) ve hayaluronik asit (HA) biyopolimerleri kullanılarak oluşturulan polimerik kafes içerisine hacimce %0 dan %50`ye kadar değişen oranlarda iletkenlik özelliğine sahip indirgenmiş grafen oksit inkorpore edilerek ve çözücü uzaklaştırma yöntemi uygulanılarak iletken film eldesi sağlanmıştır. Elde edilen hidrofilik yapıdaki iletken filmlerin yapısal karakterizasyonları FT-IR analiziyle gerçekleştirilmiştir. Filmlerin su alma kapasiteleri yapılan şişme testleriyle belirlenmiştir. İletkenlik ölçümleri ise 4-prob yöntemi kullanılarak yapılmıştır. İletkenlik ölçüm sonuçlarına göre, indirgenmiş grafen oksitin polimerik ağ içerisindeki oranı arttıkça iletkenlik özelliklerinin iyileştiği gözlemlenmiştir. Filmlerin sitotoksisite testlerinde ise WST-1 analizi kullanılmıştır. Elde edilen tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, biyouyumlu ve iletkenlik özelliğine sahip polimerik filmlerin üretilebildiği görülmüştür. Bu çalışma ile hazırlanan filmlerin, gelecek çalışmalarda özellikle kalp doku mühendisliğnde kullanılabileceği öngörülmektedir. Anahtar kelimeler: İletken biyopolimer, reduced grafen oksit, kalp doku mühendisliği 1. GİRİŞ Polimerler, yapı bakımından monomerlerin kimyasal bağlarla birbirine bağlanarak oluşturdukları yüksek mol kütleli makromoleküllerdir. Hafif olmaları ve güçlü mekanik özelliklerine iletkenlik özelliğinin de eklenebilmesi ile birçok alanda olduğu gibi biyomedikal uygulamalarda da ilgi odağı olmuşlardır. İletken biyopolimerler, metaller ve inorganik yarı iletkenler gibi elektriksel ve optik özellikler göstermelerinin yanı sıra kolay sentezlenebilme ve işlenebilme özelliğine de sahiptirler. İletken polimer eldesi için kullanılan birçok yöntem içinde en etkin yöntemlerden birisi, doğal polimerlerin oluşturduğu ağ yapısına iletken özelliği gösteren inorganik malzemelerin ilave edilmesidir [1]. Doğal biyouyumlu polimerlere iletkenlik özelliğinin kazandırılması sonucu elde edilen polimerik kompozitler, kontrollü ilaç salınımı, biyosensörler, yapay doku mühendisliği, yapı iskeleleri gibi pek çok işlev ile tıp, biyokimya, nanoteknoloji, medikal mühendisliği alanlarında oldukça dikkat çekmektedir. Özellikle son yıllarda kalp hastalıkları prevelansının artması, kardiyak doku mühendisliğine olan ilginin artmasına neden olmuştur. Miyokard infraktüsü (kalp krizi) sonrası meydana gelen hasarlı dokularda, elektriksel sinyal iletiminin bir ara madde ile tekrar devam etmesi sağlandığında senkronize kas kasılmalarının sağlanabilir olacağı fikri, bilim dünyasını biyouyumlu ve iletken polimerik malzeme arayışına yöneltmiştir [2].

2 Jelatin, kolajenin termal denatürasyonu sonucu elde edilen, iyi mekanik özelliklere sahip, doğal biyouyumlu bir polimerdir. Lif yapısına sahip olmasından dolayı, nanolifleri vücutta dokular arası sıvıyı taklit edebilir. Hyaluronik asit, normal dermis dokuyu oluşturan temel bir ara maddedir. Viskoelastik yapısı ve su tutma kapasitesi sebebiyle dokuya yapısal destek sağlar. Sodyum aljinat da; su yosunlarından elde edilen biyouyumlu, jelleştirici bir polimerdir [3]. Yapılan bu çalışmada; yukarıda özellikleri belirtilen jelatin (Jel), sodyum aljinat (SA) ve hyaluronik asit (HA) polimerleri kullanılarak oluşturulan polimerik kafes içerisine iletkenlik özelliğine sahip ve biyouyumlu olan indirgenmiş grafen oksit ilave edilerek ve çözücü uzaklaştırma yöntemi uygulanılarak iletkenlik özelliğine sahip iletken film üretilmesi, optimizasyonu ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. 2. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 2.1. Materyaller Çalışmada kullanılan Jel, HA, SA, grafit, EDC kimyasalları Sigma Aldrich firmasından, etanol ve metanol ise Merck firmasından satın alınmıştır RGO nun Hazırlanması Hummer s Metodu ile grafitten grafen oksit elde edildi. Bunun için; çeker ocakta buz banyosunda yapılan karıştırma işlemi ile H2SO4 içerisine grafit eklendi ve çözünme sağlandı, daha sonra KMnO4 ilave edilerek karıştırıldı. Isıl işlemin ardından, H2O2 ilavesi de yapılıp 24 saat boyunca yavaşça karıştıktan sonra elde edilen iki fazlı çözeltiden grafenin bulunduğu yoğun faz, santrifüj tüplerine alınarak 6500 rpm de 10 dk santrifüj edildi. Çökelek HCl ile yıkanarak tekrar santrifüj edildi, 65 o C deki etüvde 48 saat bekletilerek kurutuldu, sonra havanda dövülerek toz hale getirildi. Elde edilen GO, üç boyunlu balonda saf su ile ultra sonic banyoda karıştırıldıktan sonra içerisine hidrazin (%35 lik) ilave edildi. 100 o C sabit sıcaklıkta 24 saat mantolu ısıtıcıda karıştırıldı. Etil alkol ve saf su ile yıkama, 6 saat vakum etüvünde kurutma ve süzme işlemlerinin ardından rgo elde edilmiştir Jel / HA / SA - RGO Filmlerinin Hazırlanması Jel, HA ve SA saf su ile karıştırılıp çözeltileri (%0.5) hazırlandıktan sonra 45:10:45 oranında bir araya getirildi, içerisine çapraz bağlanma ajanı olarak EDC de ilave edilerek 1 saat boyunca 37 o C de karıştırıldı. Diğer yandan, RGO nun etanol içerisinde %1 lik çözeltisi hazırlandı ve ultrasonik banyoda 1 saat boyunca RGO`nun etanol içerisinde homojen dağılımı sağlandı. Hacimce farklı oranlarda RGO (%0, %10, %20, %30, %50) içeren polimer çözeltileri hazırlanarak petri kaplarına döküldü. Bu işlemi takiben, 37 C deki etüvde 72 saat boyunca bekletilerek çözücüsü uçuruldu ve ince filmler elde edildi. Filmlere 24 saat sonra %0.5 lik EDC çözeltisi uygulanarak ikinci çapraz bağlama işlemi uygulandı Filmlerin Karakterizasyonu Hacimce %0 (saf) ve %30 rgo içeren numunelerinin FT-IR spektrum değerleri 650 ve 4000 cm -1 aralığında Perkin Elmer Spectrum One FT-IR cihazı kullanılarak incelendi İletkenlik Ölçümleri Hacimce %0, %10, %20, %30 ve %50 RGO içeren filmlerin iletkenlik ölçümleri 4-Prob yöntemi kullanılarak yapıldı Şişme Testi Filmlerin su absoplama kapasitelerinin belirlenmesi için farklı oranlarda rgo içeren filmlerden aynı miktarda örnekler kesilerek kuru tartımları alındı. Alınan örnekler, falkon tüplerde 10 ml saf su içerisine konuldu. Orbital karışıtırıcıda 24 saat boyunca 100 rpm de ve 37 C de bekletildi. 24 saat sonunda yaş tartımlar

3 alındı. Alınan veriler ve aşağıdaki formül kullanılarak şişme oranları hesaplandı. SR = W s W 0 W Mekanik Dayanıklılık Testi %30 RGO içeren ve RGO içermeyen film numunelerinin mekanik özellikleri bir mekanik test cihazı (Zwick-Roell) kullanılarak test edildi. 1cm 8cm boyutlarında şeritler halinde kesilen kuru film numuneleri 2 mm/dakika hızla çekilerek, dayanıklılık testleri yapıldı Filmlerin Karakterizasyonu Hacimce %0 ve %30 RGO içeren polimer filmlerin FT-IR sonuçları incelendiğinde; 1027 cm -1 dalgalanması; Jel, HA ve SA polimerik ağ yapısında görülen kompozit hidrojel spektrumudur. Bu pik oluşumu, polimer kompoziti varlığını karakterize etmektedir cm -1 de oluşan piklerin şiddetindeki azalma, polimer filmi yapısındaki NH grupları ile rgo yapısındaki OH grupları arasındaki bağın gerilme titreşiminin azalmasından kaynaklanmaktadır cm -1 de görülen pik ise polimer filmi yapısında bulunan karbonil (C=O) grubun gerilme titreşimini ve buna ek olarak 1538 cm -1 de görülen pik C-N gerilme titreşimini, 1406 cm -1 de görülen dalgalanma polimer kompozitindeki, HA polimeri yapısında bulunan karboksil gruplarınının (COO - ) oluşturduğu gerilme titreşimini karakterize etmektedir. Polimerik film yapısına rgo inkorpore edilmesiyle 1650 cm -1 ile 1580 cm -1 arasında görülen dalgalanmanın şiddetinde azalma olmuştur. Bu azalmanın sebebi, polimerik yapı içerisindeki karboksil (C=O) gruplarındaki sp 2 bağlarının kırılması ile rgo yapısında bulunan hidroksil (O-H) grupların polimerik ağ yapısına bağlanmasından kaynaklanmıştır Termogravimetrik Analiz Film numunelerinin TG analizleri, Seiko EXSTAR 6000-TGA/DTA 6300 cihazı kullanılarak 10 o C /dak ısıtma hızı ile 30 ile 900 o C sıcaklık aralığında yapıldı Toksisite Testi Sitotoksisite testlerinde, WST-1 analizi kullanıldı ve film malzemesi ile temas sonrasında hücre sayıları ve büyümeleri referans (kontrol örneği) ile karşılaştırıldı. 3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Şekil 1. FT-IR grafikleri 3.2. Elektriksel İletkenlik Filmlerin iletkenlik ölçüm sonuçları incelendiğinde saf polimerik filmin iletkenlik özelliği göstermediği, %10, %20, %30 rgo içeren filmlerin iletkenlik değerlerinin ise rgo yüzdesi ile arttığı görülmektedir. Bu artış, grafen tabakalarının artması dolayısıyla spesifik yüzey alanının artması ve polimer matriksi içerisinde homojen bir dağılım göstermesi ile açıklanabilir. En iyi iletkenlik değeri %30 rgo içeren filmden elde edilmiştir (Şekil 2). Şekil 2. %RGO a karşı iletkenlik değerleri

4 Diğer yandan, %50 oranında rgo içeren filmin iletkenliğinde düşüş gözlenmiştir. Sebebi film oluşumu esnasında meydana gelen rgo aglomerasyonları sonucunda homojen dağılımın kaybolmasıdır. Tablo 1. İletkenlik sonuçları RGO (%) İletkenlik (S/cm) ,724*E ,213*E ,253*E ,486*E Termogravimetrik Analiz Her iki filme ait termogramda üç ağırlık kaybı basamağının oluştuğu gözlenmektedir (Şekil.3, Şekil.4). Birinci basamak; filme tutunan suyun buharlaşması, ikinci basamak; HA daki C-H ve C-O-C glikozit bağlarının kopması, üçüncü basamak ise; jelatindeki peptid bağlarının kırılması sonucu gerçekleşmiştir. RGO içermeyen filmin ikinci basamaktaki bozunması 230 o C ile 450 o C arasında, %30 RGO içeren filmin ise 235 o C ile 470 o C arasında gerçekleşmiştir. Oluşan bu 20 o C lik kayma, RGO nun filme termal stabilite kazandırdığını göstermektedir. RGO`nun jelatin molekül zircirlerinin hareketliliğini inhibe etmesi ve jelatin ile RGO arasında etkileşim olması bu dayanıklılığı sağlamaktadır. Şekil 4. %30 RGO filminin termogramı 3.4. Filmlerin Mekanik Dayanımları RGO ilaveli filmde, çekme ve kopma uzaması miktarının saf filme nazaran yüksek olduğu ve %10 rgo içeren filmin elastik modülü değerinin (1258 GPa) saf filme göre (948 GPa) %48 fazla olduğu görülmektedir (Şekil 5). RGO da bulunan karboksil, hidroksil, epoksil, keton gibi fonksiyonel gruplar, filmde bulunan diğer fonksiyonel gruplarla etkileşimde olduğundan saf filme göre daha kuvvetli bir ağ yapısı sağlamaktadır. rgo tabaka-larının film yüzeyine düzenli bir şekilde sıralanması da katkı sağlamıştır. Şekil 4.%30 RGO içeren film termogramı Şekil 3. RGO içermeyen film termogramı Şekil 5. Mekanik dayanım test sonuçları

5 3.5. Şişme Özellikleri Filmlerin su absorplama eğrisinde görüldüğü (Şekil 5) üzere saf numune en fazla, %50 oranında rgo içeren film ise en az değerde şişme kapasitesine sahiptir. Filmlerdeki rgo artışına bağlı olarak su absorplama kabiliyeti azalmaktadır. Şişme yüzdelerindeki bu azalma, RGO nun polimerik yapı üzerindeki fiziksel çapraz bağlanma faaliyeti ile ilişkilendirilebilir. Bu durum Jelatin/HA/SA-rGO filmlerinin su içinde Jelatin/HA/SA filminden daha kararlı yapıda durduğunu göstermektedir. Bu azalmaya ayrıca, ağ yapı içerisindeki suyun girebileceği alanları rgo nun kaplaması da sebep olmuştur. Şekil 6. Şişme testi sonuçları 3.6 Toksisite testi RGO-bazlı kompozit filmlerin sitotoksisitesini incelemek için yapılmış olan hücre çoğalması ve canlılığı WST-1 testlerinin sonuçları Şekil 6'da görülmektedir. Grafiklerden de anlaşıldığı gibi, RGObazlı kompozit filmin fibroblastların çoğalmasına herhangi bir toksik etkisinin olmadığı ve kontrol grubu ile arasında hücrelerin canlılığı açısından önemli bir farkın bulunmadığı belirlenmiştir. 4. SONUÇ Şekil 7. Sitotoksisite test sonuçları 4. SONUÇ Bu çalışmada jelatin, hiyaluronik asit, sodyum aljinat biyopolimerleri kullanılarak elde edilen ağ yapı içerisine iletken özelliğe sahip rgo hapsedilerek iletken ince film elde edilmiştir. En iyi iletkenlik, %30 rgo içeren filmde 4, S/cm olarak belirlenmiştir. Yapılan literatür araştırmalarına göre bu iletkenliğin, miyokard infraktüsünden sonra kalp dokusundaki hasarlı alanda elektriksel sinyal iletimi için gayet yeterli olacağı ve normal kas kontraksiyonu devam ettirebileceği tespit edilmiştir. Yapılan sitotoksisite testlerine göre rgo-bazlı filmlerin biyouyumlu olduğu, meka-nik dirence dayanıklı, yeterli su alma kapasitesine sahip olduğu da belirlenmiştir. Sonuç olarak üretilen jelatin bazlı RGO katkılı bu iletken filmlerin kardiyak doku mühendisliği alanında kullanılabilecek bir materyal olması öngörülmektedir. Teşekkür: Bu çalışmanın gerçekleşmesinde finansal kaynak sağlayan Marmara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi Dekanlığı`na ve kullanılan cihazlara olanak sağlayan Kimya Mühendisliği Bölümü`ne teşekkür ederiz. KAYNAKLAR [1] Minih et al, A Conductive Polymer Hydrogel Supports Cell Electrical Signaling and Improves Cardiac Function After Implantation into Myocardial Infract, American Heart Association Journals, (132), Lian, M. and Fan, J. and Zhang, Z., [2] Gelatin-assisted fabrication of graphene-based nacre with high strength, toughness, and electrical conductivity, Science Direct Carbon, (89), Wang, W., Wang, Z. and Liu, Y., [3]Preparation of Reduced Graphene Oxide/Gelatin Composite Films With Reinforced Mechanical Strength, Materials Research Bulletin, (47),

6