LÖSEMİDE MİNİMAL REZİDÜEL HASTALIK

Transkript

1 LÖSEMİDE MİNİMAL REZİDÜEL HASTALIK Türkan Patıroğlu Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Kayseri Son yıllarda çocuk ve erişkin lösemi tedavisinde hayli ilerleme olmasına karşın halen relapslara rastlanmaktadır. Lösemiye ait klinik bulgu olmadığı halde tedaviden kaçan ve relapslara neden olan hücrelerin varlığı minimal rezidüel hastalık (MRD) olarak tanımlanır. Tedavi sırasında rezidüel lösemi olup olmadığı kemik iliği yaymalarının morfolojik incelenmesi gibi geleneksel yöntemlerle anlaşılamaz. Çünkü, immatür B hücreleri ve aktive matür lenfositler gibi normal kemik iliği hücreleri lenfoblastik hücrelere çok benzer. Ayrıca, tek bir bölgeden yapılan kemik iliği aspirasyon yaymaları total kemik iliğinin çok küçük bir kısmını gösterir. Böylece bir bölge normal hücrelere sahip iken diğer taraf lösemiyi gösterebilir. Bu nedenle akut lenfoblastik lösemi (ALL) li hastaların remisyon durumu hekimlerin şüpheye düşmesine yol açar. Bu belirsizlik yoğun tedavi verilmesine neden olur ve bu durumda da ilaç toksisitesi sorunu doğar. Ya da yetersiz tedaviyi takiben relaps riski artar. Son yıllarda morfolojik analiz ile remisyonda kabul edilen pek çok hastanın ileri yöntemlerle MRD ye sahip olduğu, MRD düzeyi ile tedaviye cevap arasında kuvvetli korelasyon olduğu gösterilmiştir. Yüksek riskli ve düşük riskli hastaların belirlenmesi ve tedavi yoğunluğunun ayarlanabilmesi için MRD tayini tavsiye edilmektedir. MRD Yöntemleri MRD, akım sitometresi (AS) kullanılarak immünofenotipleme, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile moleküler olarak kromozomal hataların gösterilmesi veya klona özgü immünoglobulin (Ig) ve TCR gen düzenlenmesinin gösterilmesi gibi yöntemlerle çalışılabilir (Tablo 1). Bu yöntemler aşağıda belirtilen özelliklere sahip olmalıdır: 1. Hassasiyeti en az 10-3, tercihen 10-4 olmalıdır. 2. İlgili tedavi prokolündeki hastaların çoğunda uygulanabilmelidir. 3. Tekrarlanabilir olmalıdır. 4. İnternal kalite kontrolü ve laboratuarlar arası standardizasyonu mümkün olmalıdır. Lösemide hastalığa özgü klonal bir gen düzenlenmesi vardır ve hastalığın izlemi için belirleyici olarak kullanılabilir. ALL de MRD tanımı için ya anormal kromozomal rekombinasyon sonucu gelişen özgün füzyon proteinlerinin saptanması veya hastalığa özgü olarak ortaya çıkan Ig ya da TCR genlerinin yeniden düzenlenmelerinin saptanması gerekir. İndüksiyon tedavisi sonrası TCR gen düzenlenmesi ile B-ALL de hastaların %90 ında, klona özgü immünoglobulin gen düzenlenmesi ile de T-ALL li hastaların %20 sinde MRD olduğu gözlenmiştir. Bu oran genellikle tedavinin ilk ayları içinde göreceli olarak azalır. İndüksiyon tedavisi sonrası klonal gen düzenlenmesinin 1/1000 oranından daha sık olması relaps açısından yüksek risk oluşturmaktadır. Düzenli aralıklarla MRD bakılması ile relapslar erken tanınabilir. Akut miyeloblastik lösemi (AML) de ise bu yöntem ile MRD belirlenmesi hastaların %10 undan daha azında mümkündür. Normal hücrelerden lösemik hücreleri ayırmak için kullanılan diğer bir yöntem ise kromozomal anormallikler ve füzyon genlerinin gösterilmesidir. ALL de t(9;22) (q34;q11), trizomi 8, t(4;11) (q21;q23), monozomi 7, t(1;19) (q23;p13) gibi sitogenetik aberasyonlar kötü prognoz göstergesi olarak kabul edilmektedir. Bu gruptaki hastalarda hastalıksız sağ kalım oranı diğerlerine göre daha azdır ve daha yoğun kemoterapiye gereksinim duyarlar. 76 XXXVII. Ulusal Hematoloji Kongresi

2 Tablo 1. MRD yöntemlerinin özellikleri Akım sitometresi PCR PCR immünofenotipleme Ig/TCR gen düzenlenmesi Füzyon genlerinin incelenmesi Uygulanabilirlik Pre B-ALL - İnfant - Çocuk - Erişkin T-ALL - Çocuk - Erişkin Bilinmiyor %70-95 %70-85 >%95 %95 (yaklaşık) %70-80 >%95 >%90 >%95 >%90 %60-65 (MLL) %340 %40-45 %10-20 %10 Hassasiyet Avantaj -hızlı (1-2 gün) -oldukça hastaya özgü -normal hücre hakkında bilgi -nispeten tekniği kolay - tek hücre analizi -hücrelerin canlılığı ölçülür -yüksek oranda DNA stabilitesi -tamamen hastaya özgü -hücre başına nispeten sabit DNA miktarı -sabit hedef -önceden hazırlık gerektirmez -nispeten basit -nispeten hızlı (2-3 gün) Dezavantaj -normal hücre zemini -immünofenotipik kaymalar -subklonlar -oldukça yüksek hassasiyet gerekir (yaklaşık 5x10 6 hücre) -lab. Yoğunluğu ve zaman kaybı (yavaş) - normal hücre zemini -oldukça karışık -sürekli düzenlenme nedeniyle hedef kaybı (subklon oluşması) -RNA değişkenliği -değişken ekspresyon düzeyleri -kontaminasyon riski yüksek (hastaya özgü değil,tümöre özgü) Kolay uygulanabilir ve daha ucuz olması nedeni ile klinik uygulamada MRD tanımı için immünofenotipleme yöntemi tercih edilmektedir. İmmünofenotipleme Lösemik hücrelerin normal hücrelerden ayırımı için gerekli yöntemlerden biri anormal durumdaki hücre belirleyicilerinin ekspresyonudur. Bu anormal hücreler en iyi çok renkli akım sitometreleri ile belirlenir. Bu yöntem iki faktörden etkilenir; birincisi lösemik hücreler ile normal hücreler arasındaki immünofenotipik farklılığın derecesi, diğeri ise çalışma örneğindeki hücre sayısıdır. Bu yöntem, ALL de normal hücre arasında bir lösemik hücreyi saptayabilecek immünofenotipik özelliklere sahiptir. AML de ise çoğu hastada normal hematopoetik hücreler ile lösemik hücrelerin fenotipi kısmen benzerlik göstermekle birlikte yine de farklılıklar saptanabilir (Tablo 2). Bu farklılığın gösterilebilmesi için çok sayıda antikordan oluşan paneller tavsiye edilir. Normal durumlarda kemik iliğinde bulunan B hücre öncülleri genellikle, remisyon indüksiyonunun ilk 2-3 haftasında kemoterapiye aşırı hassasiyetlerinden dolayı yoktur. Böyle hastalarda tedavi cevabının anlaşılması için immatür B hücre belirleyicilerinden yararlanılır. Bu belirleyiciler normal ve lösemik hücrelerin ayırımında kolaylık sağlar. Lösemik olay, hücre belirleyicilerinin asenkronize veya anormal ekspresyonu ile sonuçlanır. B-ALL de lösemi immünofenotipi %95 oranında belirlenebilir. Tanıda lösemik blastların immünofenotiplemesi yapılır ve daha sonra belli zamanlarda lösemik hücre olup olmadığı yine aynı belirleyiciler ile araştırılır. Temel olarak lösemik hücrenin immünofenotipi ile ilgili önceki bilgiler olmadan da MRD çalışması mümkündür ama bu durumda negatif MRD sonuçlarını yorumlamak zor olabilir. Akım sitometresinin hassasiyeti % 0.1 kadardır. Doğru sonuç için yeterli sayıda mononükleer hücre (100000/mm 3 ) olması gerekir. Bu kadar hücrenin elde edilebilmesi için de ya 2 ml kemik iliği veya 5-10 ml periferik kan örneği incelenmelidir. Tanıda eritrositleri yok edilmiş tam kan veya kemik iliği örnekleri analiz edilir. İkinci adımda ise çok renkli akım sitometresi ile MRD araştırması yapılır. B-ALL için CD19, 79a ve/veya CD22 den Ekim 2011, Ankara 77

3 Tablo 2. Çocukluk çağı lösemilerinde MRD takibi için yöntemler Yöntem ALL AML % Hassasiyet % Hassasiyet İmmünofenotipleme 98 < Ig ve TCR proteinlerini kodlayan genlerin yeniden yapılanması <10 Füzyon gen transkripsiyonu < < en az ikisinin eksprese edilmesi gerekir. MRD çalışması temel olarak B-ALL li hastalarda CD 19, T-ALL li hastalarda ise CD 7 eksprese eden hücreler üzerinden yapılır. Debrisi dışlamak amacı ile syto 16 kullanılmalıdır. NB Jmili ve ark. MRD ile ilgili çalışmalarında dört temel aberan fenotip tanımlamışlardır. 1. Cross-linage (çapraz kökenli) Antijen (Ag) ekspresyonu (miyeloid/lenfoid) 2. Asenkronize Ag ekspresyonu 3. Antijenlerin aşırı ekspresyonu 4. Anormal ışık saçılımı Bu fenotipler ALL li hastaların %99 unda normal hücre arasındaki 1 lösemik hücreyi tanımlayabilir. İlgili hücreler nadir olduğu zaman MRD yi tanımlamak zordur. Böyle bir durumda hücre değerlendirilmeye alınmalıdır. Akut lenfoblastik lösemi ve MRD Akut lenfoblastik lösemi (ALL), 2-5 yaşlar arasındaki çocuklar ve 50 yaş üzerindeki erişkinlerde en sık görülen lösemi tipidir. Çocuklarda şifa ile sonlanma ihtimali yüksektir (> %85). Buna rağmen hastalığın tekrarlaması ve lösemiden ölümler de görülebilir. ALL de indüksiyon tedavisinin amacı tüm lösemik hücrelerin yok edilmesi ve tam remisyon sağlanarak normal hematopoezin başlatılabilmesidir. Rejenere kemik iliğinde blast özelliğindeki hücrelerin %5 den az olması, ekstramedüller löseminin olmaması, periferik kanda nötrofil sayısının 1500/mm -3 ve platelet sayısının /mm 3 nin üzerinde olması durumu remisyon olarak kabul edilir. On yıl önce prognostik sınıflama; tanıdaki beyaz küre sayısı, T-ALL fenotipi, spesifik füzyon gen aberasyonu gibi klinik, immünofenotipik ve moleküler genetik özelliklere göre yapılmakta ve bu hastalarda tedaviye cevap klinik ve laboratuvar bulgularına göre değerlendirilmekte idi. Oysa günümüzde morfolojik değerlendirme veya konvansiyonel sitogenetik yöntemlerle rezidüel hastalığın gösterilmesinin mümkün olmadığı ve prognoz hakkında tahmin yapılamayacağı belirtilmektedir. Kemoterapi alan veya transplantasyon ile iyileşenlerde kemik iliğinde lenfoid hücrelerin %10 u hematogon (lenfoid öncülü) dur. Kemik iliğinde hematogonların sayısı farklılık gösterebilir. Sitopeni ya da neoplazili hastalarda olduğu gibi bazı klinik durumlarda ve iyileşen kemik iliğinde hematogonlar daha fazla sayıda olabilir (%5-50 üzerinde olabilir). Çocuklarda da sayının daha fazla olduğu bilinmektedir. Blastları hematogonlardan ayırmak güçlük yaratmaktadır. Hematogonlar CD19 ve CD45 i yoğun eksprese eden hücrelerdir. ALL li hastalarda miyeloid antijenler aberan olarak kabul edilir. Bir antijenin az veya çok ekspresyonu ise asenkronize olduğunun göstergesidir. Hematogonlarda aberan veya aşırı antijen ekspresyonu olmaz. St. Jude tedavisi alan ALL li hastalarda 46. günde MRD %1 veya üzerinde, idame tedavisi sırasında da %0.1 veya üzerinde ise allojenik kemik iliği transplantasyonu (KİT) yapılması tavsiye edilmektedir. BFM grubu ise 33. ve 78. günlerdeki MRD düzeyini yoğun tedavi için kriter olarak kabul etmektedir. MRD saptanmayan hastalarda ise yoğun kemoterapinin gereksiz olduğu belirtilmektedir. Relaps riski yüksek hastalarda öncelikli olarak KİT tavsiye edilmektedir. Borowitz ve ark. lösemik B hücre öncüllerinin normal B hücre öncüllerinden ayrılabilmesi amacı ile MRD takibinde CD49f (integrin alfa- 6) nin aşırı ekspresyonunun da yararlı olduğunu vurgulamaktadır. Akut miyeloblastik lösemi ve MRD AML de özgün füzyon genlerinin PCR ile izlenmesi diğer yöntemlere göre ön plana çıkmaktadır. 78 XXXVII. Ulusal Hematoloji Kongresi

4 Şekil 1. Lösemide MRD yönetimi İndüksiyon tedavisinden sonra MRD yokluğu, düşük riski gösterir. MRD pozitifliği blast sayısı, immünofenotip, kromozom aberasyonu, prednison cevabı gibi klasik diğer klinik risk faktörlerinden bağımsızdır ve daha güçlü bir prognostik faktördür. MRD negatif olan hastaların sadet(8;21), t(15;17), inversiyon 16 gibi aberasyonlar ve FLT3 gen mutasyonu ve duplikasyonların takibi bu amaç için kullanılabilir. Ayrıca AML li hastaların yaklaşık olarak %90 ında eksprese edilen Wilm s tümör (WT1) geni de AML de potansiyel bir belirleyici olarak kabul edilir. WT1 geni CD34 (+) normal kemik iliği hücrelerinde de eksprese edilmektdir. Remisyon sırasında WT1 geninin aşırı ekspresyonu MRD varlığını gösterir. D Campana ve ark. yeni tanı alan AML li 46 çocukta indüksiyon tedavisinden sonra morfolojik olarak remisyonda oldukları dönemde akım sitometresi ile MRD araştırmışlar ve %33 ünde oranın %01 in üzerinde olduğunu bulmuşlardır. Hastaların takibinde MRD pozitif olanlarda ölüm oranın MRD negatif olanlara göre 3.8 kat daha fazla olduğu gözlenmiştir. AML- BFM 98 çalışmasında da benzer bulgular saptanmıştır. MRD pozitif ise hastalıksız sağ kalım oranı daha düşük ve relaps riski iki kattan daha yüksektir. MRD tayini ile KİT için zamanın ve hastanın belirlenmesi de mümkündür. İndüksiyon tedavisi sonunda MRD %1 ve üzerinde ise KİT yapılması, MRD %0.1 ve üzerinde ise gentuzumab ozogamicin verilmesi, ancak MRD pozitifliğinin ısrar etmesi durumunda KİT yapılması tavsiye edilmektedir. KİT ve MRD KİT yapılan hastalarda transplant öncesi MRD pozitifliği genellikle relaps riskini gösterir. Özellikle ALL li hastalarda KİT öncesi MRD düzeyi ile KİT sonrası klinik durum arasındaki güçlü korelasyonu gösteren çalışmalar yapılmaktadır. Bazen MRD sonuçları non-miyeloablatif allojenik KİT sonrası hastaların takibinde kolaylık sağlayabilir. MRD sonuçlarına göre KİT sonrası takip kronik miyeloid lösemide de bildirilmektedir. Lösemili çocuklarda MRD nin önemi Ekim 2011, Ankara 79

5 ce %2-10 unda relaps olduğu gözlenirken MRD pozitifliğinde % oranında relaps olduğu gözlenmiştir. AIEOP grubu BFM-2000 tedavi protokolü uygulanan 815 hastada 15. günde MRD çalışmış ve hastaların %42 sinde MRD %0.1 in altında, %47 sinde %0.1-%10, %11 inde de %10 un üzerinde pozitif bulmuşlardır. Hastaların takibinde sıra ile %7.5, %17.5 ve %47.2 relaps olduğu gözlenmiştir. St.Jude total XIII tedavisi alan hastaların %46 sında 19. günde MRD nin %0.01 in altında olduğu ve beş yıllık relaps oranının bu hastalarda %6 olduğu saptanmıştır. BFM grubunda ise 33. günde hastaların %42 sinde MRD nin %0.01 in altında olduğu ve bunlarda hastalıksız sağkalım oranının %92.3 olduğu bulunmuştur. Araştırmacılar remisyon indüksiyonu sonunda MRD pozitifliğinin (>%1) prognozu kötü yönde etkilediğini belirtmektedirler. St.Jude Total XV çalışmasında da MRD pozitifliği kötü prognostik gösterge olarak kabul edilmektedir. Allojenik kök hücre transplantasyonu öncesi MRD pozitifliği posttransplant relaps riski ile birliktedir. Lösemili erişkinlerde MRD nin önemi GMALL araştırıcıları B-ALL li 196 hastada; 1. MLL-AFF-1 veya BCR-ABL 1 füzyon genlerinin yokluğu 2. Beyaz küre (BK) sayısının 30000/mm 3 in altında olması 3. T-ALL olduğu halde BK sayısının / mm 3 in altında olması 4. Yaşın yıl arasında olması 5. İlk indüksiyon tedavisinden sonra tam remisyon sağlanması durumunu standart risk olarak kabul etmişlerdir. Bu çalışmada günler arasında yapılan MRD tayininde oranın %0.01 in altında olduğu %10 hasta, düşük riskli olarak kabul edilmiş ve 3 yıllık relaps oranının %0 olduğu gözlenmiştir. Hastaların %23 ü ise yüksek riskli bulunmuş ve bu hastalarda MRD 16. haftaya kadar %0.01 in üzerinde seyretmiş olup takipte bu hastaların %94 ünde relaps gözlenmiştir. Geriye kalan %47 lik grubun ise orta derecede riske sahip olduğu belirtilmiştir. Bu çalışmaların sonucunda MRD analizinin prognozu belirleyen diğer kriterlerden bağımsız bir risk faktörü olduğu kabul edilmiştir. Sonuç Günümüzde tek veya daha çok MRD testlerini kullanarak risk grupları belirlenmeye çalışılmaktadır. Çocuk onkolji grubu (COG), çocuklar için 29. günde MRD bakılmasını tavsiye etmekte ve %0.1- %1 değerini cut-off olarak almaktadır. St. Jude protokolünde ise 15. ve 42. günlerde MRD bakılması tavsiye edilmekte ve 15. günde MRD %1 in üzerinde ise indüksiyon tedavisinin yoğunlaştırılması, %0.1 in altında ise daha az yoğun reindüksiyon tedavisi tavsiye edilmektedir. MRD 42.günde %0.1 in üzerinde ise hasta yüksek riskli kabul edilmekte ve ilk remisyonda allojenik kök hücre transplantasyonu tavsiye edilmektedir. Bu durumda kemik iliği transplantasyonu için en önemli kriterin MRD nin varlığı olduğu kabul edilmektedir. Kaynaklar 1. Campana D. Status of minimal residual disease testing in childhood haematological malignancies. Bjh 2008; 143: DiGiuseppe JA, Fuller SG, Borowitz MJ. Overexpression of CD49f in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia: Potential usefulness in minimal residual disease detection. Cytometry B Clin Cytom 2009;76: Jolkowska J, Derwich K, Dawidowska M. Methods of minimal residual disease (MRD) detection in childhood haematological malignancies. J Appl Genet 2007; 48: Liu Yin JA, Grimwade D. Minimal residual disease evaluation in acute myeloid leukaemia. The Lancet 2002; 360: Nagler A, Condiotti R, Rabinowitz R et al. Detection of minimal residual disease (MRD) after bone marrow transplantation (BMT) by multi-parameter flow cytometry(mpfc). Med Oncol 1999; 16: Van Dongen JM, van der Velden VHJ. Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. SIOP : Krampera m, Vitale A, Vincenzi C et al. Outcome prediction by immunophenotypic minimal residual disease detection in adult T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Bjh 2003; 120: Vidriales MB, Perez JJ, Lopez Berges MC et al. Minimal residual disease in adolescent (older than 14 years) and adult acute lymphoblastic leukaemias:early immunophenotypic evaluation has high clinical value. Blood 2003; 101: Borowitz MJ, Pullen DJ, Winick N et al. Comparison of diagnostic and relaps flow cytometry phenotypes in childhood acute lymphoblastic leukaemia: implications for residual disease detection: a report from the childrens oncolgy group. Cytometry Part B 2005; 68B: XXXVII. Ulusal Hematoloji Kongresi

6 10. Ruiz-Argüelles GJ, Fernandez-Lara D, Gomez RE et al. Minimal residual disease testing in acute leukaemia by flow cytometry immunophenotyping: prognostic significance. Lab Hematol 2007;10 : Björkland E, Mazur J, Söderhall S, Mac-Donald AP. Flow cytometric follow up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia 2003; 17: Szczepansky T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia 2007; 21: Dworzak MN, Fritsch G, Grümayer ERP, Mann G, Gadner H. Detection of residual disease in pediatric acute lymphoblastic leukaemia by comparative phenotype mapping method and significance. Leuk Lymphoma 2000; 38: Sayitoğlu M, Ar C, Hatırnaz Ö ve ark.. Minimal residual disease (MRD) detection with translocations and T-cell receptor and immunoglobulin gene rearrangements in adult acute lymphoblastic leukaemia patients: a pilot study. Turk J Hematol 2008;25: Ozan Ü, Özkalemkaş F, Ali R ve ark. Akut lösemilerde minimal residüel hastalığın akım sitometrisi yöntemiyle araştırılması ve relaps ile korelasyonu. Uludağ Tıp Dregisi 2004; 30: Jmili NM, Jacob MC, Yacoub S et al. Flow cytometric evaluation of minimal residual disease in in acute lymphoblastic leukaemia type B. The poen Leuk J 2010; 3: Campana D. Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. Atlas of genetics and cytogenetics in oncolgy and haematology 2009: Campana D. Minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010;2010: Meleshko AN, Sava NN, Fedasenka UU et al. Prognostic value of MRD-dynamics in childhood acute lymphoblastic leukaemia treated according to the protocols. Leuk res 2011; (baskıda) 20. İzraeli S, Waldman D. Minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukaemia: current status and challenges. Acta Haematol 2004:112: Hu SY, Gu WY, Chen ZX et al. The significance of detection WT1 expression in childhood leukaemias. Pediatr Hematol oncol 2010; 27: Ekim 2011, Ankara 81