Bamçag Bülteni ÖZTÜRK Ş.B. Haziran 2011;2:D KANDİDA ve BİYOFİLM

Transkript

1 Bamçag Bülteni ÖZTÜRK Ş.B. Haziran 2011;2:D28 32 KANDİDA ve BİYOFİLM Dr. Ş. Barçın ÖZTÜRK Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın Kandida türleri genellikle deri ve mukoz membranlarda kolonize olabilen mayalardır. Sağlıklı bireylerin % sinde ağız ve gastrointestinal kanaldan, sağlıklı kadınların % 20 sinde genital kanaldan izole edilebilirler[1]. Bununla birlikte, günümüzde kandida cinsi patojenik mantarlar; artan sayıda invaziv prosedüre, solid organ ve kemik iliği transplantasyonuna, implante biyomateryallere, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı ile normal bakteriyel floranın baskılanmasına ve immunsupresif hasta sayılarındaki artışa bağlı olarak ciddi sistemik hastalık nedenleri arasında görülebilmektedir. Yüksek mortalite ve morbidite nedeni olan hastane kaynaklı kan akımı infeksiyonlarında kandida türleri en sık görülen dört etkenden biri olarak karşımıza çıkmaktadır [2]. Bu infeksiyonların büyük kısmı kateter, prostetik kapak, endotrakeal tüp ve eklem protezi gibi yabancı cisim (implant) kaynaklı olup, infeksiyon patogenezinde etken mikroorganizmanın biyofilm oluşturması ve biyomateryal yüzeylere tutunma özelliği gibi çeşitli faktörler rol oynamaktadır. Birçok kandida türü biyofilm adı verilen matriks yapısını oluşturabilmektedir. Biyofilm yapısı kandida patogenezinde major virulans faktörüdür ve yüksek antifungal direnç nedeniyle kandida biyofilminin eradikasyonu güçtür[3] Biyofilmler, tekil ya da serbest durumdaki benzerlerinden fenotipik olarak farklı özellikler sergileyen, ekstrasellüler polimerik maddeden (EPS) oluşan bir matriks ile kaplı mikrobiyal topluluklardır [4]. Aslında birçok mikroorganizma ekosistemde yapısal biyofilm ile yüzeylere bağlıdır [4] [5] [6] ve tüm mikrobial infeksiyonların yaklaşık % 65 i biyofilm gelişimi ile ilişkilidir [7]. Kandida Biyofilm Yapısı: Kandida biyofilm oluşumu ile ilgili veriler, tarayıcı elektron mikroskobu, fluoresans mikroskobu ve eş odaklı tarayıcı lazer mikroskobu gibi farklı mikroskobik teknikler kullanılarak elde edilmiştir. Biyofilm oluşumu dört ardışık basamakta meydana gelir: 1 mikroorganizmanın yüzeye adhezyonu, 2 koloni oluşumu ve hücrelerin organize olması, 3 EPS (ekstrasellüler polimerik madde) salgılanması ve üç boyutlu yapının olgunlaşması, 4 biyofilm hücre soyunun yayılması (Şekil 1) [3] Şekil 1: Biyofilm gelişim basamakları Serbest kandidanın adhezyonu başlangıçta hidrofobik ve elektrostatik kuvvetler gibi spesifik olmayan etkileşim ile gerçekleşir [8],[5]. Ardından spesifik adhezyon moleküllerinin salınması, güçlü bağlanmayı kolaylaştırır. Erken evre (0 11 saat) adherans ve farklı mikrokoloniler içinde blastospor gelişimi ile karakterizedir saatte kandida biyofilm oluşumunda germ tüp ve genç hifleri içeren maya karışımının çift tabakalı yapısı izlenir. Bu ara faz EPS oluşumu ile ayırt edilir. Maturasyon sırasında biyofilm, mayalar, psödohifler ve hiflerin katıştırıldığı yoğun ağ örgüsüne sahip kalın bir EPS haline gelir[3]. Hifler biyofilm kitlesinin en büyük bileşenidir ve mayaların bağlanması için taban katmanı oluşturur[9]. Olgun biyofilmin kalınlığı 25 µm ile 450 µm arasında değişmekle birlikte [10],[11],[12] sıklıkla 100 µm yi geçer [13]. Hifal hücreler arasındaki su kanalları çevredeki besinlerin kitlenin alt tabakalarına difüzyonunu kolaylaştırır[11]. Candida albicans için biyofilm oluşumu adherans (yapışma) genlerinin up regülasyonu ile ilgilidir (aglütinin benzeri dizi genleri ve hifal duvar proteini 1: Hwp 1 gibi)[14] ve bu genler aminoasit biyosentezi ile metabolizmasından sorumludur[15]. Hwp 1 ve aglütinin benzeri dizi yüzey proteinlerinin etkileşimi aracılığıyla meydana gelen hifal uzantılar arasındaki çapraz bağlanma, biyofilm yapısına ek stabilite sağlayabilir[9]. D28

2 Biyofilm Oluşumunu Etkileyen Faktörler: Yüzey, besinler, sekresyonlar, oksijen varlığı, EPS ve kandida türü gibi çok sayıda faktör biyofilm oluşumu üzerine etkilidir. 1. Yüzey Özellikleri: Yüzeyin fizyokimyasal özellikleri kandida adhezyonu ve bunu izleyen biyofilm oluşumunu etkileyebilir. Örneğin; yumuşak diş protez kaplama materyallerine kandida adhezyonu, akrilik materyallerden daha iyidir[16]. Aynı şekilde farklı kateter materyalleri değişen oranlarda kandida biyofilmine izin verir[17]: en yaygın biyofilm lateks üriner kateterlerde gözlenirken bunu PVC ve poliüretan olanlar izler. Yüzey topografisi de önemli bir faktördür, daha yumuşak yüzeylerde biyofilm oluşumu minimaldir[18]. 2. Besin/Karbon Kaynağı: Kandida biyofilmine karbon kaynağının etkisi ile ilgili çalışmalar çelişkili sonuçlar ortaya koymaktadır. Bununla birlikte glukoz, fruktoz ve laktozun, diğer besin şekerleri ile (sukroz, maltoz) karşılaştırıldığında Kandida biyofilmini arttırdığı gösterilmiştir [19]. 3. Sekresyonların Etkisi: İmplant vücuda yerleştirildiğinde ilk olarak serum ya da diğer vücut sekresyonları ile çevrelenerek, ortamdan kaynaklanan bir film tabakası ile karşılaşır. Sekresyonların oluşturduğu bu film tabakası kandidanın oluşturduğu biyofilmi arttırır [20]. Buna karşılık sekresyonların biyofilm oluşumunu anlamlı düzeyde arttırmasının, içerdiği şekere bağlı olduğu gösterilmiştir[21]. Sonuç olarak; sekresyonlar ve serumun oluşturduğu bu film tabakası, çevresel karbon kaynağına (glukoz vb) bağlı olarak kandida biyofilminin gelişimini etkileyen bir tutum sergiler[3]. 4. Oksijen Etkisi: Kandida hem aerob hem de anaerob ortamda gelişme özelliğine sahiptir. Bununla birlikte çok az çalışma şimdiye kadar özellikle anaerob ortamda Kandida biyofilminin oluşumuna odaklanmıştır[22, 23]. Gerek C.albicans gerekse non-albicans Kandida türleri anaerob koşullarda byofilm oluşturabilirler[23]. 5. Ekstrasellüler Polimerik Madde (EPS): EPS (extracellular polymeric substances) üretimi biyofilmin büyüme modunun tek özelliğidir. Sekrete edilen madde üçboyutlu, jel benzeri, yüksek ölçüde hidrate, yerel olarak yüklü ve mikrrorganizmaların immobilize edildiği bir ortam oluşturur. EPS, kandida adhezyonu ve biyofilm oluşumunda kilit rol oynar. EPS biyofilme, fagositik hücrelere karşı savunma, biyofilm bütünlüğünü sağlayan yapıyı oluşturma, aktif ilaç difüzyonunu sınırlama ve tüm bunların kombinasyonunu sağlama gibi birçok spesifik fonksiyon kazandırır[3]. Bakteriyel biyofilm matriksi esas olarak eksopolisakkarit yapıdadır. Benzer şekilde; major karbonhidrat komponenti kandida türlerine göre değişiklik göstermekle birlikte, kandida biyofilminin yaklaşık % 40 ı karbonhidrattan oluşur [24, 25]. 6. Kandida Türü: Biyofilm oluşturma yeteneği açısından Kandida türleri arasında farklılıklar vardır. Farklı türlerin biyofilmleri, morfoloji, EPS kompozisyonu ve antifungal direnç açısından farklılık gösterir. Bazı araştırmacılar C.albicans, C.dubliniensis ve C.krusei biyofilmlerinin, diğer kandida türlerine göre daha birleşik olduğunu öne sürmüştür[11, 19, 26]. Yine wild-tip kandida suşları, laboratuar referans suşlarına oranla, daha sağlıklı ve birleşik biyofilm yapısı oluştururlar. Bu özellik ilk olarak C.albicans suşlarında gösterilmiştir[27]. Metal İyonları ve Kandida Biyofilmi: Endüstriyel gelişmeler doğal su kaynaklarının özellikle suda çözünen metal iyonları ile kirlenmesini de beraberinde getirmiştir. Metal iyonlarının kandida biyofilmine etkisini gösteren bazı ilginç çalışmalar mevcuttur. Harrison ve arkadaşları C.tropicalis biyofilminin metal iyonları tarafından öldürülmeye, serbest formlara göre 65 kat daha dayanıklı olduğunu ortaya koymuştur. Test edilen toksik ağır metallerden sadece yüksek konsantrasyondaki Hg +2, CrO 4-2, veya Cu +2 yüzeye adhere olmuş kandida yı öldürebilmiştir[28]. Bu ve benzeri çalışmaların sonuçları deneysel kandida biyofilm modellerinde kullanılmıştır. Antifungal Direnç: Kandida biyofilminin antifungal ajanlara direnci ilk olarak 1995 yılında gösterilmiştir. Çalışmada Kandida biyofilmi, serbest hücrelere göre amfoterisin B, itrakonazol, flukonazol, ketakonazol gibi çeşitli antifungal ajanlara 30 ile 2000 kat kadar daha dirençli bulunmuştur[29]. Biyofilmlerin antifungal ilaçlara daha dirençli olmasında antifungal ilaçların biyofilm matriksine iyi penetre olamaması, biyofilm içindeki hücrelerin daha yavaş üremesi ve biyofilme bağlı hücrelerin D29

3 yüzeyindeki değişikliklerin rol oynadığı düşünülmektedir[30]. Biyofilm içindeki hücrelerin büyüme hızları azalsa da, antifungal direnci açıklamak için tek başına yeterli değildir. Chandra ve arkadaşları, amfoterisin B, nistatin, flukonazol ve klorheksidinin minimal inhibitör konsantrasyonlarını (MİK), kandida biyofilminin oluşumunun erken ve orta fazı ile maturasyon fazında karşılaştırmışlardır. Çalışma, kandida biyofilminde ilaç direncindeki artışın gelişmekte olan biyofilmin metabolik aktivitesindeki artış ile paralel olduğunu göstermiştir. Bu sonuç, ilaç direncinin düşük metabolik aktivite ile değil, biyofilmin olgunlaşması ile ilgili olduğunu düşündürmektedir[10]. Burada önemli bir not da, biyofilmin farklı üreme hızlarındaki hücrelerden oluşan heterojen bir populasyon olduğu ve düşük üreme hızına sahip subpopulasyonların antifungal direnç oluşturabileceğidir[31]. Ekstrasellüler polimerik madde (EPS) bakteriyel biyofilmlerde fiziksel bir bariyer gibi rol oynayarak antimikrobiyallerin biyofilme geçişini engeller ve ilaç direncini arttırır. Ancak Kandida biyofilminin antifungal direncinde EPS nin rolü net değildir. C.albicans biyofilminin sürekli sıvı akışı altında oluşturularak, matriks sentezinin stimüle edildiği bir çalışmada artmış amfoterisin B direnci saptanmıştır[25]. Yine EPS nin kaldırıldığı bir başka çalışmada, amfoterisin B kullanımı ile biyofilmdeki kandida hücrelerinin sağkalımının % 20 oranında azaldığı gösterilmiştir[32]. Buna karşılık bazı araştırıcılar statik olarak minimal matriks oluşumunun sağlandığı kandida suşları ile shaker etkisi altında matriks oluşumunun arttırıldığı suşlar arasında flusitozin, flukonazol ve amfoterisin B direnci açısından fark olmadığını göstermişlerdir[33]. Kandida biyofilminin antifungal direnç göstermesinin moleküler mekanizmaları tam olarak açıklanabilmiş değildir. Biyofilm gelişme aşamasında MDR1, CDR1 ve CDR2 genleri upregüle olur[34]. Mikrodizi analizleri ile farklı koşullardaki kandida biyofilmi incelenmiştir. Buna göre MDR ile CDR geni biyofilmde faz spesifik saptanmıştır ve azol direncini sadece erken fazda kolaylaştırdığı izlenmiştir. Buna karşılık sterol kompozisyonundaki değişme matur fazdaki direnci kapsar[35]. İn vivo biyofilm modeli ile yapılan bir çalışmada CDR1 ve CDR2 ekspresyonu biyofilm hücrelerinde serbest hücrelere göre anlamlı ölçüde artarken, EFG11 ve MDR1 gen ekspresyonunda böyle bir fark saptanmamıştır[13]. Açıktır ki genlerin kandida biyofilmindeki antifungal dirençte oynadığı rolü belirlemek açısından daha geniş ölçüde genom analizlerine ihtiyaç vardır. Bakteriyel biyofilmler çoklu ilaç direncinden sorumlu olduğu bilinen persister dormant hücreler içerirler[36, 37]. Benzer şekilde kandida biyofilminde de serbest hücrelerden farklı olarak yüksek ölçüde antifungal tolerans gösteren hücreler saptanmıştır. Kandida biyofilminin antimikrobiyal ajanlarla öldürülmeye karşı bifazik patern gösterdiği saptanmıştır. Bir kısım subpopulasyon persister kalırken, bir kısmı antifungallere duyarlılık göstermiştir[38]. Kandida Biyofilminde Probiyotik Tedavisi: Son yıllarda artan sayıda antibiyotik dirençli mikroorganizmaların ortaya çıkışı nedeniyle sağlık için destekleyici probiyotiklerin kullanımı dikkat çekmektedir. Probiyotik bakteriler, laktik asit bakterileri olarak bilinen bifidobacteria, lactobacilli ve enterococci dir. Probiyotik mikroorganizmaların mikst tür biyofilm oluşumlarındaki yapı, fizyoloji ve davranış değişikliği açısından çok önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir[39]. L.acidophilus un C.albicans üzerindeki inhibitör etkisinin gösterilmesinin üzerinden çeyrek yüzyıldan fazla zaman geçmiştir[40, 41]. Strus ve arkadaşları yakın zamanda yaptıkları bir çalışmada çok sayıda laktobasilin C.albicans, C.glabrata, C.krusei ve C.pseudotropicalis olmak üzere dört kandida türü için antikandidal etki gösterdiğini ortaya koymuşlardır[42]. Bu in vivo bulgular maya biyofilminin birçok grup organizmayı etkilediğini açıkça göstermektedir. Ancak bu olayların altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için yapılacak moleküler ve proteomik çalışmalara ihtiyaç vardır. Kaynaklar 1. Richardson DM, W.D., Superficial candidosis, in Fungal Infection Diagnosis and Management W.D. Richardson DM, Editor. 2003, Blackwell Publishing. p Wisplinghoff, H., et al., Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis, (3): p Seneviratne, C.J., L. Jin, and L.P. Samaranayake, Biofilm lifestyle of Kandida: a mini review. Oral Dis, (7): p Costerton, J.W., et al., Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol, : p Donlan, R.M. and J.W. Costerton, Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, (2): p Mukherjee, P.K., et al., Alcohol dehydrogenase restricts the ability of the pathogen Kandida albicans to form a biofilm on catheter surfaces through an ethanol-based D30

4 mechanism. Infect Immun, (7): p Potera, C., Forging a link between biofilms and disease. Science, (5409): p. 1837, Samaranayake LP, M.T., Oral Candidosis. 1990, Wright - Butterworth: London. 9. Williams, D.W., et al., Kandida biofilms and oral candidosis: treatment and prevention. Periodontol 2000, (1): p Chandra, J., et al., Biofilm formation by the fungal pathogen Kandida albicans: development, architecture, and drug resistance. J Bacteriol, (18): p Ramage, G., et al., Biofilm formation by Kandida dubliniensis. J Clin Microbiol, (9): p Kuhn, D.M., et al., Comparison of biofilms formed by Kandida albicans and Kandida parapsilosis on bioprosthetic surfaces. Infect Immun, (2): p Andes, D., et al., Development and characterization of an in vivo central venous catheter Kandida albicans biofilm model. Infect Immun, (10): p Nobile, C.J., et al., Complementary adhesin function in C. albicans biofilm formation. Curr Biol, (14): p Yeater, K.M., et al., Temporal analysis of Kandida albicans gene expression during biofilm development. Microbiology, (Pt 8): p Radford, D.R., et al., Adherence of Kandida albicans to denture-base materials with different surface finishes. J Dent, (7): p Hawser, S.P. and L.J. Douglas, Biofilm formation by Kandida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun, (3): p Chandra, J., et al., Modification of surface properties of biomaterials influences the ability of Kandida albicans to form biofilms. Appl Environ Microbiol, (12): p Parahitiyawa, N.B., et al., Interspecies variation in Kandida biofilm formation studied using the Calgary biofilm device. APMIS, (4): p Nikawa, H., et al., Effects of salivary or serum pellicles on the Kandida albicans growth and biofilm formation on soft lining materials in vitro. J Oral Rehabil, (8): p Jin, Y., et al., Biofilm formation of Kandida albicans is variably affected by saliva and dietary sugars. Arch Oral Biol, (10): p Biswas, S.K. and W.L. Chaffin, Anaerobic growth of Kandida albicans does not support biofilm formation under similar conditions used for aerobic biofilm. Curr Microbiol, (2): p Thein, Z.M., Y.H. Samaranayake, and L.P. Samaranayake, In vitro biofilm formation of Kandida albicans and non-albicans Kandida species under dynamic and anaerobic conditions. Arch Oral Biol, (8): p Baillie, G.S. and L.J. Douglas, Effect of growth rate on resistance of Kandida albicans biofilms to antifungal agents. Antimicrob Agents Chemother, (8): p Al-Fattani, M.A. and L.J. Douglas, Biofilm matrix of Kandida albicans and Kandida tropicalis: chemical composition and role in drug resistance. J Med Microbiol, (Pt 8): p Samaranayake, Y.H., et al., In vitro method to study antifungal perfusion in Kandida biofilms. J Clin Microbiol, (2): p Jin, Y., et al., Biofilm-forming ability of Kandida albicans is unlikely to contribute to high levels of oral yeast carriage in cases of human immunodeficiency virus infection. J Clin Microbiol, (7): p Harrison, J.J., et al., Metal resistance in Kandida biofilms. FEMS Microbiol Ecol, (3): p Hawser, S.P. and L.J. Douglas, Resistance of Kandida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrob Agents Chemother, (9): p Jabra-Rizk, M.A., W.A. Falkler, and T.F. Meiller, Fungal biofilms and drug resistance. Emerg Infect Dis, (1): p Kumamoto, C.A., Kandida biofilms. Curr Opin Microbiol, (6): p Baillie, G.S. and L.J. Douglas, Role of dimorphism in the development of Kandida albicans biofilms. J Med Microbiol, (7): p Baillie, G.S. and L.J. Douglas, Matrix polymers of Kandida biofilms and their possible role in biofilm resistance to antifungal agents. J Antimicrob Chemother, (3): p Mukherjee, P.K., et al., Mechanism of fluconazole resistance in Kandida albicans biofilms: phase-specific role of efflux pumps and membrane sterols. Infect Immun, (8): p Garcia-Sanchez, S., et al., Kandida albicans biofilms: a developmental state associated with specific and stable gene expression patterns. Eukaryot Cell, (2): p Keren, I., et al., Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiol Lett, (1): p Keren, I., et al., Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli. J Bacteriol, (24): p D31

5 38. LaFleur, M.D., C.A. Kumamoto, and K. Lewis, Kandida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrob Agents Chemother, (11): p Thein, Z.M., et al., Community lifestyle of Kandida in mixed biofilms: a mini review. Mycoses, (6): p Collins, E.B. and P. Hardt, Inhibition of Kandida albicans by Lactobacillus acidophilus. J Dairy Sci, (5): p Purohit, B.C., et al., The formation of germtubes by Kandida albicans, when grown with Staphylococcus pyogene, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Lactobacilius acidophilus and Proteus vulgaris. Mycopathologia, (3): p Strus, M., et al., The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Kandida. Infect Dis Obstet Gynecol, (2): p D32