T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜĠVERSĠTESĠ FE BĠLĠMLERĠ ESTĠTÜSÜ EZĠM MĠMĠK ÇALIġMALARIDA VE LĠPAZ ĠMMBĠLĠZASYUDA KULLAILABĠLECEK KALĠKSARE BĠLEġĠKLERĠĠ SETEZĠ VE BAZI EATĠYSEÇĠMLĠ TEPKĠMELERDE KULLAILMASI Arzu UYAIK DKTRA TEZĠ Kimya Anabilim Dalı Eylül-2011 KYA Her Hakkı Saklıdır

2

3 TEZ BĠLDĠRĠMĠ Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildiğini ve tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. DECLARATI PAGE I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all material and results that are not original to this work. Arzu UYAIK Tarih:

4 ÖZET DKTRA TEZĠ EZĠM MĠMĠK ÇALIġMALARIDA VE LĠPAZ ĠMMBĠLĠZASYUDA KULLAILABĠLECEK KALĠKSARE BĠLEġĠKLERĠĠ SETEZĠ VE BAZI EATĠYSEÇĠMLĠ TEPKĠMELERDE KULLAILMASI Arzu UYAIK Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı DanıĢman (lar): Yrd. Doç. Dr. ejdet ġe Prof. Dr. Mustafa YILMAZ 2011, 182 Sayfa Jüri Prof. Dr. Ayhan Sıtkı DEMĠR Yrd. Doç. Dr. ejdet ġe Prof. Dr. Mustafa YILMAZ Prof. Dr. Abdülkadir SIRIT Doç. Dr. Aydan YILMAZ Kaliksarenler, çok sayıda bileşikle konak-konuk kompleksleri oluşturabilmelerinden dolayı supramoleküler kimyada makrosiklik bileşiklerin önemli bir sınıfını temsil ederler. Kaliks[4]arenler çok sayıda uygulama için hem fenolik H gruplarından hem de fenolik halkanın p- pozisyonlarından kolaylıkla fonksiyonlandırılabilirler. Bu tez farklı kaliks[4]aren bileşiklerinin sentezlenmesini ve onların enzim-mimik ve lipaz immobilizasyonu çalışmalarında kullanılmalarını kapsayan iki uygulama alanını içermektedir. Bu amaç için imidazol ve amit grubu taşıyan kaliks[4]aren türevleri sentezlendi ve yapıları FTIR, 1 HMR ve 13 CMR gibi spektroskopik yöntemlerle aydınlatıldı. Sentezlenen imidazol bazlı kaliks[4]aren türevleri enzim-mimik çalışmalarında kullanıldı. Yapılan kinetik çalışmalar sonucu bunlardan bazılarının hem p-nitrofenil asetat (p- PA) hem de p-nitrofenil palmitat (p-pp) ın hidroliz reaksiyon hızlarını önemli derecede artırdığı gözlendi. Kaliks[4]aren amit türevleri Candida rugosa lipaz (CRL) ın sol-jel immobilizasyonu prosesinde yeni katkı maddeleri olarak kullanıldı. Kaliksaren bazlı immobilize lipazların katalitik etkinliklerini araştırmak için rasemik aproksen metil esteri ve rasemik 2-fenoksi propiyonik asit metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonları kullanıldı. Kaliks[4]aren bazlı immobilize lipazların kullanılması ile serbest sol-jel lipazla kıyaslandığında enantiyoseçimlilikte önemli bir artış olduğu görüldü. Anahtar Kelimeler: Enantiyoseçimli hidroliz, enzim-mimik, kaliksaren, sol-jel immobilizasyonu. iv

5 ABSTRACT Ph.D THESIS SYTHESĠS F CALIXAREE DERIVATIVES FR LIPASE IMMBILIZATI AD EZYME-MIMIC STUDIES AD THEIR USE FR SME EATISELECTIVE REACTIS Arzu UYAIK THE GRADUATE SCHL F ATURAL AD APPLIED SCIECE F SELÇUK UIVERSITY DCTR F PHILSPHY I CHEMISTRY Advisor(s): Assist. Prof. ejdet ġe Prof. Mustafa YILMAZ 2011, 182 Pages Jury Prof. Ayhan Sıtkı DEMĠR Assist. Prof. ejdet ġe Prof. Mustafa YILMAZ Prof. Abdülkadir SIRIT Assoc. Prof. Aydan YILMAZ Calixarenes represent an important class of macrocyclic compound due to their potential for forming host guest complexes with numerous classes of compounds in supramolecular chemistry. Calix[4]arenes can be easily functionalized both at the phenolic H groups (lower rim) and, at the para positions of the phenol rings (upper rim) to tailor them for many applications. This thesis covers the synthesis of different calix[4]arene derivatives in order to utilize them in the enzyme mimic and enzyme immobilization studies. For this purpose, calix[4]arenes bearing imidazol and amide were synthesized and characterized by the spectroscopic techniques such as FTIR, 1 HMR and 13 CMR. The synthesized imidazol based calix[4]arene derivatives were tested as enzyme models. From the kinetic studies, some of them showed significant rate accelerations in the hydrolyze reaction of both p-pp (p-nitrophenyl palmitate) and p-pa (p-nitrophenyl acetate). Calix[4]arene amide derivatives were used as the new additives for the immobilization of Candida rugosa lipase (CRL) by sol-gel method. The catalytic properties of those immobilized derivatives were assessed in both the enantioselective hydrolysis reactions of (R,S)-aproxen methyl ester and (R,S)-2- phenoxy propionic acid methyl ester. Improved enantioselectivity was observed with the calixarene-based immobilized lipases as compared sol-gel free lipase. Key Words: Calixarene, enantioselective hydrolysis, enzyme-mimic, sol-gel immobilization v

6 ĠÇĠDEKĠLER TEZ BĠLDĠRĠMĠ... iii ÖZET... iv ABSTRACT... v ÖSÖZ... x 1. GĠRĠġ Supramoleküler Kimya Konak-konuk kimyası Kaliksarenler p-ter-bütilkaliks[4]aren in sentezi Kaliks[4]arenlerin konformasyonları Kaliksarenlerin fonksiyonlandırılması Kaliksarenlerin uygulama alanları Enzimler Yapay Enzimler Enzim-mimik olarak kaliksarenler Lipaz Ara yüzeysel aktivasyon Lipaz kaynakları Lipazların özellikleri (Öztürk, 2001) Lipaz katalizli reaksiyonlar Enzim İmmobilizasyonu İmmobilizasyon metotları Adsorpsiyon-temelli immobilizasyon Kovalent bağlanma ile enzim immobilizasyonu Enzim hapsetme Sol-jel bazlı enzim immobilizasyonu Enzim immobilizasyonunda kullanılan sol-jel matriksinin kimyasal yapısı: Katkı maddesi-kontrollü enzim aktivitesi vi

7 2. KAYAK ARAġTIRMASI Lipaz İmmobilizasyonu Enzim-Mimik larak Kaliksarenler Çalışmanın Amacı ve Kapsamı MATERYAL VE METT Enstrümental Teknikler Kimyasal Sentezler ve Karakterizasyon ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrahidroksikaliks[4]aren (1) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-bromopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (2) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-bromopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren ile imidazol ün etkileştirilmesi (3) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-ftalimidopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (4) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-aminopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (5) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-aminopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren ile 4 (5)-imidazol karboksi aldehit in ekileştirilmesi (6) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (7) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28- dihidroksi kaliks[4]aren ile etilendiamin in etkileştirilmesi (8) Bileşik 8 in hekzametilentetraamin ile etkileştirilmesi (9) Bileşik (9) ile 3-aminopropilimidazol ün etkileştirilmesi (10) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28- dihidroksi kaliks[4]aren ile dietilentriamin in etkileştirilmesi (11) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28- dihidroksi kaliks[4]aren ile 3,6 diokza-1,8 diaminooktan ın etkileştirilmesi (12) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dihidroksikarbonilmetoksi 26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (13) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-diklorokarbonilmetoksi 26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (14) p-ter-bütilkaliks[4]arenin diamit türevinin sentezi (15) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrametoksikarbonilmetoksi kaliks[4]aren (16) ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrahidroksikarbonilmetoksi kaliks[4]aren (17) vii

8 ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28 tetraklorokarbonilmetoksi kaliks [4] aren (18) p-ter-bütilkaliks[4]arenin tetraamit türevinin sentezi (19) Enzim mimik Çalışmaları Lipaz İmmobilizasyonu Sol-jel enkapsülasyon metodu (Reetz ve ark., 2003) Aktivite tayini (Chiou ve Wu, 2004 ) Protein miktarı (Bradford, 1976) İmmobilize lipazlar ile (R/S)-aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi İmmobilize lipazlar ile (R/S)-2-fenoksi propiyonik asit metil ester inin enantiyoseçimli hidrolizi ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA Kaliksaren Bileşiklerinin Sentezi Enzim Mimik Çalışmaları Enzim modelleri 3, 6 ve 10 ile p-pa nın hidroliz reaksiyonu Enzim modelleri 3, 6 ve 10 ile p-pp nin hidroliz reaksiyonu İmmobilizasyon ve Enantiyoseçimli Reaksiyonlar Katkı maddesi olarak kaliksaren in kullanıldığı sol-jel kapsülleme İmmobilize lipazların aktivitesine ph ın etkisi İmmobilize lipazların aktivitesine sıcaklığın etkisi İmmobilize lipazın termal kararlılığı İmmobilize lipazlar ile (R/S)-aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi İmmobilize lipazlar ile (R/S)-2-fenoksi propiyonik asit metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi SUÇLAR VE ÖERĠLER Sonuçlar Öneriler KAYAKLAR EKLER viii

9 ÖZGEÇMĠġ ix

10 ÖSÖZ Bu çalışma, Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyeleri Yrd. Doç. Dr. ejdet ŞE ve Prof. Dr. Mustafa YILMAZ danışmanlığında FBE numaralı tez projesi kapsamında hazırlanmıştır. İlk olarak, bu çalışmanın yapılmasında desteklerini esirgemeyen değerli hocalarım Yrd. Doç. Dr. ejdet ŞE e ve Prof. Dr. Mustafa YILMAZ a çok teşekkür ederim. Ayrıca Tez İzleme Komitesi Üyesi hocalarım S.Ü. Ahmet Keleşoğlu Eğitim Fakültesi Kimya Öğretmenliği Bölümü Öğretim Üyesi Prof. Dr. Abdülkadir SIRIT a, S.Ü. Fen Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyesi Doç. Dr. Aydan YILMAZ a teşekkürlerimi sunarım. S.Ü. Fen Fakültesi Kimya Bölümü Başkanı Prof. Dr. İbrahim KARATAŞ başta olmak üzere diğer hocalarıma da teşekkür ederim. Bunların dışında, değerli yorumları ile yaptığı katkılardan dolayı DTÜ Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyesi Prof. Dr. Ayhan Sıtkı DEMİR e teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca bu çalışmayı numaralı proje ile destekleyen Selçuk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Koordinatörlüğü ne de teşekkür ederim. Çalışmalarım esnasında yardımlarını esirgemeyen laboratuvar arkadaşlarım Arş.Gör.Dr. Ezgi AKCEYLA a, Arş.Gör.Dr. Özlem ŞAHİ e, Uzman Serkan ERDEMİR e, Arş.Gör.Dr. Elif YILMAZ a, Kübra ETÇİ ye, Tuba AKSY a, Enise AKÖZ e, Ali sman KARATAVUK a, Serkan SAYI a ve Mustafa ASLA a teşekkür ederim. Son olarak sevgili eşim İbrahim UYAIK a sonsuz teşekkürler ederim. x

11 1 1. GĠRĠġ 1.1. Supramoleküler Kimya Supramoleküler kimya farklı kimyasal bileşenlerden meydan gelen kompleks moleküler sistem çalışmalarıyla ilgili bir kimya alanıdır. Cram, Lehn ve Pedersen in 1987 yılında obel ödülünü alması ile birlikte, supramoleküler kimya, çağdaş kimyanın önemli bir alanı haline gelmiştir (Gokel, 1999). Supramoleküler kimya, moleküller arası bağ ve moleküller arası yapı kimyası olarak tanımlanabilir (Lehn, 1995). Moleküller arası bağlar; iyon çifti oluşumunu (elektrostatik), hidrofilik ve hidrofobik etkileşimleri, hidrojen bağı oluşumunu, konak-konuk etkileşimlerini ve van der Walls etkileşimlerini içerir (Şekil 1.1.). H - H + H İyon-iyon etkileşimi ( kj/mol) H H H İyon-dipol etkileşimi ( kj/mol) H H H H H H 2 etkileşimi ( kj/mol) H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 Hidrojen bağı ( kj/mol) Dipol-dipol etkileşimi (5-25 kj/mol) van der Waals (hidrof obik) ( kj/mol) ġekil 1.1. Supramoleküler etkileşimler Supramoleküler etkileşimler, enzimlere veya reseptörlere substrat bağlanması, protein komplekslerinin oluşumu, genetik kodun taşınması, sinir iletim prosesleri ve hücresel tanıma (immünoloji) gibi önemli spesifik biyolojik proseslerin temelini oluşturur.

12 2 Bu nonkovalent ve çok noktalı moleküller arası etkileşimlerin tam olarak anlaşılabilmesi, substrata kuvvetlice ve seçici olarak bağlanarak supramoleküler yapı oluşturabilecek yapay reseptör moleküllerin tasarlanmasını sağlayabilir (Vögtle, 1991). Literatürdeki mevcut çalışmalara bakarak, kimya alanındaki araştırmaların çoğunlukla moleküler sistemlerden supramoleküler sistemlere doğru yöneldiği görülmektedir. Moleküler reseptörler ve substratlar supramoleküler bir türün partnerleridir. Bir spesifik substratın reseptörüne seçici olarak bağlanması ile bir süpermolekül oluşabilir. Substrat genellikle bağlanması araştırılan daha küçük bileşendir. Bu terminoloji, biyolojik reseptörler ve onların substratları arasındaki ilişkiyi ifade eder. Sentetik reseptörlerin geliştirilmesinde bir hayli yol kat edilmiştir. Bu reseptörlerin komplekslerinin oluşumunda temel kuvvet hidrojen bağıdır (Zimmerman ve Wu, 1989). Moleküler tanıma, kimya, biyoloji, eczacılık (klinik biyokimya) ve çevre alandaki etkisinden dolayı önemli köşe taşlarından biridir. Özellikle biyolojik proseslerde metal katyonlarının seçimli teşhisi ilgi duyulan önemli konulardan birisi olmuştur (Valeur, 1993). Ayrıca önemli biyolojik hedeflerin moleküler tanınması organik kimyanın önemli alanlarından birini oluşturur ve model sistemlerle gerçekleştirilen çalışmalar amino asitler, nükleik asit heterosiklik bazları, nükleotitler ve karbonhidratlar gibi pek çok reseptör ortaya çıkarmıştır (Galan ve ark, 1992) Konak-konuk kimyası Bir molekül (konak) diğer uygun bir moleküle (konuk) bağlandığı zaman konakkonuk kompleksi veya supramolekül oluşur. Konak-konuk kimyasının oluşmasında aşağıdaki üç önemli anlayış etkilidir: 1) Paul Erlich tarafından ortaya çıkarılan tanım. Buna göre: Eğer moleküller bağlı değilse etkin değildirler. Bu şekilde biyolojik reseptör kavramı ortaya çıkarılmıştır. 2) Emil Fischer tanıması: Buna göre bağlanma seçici olmak zorundadır. Bu ise anahtar-kilit modeli ile tanımlanır. Bu anlayış moleküler tanımanın temelini oluşturur (Şekil 1.2.). 3) Seçici bağlanmanın konak ve konuk arasındaki karşılıklı çekim ve benzerliği içermesi gerektiği gerçeği (Steed ve Atwood, 2000).

13 3 ġekil 1.2. Fischer in anahtar-kilit modeli Taç eterler ile başlayarak, konak-konuk alanında başlıca katyonların kompleksleşmesi üzerine odaklanılmıştır. Genellikle nötr moleküller arasındaki hidrojen bağları, yük/dipol çekimleri ve polar hidrojen bağlarından daha zayıf olmasına rağmen, yapılan pek çok çalışma hidrojen bağı ağının, çözelti içerisinde kararlı olan nötr komplekslerin oluşmasında kullanılabileceğini göstermektedir (Bell ve Liu, 1988). Konakkonuk kimyası, öncelikli olarak en azından bir tanesi yüklü olan partnerler (metal ve alkilamonyum iyonları) arasındaki etkileşimlere odaklanmıştır. Siklodekstrinler, taç eterler ve kaliksarenler gibi pek çok moleküler-kap tipi konaklar (Şekil 1.3.) yapısal gevşeklilerinden dolayı konuklarla rahatça etkileşime girebilirler (Marquez ve ark., 2004). H H H H H H H H H HH H H n H H H H H R R H H H H R R=H R Siklodekstrin Taç eter Kaliksaren ġekil 1.3. Siklodekstrin, taç eter ve kaliksarenin gösterimi

14 Kaliksarenler Fenol-formaldehit kimyası ile ilgili çalışmalar ilk olarak 1872 yılında Adolf Von Baeyer ile başlamıştır (Takemura, 2002). Ancak reaksiyon ürünleri saf olarak elde edilememiştir ve yeterli analitik teknik olmadığı için de tam olarak karakterize edilememiştir. Bu alandaki bir sonraki adım, 1894 te L. Lederer (aoya ve Sotaro, 2002) ve. Mannase (Baekeland, 1908) tarafından ılımlı ve kontrol edilebilen bazik koşullarda hidroksimetil fenollerin sentezlenmesi ile atılmıştır yılında Leo Hendrik Baekeland, fenol ve formaldehitin bazik ortam kondenzasyonu neticesindeki çapraz bağlı polimerleşme ile ticari adı Bakalit olan fenol-formaldehit rezinlerini hazırlamıştır yılında Alois Zinke ve Eric Zeigler in p-substitüe fenolleri kullanarak kontrollü çaprazbağlanma ile rezinden ziyade kristalik bir bileşiğin sentezlenmesi ile fenol-formaldehit kimyasına beklenmedik bir dönüş yapılmıştır (Mnuk ve Fetl, 1993). Aynı yıl Joseph iederl ve Heinz Vogel asetaldehit ve rezorsinolden bir siklik tetramerik bileşik sentezlemişlerdir (Cornforth ve ark., 1973). John Cornforth ve ark., Zinke nin reaksiyonlarını tekrarlamışlar ve enzim benzerleri olarak kaliksarenlerin önemini fark etmişlerdir. X-ray kristalografisi ile nihai olarak Zinke reaksiyonu ile sadece siklik tetramerlerin oluştuğu doğrulanmıştır (Conforth ve ark., 1955; Gutsche,1989). Kaliksaren kelimesi 1975 yılında David Gutsche tarafından ortaya atılmıştır. Günümüzde kaliksarenler, farklı merkezi boşluğa sahip fenolik birimlerin metilen köprüleri ile o-pozisyonundan birbirine bağlandığı halkalı oligomer sınıfı olarak tanımlanmaktadır (Vicens ve Boehmer, 1991; Stewart ve Gutsche, 1999). ġekil 1.4. Kaliksarenler Kaliksarenler aril birimlerinin sayısına göre (n=4, 5, 6, 7, 8, 9,.., 20) sınıflandırılabilirler (Audhuy-Peaudecerf ve ark., 1994; Gutsche ve ark., 1990). n=4, 6, 8

15 5 ve n=5, 7 olan kaliksarenlerin baz katalizli sentezine karşın, n=9-20 olan kaliksarenler asitkatalizli kondenzasyonla hazırlanırlar. Günümüzde kaliksarenler, siklodekstrinler ve taç eterlerden sonra, üçüncü nesil supramoleküller olarak adlandırılır (Gutsche, 2008). p-sübstitüe kaliks[n]arenlerin karakteristik özellikleri arasında; yüksek erime noktasına sahip olması, hem fenolik- H dan hem de fenolik birimlerin p- pozisyonlarından fonksiyonlandırılabilmeleri (Gutsche ve ark., 1986), farklı konformasyonlara sahip olmaları (Gutsche ve ark., 1981) ve yaygın organik çözücülerde çözünürlüklerinin çok düşük olması sayılabilir. Ancak, kaliksarenlerin CHCl 3 ve piridin gibi çözücülerde yeterli derecede çözünmesi kaliksarenlerin MR karakterizasyonuna olanak sağlamaktadır p-ter-bütilkaliks[4]aren in sentezi p-ter-bütilkaliks[4]aren in sentezi ilk olarak David Gutsche tarafından optimize edilmiştir. Buna göre ilk olarak p-ter-bütil fenolün ve %37 lik formaldehitin o C sıcaklıkta kondenzasyonu gerçekleştirilir ve ardından difenil eter içerisinde geri soğutucu altında kaynatılır (Gutsche ve ark., 1990; Gutsche ve ark., 1986) (Şekil 1.5.). Daha sonra reaksiyon karışımı soğutulur, etilasetat ilave edilen karışımdan ham ürün süzülerek ayrılır ve toluen içerisinde kristallendirilirek %50 verimle parlak, beyaz kristaller elde edilir. luşan rombik kristallerin erime noktası o C dir. R H R + HCH 0,045 ekv.ah R o C 2 saat difenileter ile 2saat kaynatılır H H H H R p-ter-bütilfenol formaldehit R p-ter-bütilkaliks 4 aren R=ter-bütil ġekil 1.5. p-ter-butilkaliks[4]aren in sentezi

16 6 ligomerleşme üzerine baz konsantrasyonunun etkisi ve ürünlerin verimi Gutsche ve ark. tarafından incelenmiştir. Yüksek baz konsantrasyonlarında hekzamer oluşumu gözlenmiştir. Ayrıca bazı oluşturan katyonun, verim ve ürün dağılımı üzerine bazı etkilerinin bulunduğu belirlenmiştir. Örneğin LiH, ah tetramer ve oktamer, KH, RbH ve CsH genellikle siklik hekzamer oluşturma yönünde davranmaktadır (Gutsche ve ark., 1990) Kaliks[4]arenlerin konformasyonları Kaliksaren konformasyonları arasındaki denge substitüentlerin tipine, çözücüye, sıcaklığa ve makrosikliğin büyüklüğüne bağlıdır. Kaliksarenler (n=4 için) koni, kısmi koni, 1,2-karşılıklı ve 1,3-karşılıklı konformasyonlarında bulunur (Şekil 1.6.). H H H H Cone Koni Kısmi koni 1,3-KarĢılıklı 1,2-KarĢılıklı ġekil 1.6. p-ter-bütilkaliks[4]aren in konformasyonları Kaliks[4]arenin hangi konformasyonda olduğu bu bileşiğin köprü Ar-CH 2 -Ar protonlarının 1 H-MR spektrumlarına bakılarak ayırt edilebilir (Çizelge 1.1.). Çizelge 1.1. Kaliks[4]aren konformasyonunun 1 H-MR spektroskopisi ile belirlenmesi Konformasyon Koni Kısmi koni 1,3-karşılıklı 1,2- karşılıklı Ar-CH 2 -Ar 1 H MR spektrumu Bir çift dublet İki çift dublet (1:1) veya bir çift dublet ve bir singlet (1:1) Bir singlet Bir singlet ve iki dublet (1:1)

17 7 Genellikle sübstitüe olmamış kaliksarenler oda sıcaklığında ve çözelti içerisinde değişken bir konformasyona sahiptir. Burada konformasyonel dönüşümün azaltılması için başlıca iki yol vardır (Gutsche, 1989): Bunlardan birincisi fenolik-h ve fenolik-p pozisyonlarından halkaya büyük hacimli gruplar bağlamak; ikincisi ise her bir aril halkasına molekül içi köprüler kurmak (Takeshita, 1995). Konformasyonlar arasındaki dönüşüm hızına sübstitüentlerin yanı sıra çözücüler de etki etmektedir. Kloroform, toluen, brombenzen ve karbondisülfür gibi çözücüler konformasyon dönüşüm serbest enerjisini yükseltir. Bu da çözücünün kaliksarenlerle kompleks oluşturduğunu gösterir. Aseton ve asetonitril gibi çözücülerin bilhassa piridinin, molekül içi hidrojen bağlarını bozması sebebiyle konformasyon dönüşümüne etkisinin büyük olduğu düşünülmektedir (Gutsche ve ark., 1981). Aromatik halka arasındaki metilen hidrojenleri yüksek sıcaklıklarda singlet pik verirken düşük sıcaklıklarda bir çift dublet pik verir. Bu durum kaliks[4]arenlerin sıcaklık değişmesiyle konformasyonlarının değiştiğini göstermektedir (Gutsche, 1989) Kaliksarenlerin fonksiyonlandırılması Kaliksarenlerin halkalı yapıdaki taç eterlere ve siklodektrinlere göre sentezlerde çok fazla tercih edilmesinin nedeni kolaylıkla türevlendirilebilmesidir. Kaliksarenlerin çözünürlüklerinin sınırlı olmasından dolayı, istenilen amaca yönelik kaliksarenler elde etmek için, kaliksarenlerin fenil halkasının para konumundan (upper rim) veya fenolik oksijen (lower rim) üzerinden değişik fonksiyonel gruplarla türevlendirilmesi gerekmektedir (Şekil 1.7.).

18 8 Upper rim fenolik halkaların para pozisyonu 4 H H H H HH HH Lower rim f enolik H bölgesi ġekil 1.7. Kaliksarenlerin fenolik-h ve p- pozisyonları Kaliksarenlerin fenolik -H gruplarından fonksiyonlandırılması eter, ester, keton, fosfin, imin, oksim gruplarının bağlanması ile oluşturulur (Yilmaz, 1999; Ting ve ark.,1990; Cameron ve Loeb, 1997). Fenolik -H gruplarının fonksiyonlandırılması değişik reaktif ve reaksiyon koşullarının seçilmesi ile başarılabilir. Kaliks[4]arenin 1,2-di-, 1,3-di-, tri-, tetra- eterleri veya esterleri uygun koşullarda sentezlenmektedir (Gutsche ve Lin, 1986; Böhmer ve ark., 1993). Fenil halkasının para köşesine bağlı ter-bütil gruplarının AlCl 3 / toluen ortamında tamamen giderilmesiyle (dealkilleme), kaliksarenlerin p-konumuna değişik fonksiyonel grupların bağlanması mümkün olmaktadır. Ayrıca kısmi -açilli veya -alkilli kaliksarenlerin ter-bütil grupları seçimli olarak dealkilleme işlemiyle uzaklaştırılabilmektedir (Dalbavie ve ark., 2000). Daha sonra, amaca göre sülfolama nitrolama, bromlama, açilleme klormetilleme diazolama, formilleme ve alkilleme gibi kısmi yer değiştirme reaksiyonları gerçekleştirilebilir (Shinkai ve ark., 1986; Hamada ve ark., 1990; Gutsche ve Lin, 1986; agasaki ve ark., 1993; Deligöz ve Ercan, 2002; Arduini ve ark., 1991). Kaliksarenler üzerine yapılan reaksiyonlar elektrofilik kinon-metit tipi substitüsyon reaksiyonlardır. Gutsche ve am (1988) tarafından önerilen bu metot, uygun bir sekonder aminle kaliksarenin aminometilasyon daha sonra kuaternizasyon ve düşünülen reaksiyonlar için başlangıç maddesi olabilecek nükleofil ile p-ter-

19 9 tetrakis(siyanometil)kaliksarenin reaksiyonudur. Burada örneğin, siyano grupları kuaterner amonyum grubu ile yer değiştirir, daha sonra amino gruplarına indirgenebilir veya karboksilik gruplarına hidroliz edilebilir. Kaliks[4]arenin allil eterlerinin p-clasien çevrilmesi metodu ise, fenolik grupların p-pozisyonuna fonksiyonel grupların transferinin gerçekleştiği bir metottur (Gutsche ve Pagoria, 1985) Kaliksarenlerin uygulama alanları Literatürde, kaliksarenlerin farklı uygulamalarda kullanıldığı pek çok çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmalardan bazıları aşağıda farklı başlıklar altında verilerek açıklanmaya çalışılmıştır. Molekül /iyon taşıyıcı olarak Kaliksarenler farklı konformasyonlara ve taç eterler gibi halkalı yapı ve özellikle sepet benzeri boşluklara sahip olduklarından birçok organik bileşikle veya iyonla kompleks yapabilme özelliğine sahiptirler. Yılmaz ve grubunca (zcan ve ark., 2009) gerçekleştirilen bir çalışmada Fe 3 4 manyetik nano parçacıkları ile aminopropiltrimetoksi silan (APTMS) etkileştirmiş ve bu da kaliks[4]aren diester türevi ile etkileştirerek manyetik özellik gösteren kaliks[4]aren elde etmişlerdir (Şekil 1.8.). Daha sonra kaliks[4]aren bazlı bu manyetik nano parçacık dikromat iyonunun ekstraksiyon çalışmalarında kullanılmıştır. ġekil 1.8. Kromat ekstraksiyonunda kullanılan kaliksaren-destekli nano parçacık

20 10 shima ve ark. (2007) tarafından yapılan bir çalışmada ise kalisarenin enzimlerdeki aminoasit grupları ile kompleks oluşturabildikleri ile ilgili bir çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada Sitokrom c enzimindeki lisin grubuna ait H + 3 ile karboksilli asit grubu bulunduran kaliksaren kompleks yapmış (Şekil 1.9.) ve bu enzimin organik ortamda çözünerek katalizör işlevi görmesi sağlanmıştır. R R R R R R H 3 + R=CH 2 CH H 3 + Enzimdeki katyonik lisin grupları ġekil 1.9. Kaliksaren ile enzimdeki amino asit grubuna ait amonyum grubunun etkileşmesi Elektrot ve sensör çalışmalarında Kim ve grubu (2003) antrasen gibi florofor taşıyan 1,3 konformasyonunda farklı iki metal katyonu taşıma bölgesi bulunduran kaliks[4]aren bileşiği sentezlemiş (Şekil 1.10.) ve bu bileşiğin bazı iyonlara karşı floresans özelliklerini incelemiştir. Yapılan çalışmada bileşik herhangi bir metalle kompleks yapmadığında floresans özellik göstermemiştir. Cs + nın bileşiğin crown-6 bölgesini tercih etmesi ve kompleksleşmesi molekülde floresans özellik göstermiş ve daha sonra bu komplekse Cu +2 iyonu ilave edildiğinde Cu +2 nin diğer bağlanma bölgesi ile etkileşmesi hem Cs + nın bu molekülden uzaklaşmasına hem de düşük floresans özellik göstermesine neden olduğunu belirtmiştir.

21 11 C C C Cs + Cs + Cu +2 Cs + H H Cu +2 H Floresans yok Floresans Düsük. Floresans ġekil Kaliks[4]arenin sensör olarak kullanımı Kaliksarenler kullanılarak birçok iyon seçimli elektrot yapılmıştır. Bunlardan biri Ramanjaneyulu ve ark. (2010) tarafından gerçekleştirilmiştir. Yapılan bu çalışmada polimer destekli kaliksaren türevi (Şekil 1.11.) sezyum için iyon seçici elektrot olarak kullanılmıştır H HC H CH H 3 C H3 C CH 3 CH 3 ġekil Cs iyonofor olarak kullanılan kaliks[4]areni türevi Monolayer çalışmalarında Chen ve ark. (2007) fenolik H bölgesinde etilester, karboksilik asit ve taç eter grupları ve fenolik bölgenin p pozisyonunda ise tiyol grubu bulunan kaliks[4]aren bileşiği

22 12 sentezlemiştir. Bu bileşiğin bir altın film üzerinde oluşturduğu monolayer sistemi (Şekil 1.12.) ise bazı proteinlerin belirlenmesinde kullanılmıştır. ġekil Au film üzerindeki kaliksaren monolayeri Kromatografi çalışmalarında Erdemir ve Yılmaz (2010), silikajel bağlı yeni bir kaliks[4]aren bileşiği sentezlemişler (Şekil 1.13.) ve bunu HPLC de sabit faz olarak kullanmışlardır. Si Si H H ġekil Sabit faz olarak kullanılan kaliksaren türevi Bu sabit fazı bazı aromatik hidrokarbonlar, fenolik bileşikler, aromatik aminler ve bazı ilaç maddelerinin kromatografik ayırımında kullanmışlardır.

23 13 Katalizör çalışmalarında Akceylan ve Yılmaz (2011), yaptıkları çalışmada amin türevli 3 farklı kaliksaren bileşiği sentezlemişler ve bunları akiral faz transfer katalizörü olarak kullanmışlardır. Faz transfer reaksiyonu olarakta p-nitrobenzilbromür ile sodyum metil bütirat ve sodyum kaprolat arasındaki esterleşme reaksiyonunu kullanmışlardır (Şekil 1.14.). H H H H H H H H H H H H BrH n n=1 n=5 Ca kat. 2 C n ġekil Akiral katalizör olarak kullanılan kalikaren türevleri ve katalizledikleri faz transfer reaksiyonu Bozkurt ve ark. (2008), cinchona alkaloid türevli kaliks[4]aren sentezleyerek bunu, -(difenilmetilen)glisin etil esteri ile benzil bromür arasındaki faz transfer alkilasyon reaksiyonunda (Şekil 1.15.) kiral faz-transfer katalizörü olarak kullanmışlardır. H Br Br - H n HH n Ph Ph BnBr,PTC 50% aq. baz Ph Ph - Cl + H 3 * H + * ġekil Kiral katalizör olarak kaliks[4]aren türevi ve kullanıldığı faz transfer alkilasyon reaksiyonu

24 Enzimler Enzimler çoğunlukla biyokatalizörler olarak adlandırılırlar. Enzimler biyolojik sistemlerin önemli ve gerekli bileşenleri olup yaşam için önemli olan kimyasal reaksiyonları katalizler. Enzimlerin yardımı olmaksızın bu kimyasal prosesler ya oldukça yavaş hızlarda olacak ya da hiç olmayacaktı (Laidler, 1958) yılında J.J. Berzelius kimyasal kataliz teorisini geliştirmiştir. Ardından 1894 de Emil Fischer, enzimlerin etkinliğini ve seçicililiğini açıklamak için ünlü anahtar-kilit modelini önermiştir (Robyt ve White, 1987). Bu modele göre katalizin gerçekleşmesi için katalizlenecek sistemdeki molekül, enzimdeki bir bölgeye uyacak yapısal uygunluk içerisinde olmalıdır (Şekil 1.2.). Enzimlerin katalitik ve kinetik özellikleri 20. yüzyılın başlarında çalışılmıştır yılında L. Michaelis ve M. L. Menten, enzim reaksiyonlarına substrat konsantrasyonun bağımlılığını gösteren klasik çalışmalarını gerçekleştirmişlerdir. Bu çalışmada, kinetik verilerin açıklanmasında enzim-substrat kompleksinin oluşumu esas alınmıştır (Robyt ve White 1987) da J. B. Summer ilk enzimi (jack bean urease) kristallendirmiştir. Kısa bir süre sonra J. H. orthrup ve M. Kunitz (1932) pepsin, tripsin ve kimotripsin enzimlerini kristallandirmişlerdir. Bu kristalik bileşiklerin analizi ile enzimlerin protein yapısı ortaya çıkarılmıştır. Enzimler genellikle substratlarına bağlanırlar ve sonra iki veya daha fazla uygun fonksiyonel grupla kataliz işlemini gerçekleştirirler. Bu düzen substrat seçiciliği, reaksiyon seçiciliği ve stereoseçiciliğe neden olur. Bağlanma; metal koordinasyonu, Lewis asit-baz koordinasyonu, organik çözücülerde hidrojen bağı oluşumu vb. ile gerçekleşebilir (Breslow, 1995). Bir katalizin temel özelliği kimyasal reaksiyonun hızı ile ilgilidir. Tüm kataliz türlerinde katalizör substratla birlikte kompleks oluşturur ve bu kompleks, sonunda bozularak katalizör ve ürünler meydana gelir (Laidler, 1958). Enzimler, uygun mikro-çevreler meydana getirirler ve bu mikro çevreler içerisinde substratlar uygun yönelimler içerisinde bulunurlar. Böylece reaksiyonun aktivasyon enerjisi düşürülür ve reaksiyon hızı artar (Matthews, 1993). Pek çok farklı enzim olduğu için, enzimlerin bir takım sınıflandırmalar içerisinde tartışılması daha uygundur. Çeşitli sınıflandırma metotları mevcuttur ancak hiçbiri tamamen tatmin edici değildir. Örneğin katalizlediği reaksiyon bakımından enzimler; hidrolitik enzimler, preteolitik enzimler, karbohidrazlar, esterazlar vb. şeklinde sınıflandırılabilir (Laidler, 1958). Enzimler ayrıca kemoterapik araçlar olarak özellikle kalıtımsal hastalıkların teşhisinde ve tedavisinde diagnostik indikatörler olarak da kullanılmaktadırlar. Ayrıca enzimlerin spesifikliğinin,

25 15 düzenleme özelliğinin, yapısal özelliğinin ve etkileşim mekanizmasının anlaşılması canlı hücrelerin fonksiyonelliğinin anlaşılabilmesi için önemli ipuçları sağlamaktadır (Robyt ve White, 1987) Yapay Enzimler Doğal enzimlerin sahip olduğu etkin katalitik özellikler, bilim adamlarını enzimleri taklit edebilecek yapıları ortaya çıkarmaya yöneltmiştir. Genel olarak bu çalışma sahası biyomimetik kimya ve yapay enzim terimleri ile tanımlamıştır. Yapay enzimlerle ilgili çalışmalar 20. yy ın ortalarında başlamıştır. Örneğin biyomimetik kimya terimi 1972 yılında R. Breslow tarafından ortaya atılmıştır. (Breslow, 1995) Yapay enzimler sahası oldukça aktiftir ve bu alanda önemli başarılar elde edilmiştir. Örneğin yapay enzimler, in vivo reaksiyonları katalizleyen yeni bir sınıf tıbbi araçları temsil ederler. Böyle katalizörler doğal enzimlere göre daha kararlı ve kolay işlenebilir olmalıdır. Ayrıca, doğal biyokimyasal proseslerde rol oynayan enzimler gibi değil, ilgilenilen tüm reaksiyonları katalizleyebilmelidirler (Breslow ve Singh, 1998). Enzim katalizi seçimli kompleksleşme ve geçiş halinin kararlılığına bağlıdır. Bu yüzden yapay enzimlerin geliştirilmesindeki önemli bir hedef, geçiş hali yapısının elektrostatik ve boyutsal özelliklerini tamamlayıcı sentetik reseptörlerin tasarlanmasıdır (Tecilla ve ark., 1990). Enzim katalizli reaksiyonların seçiciliği, enzim katalizli reaksiyonların hızı kadar önemlidir. Enzim, reaksiyonu katalizlemeden önce substrata bağlanır. Seçiciliğin bir yönü farklı moleküllerin olduğu bir ortamda sadece özel bir substratla bağlanabilme yeteneğidir. Örneğin, bu tarz bir seçicilik olmasa protein sentezinin genetik kontrolü mümkün olmazdı. Seçimli bağlanma ayrıca antijenlerde de görülebilir. Antijenler çoğunlukla hedeflerine seçimli olarak bağlanırlar. Çoğu araştırmacı antijen mimikler yapmış ve uygun durumlarda çok güçlü ve seçimli bağlanma gözlemiştir (Breslow ve Singh, 1998). Yapay enzim geliştirilmesindeki bir diğer hedef, yapay enzimlerin, doğal enzimlerle gerçekleştirilemeyen reaksiyonlarda kullanılabilmesidir (Murakami ve ark., 1996). Metal iyonları genellikle çok etkili katalizörler olduğu için, çoğu enzim bunun avantajını kullanır. Yani, metal iyonu katalizini substrat bağlama ile birleştiren enzim mimik sentezi önemli bir konudur. Aslında, literatürde yapay enzim olarak adlandırılan ilk bileşik bir metal iyonun katalitik grubu ile bir siklodekstrinin bağlama grubunu birleştiren yapıdır (Breslow ve verman, 1970).

26 16 Doğal katalizörlerin etki mekanizmalarını taklit eden basit organik sistemlerin ortaya çıkarılmasının önemi iki basit düşünce ışığında anlaşılabilir:»kararlılıklarının az olması ve doğal substratlara karşı seçimli davranmalarından dolayı enzimlerin endüstriyel olarak kullanımları kısıtlanmıştır. Ayrıca biyolojik olmayan koşullar altında kolayca denatüre olmalarından dolayı enzimler geniş çapta kullanılamamaktadırlar.»çok az sayıda enzimatik etkileşim mekanizması anlaşılabilmiştir. Dolayısıyla pek çoğu için spesifik bir yapının bir reaksiyonu nasıl artırdığı ile ilgili öğrenilmesi gerekli çok şey vardır. Enzim modelleri yapı, mekanizma ve hız artışı temelinde enzimlerin etkileşim mekanizmalarının anlaşılması amacıyla önemli bilgiler sunabilmektedir. Bir enzim modeli, substrata bağlanabilecek iyi bir bağlanma bölgesi içermelidir. Bir diğer önemli nokta ise aktif bölge bir ön düzenlenme yapabilmeli ve substratın yönelimine uyum sağlayabilmelidir. Yani molekülün bir bütün olarak esnek özellik göstermemesi bu amaç için bir dezavantajdır. Bu bağlamda, şimdiye kadar, substrata bağlanma özelliğine sahip pek çok yapay enzim geliştirilmiştir Enzim-mimik olarak kaliksarenler Konak ve konuk arasındaki etkileşimlerin kontrol edilebilmesi ile etkin sentetik enzimlerin geliştirilmesi mümkün olabilir (Kelly ve Maguire, 1987). Konak genellikle, büyükçe bir merkezi oyuk ya da boşluğu bulunan enzim veya sentetik siklik bileşik gibi bir büyük moleküldür. Konuk, tek atomlu bir katyon, basit bir inorganik anyon vb. olabilir. Daha kurallı olarak konak, çakışan bağlanma bölgesine sahip moleküler yapı, konuk ise buna uygun bir yapıya sahip türdür (Steed ve Atwood, 2000). Konuk moleküllerin supramoleküler konakların boşlukları içerisine girme yatkınlığı ile yeni kimyasal dönüşümler olabilir ve bu, enzimatik aktivitenin taklit edilebilmesini sağlayabilir. Kaliksarenlerin supramoleküler kimya alanındaki önemi, halkalı yapılarındandır. Kaliksarenin fenolik H bölgesine ya da fenolik birimlerin p pozisyonları metal bağlayıcı gruplarla modifiye edilebilirken, yapıdaki merkezi boşluk, iyonları ve küçük molekülleri kapsülleyebilme yeteneğine sahip olabilir (Şekil 1.16.). Gutsche 1980 lerde bu bileşiklerin enzim-mimik olarak kullanılabileceği düşüncesini ortaya çıkarmıştır. Aslında Gutsche nin kaliksarenlere olan ilgisini, yapay aldolaz mimikle ilgili gerçekleştirdiği çalışma tetiklemiştir. Früktoz-1,6-difosfatın biyosentezinden sorumlu olan bu enzimi taklit etmek için, Gutsche bir pozitif yüklü merkeze yataklık eden bir yapı iskeleti, bir proton çeken

27 17 grup ve özel bir uzaysal düzende hidrojen bağı oluşturucuya ihtiyaç duymuştur. Polimerler ve peptitler lineerdir ve istenilen özellikleri sağlamazlar. İlk olarak 1960 yılında Pedersen tarafından hazırlanan taç eterler çok esnektir ve siklodekstrinlerin fonksiyonlandırılması oldukça zordur. ġekil Enzim-mimik olarak kaliksaren Bu yüzden kaliksarenler büyük bir ilgiye sahiptirler çünkü bunlar siklodekstrinlere benzer yapıya sahiptirler ancak kontrollü bir şekilde kolayca fonksiyonlandırılabilirler. Bu bileşikler sayesinde enzimlerin in vivo katalitik aktivitesine benzeyen in vitro sistemler oluşturulabilir. Kaliksarenler önceden fonksiyonlandırılarak konak molekül olarak dizayn edilebilirler 1.3. Lipaz Enzimler veya biyokatalizörler substrat ile spesifik olarak etkileşen ve sonunda substratın transformasyonu/dönüşümü ile ürün oluşumuna neden olan biyomoleküllerdir. Biyokatalizörlerin inorganik katalizörlere kıyasla üstünlüğü yüksek seçicilik, hızlı reaksiyon, non-toksisite, biyolojik bozunabilirlik, laboratuvar koşullarında tekrar üretilebilirlik, ılımlı ph, sıcaklık ve basınç koşulları sayılabilir (Chaniotakis, 2004). Endüstriyel ölçekte kullanılan enzim gruplarından biri lipazlardır (gliserol ester hidrolazlar E.C ). Lipazlar sulu ortamda esterlerin hidroliz reaksiyonlarını, organik ortamda da esterleşme/transesterleşme reaksiyonlarını kataliz edebilirler. Substratlara karşı gösterdikleri seçicilik lipazların farklı uygulama alanlarında kullanılmalarını sağlamaktadır ve bu alan gün geçtikçe genişlemektedir (Vulfson ve ark., 1994). Lipazlar süt-yiyecek endüstrisinde, yağ endüstrisinde ve sağlık alanında tat ve aroma bileşenlerinin üretiminde kullanılırlar (Mojović ve ark., 1993; Knežević ve ark., 1998; Lortie 1997; Bornscheuer ve

28 18 ark.,2002). Ayrıca lipazlar, deri ve deterjan endüstrisinde sürfaktant üretiminde ve bazı analitik uygulamalarda da kullanılırlar (Šiler-Marinković, 1995). Lipazların önemli bir uygulama alanı da optikçe aktif bileşiklerin üretilmesinde karşımıza çıkmaktadır (Zaks ve Dodds, 1997; Rasor ve Voss, 2001) Ara yüzeysel aktivasyon Lipazların doğal substratları özellikle su içerisinde çözünmez, dolayısıyla da reaksiyon su-lipit ara yüzeyinde kataliz edilir (Arpigny ve Jaeger, 1999; Derewenda ve Sharp, 1993). Çoğu lipazın katalitik etkinlik mekanizması X-ray kristalografi (Maruyamaa ve ark., 2000) çalışmaları ışığında ara yüzeysel aktivasyon olarak adlandırılan bir adımı içerir. Enzimin aktif bölgesi, polipeptit zincirinin sarmal bölümü ile oluşan bir kapak (lid) ile polar çözücülerden izole edildiği için, homojen sulu ortamda bu enzimler kapalı formda (pasif konformasyonda) bulunurlar (Secundo ve ark., 2006; Mingarro ve ark., 1995) (Şekil 1.17.). ġekil Candida rugosa lipaz enziminin canlandırılan resmi. Sarı bölgeler hidrofobik aminoasitleri, maviler diğer bütün aminoasitleri ve kırmızı da aktif bölgeyi göstermektedir. ot: Aktif bölge etrafında hidrofobik halka bulunmaktadır (Gonzalez-avarro ve ark., 2001) Bu kapağın iç tarafı aktif tarafın hidrofobik bölgesine karşılık gelen non-polar aminoasitlerden meydan gelmiştir. Ancak, ikinci bir lipidik faz varlığında, lipaz ara yüzeyde adsorplanır. Kapak, konformasyonel değişikliğe uğrar ve bu durum enzimin hidrofobik kısmını açığa çıkarır ve böylece enzim substratla, non-polar çözücü ile veya bir

29 19 hidrofobik polimer taşıyıcı ile etkileşebilecek hale gelir (Gonzalez-avarro ve ark., 2001; Palomo ve ark., 2005) (Şekil 1.18.). Lipazlar α/β kıvrımlarına sahip monomerik proteinlerdir. Bu yapıda β yaprağı α sarmalları ile çevrelenmiştir (Tyndall ve ark., 2002; Jeong ve ark., 2002). Lipazların katalitik merkezi Ser-Asp (veya Glu)-His üçlüsünden oluşur. Katalitik serin kalıntısı bir klasik pentapeptittir. Diğer klasik yapısal element amit H gruplarından oluşmuş oksianyon oyuğudur. ksianyon oyuğu, ara yüzeysel aktivasyona maruz kalan lipazlarda kapalı konformasyondan açık konformasyona geçerken oluşur. ġekil Aktif bölgenin ara yüzeyde etkin hale dönüşmesinin şematik gösterimi Lipaz kaynakları Lipazlar bitki, hayvan ve mikroorganizma kaynaklı olup, lipit üretiminde önemli bir rol üstlenirler. Bu enzimler lipitlerin bir organizmadan diğerine transferini kolaylaştırmak için kullanılan sindirim enzimleridir ve organizma içerisinde enerji kaynağı olarak kullanılan yağların taşınması ve biriktirilmesi için kullanılırlar. Çizelge 1.2. de yaygın kullanılan lipazlar verilmiştir.

30 Diğer Ġsimler Candida cylindracea Thermomyces lanuginosa Penicillium cyclopium Mucor javanicus Mucor miehei R. javanicus, R. delemar, Ticari Kaynağı ve Ġsim Amano, Fluka, Sigma Amano (lipase (AY), Meito Sangyo (lipase MY, lipase F-360 ovozymes (TL IM, SP 524, Lipolase ) Amano (lipase G) Amano (lipase M) Amano (MAP), ovozymes (RM IM, Lipozyme ), Fluka Amano (lipase F), Amano (lipase D), Amano (lipase ), Fluka, Sigma, Seikagaku Kogyo Co. (Japan) ovozymes (SP 526) ovozymes (SP 525 or ovozym435) b Sigma Amano (lipase A, AP), Röhm, ovozymes (Palatase ) Amano (lipase L) Amano (lipase R) Amano (P, P-30, PS, LPL-80, LPL-200S), Fluka, Sigma Amano (lipase AH) Amano (lipase AK), Amano (lipase YS), Biocatalysts Ltd. lipase B, Wako Pure Chemical (saka) Sigma, Genzyme, Asahi Chemical, Biocatalysts Ltd. Amano (K-10) Meito Sangyo (lipase QL) 20 Çizelge 1.2. Yaygın olarak kullanılan lipazlar CVL d Bakteriyel Lipazlar c R. niveus a Kısaltma PPL CRL HLL PcamL RJL RML RL CAL-A CAL-B AL CLL ProqL PCL PCL-AH PFL PfragiL Lipazın Kaynağı Memeli Lipazı Porcine pancreas Fungal Lipazlar Candida rugosa Humicola lanuginosa Penicillium camembertii Rhizomucor javanicus Rhizomucor miehei Rhizopus oryzae Candida antarctica A Candida antarctica B Aspergillus niger Candida lipolytica Penicillium roquefortii Pseudomonas cepacia Pseudomonas cepacia Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fragi Chromobacterium viscosum Pseudomonas sp. Alcaligenes sp. Burkholderia cepaciac Pseudomonas glumae

31 Lipazların özellikleri (Öztürk, 2001) Lipazların optimum ph ı Lipazlar aktif bölgelerindeki kalıntılarının iyonlaşma durumuna ve orijinlerine bağlı olarak sadece belirli ph larda katalitik olarak aktiftirler. Bazik, asidik ve nötral kalıntılar lipazın aktif bölgesinin içindedir ve bu yüzden katalitik bölgedeki kalıntılar sadece özel bir iyonlaşma durumunda aktiftir. Lipazlar geniş bir asidik ve bazik ph değerlerinde (yaklaşık 4 den 10 a kadar) bulunabilmesine rağmen, çoğu lipazın optimum ph ı 7 ile 9 arasında değişir. Mikrobiyal lipazlar ph arasında oldukça iyi aktivite gösterirler. Termal kararlılık ve optimum sıcaklık Enzimlerin ısı karşısındaki kararlılığını iki faktör etkileyebilir. Bunlardan ilki enzim yapısıdır. Enzim molekülünde hidrofobik amino asit içeriğinin fazla olması sıkı bir yapı sağlar ki bu da enzimin dış çevredeki bir değişiklikten kolaylıkla bozunmasını engeller. Ayrıca, disülfit köprüleri ve diğer bağlar yüksek ısı ile kimyasal bozunmaya karşı dayanıklılığı artırır. İkinci olarak, yapıda bulunabilecek polisakkarit ve +2 yüklü katyonlar gibi spesifik bileşenler molekülü kararlı hale getirebilir. Genellikle lipazların geniş bir sıcaklık aralığında aktif olduğu bilinmektedir. Hayvansal ve bitkisel kaynaklı lipazların ısıya karşı kararlılıkları genellikle mikrobiyal lipazlardan daha azdır. Pankreatik lipazlar 40 o C nin üzerinde saklandığında aktivitelerini kaybederken Aspergillus niger lipaz 50 o C de kararlıdır. Molekül kütlesi Farklı kaynaklardan elde edilen lipazların molekül kütleleri çeşitlilik gösterir ancak bu sayı genellikle 20,000 ile 60,000 Da arasında değişir. Bazılarının molekül kütlesi çok yüksektir, örneğin Candida cylindraceae lipazınki 120,000 Da dır. Bunun sebebi düşük molekül kütleli protein moleküllerinin kendi kendine birleşmesiyle açıklanabilir. Pek çok enzim kda arasında molekül kütlesine sahiptir fakat Geotrichum candidum (GCL) ve Candida rugosa (CRL) gibi lipazlar yaklaşık 60 kda gibi yüksek molekül kütlesine sahiptir.

32 22 İzoelektrik nokta et yükün sıfır olduğu nokta izoelektrik nokta olarak adlandırılır ve pi şeklinde gösterilir. pi yakınında, proteinler daha az çözünme eğilimindedirler ancak pi noktasından uzaklaştıkça proteinler daha fazla çözünme eğilimindedirler. Sulu çözelti içerisinde, yüklü gruplar polar su molekülleri ile etkileşirler ve doğal olarak hidrofobik olan proteini kararlı hale getirirler. Az sayıda yüklü grup ve çok sayıda alifatik veya aromatik yan zincir proteinin su içerisinde daha az çözünmesine neden olur. pi noktasından uzaklaştıkça, iyonize olan grup sayısı artar ve çözünürlük artar. Bu yüzden, izoelektrik nokta, proteinlerin çözünürlüklerini ve proteinler arasındaki etkileşimleri etkileyen önemli bir parametredir. Aminoasit bileşimi Lipazların lipit-su ara yüzeyinde adsorpsiyonu lipaz katalizli reaksiyonlar için gereklidir. Bu yüzden enzimin amino asit bileşiminin bilinmesi yapı-işlev ilişkisinin belirlenmesi için önemlidir. Mikrobiyal enzimlerin amino asit bileşimi Çizelge 1.3. de görülmektedir. Çizelge 1.3. Mikrobiyal lipazların aminoasit bileşimi Aminoasit kalıntısı Bacillus spp. P. nitens C.viscosum G. candidum C. rugosa A B Phenylalanine Tyrosine Leucine Isoleucine Methionine Valine Half-cystine Alanine Glycine Proline Glutamic acid Serine Threonine Aspartic acid Arginine Histidine Lysine Tryptophan TTAL Aminoasit kalıntıları, kalıntılar/mol enzim olarak ifade edilmiştir

33 Lipaz katalizli reaksiyonlar Lipaz katalizli reaksiyonlar iki ana kategori içerisinde sınıflandırılabilirler. Bunlar ester sentezi ve hidrolizdir. Hidroliz reaksiyonu sulu ortamda, sentez ise organik ortamda gerçekleştirilir. Reaksiyonlar aşağıdaki gibi gösterilebilir (Şekil 1.19.): Hidroliz: R 1 CR 2 + H 2 Ester Sentezi: R 1 CH + R 2 H Asidoliz: R 1 CR 2 + R 3 CH ĠnteresterleĢme: R 1 CH + R 2 H R 1 CR 2 + H 2 R 3 CR 2 + R 1 CH R 1 CR 2 + R 3 CR 4 R 3 CR 2 + R 1 CR 4 Alkoliz: R 1 CR 2 + R 3 H R 1 CR 3 + R 2 H ġekil Lipaz katalizli reaksiyonlar Son üç reaksiyon genellikle transesterifikasyon olarak adlandırılır. Hidrolazlar olarak lipazlar; gıda, deterjan, kozmetik, deri, süt ve kağıt gibi çeşitli endüstri alanlarında kullanılabilirler. Kiral ilaçların sentezlenmesinde enzimlerin özellikle lipazların kullanılması genel bir metot olarak kabul görmektedir (Margolin, 1993; Patel,2003). Yıllar geçtikçe de ilaç üretiminde enzimlerin katalizör olarak kullanıldığı ilginç çalışmalar yapılmaktadır. Ayrıca lipazlar organik çözücülerde enzimatik hidroliz ve transesterleşme reaksiyonları ile tek-izomerli kiral bileşik hazırlanmasında da kullanılmaktadır (Gotor, 2002). Asimetrik sentezde lipazların uygulanmasına örnek olarak rasemik alkollerin, asitlerin, esterlerin veya aminlerin kinetik rezolüsyonu ve prokiral bileşiklerin desimerizasyonu sayılabilir (Ghanem ve Aboul-Enein, 2004; Garcia-Urdiales ve ark., 2005). Literatürde tek enantiyomerli ilaç üretimi konusunda bir hayli çalışma bulunmaktadır. Ayrıca, prokiral ilaçların kinetik rezolüsyonu (KR) veya enantiyoseçici enzimatik desimerizasyonu (EED) konularına pek çok ilaç şirketlerince de özel bir önem verilmektedir (Straathof, 2002).

34 24 Her yıl yağ endüstrisi alanında çoğunlukla hidroliz ve transesterifikasyon reaksiyonları için milyonlarca ton yağ kullanılmaktadır. Transesterifikasyonla dönüştürülen yağ hacmi yakıt endüstrisinde fatty asit ester (biyodizel olarak da bilinir) üretimi için gelen talep doğrultusunda giderek artmaktadır. Hidroliz ve transesterifikasyon için kullanılan şu anki prosesler normal olarak inorganik bir homojen katalizör, yüksek sıcaklık ve basınç gerektirir. Bu metotlarda enerji kullanımı oldukça fazladır çünkü şiddetli koşullar (sıcaklık ve basınç) yan reaksiyonların oluşmasına neden olur ve sonuç olarak gerekenden daha fazla saflaştırma işlemi gerekir. Ayrıca, ısıya dayanaklı doymamış yağlar bir ön hidrojenasyona tabi tutulmadan bu proseste kullanılmazlar (Saxena ve ark., 1999). Bu bağlamda, yağ kimya endüstrisinde lipazların kullanımı oldukça önemli bir konudur. Örneğin bir Japon firması sabun üretiminde ticari olarak Candida rugosa lipazları kullanmıştır. Bu çalışma ile geleneksel metottan (Colgate-Emery process) elde edilenden daha üstün özelliklere sahip ürünler elde edilmiştir. Üstelik enzimatik metotların kullanımı ile gerçekleşen bu proses maliyet olarak uygundur. Ancak enzimlerim kullanımı henüz yeterli derecede ticari ilgi kazanamamıştır. Bunun için farklı nedenler sayılabilir: Yatırımcıların geleneksel metotlar için ısrarcı olması, büyük ölçekli lipaz kullanımın getireceği ekonomik külfet, istenilen oranda üretim için enzimatik reaksiyonların kontrol edilememesi korkusu. Bu yüzden enzimlerin büyük çaplı uygulama alanları için etkili, kararlı ve kullanımı kolay sistemlerin geliştirilmesine bağlıdır. Bu noktada, immobilizasyon belki de bu tarz enzimlerin geliştirilmesi için en uygun stratejidir (Gao, 2004) Enzim Ġmmobilizasyonu Yıllardır farklı uygulamalar için immobilize enzim geliştirilmesi ile ilgili pek çok çalışma yapılmaktadır. Bu uygulamalarda immobilize enzimlerin yeniden kullanılabilirliği, üretim maliyetinin düşüklüğü ve prosesin kontrol edilebilmesi önemli avantajlar arasında sayılabilir. Aşağıda, immobilize enzimlerin genel kullanım alanları şematik olarak (Şekil 1.20.) gösterilmiştir (Vandamme, 1993; Cristallini ve ark., 1997).

35 25 İmmobilize Enzimlerin Uygulama Alanları Heterojen Biyokatalizörler Seçici Adsorbentler İlaçlar Analitik Cihazlar Katı-faz Protein Kimyası ġekil İmmobilize enzimlerin kullanım alanları Ancak, immobilize enzimin doğası ne olursa olsun ya da immobilize enzim nasıl hazırlanırsa hazırlansın, tanım olarak herhangi bir immobilize enzim, iki temel fonksiyona sahip olmak zorundadır. Bunlardan ilki ayırmaya (örn. katalizörlerin uygulama ortamından izolasyonu veya yeniden kullanımı, prosesin kontrolü) yardım etmek için tasarlanan nonkatalitik fonksiyonlar, diğeri ise katalitik fonksiyonlardır. Katalitik fonksiyonlar istenen zaman ve bölgede, hedef bileşikleri dönüştürmek için tasarlanır. on-katalitik fonksiyonlar, büyük oranda immobilize enzimin özellikle şekil, büyüklük, sıkılık ve seçilen taşıyıcının uzunluğu gibi geometrik özelliklere bağlıdır. ysa katalitik fonksiyonlar, aktivite, seçicilik, kararlılık, ph ve sıcaklık profili gibi katalitik özelliklerle ilgilidir. Genellikle bu iki bileşenin (katalitik ve nonkatalitik özellikler) özelliği immobilize enzimin en son uygulama alanını belirler. Bu yüzden, enzim immobilizasyonunda yapılacak ilk iş uygun bir immobilizasyon metodunun seçilmesidir (Cao, 2005) Ġmmobilizasyon metotları Enzim immobilizasyon teknikleri konusunda çok fazla yayın bulunmaktadır (Messing, 1975; Bickerstaff, 1997; Katchalski-Katzir ve Kraemer 2000; Gemeiner, 1992). Amino açilaz, penisilin G açilaz, pek çok lipaz, proteazlar, nitrilazlar, amilaz, invertaz, vb. gibi yüzlerce enzim farklı şekillerde immobilize edilerek endüstriyel proseslerde kullanılmaktadır. Enzim immobilizasyonu ile ilgili temel metotlar sadece birkaç kategoriye ayrılmasına rağmen adsorpsiyon, kovalent bağlama, tuzaklama, tutuklama, çapraz-bağlama ve bu orijinal metotlar temelinde yüzlerce kombine metot geliştirilmektedir (Mosbac, 1980; Katzbauer ve ark., 1995).

36 Adsorpsiyon-temelli immobilizasyon Adsorpsiyon temelli enzim immobilizasyonu, kullanılan ilk immobilizasyon metotları arasındadır. Bununla ilgili ilk çalışma 1916 yılında illson ve Griffin tarafından yapılmıştır (elson ve Griffin, 1996). Bu çalışmada invertaz, fiziksel adsorpsiyonla kömür üzerinde tutturulmuştur. Endüstriyel olarak kullanılan ilk immobilize enzim ise amino asit açilazın selülöz üzerinde adsorpsiyonu ile hazırlanmıştır (Tosa ve ark., 1967). Bu öncü çalışmalardan bu yana adsorpsiyonla enzim immobilizasyonu aşağıdaki avantajlardan dolayı geniş çapta araştırılmıştır. Tersinirlik; hem proteinin saflaştırılmasını hem de taşıyıcıların yeniden kullanılması Basitlik; enzim immobilizasyonunun ılımlı koşullar altında yapılabilmesi Kovalent immobilizasyonun (Albayrak ve Yang, 2002) tersine, herhangi bir kimyasal modifikasyon olmadığı için aktivitenin büyük oranda korunması olanağı (Sharma ve Yamazaki, 1984); Genellikle adsorpsiyon yoluyla immobilize edilen enzimler taşıyıcıdan uzaklaşma yönünde hareket ederler çünkü enzim ve taşıyıcı arasında zayıf etkileşimler bulunmaktadır ve bu etkileşim iyonik şiddet, ph gibi desorptif kuvvetlerle engellenebilir. Bazen enzimler uygun taşıyıcılar üzerinde güçlü bir şekilde adsorplanırlar (Rexova-Benkova ve ark., 1982) veya adsorpsiyon, uygulama koşulları altında yeterince güçlüdür. Bu nedenle, son zamanlarda bu metodun doğasından kaynaklanan dezavantajları ortadan kaldırmak için pek çok varyasyon geliştirilmektedir. Örnek olarak, adsorpsiyon-çapraz bağlama, modifikasyon-adsorpsiyon, seçici adsorpsiyon-kovalent bağlama ve adsorpsiyon-kaplama sayılabilir Kovalent bağlanma ile enzim immobilizasyonu Uygun taşıyıcılara enzimlerin kovalent bağlanması enzim immobilizasyonu için geliştirilen ikinci metottur. Kovalent bağlanma ile enzim immobilizasyonu günümüzde kullanılan önemli bir metottur çünkü kovalent bağlar genellikle enzim ve taşıyıcı arasında daha güçlü bir etkileşime neden olur. Bu yüzden, enzimin kullanılan matriksten sızması minimum düzeydedir.

37 27 ġekil Enzimlerin taşıyıcı üzerinde kovalent immobilizasyonu: (A) Enzimin kovalent bağ yapan fonksiyonel grubu; (B) Enzim ile taşıyıcıyı bağlayan grup (linker); (C) Taşıyıcı; (D) Ara boşluk Genellikle, enzimlerin taşıyıcılara kovalent bağlanması ile gerçekleştirilen bu immobilizasyon, enzim yüzeyindeki aktif amino asit grupları ve taşıyıcı yüzeyinde bulunan aktif fonksiyonel gruplar arasındaki kimyasal reaksiyona dayanır (Şekil 1.21.) (Cao, 2005). Bu metot güçlü bir enzim immobilizasyon metodudur. Çünkü bağlanma tersinmezdir ve enzim konformasyonundaki çok noktalı bağlanmadan dolayı yapı daha kararlı ve daha sağlamdır Enzim hapsetme Enzimlerin hapsedilmesi kelime anlamından da anlaşılacağı gibi, enzim moleküllerinin veya enzim çözeltilerinin bir matriks içerisinde tutulmasıdır. Matriks, katalitik bileşenin (çözünebilen/çözünemeyen enzim preparatının) bir sıvı ortamda (polimer çözeltisi) yayılması ile hazırlanır. Bu şekilde, enzimin kimyasal veya fiziksel metotla tutulduğu çözünmeyen bir matriks oluşur (Şekil 1.22.).

38 28 ġekil Biyokatalizörlerin hapsedilmesi Hapsetme tekniği enzim immobilizasyon metotları arasındaki en basit metotlardan biridir. Bu metot kullanılarak birden fazla enzim eş zamanlı olarak immobilize edilebilir (Wei ve ark., 2002) lilerin ortalarında enzimlerin fiziksel olarak inorganik bir jel matriks (cam) içerisinde biyolojik aktivitelerinin korunarak immobilize edilebileceği ilk kez gösterilmiştir (Dickey, 1995). Ancak, enzim immobilizasyonunda hapsetmenin önemi, 1960 lı yılların başında Bernfeld ve Wan (1963) tarafından enzim moleküllerinin polimerleşme ile oluşan jel matriks içerisinde hapsedilebileceği gösterildikten sonra fark edilebilmiştir. Daha sonra Mosbach tarafından bu metodun kullanımı daha geniş bir sahaya yayılmıştır (Mosbach ve Mosbach, 1966). Damla, membran, film, disk ve lif şekillerinde hazırlanabilen matriksler küçük substrat moleküllerine karşı geçirgen olmalıdır. rijinal hapsetme tekniklerinde enzimler (veya tüm hücreler) ilk olarak bir çözelti içerisinde dağıtılmak ve fiziksel bir bariyer oluşturma amacıyla katılaştırılmak zorundaydı. Günümüzde, matriks oluşumu için farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar arasında çapraz bağlama, polimerizasyon gibi kimyasal yollar, fiziksel jelleştirme gibi fiziksel yollar veya bu iki yolun birleşimi şeklinde farklı yolar kullanılmaktadır. Hapsetme için kullanılacak materyaller ve hapsedilecek enzimler arasındaki etkileşime bağlı olarak, hapsetme metodunun farklı varyasyonları bulunmaktadır. Bunlara örnek olarak: Kovalent yolla hapsetme, çapraz-bağlamayla hapsetme, adsorpsiyonla hapsetme, ekleme-hapsetme sayılabilir (Kil deeva ve ark., 1968) Sol-jel bazlı enzim immobilizasyonu Geleneksel silika bazlı sol-jel prosesi, sol olarak bilinen silikanın homojen bir süspansiyonunu oluşturmak için tetrametoksisilan (TMS) ya da tetraetoksisilan (TES)

39 29 gibi bir alkoksitin asit ya da baz yardımı ile hidrolizini içerir. luşan sol daha sonra olgunlaştırma ve kurutma işlemine maruz bırakılır ve böylece daha fazla polikondenzasyon reaksiyonu ve çözücü uzaklaşması olur. Böylece polikondenzasyonla jel oluşumu gerçekleşir ve enzim jel içerisinde hapsedilir. Bu basamaklar Şekil de özetlenmiştir. A) R R Si R H H + /H - 4 H 2 H Si H 4 RH R H R H R' Si R H + /H - 3 H 2 R' Si H 3 RH R H B) H H H H H Si H R' Si H H + /H - H Si Si R' H 2 H H H H C) n H H Si H H Si H R' H + /H - Si Si Si R' Si Si H R' Si Si R' ġekil Sol-jel matriksinin hazırlanması Sahip olduğu pek çok özelliğinden dolayı sol-jel prosesi önemli bir immobilizasyon metodudur. Bunlar arasında: (1) Yüzey alanı, tanecik büyüklüğü, morfoloji gibi kontrol edilebilir mikro yapı. Prekürsör tipi, katalizör tipi, prekürsörler oranı, su/prekürsör oranı, kurutma ve

40 30 olgunlaştırma prosedürleri gibi proses parametreleri değiştirilerek bu özellikler kontrol edilebilir. (2) Mükemmel termal dayanıklılık, kimyasal inertlik, foto- ve elektro- kimyasal bozulmaya karşı direnç. (3) Enzimin bütünlüğünü korumak için çözücü içerisinde sahip olunan mükemmel mekanik özellikler. (4) Etkin kafeslemeden dolayı enzim ayrılmasının engellenmesi (Braun ve ark., 1990) sayılabilir. İlk başarılı sol-jel bazlı enzim immobilizasyonu, 1990 yılında Avnir ve ark. tarafından alkali fosfatlar için kullanılmıştır. Enzimin katalitik aktivitesinin artmasında, hapsetmenin homojen olmasının ve sol-jelin mikro-çevresinin önemli olduğu bildirilmiştir. Enzimin aktivitesini kaybetmesi polipeptit zincirinin kapanması veya açılmasına bağlı olduğundan, bu çalışmada sıkı Si 2 kafesinin enzimin sağlamlığını arttığını vurgulanmıştır. zamandan bu yana enzimler, proteinler, antikorlar, antijenler, virüsler, bakteriler, hücreler gibi biyolojik olarak aktif türler ince filmler, monolitler, fiberler ve granüller halinde farklı seramik ve cam matrisler içerisinde sol-jel prosesi ile immobilize edilmektedir (Avnir ve ark., 1994; Avnir, 1995). İmmobilize enzimler heterojen biyokatalizör, biyosensörler vb. olarak kullanılmaktadırlar. Sol jel bazlı enzim immobilizasyonu alanındaki araştırmalar sol-jelin kimyasal bileşimi, katalizör tipi, su/silan oranı kurutma ve gelişme prosesi gibi pek çok yönü içerir. Bu proses parametreleri sol-jel matriksin yapısıyla yakından ilişkilidir. Bu ise immobilize enzimin kararlılığı ve aktivitesinin korunması ile ilgilidir Enzim immobilizasyonunda kullanılan sol-jel matriksinin kimyasal yapısı: Silika sol-jeller için temel kimyasal yapı taşları TMS ve / veya TES dur. luşan sol-jel, sert, inert ve porözlü olan saf Si 2 ağıdır. İnorganik ağın mekanik dayanıklılık kazanması için termal işleme maruz bırakılması gerekir. Glikoz oksidaz (Chen ve ark., 1998) ve turp peroksidazı (Wei ve ark., 1999) gibi bazı enzimler TES ya da TMS dan türemiş olan saf -(-Si 2 -)-n matriksler içerisinde immobilize edildiği zaman iyi aktivite gösterirler. Ancak lipazları da içeren pek çok enzim saf -(-Si 2 -)-n matriks içinde immobilize edildiği zaman iyi aktivite gösterememiştir. Bir biyolojik birim olarak enzimlerin, saf -(-Si 2 -)-n matriksinin sağlayamadığı bir hidrofobik çevre içindeki fonksiyonelliğinin daha iyi olabileceği düşünülmüştür. TMS veya TES ile birlikte

41 31 yardımcı prekürsörler olarak organik olarak modifiye edilen alkoksitlerin kullanılması, immobilize enzimlerin aktivitesinde iyileştirme sağlamıştır. Reetz ve ark., (1996), lipazların immobilizasyonu için TMS ile birlikte yardımcı prekürsör olarak RSi(CH 3 ) 3 gibi organik olarak modifiye olmuş alkoksitler veya 1,6-bis(trimetoksisilil)-hekzan kullanmışlardır. R olarak CH 3, -C 2 H 5, n-c 3 H 7, n-c 4 H 9, n-c 18 H 37 kullanılmıştır. İmmobilize lipazların kısmi aktivitesi alkil gruplarının zincir uzunluğu artıkça keskin bir şekilde arttığı belirlenmiştir (CH 3 <C 2 H 5 <n-c 3 H 7 <n-c 4 H 9 ). Ancak R gruplarının büyüklüğündeki daha fazla artış immobilize lipazın aktivitesinde sadece küçük bir artış sağlamaktadır. Ayrıca enzim immobilizasyonu için feniltrimetoksisilan (Wei ve ark., 1999), filosilikat (Hsu ve ark., 2002), 3-aminopropiltrietoksisilan (Venton ve Gudipati, 1995) and 3- glisidoksipropilltrimetoksisilan (Gill ve Ballesteros, 1996) gibi diğer organik olarak modifiye edilmiş alkoksitler yardımcı-polimerleştirici olarak TMS ile birlikte kullanılmışlardır. rganik olarak modifiye edilmiş sol jeller içerisinde immobilize edilmiş enzimler saf-(-si 2 -)-n matriksi içinde immobilize edilmişlerden daha yüksek aktivite göstermişlerdir. Bu sonuç organik yapı ile sağlanan bir hidrofobik mikro çevreye dayandırılmıştır. Katalizörler, hidroliz ve kondenzasyon kinetiğini kontrol ederek sol-jel yapısını etkilerler (Hench, 1998). Hem asitler hem de bazlar silika silanların hidrolizinde ve kondenzasyonunda kullanılırlar. Alkoksi silanların hidroliz reaksiyonu silisyum atomu üzerindeki su oksijeninin nükleofilik atağı ile olur (Wright ve Sommerdijk, 2001). Hem hidroliz hem de kondenzasyon kimyasını açıklamak için kullanılan mekanizmalar nükleofilik sübstitüsyon ve katılma reaksiyonlarıdır. Bir asidik kataliz, hızlı hidroliz ve yavaş kondenzasyon ile sonuçlanır ve çapraz bağlı bir ağ meydana gelir. Bu ise düzgün olarak dağılmış küçük yarık şekilli ve dar porlara sahiptir (Ro ve Chung, 1991). Tersine bazik kataliz yavaş hidroliz ve hızlı kondenzasyon ile sonuçlanır. Hidroliz olan silanlara erişimin kısıtlılığından dolayı, pürüzlü silindirik ve eşit olmayan porlara sahip jel meydana gelir. Baz katalizli sol jeller normal olarak yüksek sıcaklıkta (örneğin 1000 o C) bile dehidroksilat olmayan serbest H grupları bulundururlar (Asomoza ve ark., 1998) Katkı maddesi-kontrollü enzim aktivitesi Diğer immobilize enzim tiplerindeki gibi, hapsetme ile elde edilen pek çok immobilize enzimin aktivitesi de katkı maddelerine bağlıdır (Drevon ve Russell, 2002; Avnir ve ark., 1994; Ghanema ve Schurig, 2003; Shchipunova ve ark., 2004). Özellikle

42 32 sol-jel matriks içerisinde hapsedilen enzimler için bu durum daha önemlidir (Soares ve ark., 2004; Pandey ve ark., 1999). Enzim hapsetme prosesi esnasında ilave edilen katkı maddeleri genellikle aşağıdaki işlevlere sahiptir (Cao, 2005): Difüzyondan kaynaklanan sınırlamaları azaltma Gözenekliliği artırma Enzim aktivitesi üzerine etki Enzim konformasyonunu düzenleme Bazı katkı maddeleri gözenekli matriks yapısının oluşumunu destekleyerek etkin difüzyon katsayısını artırabilirler. Sol-jel prosesinde pek çok bileşik katkı maddesi olarak kullanılabilmektedir. Bunlar arasında; taç eterler, kaliksarenler, polisakkaritler, yüzey aktif maddeler, metal tuzlar sayılabilir.

43 33 2. KAYAK ARAġTIRMASI 2.1. Lipaz Ġmmobilizasyonu Lipazlar (triaçilgliserol açilhidrolazlar, EC ), endüstriyel biyoteknoloji ve modern organik kimya alanında çok yönlü biyokatalizörler olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadırlar. Substratın yapısına ve reaksiyon koşullarına bağlı olarak lipazlar; hidroliz, esterleşme, transesterleşme, aminoliz gibi enantiyo- ve bölge-seçimli reaksiyonları katalizlemek için kullanılan çok yönlü enzimlerdir (Vaidya ve ark., 2008; Liljeblad ve ark., 2010). İmmobilizasyon yoluyla lipaz enzimlerinin operasyonel kararlılıklarının ve katalitik etkinliklerinin iyileştirilebilmesi amacıyla yıllardır pek çok çaba sarf edilmektedir. Aslında immobilizasyon sayesinde tekrar kullanılabilirliğin arttığı, ürünlerin ortamdan kolay ayrılabildiği, kataliz işleminin ve proses kontrolünün daha işlevsel olduğu da iyi bilinmektedir. Bu bağlamda, farklı kaynaklardan edinilen lipaz enzimleri birinci bölümde anlatılan farklı metotlarla immobilize edilmektedir. Genel olarak lipaz enzimleri; kovalent bağlanma yoluyla (Da Ros ve ark., 2010), fiziksel adsorpsiyonla (Tzialla ve ark., 2010) veya iyonik etkileşimlerle ya da hapsetme yöntemleri (Reetz ve ark., 2003; Yilmaz ve ark., 2010a) ile farklı destekler üzerine bağlanmaya çalışılmaktadır. İmmobilizasyon işlemleri esnasında kullanılan immobilizasyon stratejisinin seçimi veya kullanılacak destek materyalinin seçimini içeren pek çok faktör enzimlerin aktivitesini, tekrar kullanılabilirliğini ve geri kazanımını önemli ölçüde etkilemektedir (Soares ve ark., 2001; Yang ve ark., 2009). Ayrıca, immobilizasyon stratejilerinin enzimlerin katalitik ve enantiyo seçici özelliklerini etkiledikleri de bilinmektedir (Palomo ve ark., 2002; Barbosa ve ark., 2010). Dolayısıyla farklı immobilizasyon tekniklerinin kullanımı, aktivite/seçicilik özellikleri farklı enzimlerin ortaya çıkarılmasını sağlamaktadır (Reetz ve ark., 2003; Mateo ve ark., 2007). Mevcut immobilizasyon metotları incelendiği zaman, enzimlerin inorganik polimer matriksler içerisinde hapsedilmesi ile gerçekleştirilen enzim immobilizasyonunun son zamanlarda ilgi duyulan önemli bir konu olduğu görülmektedir. Sol-jel enzim immobilizasyonu adıyla karşımıza çıkan bu metot immobilize enzim elde etmek için etkili ve kolay bir yol olarak geliştirilmiştir (Avnir ve ark., 1994). Bu tekniği Avnir ve ark. genelleştirmiştir (Avnir ve ark., 1994; Johnson ve ark. 1971; Glad ve ark. 1985; Avnir, 1995; Livage, 1996, Gill, 2001, Soares, 2004). Genel olarak bu metot, enzim varlığında

44 34 tetraetoksisilanların (Si(R) 4 ) (Hench ve ark., 1990; Brinker ve ark., 1990) asit ya da baz katalizli hidrolizini içermektedir. Mekanistik olarak silan prekürsörü hidroliz olur ve Si 2 oluşarak çapraz bağlanır ve enzimi içerisine hapseder. Çoğunlukla TMS ve TES gibi prekürsörlerin kullanıldığı bu tarz hapsetme teknikleri ile çok sayıda biyolojik olarak aktif tür başarılı bir şekilde immobilize edilebilmektedir (Avnir ve ark., 1994, Avnir, 1995; Livage, 1996, Gill, 2001). Ancak lipaz enziminin immobilizasyonunda bu metot başarılı olamamıştır. Örneğin Reetz ve ark. (1995) izooktan içerisinde oktanol ile laurik asitin esterifikasyonunu (Şekil 2.1.) model reaksiyon olarak seçtiklerinde sol-jel immobilize lipaz düşük aktivite göstermiştir. H H lipaz C 8 H 17 H 2 ġekil 2.1.ktanol ile laurik asitin esterifikasyonu Dolayısıyla, bu başarısızlığı gidermek için farklı yaklaşımlar ortaya çıkarılmaya çalışılmıştır. Örneğin Si 2 içerisindeki mikro-çevrenin çok polar olabileceği düşünülerek, içerisinde hidroliz olmayan R alkil grubu bulunduran Si(CH 3 ) 4 ve RSi(CH 3 ) 4 (Schmid ve ark., 1998) veya polidimetilsiloksan (PDMS) tipindeki alkil karışımı kullanılmıştır (Şekil 2.2.) (Reetz ve ark., 1995). RSi(CH 3 ) 3 + Si(CH 3 ) 4 H 2 lipaz immobilize lipaz 4a b c d e R = CH 3 (MTMS) R = C 2 H 5 (ETMS) R = n-c 3 H 7 (PTMS) R = n-c 4 H 9 (BTMS) R = i-c 4 H 9 (PTMS) 5 (TMS) ġekil 2.2. Sol-jel immobilize lipaz eldesi

45 35 Araştırmalar temelinde, lipaz immobilizasyonunun başarılı olması için alkil-alkoksi silanlar gibi organik olarak modifiye edilen prekürsörlerin kullanılması gerekliliği ortaya çıkmıştır. Bu durum hidrofobik olan silisyum oksit matriksinin hapsedilen lipazın ara yüzeysel aktivasyonunu kolaylaştıracağı ve uygun hale getireceği düşüncesi ile izah edilebilir. Reetz ve ark. (1995; 1996a) nın bu bağlamda yaptığı çalışmalarda lipaz aktivitesi, kullanılan model reaksiyonda geleneksel lipaz tozu kullanılarak elde edilen sonuca göre % oranında artmıştır. Bu çalışmalarda kısmi aktivite, ; her bir reaksiyon için başlangıç hızı olmak üzere, immobilize lipaz / ticari lipaz olarak tanımlanmış ve genel bir deneysel protokol olmamasına rağmen, çalışmada RSi(CH 3 ) 4 ün Si(CH 3 ) 4 e optimum oranı 5:1 olarak bulunmuştur. Bu çalışmalarda genellikle prekürsör olarak metiltrimetoksisilan CH 3 Si(CH 3 ) 4 ve katkı maddesi olarak lipaz için stabilizatör işlevi gördüğü düşünülen polivinil alkol (PVA) kullanılmıştır (Reetz ve ark., 1995; Reetz ve ark., 1996a). Diğer çalışma grupları da benzer hidrofobik alkil silanlar kullanmıştır (Furukawa ve ark., 2002; Kato ve ark., 2002; Soares ve ark. 2004; Yang ve ark., 2009; Yılmaz ve ark., 2010). Örneğin Soares ve ark. (2004) TES nin hidrolizi ile oluşan jel içerisinde CRL nin immobilizasyonunu fiziksel adsorpsiyon, kovalent bağlanma yöntemleri ile kıyaslamışlar ve sonuç olarak PVA varlığında sol-jel hapsetme yönteminin daha başarılı sonuçlar ortaya çıkardığı vurgulanmıştır. A) B) Enzim ġekil 2.3. Kovalent ve sol-jel metotla immobilizasyon Yılmaz ve ark. nın (2011) çalışmasında ise CRL glutaraldehitle-aktifleştirilmiş aminopropil cam parçacıkları üzerinde hem kovalent yolla hem de sol-jel yöntemi ile (Şekil 2.3.) immobilize edilmiş ve immobilize enzimin katalitik etkinliği p-

46 36 nitrofenilpalmitat ın ve rasemik aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizinde karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak sol-jel immobilizasyonu ile elde edilen enzimin etkinliğinin daha iyi olduğu (E>400) belirtilmiştir. Sol-jel prosesindeki hidrofobik prekürsörlerin önemi Yang ve ark. (2009) tarafından da ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışmada silanlaştırıcı prekürsörler olarak; viniltrimetoksi silan, oktil-trimetoksi silan, γ-(metakriloksipropil)-trimetoksi silan (MAPTMS) ve (TES) kullanılmış ve immobilize enzimin katalitik etkinliği de hem p-nitrofenil palmitat ın hidrolizinde hem de 4-hidroksi-3-metil-2-(2-propenil)-2-siklopenten-1-on un asimetrik açilasyonunda belirlenmiştir (Şekil 2.4.). H H rasemik-hmpc lipaz Ac S-HMPC R-HMPC asetat ġekil Hidroksi-3-metil-2-(2-propenil)-2-siklopenten-1-on un asimetrik açilasyonu ptimum koşul olarak 1/1 oranında MAPTMS/TES de gerçekleştirilen sonuçlar immobilize enzimin katalitik aktivitesinin serbest enzime göre yaklaşık on dört kat arttığını göstermiştir. Ayrıca enantiyoseçicilik serbest enzime göre E değeri yönünden kıyaslandığında yaklaşık iki kat artmıştır. Sol-jel metodunun önemli bir uzantısı sol-jel prosesi esnasında ilave olarak porözlü katı desteklerin kullanılmasını içermektedir (Reetz ve ark., 1996b). Bu tarz çifte immobilizasyon metodu lipaz içeren jellerin katı destek (örneğin; SIRA veya Celite silikatları) porları içerisinde jelleşme gerçekleştikçe bağlanmasını içermektedir. Bu şekilde termal kararlılığı ve aktivitesi daha iyi olan immobilize enzimler elde edilebilmektedir. Betancor ve ark. (2005) sol-jel immobilizasyonundan önce immobilize edilecek biyo katalizörün bir ön immobilizasyona tabi tutulduktan sonra sol-jel matriksi içerisinde hapsedildiği zaman katalizörün kararlılığının ve etkinliğinin daha başarılı olduğunu gösteren güzel bir çalışma gerçekleştirmiştir. Bu çalışmada enzim ilk olarak porözlü bir destek (Sepabead) üzerine bağlanmış ve daha sonra sol-jel tekniği ile immobilize

47 37 edilmiştir. Enzim aktivitesinin artışına ise ön immobilizasyonla kazandırılan çok noktalı kovalent etkileşimler, enzim ve jel arasındaki etkileşimlerin asgariye indirilmesi neden olarak gösterilmiştir. Lipaz immobilizasyonunun yapısal ve morfolojik özellikleri SEM (scanning electron microscopy), katı hal 29 Si ve 13 C MR spektroskpik teknikler ve spesifik alan ve por hacmi ile ilgili yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. Ayrıca kinetik çalışmalar açıkça alkil etkisi konusunu gündeme getirmiştir. Örneğin RSi(CH 3 ) 3 durumunda metil, etil, n-propil ve n-bütil sırasına göre lipaz aktivitesinde artma gözlenmiştir (Reetz ve ark., 1996c). Silikon matriksi içerisinde hidrofobikliğin artması ile enzim aktivitesinde bir artış olduğu belirlenmiştir. Termal kararlılığının ve aktivitenin artması ise Şekil 2.5. de de gösterildiği gibi hidrojen bağları, iyonik bağlanmalar veya hidrofobik etkileşimler (van der Waals) gibi çok noktalı etkileşimlerin bir sonucu olarak ortaya çıkmaktadır. Hidrofobik etkileşimler bir tür ara yüzeysel aktivasyon ile sonuçlanabilir. Lipaz konformasyonel olarak matriks içerisinde açık-lid halinde bulunmakta ve dolayısıyla da aktif halde olmaktadır. Lipazın sol-jel matriksi içerisinde yapısal değişikliğe uğradığı ile ilgili bir diğer spektroskopik çalışma ise Rodgers ve ark. (2005) tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada Candida antartica lipaz B (CALB), MTMS ve TMS prekürsörlerinin hidrolizi ile oluşan jel içerinde gliserol ve af varlığında immobilize edilmiş ve eutron scattering çalışmalarıyla yapısal değişiklikler belirlenmiştir. ġekil 2.5. Enzim ile matriks arasındaki çok yönlü etkileşimler (Reetz ve ark., 1996c)

48 38 Sekiz farklı kaynaktan edinilen lipazların sol-jel metodu ile immobilizasyonu ve bunların başarılı bir şekilde tekrar kullanılabilirliği incelenmiştir (Reetz ve ark., 1996a; Reetz, 1997). Örneğin Pseudomonas cepacia lipaz MTMS veya MTMS/PDMS jelleri içerisinde hapsedilmiş ve Şekil 2.1. deki reaksiyonda tekrar tekrar kullanılmıştır. Reaksiyon karışımı 30 o C de 23 saat karıştırıldıktan sonra, lipaz içeren jel filtrasyon veya santrifüj ile geri kazanılmış, izooktan ve pentan ile yıkanmış ve tekrar kullanılmıştır. Ayrıca jeller her on reaksiyondan sonra aseton ile yıkanmıştır. Muhtemelen adsorplanan lipazın yüzeyden uzaklaşmasından kaynaklanan aktivitedeki biraz azalıştan sonra enzim aktivitesi orijinal aktivitesinin yaklaşık %80 i civarında en azından otuz reaksiyonda sabit kalmıştır. Aynı koşullar altında lipazın hidrofobik jel üzerine fiziksel olarak adsorplandığı bir kontrol deneyi materyalin aktivitesinin sadece birkaç reaksiyon sonunda tamamen kaybettiğini göstermiştir (Reetz ve ark., 1996a; Reetz, 1997). Sol-jel lipaz immobilizasyonu organik fazlardaki uygulamalar için tasarlansa da lipazlar sulu ortamda ester hidrolizi için heterojen katalizör olarak kullanılabilmektedir (Reetz ve ark., 2000). Bu alandaki bir diğer önemli gelişme lipazların tekrar kullanılabilirliğini sağlamak maksadıyla yapılan manyetik ayırım ile ilgilidir (Reetz ve ark. 1998; Chen ve Lin, 2003). Bu amaçla örneğin Reetz ve ark. (1998) Pseudomonas cepacia ve Candida antarctica lipazın CH 3 Si(CH 3 ) 3 (MTMS) ve diğer bazı hidrofobik prekürsörlerinden meydana gelen sol-jel immobilizasyonu esnasında ortama demir oksit (Fe 3 4 ) ilave etmiştir. Bu durum katalitik olarak aktif, mekanik olarak kararlı ve reaksiyon ortamından manyetik olarak ayrılabilir immobilize lipaz oluşumuna neden olmuştur. Enzimin kısmi aktivitesi ise izooktan içerisinde laurik asitin n-oktanol ile esterleşmesi reaksiyonunda denenmiştir. Sonuçlar, immobilize enzim göre % oranında iyileşme olduğunu göstermiştir. Ayrıca 2-pentilamin in kinetik rezolüsyonu da yaklaşık % (ee) oranında tamamlanmıştır (Şekil 2.6.). H 2 H 2 HAc (S,R)-6 7 S-6 R-8 ġekil Pentilamin in kinetik rezolüsyonu

49 39 Chen ve Lin (2003) ise CRL nin TMS ve alkiltrimetoksisilanın asit katalizli polimerleşmesi ile oluşan hibrit organik-inorganik sol-jeli içerisindeki immobilizasyonu esnasında ortama Fe 3 4 nanopartiküllerini ilave etmiştir. Enzimin katalitik etkinliği ise etanol ve bütirik asitin hekzan içerindeki esterleşme reaksiyonu ile değerlendirilmiştir. Ancak bu prosedür jelin morfolojik değişimine neden olmuş ve enzim aktivitesi üzerine olumsuz tesir etmiştir. Yazarlar sol-jel tozunun nanopartikül çözeltisi ile karıştırılması sonucunda yapılan immobilizasyonda ise aktivitede görülen düşmenin önüne bir dereceye kadar geçebilmişlerdir. Manyetik etkinin önemine Cahubey ve ark. nın (2009) aminopropiltrietoksisilan ve tetraetoksiortosilikat Type A (non-manyetik) ve Type B (manyetik) nin kopolimerleşmesi ile hazırladıkları sol-jel kompozitlerde (Şekil 2.7.) gerçekleştirilen Arthobacter sp. Lipaz (ABL) ın immobilizasyonunda da işaret edilmiştir. Si Si Tip A Si Si =CH(CH 2 ) 3 HC=-Enz =CH(CH 2 ) 3 HC=-Enz Si Fe 3 4 Si Si Si Tip B =CH(CH 2 ) 3 HC=-Enz =CH(CH 2 ) 3 HC=-Enz ġekil 2.7. Sol-jel kompozitler CR H CR immobilize R 1 RS ABL R 1 R-(+) R 1 S-(-) CR H CR CEt immobilize CEt CEt RS ABL R-(+) Ee %99 S-(-) ġekil Hidroksi-3-fenilpropanoat alkil açilatlar ve 1-fenil etanol alkil açilat ların kinetik rezolüsyonu

50 40 Buna göre, etil 3-hidroksi-3-fenilpropanoat alkil açilatlar ve 1-fenil etanol alkil açilat ların kinetik resolüsyonunda (Şekil 2.8.) serbest enzime göre E değerlerinde 3-4 kat iyileşme elde edilmiştir. Reetz ve ark. nın (2003) ikinci-nesil sol-jel lipaz immobilizasyonu olarak adlandırdığı immobilizasyon yönteminin ortaya çıkarılması ile bu alanda önemli bir gelişme yaşanmıştır. Bu şekilde, termal ve mekanik olarak daha kararlı, aynı zamanda tekrar kullanılabilirliği de önemli derecede artırılabilen daha aktif heterojen katalizör enzimlerin ortaya çıkarılabilmesi imkanı doğmuştur. Bu çalışmada sol-jel prekürsörlerindeki (RSi(CH 3 ) 3 ) (Şekil 2.2., 4) alkil gruplarının iyi seçilmesi gerektiği ve 18-crown-6, Tween-80, siklodekstrinler, izopropanol, ve/veya KCl gibi katkı maddelerinin kullanılması gerekliliği vurgulanmıştır. Bu tarz katkı maddeleri lipazların aktivasyonunun artırılması amacıyla sol-jelsiz ortamlarda da kullanılmıştır (Reinhoudth ve ark., 1989; Griebenow ve ark., 1999; Alreuter ve ark., 2002; Cipiciani ve Bellezza, 2002). Reetz ve ark. nın (2003) çalışmasında en etkin lipaz jeli n-bütil ve izobütil silan prekürsörleri gösterilmiş (Şekil 2.2., 4d,4e) ve katkı maddesi olarak da 18-crown-6 or Tween-80 bulunmuştur. Bu çalışmada dokuz farklı lipaz (PfL, BcL, MmL, AnL, CrL (tip VII), CrL(L-3), TIL, PpL ve PrL) ikinci nesil sol-jel immobilizasyonu ile immobilize edilmiş ve hepsinde katalitik aktivite artışı gözlenmiştir. Ayrıca lipazların immobilizasyonu, model reaksiyondaki (Şekil 2.9.) sonuçlara göre enantiyoseçiciliği de artırmıştır. Ac H Ac lipaz (R)-8 H rasemik-6 7 (S)-6 ġekil 2.9. Rasemik 2-oktanol ün enantiyoseçimli esterleşmesi Literatürde, immobilizasyon esnasında sol-jel içerisine katkı maddelerinin ilave edilmesinin enzimin katalitik etkinliği üzerine ne gibi tesirler yapacağı ile ilgili farklı çalışmalar bulunmaktadır. Bu bağlamda polietilenglikol, gliserol, polivinilalkol, iyonik sıvılar, şekerler, taç eterler, siklodekstrinler ve kaliksarenler gibi farklı katkı maddeleri bu

51 41 amaç için kullanılmıştır (Reetz ve ark., 2003; Sahin ve ark., 2009; Zarcula ve ark., 2009; Yilmaz ve ark., 2010b). Soares ve ark. (2004; 2006) üç farklı prekürsörün (tetraetoksisilan (TES), metiltrimetoksisilan (MTMS) ve polidimetilsilan (PDMS)) poli kondenzasyonundan meydana gelen sol-jel matriksi içerisinde katkı maddesi olarak polietilen glikol (PEG) ve polivinil alkol (PVA) varlığında ve yokluğunda CRL nin immobilizasyonunu çalışmışlardır. Por büyüklüğü, por dağılımı, spesifik yüzey alanı ve katalitik aktiviteler yönünden kıyaslandığında en iyi sonuçların PEG varlığında TES prekürsörü kullanılarak gerçekleştirilen immobilizasyondan elde edildiği belirtilmiştir. Sol-jel lipaz immobilizasyonunda katkı maddesi olarak iyonik sıvılar da kullanılmaktadır. Zarcula ve ark. (2009) Pseudomonas fluorescens (Amano AK) lipazı, katalitik özelliklerini iyileştirmek maksadıyla 1:1 oranında oktiltrimetoksisilan ve tetrametoksisilan dan meydana gelen kompozit içerisinde iyonik sıvılar ortamında immobilize etmişlerdir. Katkı maddesi olarak iyonik sıvıların lipaz immobilizasyonu için önemli avantajlar sağladığı vurgulanmıştır. Alifatik sekonder alkollerin enantiyoseçici açilasyonu (Şekil 2.10.) ile incelenen lipazın katalitik özelliklerinin serbest lipaza göre önemli derecede arttığı belirlenmiştir. lipaz H H 2-hekzanol vinil asetat (R)-hekzil asetat (S)-hekzanol H asetaldehit ġekil Hekzanol'ün enantiyoseçimli açilasyonu Bir doğal polimerin (sporopollenin) katkı maddesi olarak kullanıldığı sol-jel immobilizasyonu ile CRL immobilize edilmiş ve enzimin katalitik özellikleri rasemik aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizinde tartışılmıştır. Su-izooktan reaksiyon sisteminde, polimer temelli sol-jel immobilize lipazın sol-jel serbest lipaza göre yüksek dönüşüm ve enantiyoseçiciliğe (E>400) sahip olduğu gösterilmiştir (Yılmaz ve ark., 2010). Araştırma grubumuzca gerçekleştirilen bir diğer çalışmamızda ise sol-jel lipaz

52 42 immobilizasyonu prosesi esnasında farklı yapıda kaliksarenleri katkı maddesi olarak kullanıldı (Şekil 2.11.) (Sahin ve ark., 2009). ġekil Sol jel immobilizasyonda kullanılan kaliksaren türevleri Bu çalışmada immobilize lipazın katalitik etkinliği için model reaksiyon olarak yine p-nitrofenilpalmitat ın hidrolizi (Şekil 2.12.) ve rasemik aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi seçilmiştir. Sonuçlar kaliksaren varlığında gerçekleştirilen immobilizasyonla lipazın enantiyoseçimliliğini önemli derecede arttırdığını (E>200) ortaya koymuştur. ġekil p-itrofenilpalmitat ın hidrolizi Son yıllarda (Sayın ve ark., 2011) kaliks[4]arenin glukamin türevi, manyetik Fe 3 4 nanopartikülü üzerine immobilize edilerek (Şekil 2.13.) CRL nin sol-jel immobilizasyon prosedüründe katkı maddesi olarak kullanılmıştır. İmmobilize lipazın katalitik etkinliği

53 43 rasemik aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonunda incelenmiştir. Sonuçlardan enantiyoseçimliliğin oldukça arttığı (E=460) gözlenmiştir. Fe 3 4 H H H H H H H H H H ġekil Sol jel immobilizasyonda katkı maddesi olarak kullanılan glukamin türevli manyetik kaliksaren Özetle ikinci-nesil sol-jel lipaz immobilizasyonu olarak adlandırılan ve immobilizasyon esnasında katkı maddelerinin önemini vurgulayan sol-jel immobilizasyonu ilk nesil immobilizasyondan oldukça etkili ve daha enantiyoseçicidir (Reetz ve ark., 1995; Reetz ve ark., 1996a; Reetz, 1997; Gill ve ark., 1999; Badjic ve ark., 2001; Ragheb ve ark., 2003) Enzim-Mimik larak Kaliksarenler Doğal prosesleri daha iyi anlamanın bir yolu canlı organizmalarda gerçekleşen karmaşık reaksiyonları taklit edebilme yeteneğine sahip uygun model sistemlerin oluşturulması ve bunların araştırılmasıdır. Bu noktada supramoleküler kimyanın rolü enzimlerin işlevselliğinde rol oynayan etkin bölgelerinin fonksiyonelliğine sahip enzim benzeri sistemleri (enzim-mimikler i) ortaya çıkarmaktır. Genellikle bir enzimin aktif bölgesi polipeptit zincirinin katlanması ile meydana gelen bir hidrofobik oyuk veya yarık olarak düşünülür. Bu tarz bir substrat-bağlayıcı bölge, siklodekstrinler veya kaliksarenler gibi makrosiklik bileşiklerle oluşturulabilmektedir (Breslow, 2005; Gutshe, 2008). Bu makro-yapıların her biri gerekli olan uygun oyuklar içermektedirler. Dolayısıyla bu tarz bileşikler uzun zamandır enzim-mimikler olarak çalışılmaktadır. Ancak belirtmek gerekir

54 44 ki; diğer türlerle karşılaştırıldığında, literatürde kaliksaren temelli enzim-modelleri konusunda çok az çalışma bulunmaktadır. Reinhoudt ve grubu tarafından bu alanda önemli çalışmalar gerçekleştirilmiştir (Molenveld ve ark., 1997; Molenveld ve ark., 1999a; Molenveld ve ark., 1999b; Molenveld ve ark., 2000). Bu çalışmalarda, fenolik halkanın para pozisyonundan fonksiyonlandırılan, çinko ve bakır iyonlarıyla kompleks oluşturabilen kaliksarenler sentezlenmiştir. Yapılan bir çalışmada, mono-, di- ve triatomlu Zn(II)-kaliksaren kompleksleri hidrolitik reaksiyonlarda enzim mimikler olarak tartışılmıştır ve sonuçlar piridin-zn referans kompleksi ile kıyaslanmıştır (Şekil 2.14.). H Zn +2 Zn +2 H H Zn +2 Zn +2 Et Et Et Et Et Et Et Et ġekil Di, mono atomlu Zn(II)-kaliksaren kompleksleri ve Zn(II)-piridin kompleksi Tek atomlu kaliks[4]aren kompleksi, kaliks[4]aren iskeleti içermeyen referans kompleksten altı kat daha etkin bulunmuştur. Bu sonuç bize, hidrofobik etkinin katalitik proseste önemli olduğunu vurgulamaktadır. Kaliksarenin hidrofobik aromatik yüzeyi sayesinde kataliz işlemi kolaylaştırılabilir. Bu halde kaliksaren metale bağlı su moleküllerinin pk değerini düşürebilir ve substrat ile etkileşebilir. Çalışmalarda, tek atomlu Zn(II)-kaliksaren kompleksine göre çift atomlu kompleksin (Şekil 2.15.) substrata bağlanma ve substratı dönüştürme işleminde çok daha etkili olduğu bulunmuştur. Bu bağlamda, tek atomlu kompleksin katalitik aktivitesinin elli kat daha düşük olduğu belirtilmiştir. rtamda 0.48 mm iki atomlu kompleks olması durumunda RAmodel substratı 2-hidroksi propil p-nitrofenil fosfat ın (HPP, ph 7.0, 25 o C) katalitik hidrolizinde hız kat artmıştır. Diğer nükleaz mimiklerle karşılaştırıldığında bu değerin oldukça büyük olduğunu vurgulanmıştır.

55 P H :B Zn +2 CH 3 Zn +2 R R R R R=CH 2 CH 2 Et ġekil Çift atomlu Zn(II)-kaliksaren kompleksi ile HPP nin etkileşim mekanizması Fonksiyonlandırılmış kaliks[4]aren ve referans piridin çinko komplekslerinin karşılaştırılması kaliksaren fonksiyonelliğinin substrata bağlanma ve katalitik etkinliğin arttırılmasında etkili olduğunu göstermiştir (Molenveld ve ark., 1997). Ayrıca kaliksarenin fenolik -H bölgesinin taç eter köprüsü ile modifiye edilmesiyle (Şekil 2.16.) gerçekleştirilen çalışmada sonuçlar, katalitik etkinliğin azaldığını göstermiştir. Bu da katalizörün etkinliğinde yapı esnekliğinin ne derece önemli olduğunu ortaya çıkarmıştır (Molenveld ve ark., 1999a). Zn +2 Zn +2 R R R=n-Pr ġekil Kaliks[4]aren bazlı çift atomlu Zn(II) modeli

56 46 Diğer bir çalışmada, üç atomlu metalli-hidrolazları taklit edebilmek amacıyla mevcut sisteme bir çinko daha ilave edilerek üç atomlu çinko kompleksi oluşturulmuştur (Şekil 2.17.) (Molenveld ve ark., 1999a). luşturulan bu modelin RA dinükleotidlerin ayrılması için etkili bir katalizör olduğu gösterilmiştir. Katalitik aktivite bir seri RAdinükleotidle denenmiştir. Katalizlenmeyen duruma göre 10 3 ve 10 4 oranında artış sağlanmıştır. Zn +2 Zn +2 Zn +2 R R R R R=CH 2 CH 2 Et ġekil Kaliks[4]aren bazlı üç atomlu Zn(II) modeli Çift metalli fosfodiesteraz mimik olarak iki atomlu Cu(II)-kaliks[4]aren kompleksi sentezlenmiş (Şekil 2.18.) ve katalitik etkinliği araştırılmıştır. Ayrıca, sonuçlar tek atomlu referans kompleksle karşılaştırılmıştır (Molenveld ve ark., 1998). Cu Cu H H Cu +2 Et - P H - P - - Et Et Et Et Et EPP HPP ġekil İki atomlu Cu(II)-kaliks[4]aren kompleksi ve referans kompleks

57 47 Bu kaliks[4]aren kompleksi referans komplekse göre daha etkin bir şekilde RA modeli HPP (Şekil 2.19.) ve DA modeli etil-p-nitrofenil fosfat (EPP) fosfodiesterlerine bağlanmış ve onları parçalamıştır. B: H P - 2 H Cu Cu H H R R R R R=CH 2 CH 2 Et ġekil Kaliks[4]aren-Cu +2 kompleksi ile HPP nin etkileşim mekanizması Kaliksaren temelli kompleks, hidroliz reaksiyonlarını HPP için , EPP için ise kat artırmıştır. Ayrıca, kaliks[4]arenin aromatik yüzeyi yapay enzimin nötral ve düşük asitli ortamda aktif olmasını sağlamıştır (Molenveld ve ark., 1997). Literatürde, iki tane bisimidazoil-cu(ii) merkezine ve iki tane hidroksi metil grubuna sahip kaliks[4]aren türevlerinin, bifonksiyonel fosfodiesteraz modelleri olarak kullanıldığı bir çalışma bulunmaktadır (Molenveld ve ark., 1999c). Bu çalışmada, katalitik özellikler HPP nin transesterleşmesi ile belirlenmiştir. Aminometilkaliks[4]aren (Şekil 2.20.) RA model substratı HPP nin molekül içi transesterleşmesinde katalitik etkinlik göstermiştir. Substrata bağlanmada ise bir veya iki Cu(II) merkezi ve iki amonyum grubu etkilidir. Hidroksimetilkaliks[4]aren yaklaşık olarak kaliks[4]aren-cu(ii) kompleksi ile aynı oranlarda reaksiyonu hızlandırmıştır. Hidroksi metil kaliks[4]arenin bazik ortamda daha az etkin olduğu bulunmuştur. Bu ise substratın katalizöre daha zayıf bağlandığını işaret etmektedir.

58 48 H R' R' H + H 3 Cu +2 P 2 H 3 + R R R R=CH 2 CH 2 Et R'=CH 2 H R'=CH 2 H 2 R H Cu +2 H - ġekil HPP nin transesterleşmesi Tolman ve ark. (2002) kaliks[4]arenlerin metallerle kompleksleşmesi için üç veya daha fazla tek dişli liganttan meydana gelen çok dişli ligantlar geliştirmiştir. Bu çalışma canlı sistemlerde var olan multinükleer metalik sistemlerin etkinliğini, yapısını ve spekstroskopik özelliklerini anlamak amacıyla gerçekleştirilmiştir. Literatürde, orijinal olarak Shinkai ve ark. (1986; 1988; 1989; 1990) tarafından sentezlenen p-sülfonatokaliks[n]arenlerle (Şekil 2.21.) ilgili bir enzim-mimik çalışması Goto ve ark. (2001) tarafından gerçekleştirilmiştir. S 3 H H CH 2 n CH 3 C * CH C CH 2 -R H R= H : -Ac-L-Ala-H R= R= H : -Ac-L-Phe-H : -Ac-L-Tyr-H n= 4 : kaliks-s4 n= 6 : kaliks-s6 n= 8 : kaliks-s8 -Ac-L-Amino asit R= R= H H : -Ac-L-His-H : -Ac-L-Trp-H ġekil p-sülfonatokaliks[n]arenler

59 49 Bu çalışmada p-sülfonatokaliks[n] arenlerin (n=4, 6 ve 8), metanol içerinde -Ac- L-amino asitlerin alkolizini katalizledikleri belirlenmiştir. Ala, His, Phe, Trp ve Tyr ile karşılaştırıldığında -Ac-L-His-H ın hidroliz reaksiyonu hızının p- sülfonatokaliks[n]arenlerin varlığında bu kaliksarenlerin halkalı olmayan türevleri olan p- hidroksibenzensülfonik asit varlığındaki duruma göre oldukça arttığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar ve 1 H-MR sonuçları ışığında, katalitik etkinliğin, -Ac-L-His-H ve p- sülfonatokaliks[n]arenler arasındaki spesifik etkileşimlerden kaynaklandığı öne sürülmüştür. Şekil de verilen Reinaud ve grubu tarafından (Blanchard ve ark., 1998; Seneque ve ark., 2000) sentezlenen üç piridil grubu ile fonksiyonlandırılan kaliks[6]arenlerin enzim-mimik çalışmaları için uygun yapılar oluşturduğu bildirilmiştir. Yapılan çalışmada mononükleer bakır enzimlerinin aktif bölgelerini modelleyen kaliks[6]aren temelli bir supramoleküler sistem tanımlamışlardır. H Me 3 x CH 2 Cl 3 baz M M S -ligand Kaliks[6]aren (X 6 Me 3 H 3 ) X 6 Me 3 3 ġekil Enzim-mimik olarak kullanılan kaliks[6]aren in Zn kompleksi Diğer çalışmada ise bakır iyonları yerine çinko iyonları kullanılarak (Şekil de M=Zn +2 ) tris(histidin) koordinasyon çekirdeği oluşturulmuştur. Çinko kompleksleri X-ray ve 1 H-MR spektroskopisi ile karakterize edilmiştir. Cuaves ve ark. (2000) karboksikolinesterazları modellemek amacıyla fonksiyonel kaliks[6]aren bileşikleri sentezlemişler (Şekil 2.23.) ve bu bileşiklerin, p- nitrofenilfosfokolin karbonat ın (PPCC) hidrolizini katalizörsüz duruma göre bin kat hızlandırdıklarını belirlemişlerdir.

60 50 H H + H Cl - H R Me Me Me Me Me + Cl - PPCC 2 ġekil Karboksikolinesteraz modeli fonksiyonel kaliks[6]aren Bir başka çalışmada Öztürk ve Akkaya (2004) 1,4,7,10-tetraazasiklododekan (cyclen) ile fonksiyonlandırılan kaliks[4]aren türevleri sentezlenmiş ve bu kaliksarenlerin metal-enzim modeli temelinde Zn(II) ile komplekslerinin hidrolitik aktiviteleri çalışılmıştır. Hidroliz reaksiyonları nötral ve hafif bazik ortamlarda (ph 7-8.5) gerçekleştirilmiş, p-nitrofenil karbonat ve p-nitrofenilasetat ile mono- ve dinükleer komplekslerin hidroliz reaksiyonlarında kayda değer farklar gözlenmemiştir. Bu çalışmada p-nitrofenilstearat ve binükleer kompleks arasındaki reaksiyon iyi sonuç vermemiştir. H +2 H H 2 ġekil Cyclen ile fonksiyonlandırılan kaliks[4]aren ve p-nitrofenilstearat arasındaki etkileşim mekanizması

61 51 Ancak p-nitrofenil asetat ve mononükleer kompleksin ph 8.5 de gerçekleşen reaksiyonu katalizlenmeyen reaksiyona göre dört yüz kat hızla gerçekleşmiştir (Şekil 2.24.). Çalışmada cyclen-zn(ii) kompleksinin makrosiklik yapının esnekliğini azalttığı dolayısıyla iki cyclen grubu içeren yapının etkileşim yönünden daha zayıf kaldığı belirtilmiştir. Bu çerçevede katalizin substratın kaliksaren oyuğu içerine girmeksizin dış sınırda olabileceği belirtilmiştir. Fonksiyonel grupların bağlanması supramoleküler enzim-mimiklerin katalitik özellikleri için önemlidir, çünkü model yapılara farklı fonksiyonel grupların katılması reseptör moleküllerle olan etkileşimleri daha uygun hale getirebilir. Özellikle imidazol fonksiyonelliği, aldol-tipi kondenzasyon reaksiyonlarını veya hidrolitik prosesleri artırabilecek asit-baz çifti veya nükleofil olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu kapsamda, Dospil ve Schatz (2001), farklı pozisyonlarında imidazol grupları içeren kaliks[4]arenler sentezlemişler (Şekil 2.25.) ve bunları trans-açiltransferaz aktivitesine sahip metalsiz enzim-mimikler olarak kullanmışlardır. R R R H 3 (R=H) 4 (R=Bz) H R R H 5 (R=H) 6 (R=Bz) R H R H 7 (R=H) 8 (R=Bz) ġekil İmidazol türevli kaliks[4]arenler Kaliks[4]arenin fenolik halkanın p pozisyonuna (upper rim) bir nükleofilik grubun bağlanması başlangıç reaksiyon hızında artışla sonuçlanmıştır. Makrosiklik yapı hidroliz reaksiyonunu makrosiklik olmayan katalizör ile kıyaslandığında %13, şahit durumuna göre ise %52 oranında hızlandırmıştır. Diimidazol kaliks[4]aren ise reaksiyon hızını iki katına çıkarmıştır. Bu durum katalitik bölgelerin bir tür etkileşimine işaret etmektedir. ph 6.3 de imidazol birimlerinin %50 si protonlanmıştır ve her iki imidazol grubu da sulu ortamdaki ester hidrolizi için asit-baz katalizörü olarak davranabilmektedir. Kaliks[4]arenler substrat (p-nitrofenil benzoat) ile etkileşimde (hidroliz) en uygun konformasyona girebilecek esnekliğe sahiptir.

62 52 Görüldüğü gibi kaliksarenler enzimlerin katalitik etkinliklerinin modellenmesinde uygun ortamlar sağlamaktadırlar ÇalıĢmanın Amacı ve Kapsamı Biyolojik olarak aktif çoğu bileşik stereo izomerlerin karışımı olarak bulunmaktadır. Ancak çoğu zaman sadece tek bir enantiyomerin, ilacın spesifik etkisine sebep olduğu bilinmektedir. aproksen ve 2-fenoksi propiyonik asit gibi 2-aril propiyonik asitler sadece bir enantiyomeri aktif bileşiklerdir. Bu bileşikler ağrı kesici ve ateş düşürücü olarak kullanılmaktadır. Sadece (S) enantiyomer tedavi edici etkiye sahiptir. Bu ilaçların kullanımına bağlı olarak ortaya çıkan ve en fazla bilinen yan etkileri böbrek ve mide rahatsızlıklarıdır. Sonuç olarak farmakoloji ve kimya alanında rasemik karışımlar yerine sadece tek bir enantiyomerin üretimi önemli bir proses haline gelmiştir. Biyoteknoloji alanındaki artan bilgiler kiral bileşiklerin stereo seçimli ayrılmaları için yeni fikirler ortaya çıkarmaktadır. Bu maksatla farklı yöntemler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Kuşkusuz enzimler kusursuz biyokatalizörler olarak tanımlanır. İşte doğal enzimlerin oldukça etkili kataliz özellikleri, bilim adamlarını enzimleri taklit etmeye yöneltmiştir. Bilim adamları bu çalışma sahasını biyomimetik kimya ve yapay enzim terimleri ile tanımlamışlardır. Genellikle enzimin aktif kısmı hidrofobik boşluk ya da polipeptid zincirinin katlanmasıyla oluşmuş yarık olarak düşünülür. Böyle bir substrat bağlama kısmı siklodekstrin, crown eter, siklophan ve kaliksarenler gibi makrosiklik bileşikler tarafından sağlanabilir. Bu bileşiklerin her biri yapay enzim özelliği için gerekli olan boşluğa sahiptirler. Bu çalışmada öncelikle, basit enzim-mimik modelleri olarak kullanılabilecek kaliks[4]aren bileşikleri sentezlemeyi amaçladık. İkinci olarak da, CRL nin katalitik etkinliğini artırabilmek amacıyla kaliks[4]aren bileşiklerini sol jel immobilizasyon prosesinde katkı maddesi olarak kullanılmayı amaçladık.

63 53 3. MATERYAL VE METT 3.1. Enstrümental Teknikler Erime noktası Gallenkamp marka erime noktası tayin cihazı ile yapıldı. 1 H MR spektrumları CDCl 3 içinde 400 MHz Varian 6105 spektrofotometresi ile alındı. MR spektrumunda kimyasal kayma değerleri ( ) ppm cinsinden belirtildi. IR spektrumları Perkin Elmer spektrum 100 ile alındı. Elementel analizler Leco CHS-932 cihazi ile yapıldı. HPLC çalışmaları Agilent 1200 (Kolon: Chiracel D-H, 25cm, 4.6 mm) ile yapıldı. UV-vis. ölçümlerinde Shimadzu 160A UV-visible spektrofotometresi kullanıldı. Analitik TLC ler silika jel tabakasıyla (Si 2, Merck 60 F 254 ) kaplanmış alüminyum plakalar kullanarak yapıldı. Kolon Kromatografisi çalışmalarında silika jel 60 (Merck, tanecik büyüklüğü mm, mesh) kullanıldı. Tüm sulu çözeltiler, Millipore Milli-Q Plus su arıtma cihazıyla saflaştırılan saf su ile hazırlandı. HPLC de kullanılan çözücüler HPLC saflıkta olup Merck, Sigma-Aldrich ve Flukadan satın alındı Kimyasal Sentezler ve Karakterizasyon Çalışmanın her iki amacına yönelik kullanılan bileşiklerden bazıları literatürde var olan prosedürler kullanılarak bazıları da bilinen metotların modifiye edilmesi ile sentezlendi. Enzim-mimik çalışmalarında kullanılmak üzere üç şema ve lipaz immobilizasyonunda kullanılmak üzere ise iki şema olmak üzere toplam 19 bileşik sentezlendi. Bu bileşiklerin sentez yöntemleri aşağıda sırayla verildi.

64 54 1,3-dibrompropan K 2 C 3 H H HH CH 3 C H H 1 Br 2 Br H ai CH 3 C H H 3 ġekil 3.1. Enzim-mimik çalışmasında kullanılan 3 numaralı kaliksaren in sentez şeması

65 ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrahidroksikaliks[4]aren (1) 1 L lik bir balona, 100 g (0.665 mol) p-ter-bütilfenol, 62.3 ml (0.83 mol) %37 lik formaldehit ve 1.2 g (0.03 mol) ah alındı. Reaksiyon karışımı banyonun (yağ banyosu) sıcaklığı o C da sabit tutularak ksilol cihazı takılı bir geri soğutucu sisteminde azot gazı altında saat ısıtıldı. Bu esnada reaksiyon karışımı viskoz bir halden önce turuncu renge daha sonra katı sarı bir kütleye dönüştü. Bu noktada karışım oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve ml difenil eter ile süspanse edilip 1 saat oda sıcaklığında karıştırıldı, azot girişi ve bir ksilol cihazı takılıp, balon ısıtılarak suyun ortamdan uzaklaştırılması ve karışımın berraklaşması sağlandı. Su çıkışı tamamlandığında karışım bir geri soğutucu takılarak saat kaynatıldı. Daha sonra reaksiyon karışımı oda sıcaklığına soğutulup, 1 L etil asetat ile muamele edilerek 1 saat karıştırıldı ve sonra da çökmenin tamamlanması beklendi. luşan beyazımsı çökelek süzülüp iki kez 100 ml etil asetatla, bir kez 200 ml asetik asitle ve en son su ile yıkandı. Kurutulan 66.5 g (% 62) ham ürün toluenden yeniden kristallendirilerek 61.6 g parlak, beyaz kristal yapıda, erime noktası o C (lit., o C) (Gutsche, 1990) olan başlangıç maddesi 1 elde edildi. 1 H-MR (CDCl 3 ): δ 1.20 (s, 36H, Bu t ), 3.45 (d, 4H, ArCH 2 Ar), 4.25 (d, 4H, ArCH 2 Ar), 7.05 (s, 8H, ArH), (s, 4H, H). HH HH ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-bromopropoksi)-26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (2) 5 g (7.71 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren 200 ml asetonitril içerisinde çözüldü. Üzerine 2.66 g (19.29 mmol) K 2 C 3 ilave edilerek 30 dakika karıştırıldı. Sonra bu karışıma 7.86 ml ( 14.4 mmol) 1,3-dibrompropan eklenerek 24 saat kaynatıldı. Daha sonra reaksiyon karışımı süzüldü ve çözücü uzaklaştırıldı. Kalan kısıma metanol ilave edilerek çöktürüldükten sonra süzülüp kurutuldu. CH 2 Cl 2 /MeH den kristallendirildi. Bileşik 2 % 75 verimle elde edildi. Erime noktası o C. (lit o C, Li, 1999). 1 H MR

66 56 (CDCl 3 ) δ (ppm): 1.00 (s, 18H, Bu t ), 1.29 (s, 18H, Bu t ), 2.51 (q, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 3.35 (d, 4H, J=12.7 Hz, ArCH 2 Ar), 4.05 (t, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 4.15 (t, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 4.28 (d, 4H, J=12.7 Hz, ArCH 2 Ar), 6.90 (s, 4H, ArH), 7.05(s, 4H, ArH), 7.70 (s, 2H, H). H H Br 2 Br ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-bromopropoksi)-26,28-dihidroksi kaliks[4]aren ile imidazol ün etkileģtirilmesi (3) 2.5 g (2.8 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren in dibrom propan türevi 250 ml kuru asetonitril içerisinde çözüldü. Üzerine 0.92 g (6.16 mmol) ai ilave edilerek 2 saat ısıtılarak karıştırıldı. Sonra bu karışıma 0.95 g (14 mmol) imidazol eklenip 72 saat kaynatıldı. Daha sonra reaksiyon karışımı süzülüp çözücü uzaklaştırıldı. Kalan katı kısım metanolde çözüldü, su ilave edilerek çöktürüldükten sonra süzülüp kurutuldu. Bileşik 3 % 76 verimle elde edildi. Erime noktası o C. 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.85 (s, 18H, Bu t ), 1.2 (s, 18H, Bu t ), 2.6 (q, 4H, J=5.1 Hz, CH 2 ), 3.35 (d, 4H, J=13.69 Hz, ArCH 2 Ar), 4.05 (d, 4H, J=13.69 Hz, ArCH 2 Ar), 4.1 (t, 4H, J=5.1 Hz, CH 2 ), 4.9 (t, 4H, J=5.1 Hz, CH 2 ), 6.50 (s, 2H, imh), 6.68 (s, 4H, ArH), 7.05 (s, 4H, ArH), 8.15 (s, 2H, im H). 13 C MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 30.8, 31.7, 33.8, 47.5, 74.2, 76.8, 77.1, 77.4, 123.5, 125.3, 125.9, 127.8, 131.8, 142.8, 147.8, 148.8, Anal. Hesaplanan. C 56 H : C, 77.74; H, 8.39;, 6.48 %. Bulunan: C, 77.92; H, 8.57 ;, 6.12 %. H H 3

67 57 Br H H HH 1 KI, K 2 C 3, CH 3 C H H H 2 H 2 H 2 Etanol 4 H H H 2 5 H 2 CH H Kloroform Metanol H H HC HC H H 6 ġekil 3.2. Enzim-mimik çalışmasında kullanılan 6 numaralı kaliksaren in sentez şeması

68 ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-ftalimidopropoksi)-26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (4) 4.5 g (6.9 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren, 3.88 g (14.47 mmol) -(3- bromopropil)ftalimid, 1.14 g (8.2 mmol) K 2 C 3 ve 2 g (12 mmol) KI 100 ml kuru asetonitril içerisinde 60 saat kaynatıldı. Sonra çözücünün bir kısmı evaporatörde uzaklaştırıldı. Kalan kısıma seyreltik HCl eklenerek su ile çöktürüldü. Daha sonra süzülerek metanol ile yıkandı ve bileşik 4 % 78 verimle elde edildi. Erime noktası o C. (lit o C, Chrisstoffels, 1999). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.98 (s, 18H, Bu t ), 1.3 (s, 18H, Bu t ), 2.45 (q, 4H, J=6.4 Hz, -CH 2 -), 3.35 (d, 4H, J=12.3 Hz, ArCH 2 Ar), 4.1 (t, 8H, J=6.4 Hz, CH 2,CH 2 ), 4.3 (d, 4H, J=12.3Hz, ArCH 2 Ar), 6.80 (s, 4H, ArH), 7.05 (s, 4H, ArH), 7.49 (s, 2H, H), 7.6 (s, 4H, benzen ArH), 7.75 (s, 4H, benzen ArH). H H ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-aminopropoksi)-26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (5) 2.5 g (3.27 mmol), 5,11,17,23-tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-ftalimidopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren (4) 200 ml etanol içerisinde çözülerek üzerine 3.1 ml (0.063 mol) H 2 H 2.H 2 ilave edildi. 9 saat kaynatıldıktan sonra etanol uzaklaştırıldı. Kalan kısım 100 ml CH 2 Cl 2 içerisinde çözüldü ve 100 ml su ilave edilerek birkaç damla derişik H 3 ilave edildi. rganik faz ayrılarak birkaç kez su ile yıkandı ve MgS 4 üzerinden kurutuldu. Daha sonra çözücü uzaklaştırıldıktan sonra bileşik 5 % 82 verimle elde edildi. (Chrisstoffels, 1999). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.98 (s, 18H, Bu t ), 1.29 (s, 18H, Bu t ), 2.15 (q, 4H, J=6.2 Hz, -CH 2 -), 3.2 (t, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 3.35 (d, 4H, J=13.49 Hz,

69 59 ArCH 2 Ar), 4.05 (t, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 4.25 (d, 4H, J=13.49 Hz, ArCH 2 Ar), 6.80 (s, 4H, ArH), 7.05 (s, 4H, ArH). H H H 2 5 H ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-aminopropoksi)-26,28-dihidroksi kaliks[4]aren ile 4 (5)-imidazol karboksi aldehit in ekileģtirilmesi (6) 1 g (1.31 mmol) 5,11,17,23-tetra-ter-bütil-25,27-bis(3-aminopropoksi)-26,28- dihidroksi kaliks[4]aren 20 ml kloroformda çözüldü. Üzerine 20 ml metanolde çözülmüş 0.25 g (2.62 mmol) 4 (5)-imidazol karboksi aldehit ilave edildi ve reaksiyon karışımı 24 saat ısıtılarak karıştırıldı. Daha sonra çözücüsü uzaklaştırılıp dietileter ve n-hekzan ile yıkandı. Bileşik 6 % 75 verimle elde edildi. Erime noktası o C. 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.98 (s, 18H, Bu t ), 1.28 (s, 18H, Bu t ), 2.30 (q, 4H, J=6.2 Hz, -CH 2 -), 3.35 (d, 4H, J=13.3 Hz, ArCH 2 Ar), 3.90 (t, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 4.05 (t, 4H, J=6.2 Hz, CH 2 ), 4.30 (d, 4H, J=13.3 Hz, ArCH 2 Ar), 6.80 (s, 4H, ArH), 6.68 (s, 4H, ArH), 7.35 (s, 2H, imh), 7.70 (s, 2H, imh ), 8.30 (s, 2H, CH). 13 C MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 31, 31.7, 33.8, 74.2, 76.8, 77.1, 77.4, 125.3, 125.5, 127.7, 132.4, 142, 149.7, Anal. Hesaplanan. C 58 H : C, 75.78; H, 8.11;, 9.14 %. Bulunan: C, 75.92; H, 8.20;, 9.37 %.

70 60 H H HC HC H 6 H

71 61 BrCH 2 CCH 3 HH HH Aseton H H 1 C C CH 3 7 CH 3 C H H H C H TFA HMTA 8 HC CH HC CH H H H H C H C H H 2 Kloroform/metanol C H C H 9 10 ġekil 3.3. Enzim-mimik çalışmasında kullanılan 10 numaralı kaliksaren in sentez şeması

72 ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (7) 5 g (7.71 mmol) p-ter-bütilkaliks[4]aren ve 1.29 g (9.4 mmol) potasyum karbonat 250 ml aseton içerisinde 2 saat geri soğutucu altında kaynatıldı. Daha sonra 1.48 ml (16.19 mmol) metilbromasetat ilave edildi ve 24 saat kaynatılarak karıştırıldı. Soğutulan karışım süzüldü, süzüntü destillendi. Kalan katı etanol içerisinde kristallendirildi. Verim % 65, E.n o C (lit o C, Collins, 1991). IR: 3430 cm -1 (H), 1765cm -1 (C=). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.98 (s, 18H, Bu t ), 1.28 (s, 18H, Bu t ), 3.35 (d, 4H, J=14.6 Hz, ArCH 2 Ar), 3.85 (s, 6H, CH 3 ), 4.45 (d, 4H, J=14.6 Hz, ArCH 2 Ar), 4.55 (s, 4H, CH 2 ), 6.80 (s, 4H, ArH), 6.98 (s, 2H, H), 7.05 (s, 4H, ArH). H H C C CH 3 7 CH ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren ile etilendiamin in etkileģtirilmesi (8) 2.5 g (3.15 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren in dimetil ester türevi 100 ml CH 2 Cl 2 ve 100 ml metanol karışımında çözüldü. Üzerine ml (18.94 mmol) etilendiamin ilave edilerek 16 saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Daha sonra çözücü evoparatörde uzaklaştırıldı ve kalan kısım metanolden kristallendirildi. Verim % 82, E.n o C (lit. >300, staszewski, 1991). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 1.16 (s, 18H, Bu t ), 1.25 (s, 18H, Bu t ), 3.49 (d, 4H, J=13 Hz, ArCH 2 Ar), 3.68 (m, 4H, CH 2 -H), 4.25 (d, 4H, J=13 Hz, ArCH 2 Ar), 4.54 (s, 4H, CH 2 ), 7.05(s, 8H, ArH), 8.31 (s, 2H, H), 8.60 (t, 2H, H).

73 63 H H C C H H BileĢik 8 in hekzametilentetraamin ile etkileģtirilmesi (9) 1 g (1.26 mmol) 8 no lu bileşik ve 7.12 g (38.9 mmol) hekzametilentetraamin 60 ml TFA içerisinde çözüldü. Reaksiyon karışımı 45 saat kaynatılarak karıştırıldı (Chawla ve ark., 2006). Daha sonra asitli suda çöktürüldü ve kloroform ile ekstraksiyon yapıldı. rganik faz ayrıldı ve MgS 4 ile kurutuldu. Çözücü uzaklaştırıldıktan sonra kalan katı kısım n-hekzan ile yıkandı ve bileşik 9 %78 verimle elde edildi. E.n o C. 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 1.15 (s, 18H, Bu t ), 3.55 (d, 4H, J=13.6 Hz, ArCH 2 Ar), 3.70 (m, 4H, CH 2 -CH 2 ), 4.18 (d, 4H, J=13.6 Hz, ArCH 2 Ar), 4.55 (s, 4H, CH 2 ), 7.10 (s, 4H, ArH), 7.65 (s, 4H, ArH), 9.18 (s, 2H, H), 9.80 (s, 2H, CH). Anal. Hesaplanan. C 44 H : C, 72.11; H, 6.60;, 3.82 %. Bulunan: C, 72.34; H, 6.51;, 3.96 %. HC CH H H C C H H BileĢik (9) ile 3-aminopropilimidazol ün etkileģtirilmesi (10) 0.72 g (0.88 mmol) 9 no lu bileşik 20 ml kloroform-20 ml metanol karışımında çözüldü. Üzerine 0.24 ml (0.98 mmol) 3-aminopropilimidazol ilave edildi ve 24saat ısıtılarak karıştırıldı. Daha sonra çözücü uzaklaştırılarak kalan katı kısım n-hekzan ile yıkanarak kurutuldu. Verim % 85, E.n o C. 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 1.15 (s, 18H, Bu t ), 2.15 (m, 4H, CH 2 ), 3.50 (t, 4H, CH 2 ), 3.58 (d, 4H, J=13.10 Hz, ArCH 2 Ar),

74 (m, 4H, CH 2 -CH 2 ), 4.0 (m, 4H, CH 2 ), 4.25(d, 4H, J=13.1 Hz, ArCH 2 Ar), 4.52 (s, 4H, CH 2 ), 6.90 (s, 2H, imh), 7.05 (s, 2H, imh), 7.11 (s, 4H, ArH), 7.40 (s, 2H, H), 7.50 (s, 4H, ArH), 8.05 (s, 2H, imh), 8.35 (s, 2H, CH= ), 8.70 (t, 2H, H). 13 C MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 31.2, 31.6, 31.9, 34.7, 39.4, 44.2, 57.2, 74.8, 76.8, 77.1, 77.4, 118, 126.8, 128, , 129.5, 132, 136.5, 147.2, 149.9, 154.9, 161.5, Anal. Hesaplanan. C 56 H : C, 71.01; H, 7.02;, 11.83%. Bulunan: C,71.24 ; H, 6.92;, %. HC CH H H C H C H 10

75 65 H H H H 1 BrCH 2 CCH 3 K 2 C 3 Aseton H H C C CH 3 7 CH 3 H H H H H H C H 8 C H H C H 11 C H H C C H 12 ġekil 3.4. Lipaz immobilizasyonu çalışmasında kullanılan 8,11 ve 12 numaralı kaliksaren lerin sentez şeması

76 ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren ile dietilentriamin in etkileģtirilmesi (11) 2 g (2.48 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren in dimetil ester türevi 100 ml toluen ve 100 ml metanol karışımında çözüldü. Üzerine ml (4.79 mmol) dietilentriamin ilave edilerek 90 saat kaynatıldı. Daha sonra çözücü destilasyon ile uzaklaştırıldı. Kalan kısım metanolden kristallendirildi. Verim % 72, E.n o C (lit o C, staszewski, 1991). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.88 (s, 18H, Bu t ), 1.45 (s, 18H, Bu t ), 2.95 (q, 4H, CH 2 - H), 3.38 (d, 4H, J=12.91 Hz, ArCH 2 Ar), 3.55 (q, 4H, CH 2 -H), 4.25 (d, 4H, J=12.91 Hz, ArCH 2 Ar), 4.50 (s, 4H, CH 2 ), 6.30 (s, 2H, H), 6.70 (s, 4H, ArH), 6.70 (s, 4H, ArH), 8.30 (t, 2H, H). H H C C H H 11 H ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dimetoksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren ile 3,6 diokza-1,8 diaminooktan ın etkileģtirilmesi (12) 2 g (2.5 mmol) p-ter-bütil-kaliks[4]aren in dimetil ester türevi 100 ml toluen ve 100 ml metanol karışımında çözüldü. Üzerine ml (2.5 mmol) 3,6 diokza-1,8 diaminooktan ilave edilerek kaynatıldı. Daha sonra çözücü evoparatörde uzaklaştırıldı. Kalan kısım kolon kromatografisi (Si 2, CH 2 Cl 2 / MeH; 9/1) ile saflaştırıldı. Verim % 52, E.n o C (lit o C. Böhmer, 1993). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.85 (s, 18H, Bu t ), 1.34 (s, 18H, Bu t ), 3.35 (d, 4H, J=13.49 Hz, ArCH 2 Ar), ), 3.64 (s, 8H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ), 3.75 (t, 4H, CH 2 -H), 4.20 (d, 4H, J=13.49 Hz, ArCH 2 Ar), 4.50 (s, 4H, CH 2 ), 6.0 (s, 2H, H), 6.65 (s, 4H, ArH), ), 7.18 (s, 4H, ArH), 8.25 (t, 2H, H).

77 67 C H H H C H 12

78 68 BrCH 2 CCH 3 Aseton BrCH 2 CCH 3 Aseton H H 1 H H KH Etanol H H KH Etanol C CH 3 7 C CH 3 C C C C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 16 Tiyonilklorür THF H H Tiyonilklorür THF C H 13 C H C C C C H H H H 17 H H C Cl 14 C Cl C Cl C C C Cl Cl Cl 18 H H C C C C C C ġekil 3.5. Lipaz immobilizasyonu çalışmasında kullanılan 15 ve 19 numaralı kaliksaren lerin sentez şeması

79 ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-dihidroksikarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (13) 5 g (6.3 mmol) kaliksaren in diester türevi 200 ml etanol içerisinde çözüldü. Üzerine KH ın sulu çözeltisi ilave edilerek 8 saat kaynatıldı. Sonra çözücü tamamen destillendi ve kalan kısım asitli su ile çöktürüldü. Daha sonra süzüldü ve su ile yıkandı. % 94 verimle diasit türevli kaliksaren 13 elde edildi (Shinkai ve ark., 1989). 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 1.15 (s, 18H, Bu t ), 1.25 (s, 18H, Bu t ), 3.42 (d, 4H, J=13.8 Hz, ArCH 2 Ar), 4.20 (d, 4H, J=13.8 Hz, ArCH 2 Ar), 4.70 (s, 4H, CH 2 ), 7.00 (s, 4H, ArH), 7.15 (s, 4H, ArH). H H =C C= H 13 H ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,27-diklorokarbonilmetoksi 26,28-dihidroksi kaliks[4]aren (14) 0.7 g (0.92 mmol) p-ter-bütilkaliks[4]arenin diasit türevi 13 alınarak 35 ml THF de çözüldü. Üzerine 4.5 mmol tiyonilklorür ilave edildi ve 3 saat geri soğutucu altında kaynatıldı. Daha sonra çözücü vakum altında tamamen destile edildi ve daha fazla saflaştırılmadan bir sonraki basamakta kullanıldı. H H =C C= Cl 14 Cl

80 p-ter-bütilkaliks[4]arenin diamit türevinin sentezi (15) Bir önceki adımda elde edilen asitklorür türevi 25 ml THF içerisinde çözüldükten sonra üzerine 1.25 ml (7.3 mmol) dibütilamin ilave edildi ve reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 3 saat karıştırıldı. Sonra karışım süzüldü ve süzüntü evoparatörde destillendi. Kalan katı kısım diklormetanda çözülüp, su ile yıkandı. rganik faz ayrıldı ve MgS 4 üzerinden kurutuldu. Çözücü evoparatörde destillendi ve oluşan ürün n-hekzan ve dietileter ile yıkanıp kloroformdan kristallendirildi. Verim % 52, E.n o C. 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.95 (t, 12H, CH 3 ), 1.05 (s, 18H, Bu t ), 1.17 (s, 18H, Bu t ), 1.35 (m, 8H, CH 2 ), 1.6 (m, 8H, CH 2 ), 3.28 (d, 4H, J=12 Hz, ArCH 2 Ar), 3.38 (q, 8H, CH 2 ), 4.45 (d, 4H, J=12 Hz, ArCH 2 Ar), 4.8 (s, 4H, CH 2 ), 6.88(s, 4H, ArH), 6.90 (s, 4H, ArH), 7.95 (s, 2H, H). 13 C MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 14, 20.3, 29.7, 31.2, 31.6, 31.9, 33.6, 34, 45.8, 46.8, 73.4, 76.8, 77.1, 77.4, 124.8, 125.6, 127.6, 133.4, 140.8, 146.6, 150.2, 152.1, 168. Anal. Hesaplanan. C 65 H : C, 77.85; H, 9.60;, 2.84 %. Bulunan: C, 77.92; H, 9.66;, 2.85 %. H H C C ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrametoksikarbonilmetoksi kaliks[4]aren (16) 5 g (7.71 mmol) p-ter-bütilkaliks[4]aren ve 4.25 g (30.84 mmol) potasyum karbonat 250 ml aseton içerisinde 2 saat geri soğutucu altında kaynatıldı. Daha sonra 2.84 ml (30.84 mmol) metilbromasetat ilave edildi ve 24 saat kaynatılarak karıştırıldı. Soğutulan karışım süzüldü, süzüntü destillendi. Kalan katı etanol içerisinde kristallendirildi. E.n o C (lit., o C, Arnaud-eu ve ark., 1989). Verim % H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 1.05 (s, 36H, Bu t ), 1.17 (s, 18H, Bu t ), 3.20 (d, 4H, J=13.30

81 71 Hz, ArCH 2 Ar), 3.78 (s, 12H, CH 3 ), 4.82 (s, 8H, CH 2 ), 4.83 (d, 4H, J=13.30 Hz, ArCH 2 Ar), 6.90 (s, 8H, ArH). C C C C CH 3 CH 3 CH 3 CH ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28-tetrahidroksikarbonilmetoksi kaliks[4]aren (17) 3.9 g (4.4 mmol) kaliksaren in tetra ester türevi 200 ml etanol içerisinde çözüldü. Üzerine KH ın sulu çözeltisi ilave edilerek 8 saat kaynatıldı. Sonra çözücü tamamen destillendi ve kalan kısım asitli su ile çöktürüldü. Daha sonra süzüldü ve su ile yıkandı. % 54 verimle tetra asit türevli kaliksaren 17 elde edildi. (Shinkai ve ark., 1989) C C C C H H H H ,11,17,23-Tetra-ter-bütil-25,26,27,28 tetraklorokarbonilmetoksi kaliks [4] aren (18) 0.8g (0.91 mmol) p-ter-bütilkaliks[4]arenin tetraasit türevi 17 alınarak 35 ml THF de çözüldü. Üzerine 4.5 mmol tiyonilklorür ilave edildi ve 3 saat geri soğutucu altında kaynatıldı. Daha sonra çözücü vakum altında tamamen destilllendi ve daha fazla saflaştırılmadan bir sonraki basamakta kullanıldı.

82 72 C Cl C C C Cl Cl Cl p-ter-bütilkaliks[4]arenin tetraamit türevinin sentezi (19) Bir önceki adımda elde edilen tetraasitklorür türevi 30 ml THF içerisinde çözüldükten sonra üzerine 1.55 ml (9.1 mmol) dibütilamin ilave edildi ve reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 3 saat karıştırıldı. Sonra karışım süzüldü ve süzüntü evoparatörde destillendi. Kalan katı kısım metanolden kristallendirildi. Verim % 58, E.n o C. 1 H MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 0.82 (m, 24H, CH 3 ), 1.00 (s, 36H, Bu t ), 1.20 (m, 16H, CH 2 ), 1.40 (m, 16H, CH 2 ), 3.20 (d, 4H, J=12.91Hz, ArCH 2 Ar; m, 16H, -CH 2 ), 4.90 (s, 8H, CH 2 ), 5.2 (d, 4H, J=12.91 Hz, ArCH 2 Ar), 6.70 (s, 8H, ArH). 13 C MR (CDCl 3 ) δ (ppm): 10.8, 20.1, 20.4, 29.9, 31.4, 32.4, 33.7, , 71.5, 76.7, 77.1, 77.4, 125.2, 133.6, 144.1, 154.0, Anal. Hesaplanan. C 84 H : C, 76.09; H, 10.03;, 4.23 %. Bulunan: C, 76.42; H, 10.18;, 4.41 %. C C C C 19

83 Enzim mimik ÇalıĢmaları Kinetik reaksiyonlar Şekil 3.6. da gösterilen model substratlar p-nitrofenilasetat (p- PA) ve p-nitrofenilpalmitat ın (p-pp) hidrolizinden açığa çıkan p-nitrofenol (p-p) ile takip edildi. 2 2 H 3 C H 3 C(H 2 C) 14 p-pa p-pp ġekil 3.6. p-itrofenilasetat ve p-nitrofenilpalmitat ın kimyasal yapıları Enzim modelleri 3, 6 ve 10 varlığında (%50 DMS/%50 Su) çözücü karışımında her iki substratın hidrolizi farklı ph değerlerinde (7.0, 7.5, 8.0 ve 8.5) çalışıldı. Çözelti ph ları TRIS tamponu kullanılarak belirlendi. Enzim modelleri 3, 6 ve 10 (DMS içerisinde 35 µl, 10 mm) oda sıcaklığında 1750 µl, 40 mm tampon içeren küvet içerisine ilave edildi. Birkaç saniyelik dengeleme zamanından sonra uygun miktardaki p-pa (DMS içerisinde 56 µl, 25 mm) küvet içerisine dikkatli bir şekilde ilave edildi. p-p nin açığa çıkması ile UV-visible spektrofotometresinde 400 nm dalga boyunda meydana gelen absorpsiyon artışı kaydedildi. Son konsantrasyonlar: Enzim modelleri için 0.1 mm; tampon için 20 mm; p- PA için 0.4 mm. Enzim modelleri 3, 6 ve 10 (DMS içerisinde µl, 10 mm) oda sıcaklığında 1750 µl, 40 mm tampon içeren küvet içerisine ilave edildi. Birkaç saniyelik dengeleme zamanından sonra uygun miktardaki p-pa (21 µl, 25 mm) küvet içerisine dikkatli bir şekilde ilave edildi. p-p nin açığa çıkması ile UV-visible spektrofotometresinde 400 nm dalga boyunda meydana gelen absorpsiyon artışı kaydedildi. Son konsantrasyonlar: Enzim modelleri için; 0.35 mm; tampon için 20 mm; p-pa için 0.15 mm. Enzim modellleri 3, 6 ve 10 (DMS içerisinde 17.5 µl, 10 mm) oda sıcaklığında 1750 µl, 40 mm tampon içeren küvet içerisine ilave edildi. Birkaç saniyelik dengeleme zamanından sonra uygun miktardaki p-pp (DMS içerisinde 56 µl, 12.5 mm) küvet içerisine dikkatli bir şekilde ilave edildi. p-p nin açığa çıkması ile UV-visible

84 74 spektrofotometresinde 400 nm dalga boyunda meydana gelen absorpsiyon artışı kaydedildi. Son konsantrasyonlar: Enzim modelleri için; 0.05 mm; tampon için 20 mm; p- PP için 0.2 mm. Enzim modelleri 3, 6 ve 10 varlığında ve yokluğunda p-pa ve p-pp nin hidroliz reaksiyonları 4 farklı ph değerinde (7.0, 7.5, 8.0; 8.5) çalışıldı. Birinci mertebe reaksiyonlarda hız aşağıdaki gibi ifade edilir: d[ S] R k[ S] dt (3.1.) Eşitlik 3.1. de [S];substrat konsantrasyonu, k; hız sabiti ve t ise zamandır. Bu eşitliğin düzenlenmesi ile d[ S] kdt [ S] (3.2.) eşitliği elde edilir. İntegrasyon ve gerekli düzenlenmeler yapıldığında aşağıdaki genel eşitlik elde edilir: kt [ St ] [ S0 ] e (3.3.) Deneysel çalışmalarımızda reaksiyon ortamında oluşan ürünün konsantrasyonu belirlendiği için yukarıdaki eşitlik ürün konsatrasyonu yönünden ele alınarak ve absorpsiyon-konsantrasyon ilişkisi göz önünde bulundurularak aşağıdaki eşitlik elde edilir: ln A At A kt (3.4.) / Eşitlikte A ; sonsuz andaki absorbans değeri, A t ; t anındaki absorbans değeridir. Eşitlik kullanılarak (ln A A / A t ) nın zamana karşı grafiğe geçirilmesi ile reaksiyon hız sabiti (yalancı-birinci mertebeden) elde edilir (Şaki, 2004).

85 75 Hidroliz reaksiyonu sonucunda açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbsiyon değerindeki artış ile hem katalizörlü (k kat ) hem de katalizörsüz (k kats ) reaksiyonların başlangıç hız sabitleri yukarıda belirtildiği gibi hesaplandı Lipaz Ġmmobilizasyonu Sol-jel enkapsülasyon metodu (Reetz ve ark., 2003) Candida rugosa lipaz (CRL) (60 mg), fosfat tamponu içerisinde (390 µl, 0.05 M, ph=7.0) karıştırıldı. Karışım üzerine kaliksaren türevi (0.05 g), 100 µl polivinil alkol (%4 g/v), 50 µl af çözeltisi (0.1 M) ve 100 µl izopropil alkol ilave edilerek karıştırılıp homojenize edildi. Daha sonra 780 µl oktiltrietoksisilan (TES) (2.5 mmol) ve 74 µl tetraetoksisilan (TES) (0.5 mmol) ilave edilerek karıştırıldı. Birkaç dakika sonunda oluşan jelimsi karışım (Şekil 3.7.) bir gece +4 o C de bekletilerek 10 ml distile su ve 10 ml izopropil alkol ile yıkandı. Daha sonra karışım liyofilizatörde kurutuldu. Yıkama çözeltilerinin protein içeriği ve immobilizasyon yüzdeleri Bradford (1976) metodu ile belirlendi. ġekil 3.7. Kaliksaren katkılı sol-jel kapsüllemenin şematik gösterimi

86 Absorbans (400 nm) Aktivite tayini (Chiou ve Wu, 2004 ) 1 ml fosfat tampon çözeltisi (ph=7.0) içerisinde bulunan belirli miktarlardaki serbest lipaz veya immobilize lipaz karışımına etanol içerisinde hazırlanmış % 0.5 lik p- PP çözeltisinden 1 ml ilave edilerek oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı. Daha sonra reaksiyon, 2 ml 0.5 a 2 C 3 ilavesiyle durduruldu. Karışım santifürüj edilerek, enzimatik aktivite UV-visible spektrofotometresinde, açığa çıkan p-p nin 400 nm dalga boyundaki absorbansından hesaplandı. Bu absorbans değeri standart olarak çizilen p-p (mol/litre) kalibrasyon grafiğinde (Şekil 3.8.) yerine konularak açığa çıkan p-p nin miktarı tespit edildi. Lipazın 1 Unit (U) i, dakikada 1µmol p-pp hidroliz etmek için gerekli olan lipaz miktarıdır. Bu verilerden yararlanılarak serbest ve immobilize lipazların aktiviteleri belirlenmiştir. 2,5 2 1,5 1 0, p-p (µm) ġekil 3.8. Standart p-p ( p-nitrofenol)- absorbans grafiği (λmax=400nm) Protein miktarı (Bradford, 1976) Serbest ve immobilize lipaz içerisindeki protein miktarı Bradford metoduna göre bulundu. Bunun için standart olarak Bovine serum albumin (BSA) nın belirli konsantrasyonlardaki çözeltileri hazırlanarak bu çözeltilerin 0.1 ml si 3 ml Bradford reagent (Coomassie Brilliant Blue G-250 ) ile etkileştirilip 595 nm dalga boyundaki

87 Absorbans (595 nm) 77 absorbansları ölçüldü. Standart olarak, absorbans - protein miktarı (mg/ml) grafiği çizildi (Şekil 3.9.) ve bu grafik protein çalışmalarında referans alındı. 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,25 0,5 0,75 1 protein miktarı (mg/ml) ġekil 3.9. Standart protein miktarı (mg/ml)- absorbans grafiği (λmax =595 nm) Lipaz immobilizasyonu gerçekleştirildikten sonra, immobilize lipazların serbest lipaz a göre termal kararlılık, optimum ph ve optimum sıcaklık gibi özellikleri incelendi. Termal kararlılık deneyleri serbest ve immobilize lipazların 0.05 M fosfat tamponu içerisinde (ph=7.0) 60 o C de 120 dakika bekletilip aktivitelerine bakılarak yapıldı. Enzimatik aktivitede, immobilize ve serbest lipazlar için optimum ph belirlendi. Bunun için aktivite tayininde verilen ph=7.0 ve 0.05 M fosfat tamponu yerine farklı ph larda (4,6,7,8 ve 9) hazırlanan fosfat tampon çözeltileri kullanılarak aktivitelerine bakıldı. İmmobilize ve serbest lipazların optimum sıcaklığı, ph=7.0 ve 0.05 M fosfat tamponu içerisinde her sıcaklık derecesinde (25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ve 60 o C) 20 dakika bekletilerek substratın (p-nitrofenilpalmitat) ilavesiyle tespit edildi (Hung ve ark., 2003) Ġmmobilize lipazlar ile (R/S)-aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi Rasemik aproksen metil esterinin serbest lipaz ile gerçekleştirilen enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonu için mg/ml (ph=7.0 de 0.05 M fosfat tamponu içerisinde)

88 78 enzim çözeltisi kullanıldı. aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonlarında kullanılan bütün immobilize lipazların miktarı serbest lipazın kullanılan miktarına karşılık gelen Unit e eşdeğer olacak şekilde belirlendi. Genel Prosedür; 5 ml lik vial şişe içerisine 2 ml serbest enzim çözeltisi (0.781 mg/ml, ph=7.0, 0.05 M fosfat tamponu) ya da serbest lipaz a eşdeğer Unit de immobilize lipaz konuldu. Daha sonra üzerine 100 µl (R/S)-aproksen metil esterinin izooktan içerisindeki çözeltisi (20 mm) ilave edildi ve 24 saat 35 o C de inkübe edildi. Daha sonra karışım üzerine 2 ml izooktan konularak ekstraksiyon yapıldı (Şekil 3.10.). İzoktan fazındaki numune, HPLC ye verilerek (R/S)-aproksen metil esterinin (S)-aproksen e enantiyomerik olarak dönüşümü belirlendi. ġekil (R/S)-aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi Ġmmobilize lipazlar ile (R/S)-2-fenoksi propiyonik asit metil ester inin enantiyoseçimli hidrolizi 2-Fenoksi propiyonik asit metil ester inin serbest lipaz ile gerçekleştirilen enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonu için mg/ml (ph=7.0 de 0.05 M fosfat tamponu

89 79 içerisinde) enzim çözeltisi kullanıldı. 2-Fenoksi propiyonik asit metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonlarında kullanılan bütün immobilize lipazların miktarı serbest lipazın kullanılan miktarına karşılık gelen Unit e eşdeğer olacak şekilde belirlendi. Genel Prosedür; 5 ml lik vial şişe içerisine 2 ml serbest enzim çözeltisi (0.487 mg/ml, ph=7.0, 0.05 M fosfat tamponu) ya da serbest lipaz a eşdeğer Unit de immobilize lipaz konuldu. Daha sonra üzerine 100 µl (R/S)-2-fenoksi propiyonik asit metil esterinin izooktan içerisindeki çözeltisi (20 mm) ilave edildi ve 1 saat 35 o C de inkübe edildi. Daha sonra karışım üzerine 2 ml izooktan konularak ekstraksiyon yapıldı (Şekil 3.11.). İzoktan fazındaki numune, HPLC ye verilerek (R/S)-2 fenoksi propiyonik asit metil esterinin (R)-2 fenoksi propiyonik asite enantiyomerik olarak dönüşümü belirlendi. ġekil (R/S)-2-Fenoksi propiyonik asit metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi HPLC de elde edilen sonuçlara göre yapılan hesaplamalar literatürdeki (Chen ve ark., 1982) formüller kullanılarak yapıldı. Enantiyomerik fazlalık (ee), dönüşüm oranı (x), enantiyoseçimlilik (E) gibi değerler aşağıdaki bağıntılar kullanılarak bulundu.

90 80 E= ln[ (1- x) (1-ee s ) ] ln[ (1- x) (1+ee s ) ] x= ee s C R - C S ee s = ee p = ee s + ee p C R + C S C S - C R C S + C R ee s ; Kalan substratın enantiyomerik fazlalığı ee p ; luşan ürünün enantiyomerik fazlalığı C R ; R enantiyomerinin konsantrasyonu C S ; S enantiyomerinin konsantrasyonu

91 81 4. ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA 4.1. Kaliksaren BileĢiklerinin Sentezi Bu çalışmada amaç; enzim mimik çalışmalarında ve lipaz ın sol-jel prosedürüne göre immobilizasyonunda katkı maddesi olarak kullanılabilecek farklı fonksiyonel gruplar içeren kaliks[4]aren bileşikleri sentezlemekti. Bunun için ilk olarak başlangıç bileşiğimiz olan p-ter-bütilkaliks[4]aren (1) literatürde belirtilen metoda göre sentezlendi (Gutche, 1990). R HCH ah H R= t er-bütil HH HH 1 Daha sonra enzim-mimik çalışmalarında kullanacağımız kaliksaren bileşiklerini elde etmek için kaliksaren bileşiği hem fenolik-h üzerinden hem de fenolik halkanın p- pozisyonundan fonksiyonlandırıldı. Bu amaçla ilk olarak kaliksaren, 1,3-dibrompropan ile K 2 C 3 varlığında asetonitril içerisinde etkileştirildi, reaksiyon ince tabaka kromatografisi ile takip edildi ve % 75 verimle dibrom türevi 2 elde edildi. 1,3-dibrompropan K 2 C 3 HH HH CH 3 C H H 1 Br 2 Br 1 H MR spektroskopisinde δ 3.35 ve 4.28 ppm de gözlenen AB tipi protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, 2.51, 4.05 ve 4.15 ppm deki protonlar ise dibrom propanın bağlandığını göstermektedir.

92 82 H H H ai H H CH 3 C Br 2 Br 3 Sentezlenen 2 bileşiği imidazol ile asetonitril içerisinde etkileştirildi. Reaksiyon ince tabaka kromatografisi ile takip edildi ve 3 numaralı kaliksaren bileşiği % 76 verimle elde edildi 1 H MR spektroskopisinde δ 3.35 ve 4.05 ppm de gözlenen AB tipi protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, dibrom bileşiğindeki CH 2 protonunun 4.15 ppm deki δ değeri imidazol bağlandıktan sonra 4.9 ppm e kayması ve imidazol grubuna ait 8.15 ppm deki δ değeri bileşiğimizin sentezlendiğini göstermektedir. Enzim-mimik çalışmalarında kullandığımız ikinci bileşiği sentezlemek için ilk olarak kaliksaren, -(3-bromopropil)ftalimit ile KI ve K 2 C 3 varlığında asetonitril içerisinde etkileştirildi ve bileşik 4 elde edildi (Chrisstoffels, 1999). Br HH HH 1 KI, K 2 C 3, CH 3 C H H 4 1 H MR spektroskopisinde δ 3.35 ve 4.3 ppm deki AB tipi protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 7.6 ve 7.75 ppm deki protonlarda ftalimitteki aromatik halka protonlarını göstermektedir. Sentezlenen 4 bileşiği daha sonra amin türevli kaliksaren elde etmek için KH varlığında etanol içerisinde hidroliz edildi ve % 82 verimle 5 bileşiği elde edildi (Chrisstoffels, 1999).) 1 H MR spektroskopisinde δ 3.35 ve 4.25 ppm deki AB tibi dublet

93 83 protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğuna, δ 3.20 ppm deki H 2 ye bağlı triplet 4 protona işaret etmektedir. H H H 2 H 2 H 2 Etanol H H H 2 5 H 2 4 Daha sonra elde edilen 5 bileşiği kloroform/ metanol çözücü karışımında 4 (5)- imidazol karboksi aldehit ile etkileştirilerek % 75verimle 6 numaralı bileşik elde edildi. Bu bileşiğin IR spektrumundaki 1648 cm -1 deki (-HC=-) grubuna ait bant bağlanmanın gerçekleştiğini göstermektedir. CH H H 2 H H H 2 5 Kloroform Metanol HC H H HC H 6 H 1 H MR spektrumuna bakıldığında δ 3.35 ve 4.30 ppm deki AB tipi dublet protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 8.30 ppm deki (-HC=-) grubuna ait protonlar ve δ 7.70 ve 7.35 ppm deki imidazol grubuna ait protonlar bileşiğin sentezlendiğini göstermektedir. Enzim-mimik çalışmalarında kullandığımız üçüncü bileşiği sentezlemek için de ilk olarak kaliksaren, K 2 C 3 varlığında aseton içerisinde metilbromasetat ile etkileştirilerek

94 84 diester türevine dönüştürüldü. Reaksiyon ince tabaka kromatografisi ile izlendi ve bileşik 7 % 65 verimle elde edildi. Bileşiğin IR spektrumunda 1765 cm -1 deki bant ester grubuna işaret etmektedir. 1 H MR spektrumundaki δ 3.35 ve 4.45 ppm deki AB tipi dublet protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu göstermektedir. BrCH 2 CCH 3 K 2 C 3 HH HH 1 Aseton C H H C CH 3 7 CH 3 Bir sonraki basamakta elde edilen bileşik 7 kloroform/metanol ortamında etilendiaminle etkileştirilerek % 82 verimle 8 numaralı bileşik elde edildi. Reaksiyon hem ince tabaka kromatografisi ile hem de 7 nolu bileşiğin IR spektrumunda 1765 cm -1 de görülen ester karboniline ati bandın kaybolup, 1688 cm -1 deki amit grubuna ait bandın ortaya çıkması ile takip edildi. 1 H MR spektrumundaki δ 3.49 ve 4.25 ppm deki AB tipi protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu ve δ 8.60 ppm deki protonlar da amit bağının oluştuğunu göstermektedir. HC CH Etilendiamin HMTA H H CHCl 3 /MeH H H TFA H H C CH 3 7 C CH 3 C H 8 C H C H 9 C H Daha sonra 8 bileşiği literatüre göre (Chawla ve ark., 2006) triflorasetikasit ortamında hekzametilentetraamin ile etkileştirildi ve fenolik halkanın p- pozisyonunda aldehit grubu bulunduran 9 numaralı bileşik % 78 verimle elde edildi. 1 H MR spektrumundaki δ 3.55 ve 4.18 ppm deki AB tipi dublet protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 9.80 ppm deki protonlar aldehit grubunun varlığını doğrulamaktadır.

95 85 Son olarakta bileşik 9, kloroform/metanol ortamında 3-aminopropilimidazol ile etkileştirerek 10 numaralı bileşik % 78 verimle elde edildi. HC CH HC CH H H H H C H C H H 2 CHCl 3 / MeH C H C H 9 10 Bileşiğin 1 H MR spektrumundaki δ 3.58 ve 4.24 ppm deki AB tipi dublet protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, ayrıca aldehit grubuna ait δ 9.80 ppm deki pikin kaybolup 8.35 ppm deki CH= grubundaki protona ait pikin ortaya çıkması bileşiğin sentezlendiğini göstermektedir. Daha sonra çalışmanın ikinci bölümü olan lipaz immobilizasyonunda kullanılan kaliksarenlerin sentezlenmesi aşamasına geçildi. Bu amaçla ilk olarak kaliksarenin halkalı amit türevleri sentezlendi. Bu çalışmada kullandığımız ilk halkalı amit önceki şemada sentezlenen 8 numaralı bileşiktir. İkinci bileşik ise kaliksaren in diester türevinin toluen/metanol ortamında dietilentriamin ile etkileştirilmesi ile elde edilen 11 numaralı bileşiktir. Diester bileşiğinin IR spektrumundaki 1765 cm -1 deki bantın kaybolup yerine 1678 cm -1 deki bantın ortaya çıkması amit türevinin oluştuğunu göstermektedir. 1 H MR spektrumundaki δ 3.38 ve 4.25 ppm deki protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 8.30 ppm deki protonlar amit grubunun varlığını doğrulamaktadır.

96 86 Dietilentriamin C H H C Toluen/Metanol C H H C CH 3 7 CH 3 H H H 11 Sentezlenen üçüncü halkalı amit ise; kaliksaren in diester türevinin toluen/metanol ortamında 3,6 diokza-1,8 diaminooktan ile etkileştirilmesi ile elde edilen 12 numaralı bileşiktir. Bileşik kolon kromatografisi ile saflaştırıldıktan sonra % 52 verimle elde edildi. Bileşiğin IR spektrumunda 1661 cm -1 deki bant amit pikine aittir. 1 H MR spektrumundaki δ 3.35 ve 4.20 ppm deki protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 8.25 ppm deki protonlar amit grubuna ait protonlar bileşiğin sentezlendiğini göstermektedir. 3,6 diokza-1,8 diaminooktan C H H C Toluen/Metanol C H H C CH 3 7 CH 3 H H 12 Yine lipaz immobilizasyonunda kullanılmak üzere kaliksaren in di ve tetra türevli iki tane amit türevi sentezlendi. Bunun için kaliksaren literatüre göre (Collins, 1991) diester 7 ve tetraester 16 türevine dönüştürüldü. 16 numaralı bileşiğin 1 H MR spektrumuna bakıldığında δ 3.20 ve 4.83 ppm deki protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 3.78 ppm deki protonlar ester grubunun 12 eşdeğer potonuna işaret etmektedir. Ayrıca δ 1.05 ppm deki ter-bütil grubuna ait eşdeğer protonlar

97 87 kaliksaren bileşiğinin fenolik H grubunun dördünede ester grubunun bağlandığını doğrulamaktadır. H H KH Etanol H H Tiyonilklorür THF H H C CH 3 7 C CH 3 C H 13 C H C Cl 14 C Cl Sentezlenen ester bileşikleri etanol içerisinde KH varlığında diasit 13 ve tetraasit 17 türevlerine dönüştürüldü. Daha sonra elde edilen asit fonksiyonlu kaliksarenler THF içerisinde tiyonilklorür ile etkileştirilerek asit klorür türevlerine dönüştürüldü. BrCH 2CCH 3 Aseton KH Etanol H H 1 H H 16 C C C C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 C C C C H H H H 17 Elde edilen kaliksaren in diasitklorür 14 ve teraasitklorür 17 bileşikleri dibütilamin ile THF çözücü ortamında etkileştirilerek di ve tetra amit bileşiklerine dönüştürüldü. Dibütilamin THF H H H H C Cl 14 C Cl C C 15

98 88 Sentezlenen 15 numaralı bileşiğin IR spektrumunda ester grubuna ait bantın görülmemesi ve amit grubuna ait 1646 cm -1 deki bantın varlığı amit bağının oluştuğuna işaret etmektedir. Bileşiğin 1 H MR spektrumundaki δ 3.28 ve 4.45 ppm deki protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 0.95, 1.35, 1.6 ve 3.38 ppm deki protonlar dibütilamin grubuna ait protonlara işaret etmektedir. C C C C H H H H 17 Tiyonilklorür THF C C C C Cl Cl Cl Cl 18 Dibütilamin THF C C 19 C C 19 numaralı bileşiğin 1 H MR spektrumuna bakıldığında ise δ 3.20 ve 5.20 ppm deki protonlar bileşiğin koni konformasyonunda olduğunu, δ 0.82, 1.20, 1.4 ve 3.20 ppm deki protonlar dibütilamin bileşiğndeki protonlara işaret etmektedir. Ayrıca δ 1.00 ppm deki singlet 36 proton eşdeğer ter-bütil gruplarını göstermektedir Enzim Mimik ÇalıĢmaları Enzim-mimik modelleri olarak 3, 6 ve 10 numaralı kaliksaren türevleri (Şekil 4.1.) kullanılmıştır. Enzim modelleri 3, 6 ve 10 varlığında ve yokluğunda p-pa ve p-pp nin hidroliz reaksiyonları 4 farklı ph değerinde (7.0, 7.5, 8.0; 8.5) çalışıldı. Zamana karşı absorbans ve zamana karşı ln[(a -A t )/A ] değerleri grafiğe geçirildi.

99 89 H H H H HC CH 3 HC H 6 HC H C H H H C H 10 ġekil 4.1. Enzim-mimik olarak kullanılan kaliks[4]aren türevleri Hidroliz reaksiyonu sonucunda açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbsiyon değerindeki artış ile hem katalizörlü (k kat ) hem de katalizörsüz (k kats ) reaksiyonların başlangıç hız sabitleri hesaplandı Enzim modelleri 3, 6 ve 10 ile p-pa nın hidroliz reaksiyonu H 3 C 2 Enzim modeli H 2 p -PA p-p 400 nm, UV Enzim modeli 3 varlığında gerçekleştirilen p-pa nın hidroliz reaksiyonunda kayda değer bir hız artışı gözlenememiştir. Dolayısıyla bu bileşikle ilgili veriler burada tartışılmamıştır. 3 ve 10 numaralı enzim modellerinin yapılarına bakıldığında ikisinde de aynı imidazol grubu bulunmaktadır. Ancak 3 numaralı enzim modelinde imidazol grubu fenolik H tarafında bulunmaktadır. 10 numaralı enzim modelinde ise imidazol grubu fenolik halkanın para konumunda bulunmakta ve farklı olarak bir de schiff bazı grubu bulunmaktadır. 6 ve 10 numaralı enzim modellerine ait grafikler aşağıda gösterilmiştir.

100 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=7 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi Şekil 4.2., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil 4.3. Enzim modeli 6 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =0, s- 1 ve R 2 =0.999 Şekil 4.3. e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 3 kat arttığı bulunmuştur.

101 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=7.5 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi. Şekil 4.4., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil 4.5. Enzim modeli 6 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =0, s -1 ve R 2 =0.998 Şekil 4.5. e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 20 kat arttığı bulunmuştur.

102 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=8 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi. Şekil 4.6., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil 4.7. Enzim modeli 6 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =0, s -1 ve R 2 =0.997 Şekil 4.7. ye göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 25 kat arttığı bulunmuştur.

103 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=8.5 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi. Şekil 4.8., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil 4.9. Enzim modeli 6 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =1, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil 4.9. a göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 31 kat arttığı bulunmuştur.

104 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=7.5 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 10 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi. Şekil 4.10., enzim modelimizle (10) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 10 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =3, s -1 ve R 2 =0.996 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 10 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 10 kat arttığı bulunmuştur.

105 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=8 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 10 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi. Şekil 4.12., enzim modelimizle (10) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn 1500 ġekil Enzim modeli 10 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =3, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 10 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 11,5 kat arttığı bulunmuştur.

106 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=8.5 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 10 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi. Şekil 4.14., enzim modelimizle (10) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn 1500 ġekil Enzim modeli 10 (0.1 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat = s -1 ve R 2 =0.997 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 10 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 12,5 kat arttığı bulunmuştur.

107 Absorbans 97 Elde edilen tüm sonuçlar Çizelge 4.1. de özetlenmiştir. Çizelgeden de görüleceği gibi ph hız değişiminde önemli bir parametre olarak karşımıza çıkmaktadır. Hem enzim modeli 6 hem de 10 için ph artışı ile hidroliz reaksiyon hızı artmıştır. Bu sonuç bize reaksiyon mekanizmasında ortam ph ının etkin olduğunu göstermektedir. Çizelge 4.1. Enzim modelleri 6 ve 10 ile gerçekleştirilen p-pa nın hidroliz reaksiyonu için kinetik veriler Enzim modeli ph k kat /k kats Reaksiyon 20mM ve belirtilen ph larda TRIS tamponu içerisinde gerçekleştirildi. Konsantrasyonlar; p-pa için 0.4 mm; enzim modelleri için 0.1 mm dır. Ayrıca, p-pa nın hidroliz reaksiyonunda enzim modelleri 3, 6 ve 10 ile farklı enzim/substrat konsantrasyon oranında deneyler yapılmıştır. Enzim modeli 3 bu konsantrasyon oranında da yine katalitik etkinlik göstermemiştir Zaman/sn ġekil o C ve ph=7 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi.

108 Absorbans ln[(a -A t )/A ] 98 Şekil 4.16., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =8, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil ye göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 48 kat arttığı bulunmuştur Zaman/sn ġekil o C ve ph=7.5 de (tris tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi

109 Absorbans ln[(a -A t )/A ] 99 Şekil 4.18., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn 1500 ġekil Enzim modeli 6 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =9, s -1 ve R 2 =0.998 Şekil a göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 130 kat arttığı bulunmuştur Zaman/sn ġekil o C ve ph=8 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi

110 Absorbans ln[(a -A t )/A ] 100 Şekil 4.20., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =1, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 152 kat arttığı bulunmuştur Zaman/sn ġekil o C ve ph=8.5 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi

111 Absorbans ln[(a -A t )/A ] 101 Şekil 4.22., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =1, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 207 kat arttığı bulunmuştur Zaman/sn ġekil o C ve ph=7.5 de TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 10 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi

112 Absorbans ln[(a -A t )/A ] 102 Şekil 4.24., enzim modelimizle (10) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 10 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =3, s -1 ve R 2 =0.998 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 10 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 43,6 kat arttığı bulunmuştur Zaman/sn ġekil o C ve ph=8 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 10 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi

113 Absorbans ln[(a -A t )/A ] 103 Şekil 4.26., enzim modelimizle (10) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 10 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =5, s -1 ve R 2 =0.998 Şekil ye göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 10 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 53,8 kat arttığı bulunmuştur Zaman/sn ġekil o C ve ph=8.5 de (TRIS tamponu) p-pa nın enzim modeli 10 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi

114 ln[(a -A t )/A ] 104 Şekil 4.28., enzim modelimizle (10) katalizlenen p-pa nın hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn 1500 ġekil Enzim modeli 10 (0.35 mm) katalizliğinde p-pa nın hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =8, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil a göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 10 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 123,6 kat arttığı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.2. de özetlenmiştir. Çizelge 4.2. Enzim modeli 6 ve 10 ile gerçekleştirilen p-pa nın hidroliz reaksiyonu için kinetik veriler Enzim modeli ph k kat /k kats Reaksiyon 20mM ve belirtilen ph larda TRIS tamponu içerisinde gerçekleştirildi. Konsantrasyonlar; p-pa için 0.15 mm; enzim modelleri için 0.35 mm dır.

115 105 Enzim modelinin konsantrasyonun substrata oranla ortamda fazla miktarlarda bulunması hız artışı üzerine olumlu etkilerde bulunmuştur. Bu durum tüm ph larda görülmüştür (Çizelge 4.2.). Enzim kinetiği ile ilgili gerçekleştirilen çalışmalarda benzer sonuçlar elde edilmiştir Enzim modelleri 3, 6 ve 10 ile p-pp nin hidroliz reaksiyonu H 3 C(H 2 C) 14 2 Enzim modeli H 2 p -PP p -P 400 nm, UV Enzim modelleri 3 ve 10 varlığında gerçekleştirilen p-pp nin hidroliz reaksiyonunda kayda değer bir hız artışı gözlenememiştir. Sadece enzim modeli 6 katalizörlüğünde gerçekleştirilen reaksiyonda hız artışı görülmüştür. Bu kısımda gerçekleştirilen hidroliz reaksiyonunda substrat olarak p-pa ya kıyasla daha uzun alkil zincirine sahip olan p-pp kullanılmıştır. Substrattaki uzun alkil zincirinin enzimatik aktivite üzerine olumsuz etki gösterdiğini söyleyebiliriz. Enzim modeli 10 daki fenolik H gruplarının azacrown köprüsü ile kapalı halde bulunmasının yapıdaki esnekliği azalttığı söylenebilir. Bu durumda substrat-enzim arasındaki etkileşim daha az olmaktadır ki bu da enzim modelinin katalitik etkinliğinin azalmasına neden olabilmektedir. Literatürde de (Molenveld ve ark., 1999a) buna benzer yapısal esnekliğin düşük olmasının katalitik etki üzerine olumsuz etkiler yaptığı belirtilmiştir.

116 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=7 de (TRIS tamponu) p-pp nin enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi Şekil 4.30., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pp nin hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.05 mm) katalizliğinde p-pp nin hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =4, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 44,6 kat arttığı bulunmuştur.

117 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=7.5 de (TRIS tamponu) p-pp nin enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi Şekil 4.32., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pp nin hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.05 mm) katalizliğinde p-pp nin hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=7.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =6, s -1 ve R 2 =0.991 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 104 kat arttığı bulunmuştur.

118 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=8 de (TRIS tamponu) p-pp nin enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi Şekil 4.34., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pp nin hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.05 mm) katalizliğinde p-pp nin hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =4, s -1 ve R 2 =0.990 Şekil e göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 147 kat arttığı bulunmuştur.

119 ln[(a -A t )/A ] Absorbans Zaman/sn ġekil o C ve ph=8.5 de (TRIS tamponu) p-pp nin enzim modeli 6 ile katalizlenen hidrolizi sonucu açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbansının zamana göre değişimi Şekil 4.36., enzim modelimizle (6) katalizlenen p-pp nin hidrolizinde zamanın fonksiyonu olarak açığa çıkan p-p nin 400 nm deki absorbans artışını göstermektedir Zaman/sn ġekil Enzim modeli 6 (0.05 mm) katalizliğinde p-pp nin hidrolizi sonucu oluşan p-p nin ln[(a - A t )/A ] değerlerinin zamana göre değişimi (ph=8.5 TRIS tamponu ve 25 o C). Yalancı birinci mertebe hız sabiti k kat =4, s -1 ve R 2 =0.999 Şekil ye göre yapılan hesaplamalarımızdan enzim modeli 6 varlığında meydana gelen reaksiyon hızının, katalizörsüz ortamda gerçekleşen reaksiyon hızına göre 165 kat arttığı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.3. de özetlenmiştir.

120 110 Çizelge 4.3. Enzim modeli 6 ile gerçekleştirilen p-pp nin hidroliz reaksiyonu için kinetik veriler Enzim modeli ph k kat /k kats Reaksiyon 20mM ve belirtilen ph larda TRIS tamponu içerisinde gerçekleştirildi. Konsantrasyonlar; p-pp için 0.2 mm; enzim modelleri için 0.05 mm dır. Enzim modeli 6 nın enzim modelleri 3 ve 10 dan farklı bir imidazol ve schiff bazı grubun sahip olmasının hız artışında etkili olduğu görülmektedir. Bu durum tüm ph larda gözlenmiştir. Enzim modeli 6 ile substrat p-pp arasındaki muhtemel etkileşim mekanizması Şekil de gösterilmiştir. H H HC H.. H.. H H CH 2 ġekil p-pp ile 6 numaralı kaliksarenin etkileşim mekanizması

121 Ġmmobilizasyon ve Enantiyoseçimli Reaksiyonlar Katkı maddesi olarak kaliksaren in kullanıldığı sol-jel kapsülleme Enzimin, RSi(CH 3 ) 3 ve Si(CH 3 ) 4 karışımının baz katalizli hidrolizi ile meydana gelen sol-jel materyaller ile kapsüllenmesini orijinal olarak Reetz ve ark. (2003) ortaya çıkarmıştır. Ayrıca bu çalışma grubu 18-crown-6 ve siklodekstrin gibi katkı maddeleri varlığında kapsüllenen lipazların daha fazla aktivite ve stereoseçicilik gösterdiğini belirtmişlerdir. Reinhoudt ve grubu (1989) organik çözücülerde enzim aktivitesinin crowneter e bağlılığını değerlendirmek amacıyla bir çalışma yapmışlardır. 18-Crown-6 nın amonyum grupları ile komples oluşturma kapasitesi oldukça fazla olduğu için, bu bileşik enzimlerin katyonik lisin grupları ile kompleksler oluşturabilir. Kompleksleşme olduktan sonra, lisin gruplarının yükü korunur ve dolayısıyla tuz köprüsü oluşumuna etkisi azalır. Bu yüzden, eter-lisin komplekslerinin oluşumu moleküller arası ve moleküller içi tuz köprülerinin oluşumunu azaltabilir. Üstelik, bu çalışmada aktivasyonun açıkça makrosiklik etkiden kaynaklandığı gözlenmiştir. Böylece enzimin mevcut konformasyonu korunmuş olur. Crown eterlerden başka kaliksarenler de, en önemli makrosiklik konak moleküllerden birini temsil etmektedir. Literatürde, kaliks[4]aren türevlerinin katyonik lisin ile kompleksler oluşturduğu gösterilmiştir (shima ve ark., 2007). Bu çalışmada CRL nin sol-jel kapsüllenmesinde katkı maddesi olarak kullanılan kaliksaren bileşiklerinin etkisi incelenmiştir. Kıyaslama yapmak için ayrıca katkı maddesi olarak dibenzo-18-krovn-6 denenmiştir. İmmobilizasyonun etkinliği lipaz aktivitesi ve spesifik aktivite yönünden değerlendirilmiştir. Bu terimler aşağıdaki gibi tanımlanmıştır: İ İ ı ı ı ı ı

122 112 Çizelge 4.4. Kaliksaren destekli lipazların protein yükleme ve aktivite değerleri. Sol-jel prosesinde Protein Protein Lipaz Spesifik kullanılan katkı yükleme yükleme aktivitesi aktivite maddeleri ( mg /g- ) verim (%) (U/g destek) ( U/mg-protein) 8-CRL CRL CRL CRL CRL Dibenzo-18- crown Serbest lipaz - a b 35.6 a Serbest lipaz çözeltisinin protein içeriği 70 µg/ml dir. b Serbest lipazın aktivitesi 1 ml (% 0,2) için ifade edilmiştir. Çizelge 4.4. de gösterildiği gibi sol-jel metodu ile immobilize edilen lipazlar p- PP nin hidrolizinde (Şekil 4.39.) katalizör olarak oldukça etkindirler. 2 H 3 C(H 2 C) 14 p-pp 2 H Kaliks-CRL p-p 400 nm, UV ġekil p-pp nin hidrolizi reaksiyonu Ayrıca sonuçlar, kaliksaren destekli immobilize lipazların aktivitesinin, dibenzo- 18-crown-6 destekli olan lipazdan daha fazla olduğu görülmektedir. Yine Çizelge 4.4. e bakıldığı zaman 8, 11 ve 12 numaralı katkı maddeleri durumunda protein miktarlarının sırasıyla 17.4 mg/g-(8-crl), 11.2 mg/g-(11-crl) ve 5.1 mg/g-(12-crl) olduğu görülmektedir. Ayrıca 8-CRL, 11-CRL ve 12-CRL numaralı immobilize lipazların

123 113 aktiviteleri de sırasıyla 123.6, 142.1, ve U/g destek tir. Kapsüllenmiş lipaz 12- CRL nin diğerleri (11-CRL ve 8-CRL) ile kıyaslandığında daha etkin olduğu bulunmuştur. Bir immobilize-enzim sisteminin katalitik etkinliğinin her zaman destek üzerinde adsorplanan protein miktarı ile orantılı olmadığı gösterilmiştir ki (Erdemir ve Yilmaz, 2009) benzer bir sonuç bizim çalışmamızda da karşımıza çıkmıştır. Bu sonuç bize protein yükleme miktarının tek başına enzim moleküllerinin aktivitesinin belirlenmesinde etkili olmadığını göstermektedir. Aktif merkezlerin ve konformasyonun değişimine bağlı olarak aktivite kaybı söz konusudur. Ayrıca, immobilize enzimlerin protein yükleme değerleri arasındaki farkın kaliksarenin halkalı amit türevlerini içeren destek ve lipaz arasındaki etkileşimlerden kaynaklanabileceği söylenebilir. Literatürden kaliksarenlerin, katyonik lisin grupları ile kompleks oluşturduğu bilindiği için bu üç halkalı amit türevinin L-lisinle kompleksleşme derecesine bakıldı. Sonuçlar 12 numaralı kaliksarenin diğerlerine göre daha fazla kompleks yaptığını ortaya çıkardı. Bu da aktivitedeki artışımızı desteklemiş oldu. Katkı maddesi olarak kullanılan diğer bileşikler de 15 ve 19 numaralı kaliksaren bileşikleridir. Çizelge 4.4. e bakıldığı zaman 15 ve 19 numaralı katkı maddeleri durumunda protein miktarlarının sırasıyla 33.9 mg/g-(15-crl) ve 34.8 mg/g-(19-crl) olduğu görülmektedir. Ayrıca 15-CRL ve 19-CRL numaralı immobilize lipazların aktiviteleri de sırasıyla 83.6 ve U/g destek tir. 15 ve 19 numaralı bileşikler aynı amin kullanılarak fakat biri di fonksiyonlu, diğeri ise tetra- fonksiyonlu olarak sentezlenmişlerdir. Sonuçlardan tetra fonksiyonlu olan yani 19-CRL nin daha aktif olduğu görülmektedir. Bu da 19-CRL nin daha fazla hidrofobik yapısı ile enzimle daha çok etkileştiği sonucunu çıkarabilir Ġmmobilize lipazların aktivitesine ph ın etkisi Enzimatik aktiviteyi değiştiren en önemli parametrelerden biri çözeltinin ph dır. Bu yüzden, serbest ve immobilize enzimlerin aktivitelerini ph nın fonksiyonu olarak kıyaslamak çokça kullanılmaktadır. İmmobilize enzimlerin aktivitesine ph etkisi birçok araştırmacılar tarafından çalışılmıştır. Elde edilen sonuçlar ışığında bu etkinin immobilizasyon metoduna ve enzim ve destek arasında meydan gelen ikincil etkileşimlere (hidrofilik ve hidrofobik) bağlı olduğu belirtilmiştir (Puthli ve ark., 2006).

124 Bağıl Aktivite (%) Bağıl Aktivite (%) Serbest lipaz 8-CRL 11-CRL 12-CRL ph ġekil Serbest ve immobilize lipazlar 8,11 ve 12-CRL nin optimum ph grafiği Bu çalışmada p-pp nin hidrolizinde serbest ve immobilize lipazların aktivitesi üzerine ph etkisi ortam ph ının 3 ile 9 arasında değiştirilmesi ile belirlendi. Elde edilen ph grafikler Şekil ve Şekil de gösterildi CRL 19-CRL Serbest lipaz ph ġekil Serbest ve immobilize lipazlar 15 ve 19-CRL nin optimum ph grafiği

125 Bağıl Aktivite (%) 115 p-pp nin hidrolizinde en etkin ph değeri hem serbest hem de tüm immobilize lipazlar için 7.0 olarak bulunmuştur. Bu sonuçlar serbest lipazın optimum ph değerinin immobilizasyondan sonra değişmediğini göstermektedir. Literatürde buna benzer sonuçlar belirtilmiştir (Erdemir ve Yilmaz, 2009; Ghiaci ve ark., 2009) Ġmmobilize lipazların aktivitesine sıcaklığın etkisi İmmobilize lipazlara sıcaklık etkisi immobilizasyon prosedürünün enzim aktivitesini nasıl etkilediğini anlamak için gerekli olan önemli parametrelerden biridir. Genellikle immobilizasyonun, serbest enzimlerde gözlenen optimum sıcaklığı daha yüksek değerlere kaydırdığı gözlenmiştir Serbest lipaz 8-CRL 11-CRL 12-CRL T ( o C) ġekil Serbest ve immobilize lipazlar 8,11 ve 12-CRL nin optimum sıcaklık grafiği

126 Bağıl Aktivite (%) CRL 19-CRL Serbest lipaz T( o C) ġekil Serbest ve immobilize lipazlar 15 ve 19-CRL nin optimum sıcaklık grafiği Serbest ve immobilize lipazlarla katalizlenen ph=7 deki p-pp nin hidrolizinin sıcaklığa bağımlılığı, o C aralığında çalışılmış ve sonuçlar Şekil ve Şekil de verilmiştir. Serbest enzimle yapılan çalışmada optimum sıcaklık yaklaşık 35 o C iken bu değer immobilize enzimler için yaklaşık 45 o C ye kaymıştır. Başka bir ifadeyle serbest lipaz yüksek sıcaklıkta konformasyonel değişikliklerden dolayı bozunmaya uğrarken, sıcaklık artışı (45 o C) immobilize lipazların konformasyonel bütünlüğünü bozmamıştır. Görüldüğü gibi immobilize lipaz katalitik etkinliğini daha yüksek sıcaklıklarda dahi gösterebilmektedir. Elbette durum bazı durumlarda avantajlı olabilir ve bunun immobilize lipazın daha sıkı yapısından kaynaklandığı söylenebilir. Ayrıca bu sonuç enzim ve destek arasındaki hidrofobik etkileşimlerin sonucu olarak enzim hareketindeki konformasyonel kısıtlamalarla veya proteinin termal denatürasyona karşı artan direnci ile açıklanabilir (Mateo ve ark., 2007). Bunlardan başka, yüksek sıcaklıklarda substrat ve ürünlerin difüzyonundaki kısıtlamadan kaynaklanabilir Ġmmobilize lipazın termal kararlılığı Enzimin termal deaktivasyonu, verimliliği artırmak ve mikrobiyal kirliliği engellemek için daha yüksek sıcaklık uygulamayı engelleyici bir faktördür. CRL nin hem

127 Bağıl Aktivite (%) 117 saf hem de ham halinin aktivitesinin çok çabuk kaybolduğu iyi bilinmektedir (Moreno ve ark., 1997). Bu yüzden, bu çalışmanın temel amaçlarından biri de lipazın kararlılığını iyileştirmek ve aktivitesini minimum kayıpla yüksek sıcaklıklarda daha uzun süre koruyabilmesini sağlayabilmektir Serbest lipaz 8-CRL 11-CRL 12-CRL Zaman (dakika) ġekil Serbest ve immobilize lipaz 8, 11, 12-CRL nin termal kararlılık grafiği İmmobilize lipazların termal kararlılığını test etmek için, serbest ve kapsüllenmiş enzimi 60 o C deki sulu çözelti içerisinde belirli sürelerde inkübe edip onların kalan aktiviteleri ölçüldü. Şekil ve Şekil de serbest ve immobilize enzimlerin termal kararlılık grafikleri verilmiştir. Şekil e bakıldığı zaman serbest lipaz 60 o C de başlangıç aktivitesini yaklaşık 100. dakikada tamamen kaybederken, immobilize lipazlar 12-CRL, 11-CRL ve 8-CRL yine 60 o C sıcaklıkta 120. dakikanın sonunda bile başlangıç aktivitelerinin sırasıyla % 62, % 43 ve % 33 ünü koruyabilmektedirler.

128 Bağıl Aktivite (%) CRL 19-CRL Serbest lipaz Zaman(dakika) ġekil Serbest ve immobilize lipaz 15 ve 19-CRL nin termal kararlılık grafiği Aynı şekilde immobilize lipazlar 15-CRL ve 19-CRL için aynı deney yapıldı ve termal kararlılık grafikleri Şekil de görüldüğü gibi bulundu. Serbest lipaz 60 o C de başlangıç aktivitesini yaklaşık 100. dakikada tamamen kaybederken, immobilize lipazlar 15-CRL ve 19-CRL yine 60 o C sıcaklıkta 120. dakikanın sonunda bile başlangıç aktivitelerinin sırasıyla % 58 ve % 57 sini koruyabilmektedirler. Bu sonuçlar, enzim ve destek arasındaki muhtemel etkileşimlerden dolayı immobilize lipazların termal kararlılıklarının serbest enzimininkinden daha iyi olduğunu işaret etmektedir. İmmobilize enzimlerin termal-kararlılıklarında gözlenen artış Yilmaz ve ark. (2010b) nın çalışmalarında da gözlemlenmiştir. Muhtemelen bu durum lipazın sol-jel matriks içerisinde sıkıca tutulmasından konformasyonun ve aktif merkezlerin zarar görmemesinden kaynaklanmaktadır. İmmobilize lipazın aktivitesinin korunması, lipaz ve sol-jel matriks arasında meydana gelen etkileşimlerin (hidrofobik etkileşimler, hidrojen bağı oluşumu vb.) de önemli rolü vardır Ġmmobilize lipazlar ile (R/S)-aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi Son yıllarda enzim kullanımı ile optikçe zenginleştirilmiş bileşiklerin elde edilmesi kimyasal sentez yolu ile bu tür bileşiklerin elde edilmesine alternatif bir yol olarak

129 119 gösterilmektedir. Lipazlar çevresel olarak zararsız ve ucuz proseslerle enantiyoseçimli hidroliz ve esterifikasyon reaksiyonları yapabilmektedirler. Enzimlerin bağlanma bölgeleri seçimli olarak sadece stereoizomerlerden biri ile etkileşime girer. Bu şekilde istenmeyen enantiyomerden kaynaklanabilecek yan etkiler ortadan kalkmaktadır. Sonuç olarak, farmakoloji ve kimya endüstrisinde enzimler kullanılarak rasemik karışım yerine sadece bir tek enantiyomerin üretimi önemli bir proses haline gelmiştir. Farklı kaynaklardan elde edilen lipazların geleneksel kimyasal metotlara göre, daha yüksek biyolojik aktivitelere sahip saf enantiyomer elde etmek için daha iyi katalizörler olduğu gösterilmiş ve son zamanlarda bu, kiral ilaç sentezi için genel bir strateji olmuştur (Barbosa ve ark., 2010). Önceki çalışmamızda, Candida rugoza lipazın sol-jel kapsüllenmesinde kaliks[n]arenleri ve türevlerini (karboksil ve amin) katkı maddesi olarak kullanarak bunların aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonunda enantiyoseçimlilik değerinde (E>200) artışa neden olduğununu gözlemledik (Sahin ve ark., 2009). Bu tez çalışmasında ise amit fonksiyonlu kaliksaren türevlerini CRL nin sol-jel immobilizasyonunda katkı maddesi olarak kullandık ve (R/S)-aproksen metil esterinin kinetik rezolüsyonunda enantiyoseçimliliğe etkisini araştırdık (Şekil 4.46.) aproksen gibi 2-aril propiyonik asitler sadece bir izomeri aktif bileşiklerdendir. Bu bileşikler ağrı kesici ve ateş düşürücü olarak çok fazla kullanılırlar. H 3 C CH H 3 C CCH 3 Kaliks-CRL (S)-aproksen (R/S)-aproksen metil esteri H 3 C CCH 3 (R)-aproksen metil esteri ġekil (R/S)-aproksen metil esterinin kinetik rezolüsyonu

130 120 Çizelge 4.5. de, 25 o C de ve ph=7 de sulu tampon çözelti/izooktan içerisinde kapsüllenmiş lipazlarla katalizlenen (R/S)-aproksen metil esterinin hidrolizine ait dönüşüm (x), enantiyomerik fazlalık (ee) ve enantiyoseçimlilik (E) değerlerini göstermektedir. Çizelge 4.5. Katalizör olarak kapsüllenen lipazların kullanıldığı rasemik aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi x (%) ee s (%) ee p (%) E 8-CRL > CRL > CRL > CRL > CRL > Dibenzo-18-crown > Serbest lipaz a > a Kaliksaren siz ortamda kapsüllenen serbest lipaz. Enantiyomerik fazlalık (ee) Kiral HPLC (Agilent 1200 Series, Chiralcel D-H kiral kolonu) ile belirlenmiştir. Hareketli faz olarak n-hekzan/2-propanol/triflorasetik asit (100/1/0.1, v/v/v); zaman, 24 saat; substrat konsantrasyonu, 20 mm; ph 7.0; sıcaklık, 35 o C. Kaliksaren in halkalı amit türevleri varlığında kapsüllenmiş lipazlarla (8-CRL, 11- CRL ve 12-CRL) gerçekleştirilen rezolüsyon reaksiyonu 24 saat sonra sonlandırıldı. Reaksiyon sonunda aproksen metilat (reaksiyona girmeyen R-ester) ve enantiyoseçimliliği çok yüksek (E=327, E=317, E=215) olan ve % 48.4, % 48.1, % 42.4 dönüşümde uygun asit (ee p, %98) meydana gelmiştir (Uyanik ve ark., 2011). İmmobilize lipazlar 15-CRL ve 19-CRL ile gerçekleştirilen reaksiyonda ise sırasıyla enantiyoseçimlilik E=275 ve E=297, dönüşüm değerleri ise % 46.7 ve % 47.6 olarak bulundu. Ancak kapsüllenmiş serbest lipazla gerçekleştirilen reaksiyonda bu değerler çizelgeden de görülebileceği gibi % 37.9 dönüşümde % 98 ee p ve enantiyoseçimlilik (E) 166 olarak bulunmuştur. Şekil de rasemik aproksen metil esterinin immobilize lipazlarla gerçekleştirilen enantiyoseçimli hidrolizine ait HPLC kromatogramları verilmiştir. Verilen kromatogramlardan immobilize lipazların enantiyoseçimli olarak (S)-esterini hidroliz ettiği görülmektedir.

131 121 ġekil (R/S) aproksen metil esterinin immobilize lipazlarla gerçekleştirilen enantiyoseçimli hidrolizine ait HPLC kromatogramları Buna göre kapsüllenen serbest enzim durumuna göre katkı maddesi varlığında gerçekleşen immobilizasyon yüksek enantiyoseçimliliğe ve yüksek dönüşüme neden olmuştur. Bu sonuçlar Reetz ve ark. (2003) nın sonuçları ile uyum içerisindedir ve immobilizasyonda katkı maddesinin önemine işaret etmektedir. İmmobilizasyon esnasında enzim ve destek materyali arasındaki etkileşimlerin bir sonucu olarak protein konformasyonunun çok fazla değişmediğinden kaynaklanabileceğini açıklamışlardır. Kaliksaren in amit türevleri varlığında kapsüllenen lipazlarla katalizlenen hidroliz reaksiyonunda yüzde dönüşüm ve enantiyoseçimliliğe sıcaklığın etkisini test etmek için, 35

132 x (%) E x (%) E 122 o C ve 45 o C olmak üzere iki farklı sıcaklıkta deneyler gerçekleştirildi. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar Şekil ve Şekil da verildi. Şekilde görülen sonuçlardan kapsüllenmiş lipazların enantiyoseçimliliklerindeki artışın reaksiyon sıcaklığına bağlı olduğu görülmektedir CRL 11-CRL 12-CRL 8-CRL 11-CRL 12-CRL T ( o C) 0 ġekil CRL, 11-CRL ve 12-CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) sıcaklıkla değişimi 15-CRL 19-CRL CRL 19-CRL T ( o C) 0 ġekil CRL ve 19-CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) sıcaklıkla değişimi

133 x (%) E 123 Bu sonuç şaşırtıcı değildir çünkü, yüksek reaksiyon sıcaklığı substratların enzimin aktif bölgesine daha hızla diffüze olması veya ürünlerin ise daha hızlı ayrılması manasına gelir ki buda yüksek reaksiyon dönüşümü ile sonuçlanır. Ayrıca kaliksaren in amit türevleri varlığında kapsüllenen lipazlarla katalizlenen hidroliz reaksiyonunda yüzde dönüşüm ve enantiyoseçimliliğe ph etkisi incelendi. 8-CRL 11-CRL 12-CRL 50 8-CRL 11-CRL 12-CRL ph 0 ġekil CRL, 11-CRL ve 12-CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) ph ile değişimi Deneyler üç farklı ph değerindeki (5, 7 ve 9) tampon çözeltiler içerisinde gerçekleştirildi. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar Şekil ve Şekil de verildi. En iyi dönüşüm ve enantiyoseçimliliğin ph=7.0 de yani nötr ortamda olduğu görüldü.

134 x (%) E x (%) E CRL 19-CRL CRL 19-CRL ph 0 ġekil CRL ve 19-CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) ph ile değişimi Kaliksaren türevleri varlığında immobilize edilen lipaz, yapıdaki artan çapraz bağlanmalardan dolayı suda çözünmez. Dolayısıyla, bu özellik tekrar kullanılabilirlik çalışmaları için çok önemlidir. İmmobilize lipazların tekrar kullanılabilirliği rasemik aproksen metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonunda incelendi x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi

135 x (%) E x (%) E x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi Şekil 4.52., Şekil ve Şekil de 8-CRL, 11-CRL ve 12-CRL varlığında kapsüllenmiş lipazların tekrar kullanılabilirlikleri ile dönüşüm ve enantiyoseçimliliğin değişimi görülmektedir. Buna göre altıncı kullanım sonunda dönüşüm oranları sırasıyla %16, %16 ve %18 dir x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi

136 x (%) E x (%) E x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi Şekil ve Şekil da da 15 ve 19 numaralı kaliksarenler varlığında gerçekleştirilen immobilizasyon sonucu elde edilen lipazların tekrar kullanılabilirlik deneyleri ile değişen dönüşüm ve enantiyoseçimliliklerinin grafiği görülmektedir. Buna göre 5. kullanımdan sonra dahi dönüşüm oranları 15-CRL için % 32 ve 19-CRL için % 36 dır x(%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik aproksen metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi

137 127 Aktivitedeki azalmalar, proteinlerin denatürasyonunu ile enzimin inaktivasyonundan ve proteinlerin tekrar kullanım esnasında destekten ayrılmasından kaynaklanmaktadır Ġmmobilize lipazlar ile (R/S)-2-fenoksi propiyonik asit metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi Elde edilen immobilize lipazların enantiyoseçimli reaksiyonlara olan etkisini incelemek için kullandığımız diğer bir reaksiyon ise (Şekil 4.57.); aril propiyonik asit türevi olan rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin ester türevidir. Bu ilaç türü de yine farmakoloji alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. CH CCH 3 Kaliks-CRL (R)-2-Fenoksi propiyonik asit (R/S)-2-Fenoksi propiyonik asit metil esteri CCH 3 (S)-2-Fenoksi propiyonik asit metil esteri ġekil (R/S)-2-Fenoksi propiyonik asit metil esterinin kinetik rezolüsyonu Çizelge 4.6. da, 25 o C de ve ph=7 de sulu tampon çözelti/izooktan içerisinde kapsüllenmiş lipazlarla katalizlenen (R/S)-2-Fenoksi propiyonik asit metil esterinin hidrolizine ait dönüşüm (x), enantiyomerik fazlalık (ee) ve enantiyoseçimlilik (E) değerlerini göstermektedir.

138 128 Çizelge 4.6. Katalizör olarak kapsüllenen lipazların kullanıldığı rasemik 2-fenoksi propiyonik asit metil esterinin enantiyoseçimli hidrolizi. x (%) ee s (%) ee p (%) E 8-CRL > CRL > CRL > CRL > CRL > Serbest lipaz a > a Kaliksaren siz ortamda kapsüllenen serbest lipaz. Enantiyomerik fazlalık (ee) Kiral HPLC (Agilent 1200 Series, Chiralcel D-H kiral kolonu) ile belirlenmiştir. Hareketli faz olarak n-hekzan/2-propanol (90/10 v/v); zaman, 1 saat; substrat konsantrasyonu, 20 mm; ph 7.0; sıcaklık, 35 o C. Kaliksaren türevleri varlığında kapsüllenmiş lipazlarla (8-CRL, 11-CRL, 12-CRL, 15-CRL ve 19-CRL) gerçekleştirilen rezolüsyon reaksiyonu 1 saat sonra sonlandırıldı. Bu süre sonunda reaksiyona girmeyen S-ester yüksek enantiyoseçimlilikte (E=256, E=274, E=293, E=224 ve E=327) ve dönüşümde % 45.7, % 46.6, % 47.4, % 43.3 ve % 48.8 uygun asit (ee p, %98) meydana gelmiştir. Kapsüllenmiş serbest lipazla gerçekleştirilen reaksiyonda bu değerler çizelgeden de görülebileceği gibi dönüşüm oranı % 42.0, enantiyomerik fazlalık % 98 ee p ve enantiyoseçimlilik E= 211 olarak bulundu. Sonuçlara göre kaliksaren türevleri ile kapsüllenen enzimin enantiyoseçimliliğinin daha da artığı görüldü. Rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonuna sıcaklığın etkisini görmek için yine iki farklı sıcaklıkta deneyler yapıldı. Enantiyoseçimlilik ve dönüşümün sıcaklıkla değişim grafiği Şekil ve Şekil da görülmektedir. aproksen metil esterinin hidroliz reaksiyonunda olduğu gibi bu hidroliz reaksiyonunda da enantiyoseçimlilik ve dönüşüm değerleri sıcaklıkla artış göstermiştir.

139 x (%) E x (%) E CRL 11-CRL 12-CRL 8-CRL 11-CRL 12-CRL T ( o C) 0 ġekil CRL, 11-CRL ve 19-CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) sıcaklıkla değişimi 15-CRL 19-CRL CRL 19-CRL T ( o C) 0 ġekil CRL ve 19-CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) sıcaklıkla değişimi Ayrıca kaliksaren in amit türevleri varlığında kapsüllenen lipazlarla katalizlenen rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin enantiyoseçimli hidroliz reaksiyonunda yüzde dönüşüm ve enantiyoseçimliliğe ph etkisi incelendi. Deneyler ph=5, 7 ve 9 olmak üzere üç farklı değerindeki tampon çözeltiler içerisinde gerçekleştirildi.

140 x (%) E x (%) E CRL 11-CRL 12-CRL 8-CRL 11-CRL 12-CRL ph 0 ġekil CRL, 11-CRL ve 12-CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) ph ile değişimi Bu deneylerden elde edilen sonuçlar Şekil ve Şekil de verildi. En iyi dönüşüm ve enantiyoseçimliliğin ph=7.0 de yani nötr ortamda olduğu görüldü. 15-CRL 19-CRL CRL 19-CRL ph 0 ġekil CRL ve 19-CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) ph ile değişimi

141 x (%) E x (%) E 131 Kaliksaren türevleri varlığında immobilize edilen lipazların 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin hidroliz reaksiyonunda enantiyoseçimliliğe ve dönüşüme tekrar kullanılabilirliğin etkisi incelendi x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik 2-Fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi

142 x (%) E x (%) E x(%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi Şekil 4.62., Şekil ve Şekil de 8-CRL, 11-CRL ve 12-CRL varlığında kapsüllenmiş lipazların tekrar kullanılabilirlikleri ile dönüşüm ve enantiyoseçimliliğin değişimi görülmektedir. Buna göre beşinci kullanım sonunda dönüşüm oranları sırasıyla % 39, % 34 ve % 41 dir x (%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi

143 x (%) E x(%) E tekrar kullanım ġekil CRL ile rasemik 2-fenoksi propiyonik asitin metil esterinin dönüşüm (% x) ve Enantiyoseçimliliğin (E) tekrar kullanılabilirlikle değişimi Şekil ve Şekil da da 15 ve 19 numaralı kaliksarenler varlığında gerçekleştirilen immobilizasyon sonucu elde edilen lipazların tekrar kullanılabilirlik deneyleri ile değişen dönüşüm ve enantiyoseçimliliklerinin grafiği görülmektedir. Buna göre 5. kullanımdan sonra dönüşüm oranları 15-CRL için % ve 19-CRL için % 35.6 dir. Kaliksaren katkılı kapsüllenmiş lipazların oldukça dayanıklı oldukları ve 5. kullanımda enantiyoseçimlilik ve dönüşüm değerleri önemli ölçüde korudukları görüldü.

144 SUÇLAR VE ÖERĠLER 5.1. Sonuçlar Enzim-mimik çalışmalarında ve enzim immobilizasyonunda kullanılabilecek farklı fonksiyonel gruplara sahip kaliks[4]arenler sentezlendi. Sentezlenen bileşiklerin yapıları FTIR, 1 H-MR, 13 C-MR ve elementel analiz teknikleri ile karakterize edildi. Sentez aşaması tamamlandıktan sonra bu bileşikler iki farklı uygulamada kullanıldı. Uygulamamızın ilk aşamasında sentezlenen imidazol fonksiyonel grubuna sahip 3, 6 ve 10 numaralı kaliksarenlerin enzim-mimik özellikleri incelendi. -Bu maksatla model reaksiyon olarak p-pp ve p-pa nın hidroliz reaksiyonları seçildi ve reaksiyon DMS/H 2 çözücü ortamında gerçekleştirildi. -Bu reaksiyonlarda enzim mimik olarak düşünülen kaliksarenlerin hidroliz reaksiyonunu ne derecede hızlandırdıkları belirlendi. -Bunun için, hidroliz reaksiyonunun başlaması ile açığa çıkan p-p nin eş zamanlı olarak UV absorpsiyon değerleri belirlendi. Kaliksaren varlığında ve kaliksaren yokluğunda gerçekleştirilen reaksiyonların hız sabitleri tayin edildi. -Kullanılan enzim modellerinin model reaksiyonlar üzerindeki etkisi göz önüne alındığında 6 numaralı bileşiğin en iyi enzim modeli olduğu gözlendi. p-pa için reaksiyon hızını 207 kat, p-pp için ise 165 kat artırdığı gözlendi.

145 135 Uygulamamızın ikinci kısmında ise sentezlenen amit türevli kaliks[4]aren türevleri (8,11,12,15 ve 19) enzim immobilizasyon metotları içerisinde popüler bir yere sahip olan sol-jel kapsülleme metodu ile immobilizasyon işlemi esnasında katkı maddeleri (additives) olarak kullanıldı. -Kaliksarenli ortamda immobilize edilen CRL nin (kaliks-crl) enzimatik aktivitesi başlıca iki farklı model reaksiyonda belirlendi. -İlk model reaksiyonumuz p-pp nin hidroliz reaksiyonudur. Bu model reaksiyonda kullanılan halkalı amit yapısı bulunduran kaliksaren (8, 11 ve 12) bazlı immobilize CRL lerin enzimatik aktiviteleri diğer amit türevli kaliksarenler (15 ve 19) ortamında immobilize edilen lipazların aktiviteleri ile kıyaslandığında, halkalı kaliksarenler eşliğinde immobilize edilen enzimlerin, hidroliz reaksiyonundaki aktivitesinin daha iyi olduğu görüdü. Bu sonucun oluşmasında enzimin aktif bölgelerinin korunduğu ve konformasyonunun değişmediğinden kaynaklanmaktadır. -Ayrıca tüm immobilize lipazlar serbest lipaza göre daha iyi termal kararlılık sergilemiştir. Serbest lipaz, yapılan termal kararlılık deneyinde 100 dakikanın sonunda