Kullanım Talimatları. TITAN III Hemoglobin Elektroforez REF. 3022

Transkript

1 Kullanım Talimatları TITAN III Hemoglobin Elektroforez REF. 3022

2 KULLANIM AMACI Alkali tamponunda selüloz asetat kullanarak Helena Hemoglobin Elektroforez Prosedürü anormal haemoglobinlerin kalitatif ve kantitatif tayin edilmesi içindir. Baş fonksiyonlara sahip bir protein grubu olan hemoglobinler (Hb) ters yönde karaciğerde karbon dioksit ve dokudan oksijen taşımaktadır. Hemoglobinler peptit zincirlerleri oluşturur ve buna globin ve demir protoporfirin Heam denir. Dört polipeptid zincirlerin her biri spesifik bir amino asit sırası oluşturur, bunlar α, β, γ ve δ dır. İki diğer zincirler ξ ve Z embriyoda oluşur. Her normal hemoglobin molekülü alfa olmayan bir zincir çifti ve bir alfa zinciri çifti içerir. Normal yetişkin hemoglobininde (HBA), alfa olmayan zincirlere beta denir ve α2β2 olarak gösterilir. Fetal hemoglobinin alfa olmayan zincirine gama denir ve α2γ2 olarak gösterilir. Minör (% 3) bir hemoglobin fraksiyonuna HbA2 denir ve bu alfa ve delta zincirleri içerir ve α2δ2 olarak gösterilir. Globin zincir sentezi kalıtsal bir inhibisyonuna talasemi denir, alfa olmayan zincirler HbH (α4) veya Hb Bart's (β4) forma agrega olabilir. Globine ek olarak, her bir hemoglobin molekülü zincirlerinin katlanması ile oluşan paket içinde yer alan dört heme grubu (her zincir için) içerir. Normal yetişkin eritrositleri içinde majör hemoglobin HbA dir ve eritrosit içinde HbA2 ve Hbf küçük miktarlarda bulunmaktadır. Ayrıca, günümüzde 400'den fazla mutant hemoglobin bilinir özellikle diğer anormal hemoglobin ile kombinasyonunda veya homozigot durumunda bazı hemoglobinler ciddi klinik etkilere neden olabilir. Wintrobe1 de hemoglobin sentezinin anormallikleri üç grupta ayrılır. 1. Anormal protein molekülünün üretimi (orak hücreli anemi gibi). 2. Normal protein sentezinin miktarında azalma (thalassaemia gibi). 3. Gelişimsel anormallikler (hereditary persistence of foetal haemoglobin (HPFH) gibi). En sık rastlanan iki mutant hemoglobin HBS ve HBC dir. Hb Lepore, HBE, HbGPhiladelphia, HBD-Los Angeles ve HBO-Arap genellikle daha az görülebilir 2. Elektroforez genellikle hemoglobinopatiyi tanımlamak ve ayırmak için kullanılan en iyi yöntem olarak kabul edilir. Hemoglobin elektroforezin protokolu iki sistemin adım adım kullanımını içerir 3-8. İlk elektroforez alkali tampon ile yapılmaktadır. Selüloz asetat büyük destek ortamında kullanılır çünkü minimal ayırma zamanına sahip HbA, F, S ve C ve diğer birçok mutantın hızlı ayrılmasını sağlar. Ancak, birçok yapısal olarak farklı haemoglobinin elektroforetik benzerliği nedeniyle, değerlendirme elektrik yükü dışında bir özellikle ölçülen asit tampon elektroforez ile desteklenmelidir. Eğer HbA yanı sıra hem HbS hem de HBC ise kimliğinin tanımlanması basit bir prosedürdür. HbF ve diğer birçok mutantlar, sitrat agar elektroforezidir. Bu yöntem, bir alkalin elektroforetik tampon ve agaroz desteği ile hemoglobinin kompleks etkileşimine dayalıdır. Elektroforez prosedürü, diğer anormal hemoglobinlerin yanı sıra HbS, HbC ve Hbf varlığında tamamlayıcı ispatını sağlamak için hemolizatin dakikalık miktarını gerektiren basit bir prosedürdür. Tam kandan hazırlanan hemolizat ın küçük örnekleri Titan III Selüloz Asetat Plakada uygulanır. Numunede hemoglobinler (ph ) bir alkali tampon kullanarak elektroforezi ile ayrılmıştır ve Ponceau S Boya ile boyanır. Paternler, densitometer taramada taranır ve belirlenen her bir bant relatif yüzde verir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. Supre-Heme Buffer (Kat No. 5802) 1

3 Buffer Tris-EDTA ve borik asit içerir, ph ml saf su içinde bir flakon bufferı çözün. Buffer tüm materyaller çözündüğünde ve tamamen karıştığında kullanıma hazırıdır. 2. Hemolizat Reaktif (Kat. No. 5125) Reaktif koruyucu olarak eklenen 0.01% potasyum siyanür ile saf suda M EDTA içerir. Reaktif kullanıma hazırıdır. 3. Ponceau S Stain (Kat. No. 5526) Boya toz olarak verilir ve Ponceau S ve Sulphosalicylic Asit bir karışımıdır. 1 litre saf suda şişe içeriğini çözün ve tamamen çözünene kadar veya 30 dakika boyunca karıştırın. 4. Clear Aid (Kat. No. 5005) Reaktif polietilen glikol içerir. Clear Aid, ADIM-ADIM PROSEDÜRÜ ünde kullanılan temizleme solüsyonu hazırlamak için kullanılır. 30 parça glacial asetik asit, 70 parça absolut metanol ve 4 parça Clear Aid karıştırın. 5. Diğer Kit Bileşenleri Her bir kit kullanım talimatları içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. Supre-Heme Buffer (Kat No. 5802) Paketlenmiş buffer derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Buffer solüsyonu C de iki ay boyunca stabildir. Eğer bakteriyel kontaminasyon belirtisi görülüyorsa veya nem veya renk değişikliği görülüyorsa buffer da bozulma olabilir. 2. Hemolizat Reaktif (Kat. No. 5125) Reaktif derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. 3. Ponceau S Stain (Kat. No. 5526) Stain, derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Sıkıca kapağı kapatılmış şişeyi saklayın. Stain istenen şekilde saklandığı takdirde birden çok kez tekrar edilebilir. Bozulma aşırı buharlaşma sonucu veya büyük miktarda çökme sonucu görülebilir. 4. Clear Aid (Kat. No. 5005) Clear aid,15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Metanol buharlaşmasını önlemek için sıkıca kapatılmış bir kapta hazırlanan temizleme solüsyonu saklayın. Buharlaşma oluştuğunda plakalar ayrılabilir. Temizleme solüsyonunun aşırı kullanımından oluşan su kirliliği plakaların bulanık olmasına neden olacaktır. NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI EDTA ya da heparin içeren tüplerde tam kan toplanır. Numune hazırlama ADIM-ADIM PROSEDÜR de özetlenmiştir. Tam kan örnekleri 1 haftaya kadar C de saklanabilir. Alternatif Numune Hazırlama Prosedürü: Örneklerden denatüre edilmiş hemoglobinler uzaklaştırılırsa, gerekli görülmesi halinde aşağıdaki adımları uygulayın: a. 5 dakika boyunca 3500 RPM de kan numunesini santrifüj edin. b. Numuneden plazmayı alın ve üç kez 0.85% saline (v/v) de kırmızı kan hücrelerini yıkayın. Her bir yıkama sonrası, 3500 RPM de 10 dakika hücreleri santrifüj edin. 2

4 c. Yıkanmış kan hücrelerine 1 hacim saf su ve 1/4 hacim tolüen (yada karbon tetraklorür) ekleyin. d. Bir dakika yüksek hızda vorteksleyin. e RPM de 10 dakika numuneleri santrifüj edin. f.eğer tolüen kullanılırsa, tüpün üst tabakası hücre stroması içerir ve bir sonraki adıma geçmeden önce kapiler pipet ile alın. Temiz orta tabaka istenen örneği içerir. Eğer karbon tetra klorür kullanılırsa, tüm kırmızı hücre atık materyali santrifüj sonrası tüpün altında kalacaktır. g. Whatman #1 filter kağıdının iki katmanı üzerinden temiz kırmızı solüsyonu filtreleyin. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Kat. No I.O.D Kat. No EWS Digital Power Supply Kat. No Titan Ill-H Cellulose Acetate (25 plates 94 x 76 mm) Kat. No Titan lll-h Cellulose Acetate (25 Plates 76 x 60 mm) Kat. No Supre Heme Buffer (10 x 14.6g) Kat. No Hemolysate Reagent (1 x 250ml) Kat. No Ponceau S 5% acetic acid Absolute methanol Kat. No Clear Aid (1 x 250ml) Kat. No Zip Zone Prep Kat. No Zip Zone Chamber Wicks (500/box) Kat. No Titan Plastic Envelopes (12 sample 100/pkg) Kat. No Titan Plastic Envelopes (200 pkg) Kat. No Titan Blotter pads (100/box 89 x 108mm) Kat. No Titan Blotter Pads (100/box 76 x 102 mm) Kat. No Helena marker Kat. No Identification Labels Kat. No Haemoglobin Report Form (100/pad) Kat. No Glue Stick ADIM-ADIM PROSEDÜR ml saf suda bir flakon Supre-Heme Bufferı çözün. 2. Helena Markerın parlak sert tarafından işaretleyerek Titan III-H Plakalara gerekli sayıda uygun kodu verin dakika Supre-Heme Buffer içinde gerekli sayıda plakayı ıslatın. Plakalar kullanım talimatına göre buffer içinde ıslatılmalıdır. Alternatif olarak, plakalar yavaş ve düzgün şekilde buffer içine plakaların bir rakı düşürülerek ıslatılabilir. NOT: Aynı ıslatılan buffer eğer kapağı sıkıca kapatılarak saklanırsa, yaklaşık bir hafta için veya 12 plaka ıslatmak için kullanılabilir. Eğer uzun süreli saklama için kullanılırsa, plakalardan artan çözücü buffer da birikebilir ve proteinlerin zayıf ayrılmasına neden olur veya buharlaşma daha büyük buffer konsantrasyonuna neden olabilir. 4. Tankın dış bölümündekilerin her biri içine yaklaşık olarak 100ml Supre-Heme Buffer dökün. 5. Buffer içinde tek kullanımlık 2 fitili ıslatın ve buffer ile temasını sağlamak için destek köprüsü kurun ve fitillerin altında hava kabarcıkları olmamasına dikkat edin. 6. Buffer buharlaşmasını önlemek için tankı kapatın. 7. Aşağıdaki hasta numunelerinin bir hemolizatını hazırlayın: a. Tam kan kullanarak: 3 parça Hemolysate Reaktife 1 parça tam kan ekleyin. İyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. b. Paketlenmiş hücreleri kullanarak: 1 bölüm 6 parça Hemolysate Reaktife 1 parça paketlenmiş kırmızı kan hücreleri ile karıştırın. İyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. 3

5 NOT: Örnekten alınan denatüre edilmiş hemoglobinlerin uzaklaştırılması gerekli görülürse, Alternatif Numune Hazırlama Prosedüre bakın. 8. Microdispenser kullanarak Sample Well Plates kuyularına içine Helena Hemo Kontrollerden en az 5μl veya 5μl hazırlanmış hasta hemolizat koyun. NOT: Helena Hemo Kontrolleri şişeden direk olarak kullanın. Bir hemolizat hazırlamayın. 9. Eğer örnekler 2 dakika içinde kullanılmazsa, buharlaşmayı önlemek için cam bir slayt ile Sample Well Plate kapatın veya 4 kez numune kuyulara uçları bastırarak aplikatörü prime edin. Kurutucu kağıdı parçasına bu yüklemeyi uygulayın. Tekrar aplikatörü yüklemeyin ve bir sonraki adıma geçin. 11. Buffer dan ıslatılmış Titan III Plate alın ve iki kurutucu arasında sıkıca kurutun. "KATOT UYGULAMA" işaretli siyah çizici hattı ile plakanın alt kenarını hizalayarak, selüloz asetat yukarı olacak şekilde, hizalanan tabana plakayı koyun. Tanımlama markası örneği No 1 ile uyumlu olmalıdır. Hizalamam tabanına plakayı yerleştirmeden önce hizalama tabanının ortasında bir damla buffer veya suyu yerleştirin. Bu örnek uygulama sırasında plakanın kaymasını önler veya 4 kez numune kuyusu içine aplikatör uçları bastırarak plakaya numuneyi uygulayın ve hizalayarak tabanına aplikatörü transfer edin. Aşağıdaki düğmeye basın ve 5 saniye tutun. 13. Selüloz asetat aşağı olacak şekilde tank içine plakaları koyun. Fitiller ile temasından emin olmak için plaka üzerine bir ağırlık koyun. 14. Elektroforez: 25 dakika, 350 volt. 15. Tanktan plakayı alın ve 5 dakika boyunca Ponceau S içinde boyayın. 16. % 5 asetik asit ile 3 kez peş peşe yıkayarak boyadan arındırın. Plakaları 2 dakika boyunca her bir yıkamada kalmasını için bekletin. 17. Plakalar kurutulmalıdır ve bu noktada kalıcı bir kayıt için saklanmalıdır. Eğer şeffaf bir arka plan isteniyorsa (yani Dansitometrisi için) sonraki adıma geçin. 18. Plakalar absolute metanol içinde 2 kez peş peşe yıkayarak kurutulmalıdır. Plakaları 2 dakika boyunca her bir yıkamada kalmasını için bekletin dakika boyunca yıkama solüsyonu içien plakayı koyun. 20. Yıkama solüsyonundan plakaları çıkarın ve aşırı solüsyonu dökün. 21. Micro-Hood altında veya fırın içinde 56 C de 10 dakika boyunca veya kuruyana kadar kurutucu üzerinde selüloz asetat yukarı doğru olacak şekilde plakaları koyun. Hemoglobin Bantların Değerlendirilmesi 1. Kalitatif Değerlendirme: Hemoglobin plakaları anormal hemoglobin bantların varlığı için görsel olarak kontrol edilebilir. Helena Hemo Kontroller bandın tanımlanması için bir gösterge sağlar. 2. Kantitatif Değerlendirme: Bir 525nm filtre kullanarak dansitometre de temizlenmiş ve kurutulmuş plakaları tarayarak her bir hemoglobin bandı relatif yüzde olarak belirleyin. Son Ürünün Kararlılığı: Kurutulmuş plakalar belirsiz bir süre boyunca stabildir ve Titan Plastik Zarflar içinde saklanabilir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Figürler 1 ve 2 hemoglobinler belirlenmesi için ard arda kullanılabilen selüloz asetat ve sitrat agar elektroforez kombinasyonunun nasıl olduğunu göstermektedir. 4

6 Figür 1. Titan III Selüloz Asetat üzerine Hemoglobinlerin Elektroforetik Hareketleri. Figür 2. Olası Hb mutantların eliminasyonunu gösteren Titan Jel Asit Hb üzerinde Hemoglobinlerin Elektroforetik Hareketleri. Hemoglobin değişkenleri klinik semptomlarla ayırt edilmezler bundan dolayı araştırmacıların öncelikli ilgisini çekmezler. Talasemi sendromlar, yaşam boyu siyanoz, hemolitik anemi eritrositler veya orak bozukluğuna neden olan değişkenlerin varlığında veya eğer heterozigot genetik görüş için yeterli olarak yaygınsa klinik olarak önemlidir. HbS-S, HbS-D-Los Angeles, and HbS-O Arab ın kombinasyonları ciddi orak bozukluklara neden olurlar. HBH, E-Fort Worth ve Lepore dahil olan çeşitli değişkenler talasemik bir kan resmine neden olur. 2 Patoloji ve frekans açısından en önemli iki değişken hemoglobin Hbs ve HbC2 dir. Orak hücreli anemi (HbSS) acı verici ve ölümcül bir hastalıktır. Yaklaşık olarak 5-6 aylarda ortaya çıkar. Klinik seyri vücudun neredeyse tüm organlarında enfarktüs, halsizlik, letarji ve anemi ile sıcaklık yükselmesi ve ağrı çekilmesidir. Homozigot HbCC tek tek eritrosit içinde HbC in kristalleşmesi ya da çökelmesine neden olan hafif hemolitik anemiye maruz kalır. HbSC hastalık vakalarında orak-hücreli anemi daha hafif bir hemolitik anemi ile karakterize edilmektedir. Diğer zincirler normal olarak sentezlenirken globin(α veya β) zincirinin azalmış sentezinden dolayı hipokromi ve mikrositoz ile hemoglobin bozukluklarının bir grubunu olan talasamialar karakterize edilir. 9, 10 Kararsız globin zincirleri bu dengesiz sentezin sonuçlarıdır. Kırmızı hücre içinde bu çözelti, hücrenin kısa ömürlü organlarının dahil edilmesi ile oluşturur. α-talasemide, α-zincir eksilir veya hiç bulunmaz ve β-talasemide β-zincirleri etkilenir. Hbf in devam eden yüksek yüzdesinin sonucu olan doğumdan sonra yaklaşık dört ayda gama 5

7 zinciri sentezinde son bulan mekanizmaların genetik bir hatası hemoglobin kantitatif bozukluğu sentezi ve kalıtsal persistan fetal hemoglobini (HPFH) gösterir. En sık görülen hemoglobin anormallikleri: Orak Hücre özelliği HbA2 in normal bir miktarını ve HbA ve HbS gösteren bir heterozigot durumdur. Sitrat agar sonuçları HbA ve HBS göçmen pozisyonlarında (bölge) hemoglobin gösterir. Orak Hücre Anemi Ancak HbF in küçük bir miktarında var olmasına rağmen, bu bir homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbS gösterir. Orak-C Hastalığı Bu bir heterozigot durumudur, HbS ve HbC gösterir. Orak Hücre -Talasemi Hastalığı Bu durum HbA, HbF, HbS ve HbA2 gösterir. Orak Hücre β-talasemi HbA içinde yoktur. Talasemi-C Hastalığı Bu durum HbA, HbF ve HbC gösterir. C Hastalığı Bu homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbC gösterir. Talasemi Major Bu durum Hbf, HbA ve HbA2 gösterir. Bilinmeyenin hesaplanması: Helena EDC. CliniScan ve bilgisayar aksesuarları ile diğer Helena densitometreleri otomatik olarak bantları relatif yüzde yazdıracaktır. Daha fazla gerekli olan testler: 1. Sitrat agar elektroforez selüloz asetatta tespit edilen anormal hemoglobinlerin doğrulama testi için gereklidir. 2. Globin zincir analizi (hem asit ve hem de alkali) ve yapısal çalışmalar nadiren bazı hemoglobinleri pozitif olarak tanımlamak için gerekli olabilir. 3. Anyon değişimli kolon kromatografisi HbA2 miktarının belirlenmesi için en doğru yöntemdir. HbS in varlığında HbA2 in kantitasyonu için Helena Biyoteknoloji Orak-Thal Quik Sütun Yöntemi veya Helena Biyoteknoloji Beta-Thal HbA2 Quik Sütun Prosedürü tavsiye edilir. HbA2 kantitasyonu, b-talasemi özelliğinin teşhisinde en önemli tanısal testlerden biridir. 4. HbF (1-10%) in düşük seviyelerinde Helena Biyoteknoloji HbF-QuiPlate prosedürü kullanarak radyal immunodiffuzyon tarafından doğru şekilde miktarı belirlenebilir. KALİTE KONTROL Aşağıdaki kontroller hemoglobin elektroforezi için Helena BioSciences Europe da bulunur: Kat. No AA2 Hemo Kontrol Kat. No ASA2 Hemo Kontrol Kat. No AFSA2 Hemo Kontrol Kat. No AFSC Hemo Kontrol Kontroller hemoglobin bantlarının tanımlanması için marker olarak kullanılabilir ve prosedürün doğruluğunu doğrulamak için miktarı belirlenmelidir. Test değerleri ve göç paternleri için kontroller ile sağlanan paket insertüne bakın. Her bir plaka çalışmasında bu kontrollerin en az birini kullanın. SINIRLAMALAR Bazı anormal hemoglobinler benzer elektroforetik hareketliliğe sahiptir ve diğer metodolojiler tarafından farklı olmalıdır. 6

8 REFERANS DEĞERLERİ Doğumda, normal bireyin eritrositinde hemoglobin çoğunluğu fetal hemoglobin, HbF dir. Yetişkin hemoglobin, HbA in bazıları ve HbA2 in küçük bir miktarı da vardır. Yeni doğduğunda ve yetişkinlik arasında, major hemoglobin günümüzde HbA ile % 2 HbF den az ve % 3.5 HbA2 a kadardır. BİBLİYOGRAFİ 1. Wintrobe, Maxwell M Cynical Hemaotogy 6th Edition. LaFebiger. Philadelphia Fairbanks, VF, Diagnostic Medicine. Nov/Dec, Schneider, RG, et al. Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, August Center for Disease Control. Laboratory Methods for Detecting Hemoglobinopathies, U.S, Department of Health and Human Services/Public Health Service, Schneider. RG. Method for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in the Routine Clinical Laboratory. CRC Clinical Reviews in Clinical laboratory Sciences, Schneider, RG et al., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 48(5); Huisman.THJ and Schroeder. WA. New Aspects of the Structure, function, and Synthesis of Hemoglobins. CRC Press. Cleveland Schmidt, RM, et al. The Detection of Hemoglobinopathies, CRC Press, Cleveland Weatherall. DJ and Clegg JB. The Thalassaemia Syndromes. Blackwell Scientific Publications. Oxford, Lehman, H and Huntsman RG. Man's Haemoglobins. JB. Lippincott Co., Philadelphia, I974. 7