Ankara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Tandoğan-Ankara-Türkiye

Transkript

1 BİYODÖNÜŞÜMLE ASPARTİK ASİTTEN L-ALANİN ÜRETİMİ Güzide ÇALIK ve İ. Halil VURAL Ankara Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Tandoğan-Ankara-Türkiye BIOPRODUCTION OP L-ALANINE FROM ASPARTIC ACID SUMMARY Production of L-alanine by means of biochemical processes can be achieved not only with high yield but it eliminates the side products under mild operation conditions, as well. In this work, bioproduction process o f L-alanine from aspartic acid vising L-aspartat J3-decarboxylase activity o f Pseudomonas dacunhae (DSM 1455} was investigated. Optimum solid and liquid growth media were designed, considering the highest enzyme activity, in small scale, agitation- and heating rate-controlled bioreactors, and optimum ph and temperature for the enzyme activity were found as 7.5 and 299 K, respectively. Glutamic acid was used as the carbon source for the growth anc: Cc= Î0 g/dm3 and 15 g/dm3 were the optimum values for the biomass concentration (Cx) and the enzyme activity (r0o), respectively. Higher concentrations of glutamic acid inhibited the growth and the emyme activity. Under optimum conditions, CtJ= 72.5 g/dm3 L-alanine was produced by 81.5% conversion of the aspartic acid. ÖZET Biyodönüşüm prosesleriyle L-alanin üretimi yüksek dönüşümle, yan ürün oluşturmadan ve ılımlı koşullarda gerçekleşmektedir. Pseudomonas dacunhae (DSM 1455) hücrelerinin L-aspartat Jî-dekarboksilaz enzimi kullanılarak aspartik asitten L-alanin üretim prosesinin araştırılması amacıyla, enzim aktivitesi kriter alınarak üretimi sağlayan P, dacunhae hücrelerinin katı ve sıvı çoğalma ortamı tasanmı yapılrmşür. Küçük ölçekte karıştırma ve ısıtma kontrollü sistemlerde gerçekleştirilen biyodönüşümlerle en uygun çoğalma ortamı ph ve sıcaklığının sırasıyla 7.5 ve 299 K olduğu bulunmuştur. Mikroorganizma, çoğalma ortamında glutamik asiti karbon kaynağı olarak kullanmaktadır. C0= 10 g/dm3 ve 15 g/dm3 derişimlerde glutamik asit sırasıyla biyokütle derişimi (Cx) ve enzim aktivitesi (r0o) açısından en uygun değerlerdir. Yüksek derfşimlerinde ise hem Cx, hem de r0o azalmaktadır. Opürmım koşullarda aynı biyoreaktör sisteminde %81.5 aspartik asit biyodönüşümü ile Cy= 72.5 g/dm3 derişimde L-alanin Üretilmiştir. GİRİŞ Doğal İpeğin ana bileşeni olması nedeniyle sentetik elyaf üretiminde, tad verici bir nıadde olduğundan bazı yiyecek ve içeceklerde katkı maddesi olarak, kolay özümlenen bir azot kaynağı olması nedeniyle de damardan yapılan beslemelerde serum bileşenlerinden biri olarak kullanılan L-alanin, üretimi ve kullanım alanları gün geçtikçe artan bir amino asittir. Süreli yayın literatüründe, kimyasal üretimle kıyaslandığında yüksek dönüşümle, yan ürün oluşturmadan ve ılımlı koşullarda L-alanin üretimini 387

2 mümkün kılan biyodönüşüm ile üretim prosesleri hakkında detaylı bilgi mevcut değildir. Bulunan az sayıda bilgi, patent literatürü ile kıyaslandığında ise çelişen sonuçlarla karşılaşılmaktadır. Chibata vd (1965), Pseudomonas dacunhae hücrelerinin L-aspartat J3-dekarboksilaz enzimi kullanılarak L-aspartik asiten L-alanin üretimini incelemiş ve 37 C sıcaklıkta 72 st'de küçük ölçekte yüksek dönüşümle L-alanin üretildiğini bildirmişlerdir (1). Chibata vd * (1987) ise K-Carrageenan a tutuklanmış hücreler ile fumarik asitten L-alanin üretiminde enzim kararlılığım artırma çalışmaları yapmışlardır (2). Furui ve Yamashita (1983) yüksek basınçlı sistemde piston akış düzeninde, karışmalı ve atmosfer basıncında çalışan sisteme kıyasla daha yüksek dönüşüm elde edildiğini bildirmişlerdir (3). Pseudomonas dacunhae hücrelerinin L-aspartat J3-dekarboksilaz enzimi ile L-aspartik asitden L-alanin üretimi prosesinin literatürde yer almayan işletme koşullarını belirlemek amacıyla ele alınan bu çalışmada, enzim aktivitesini en yüksek kılan mikroorganizma katı ve sıvı çoğalma ortamı tasarımı yapılmış, çoğalma ve aktivite için en uygun işletme koşullan belirlenmiştir. Mikroorganizmanın karbon kaynağı olarak tükettiği glutamik asitin optimum derişimi bulunmuş en uygun koşullarda L-alanin üretimi küçük ölçekte gerçekleştirilmiştir. DENEL BÖLÜM Enzim kaynağı olarak kullanılan P. dacunhae (DSM 1455) mikroorganizması, %0.3 et özütü, %1.25 maya özütü, %0.5 pepton %0.5 KH2P04 ve %1.5 agar içeren ve ph değeri 4M KOH ile 7.0'a ayarlanan eğik agar ortamında 303 K sıcaklıkta 18 st inkübe edilerek katı ortamda çoğaltılmış, bu ortamdan %2.78 L-glutamik asit, %0.5 maya özütü, %0,05 KH2PC4ve %0.01 MgS0.,.7H20 içeren, ph değeri 7.5 olan 20 mi hacmindeki sıvı çoğalma ortamlarına ekilmiş; 303 K sıcaklıkta 105 dk*! hızda çalıştırılan çalkalamalı.su banyosunda 24 st kalma süresinde tutularak mikroorganizma derişimi artırılmıştır. Enzim aktivitesini belirlemek amacıyla, İM L-aspartik asit, İmM pirüvik asit, O.lmM piridoksal 5-fosfat (PLP) ve %0.1 Tween 20 içeren çözeltinin ph'ı %25 NH4OH çözeltisi ile 5.5 değerine ayarlanmış; bu karışımın 5 ml'sîne belirlenen derişimlerde mikroorganizma eklenmiş, çalkalamalı su-banyosunda, 310 K sıcaklıkta 2 st süre ile tepkime gerçekleştirilerek oluşan L-alanin miktan belirlenmiştir. Enzim aktivitesi ya da L-alanin başlangıç üretim hm (rûo), jimol/mi st ya da jımol/mg st olarak tanımlanmıştır. Değişik koşullarda gerçekleştirilen biyodönüşümlerde L-alanin derişimi Waters Pico-Tag Amino Asit Analiz Sisteminde ölçülmüş; farklı çoğalma koşullarındaki mikroorganizma derişimleri ise Shimadzu UV-160 A Spektrofo to metresi nde 500 nm'de hazırlanmış olan kalibrasyon eğrisi kullanılarak bulunmuştur. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Pseudomonas dacunhae hücrelerinin ilk çoğalma basamağı olan katı ortam bileşimini belirlemek amacıyla yedi ayrı katı ortam tasarlanarak mikroorganizma çoğalma ve enzinı aktivitesi açısından en uygun katı ortam belirlenmiştir. Buna göre yukarıda bileşimi verilen katı ortamın en uygun

3 olduğu bulunmuştur. En uygun sıvı çoğalma ortamını belirlemek amacıyla İse dört ayn ortam denenmiş ve içinde literatürde verilenler ve onların modifikasyonlarından oluşan ortamların da bulunduğu deneme ortamları içinde yine bileşimi yukarıda verilen sıvı çoğalma ortamının enzim aktivitesi açısından en uygun olduğu bulunmuştur. Katyon etkisini belirlemek amacıyla L-aspartik asit yerine L-aspartik asitin sodyum ve potasyum tuzu kullanılarak tepkimeler gerçekleştirilmiştir. L-Aspartik asit, sodyum aspartat ve potasyum aspartatın kullanılmasıyla elde edilen aktivite değerinin şırasıyla 4.72, 1.40 ve 4.37 fimol/mg st olduğu bulunmuştur. Karıştırma ve sıcaklık kontrollü, V= 20 mi çalışma hacimli mikrobiyolojik hava filtreleri içeren biyoreaktörlerde T= 303 K sıcaklık ve N= 105 d k 1 karıştırma hızı koşullarında mikroorganizma çoğalma ortamının biyokütle derişimi, Cx, ve L-alanin başlangıç üretim hızı olarak tanımlanan enzim aktivitesi açısından en uygun ph değeri sırasıyla 7.5 ve 6.5 olarak bulunmuştur, Şeklî 1. Aynı koşullarda çoğalma ortamı sıcaklığının etkisini belirlemek amacıyla yapılan deneyler sonucu ise T= 299 K değerinin hem mikroorganizma derişimi hem de enzim aktivitesi açısından en uygun olduğu bulunmuştur. Şekil 2. Çoğalma ve enzim üretim ortamında karbon kaynağı olarak bulunan glutamik asitin en uygun derişimini belirlemek ve literatürde verilen (4) 27.8 g/dm3 değeri ile kıyaslamak amacıyla, ph= 7.5, T= 303 K, N= 105 dk! koşullarında V - 20 ml den ölçek büyütme ile V= 200 ml'ye geçilerek glutamik asit derişiminin, kalma süresi (t) İle mikroorganizma derişiminin (Cx) değişimine (Şekil 3) ve enzim aktivitesine (rû0) etkisi {Şekil 4) araştırılmış ve mikroorganizma derişimi ve enzim aktivitesi açısından sırasıyla C0= 10 g/dm3 ve C0= 15 g/dm3değerlerinin en uygun olduğu görülmüştür, Şekil 4. Şekil 1. ph Çoğalma ortamı ph mın biyokütle derişimi ve enzim aktivitesine etkisi. V= 20 mi, T K, N= 105 dk'1, t«2 st.

4 Şekil 2. Çoğalma ortamı sıcaklığının biyokütle derişimi ve enzim aktivitesine etkisi. V= 20 ml, ph= 7.5, N= 105 dk*1, t= 2 s t. t, st Şekil 3. Biyokütle derişiminin kalma süresi ve başlangıç glutamik asit derişimi ile değişimi. V= 200 mi, T= 303 K. ph= 7.5, N= 105 d k 1.

5 Cg,fl/dm3 Şekii 4. Glutamik asit derişiminin blyokütle derişimi ve enzim aktivitesine etkisi. V= 200 mî, T* 303 K, ph= 7.5, N= 105 d k 1, t= 25 st. Aynı biyotepkime sisteminde, V- 50 mi hacimli reaktörlerde CAo= 1 M L-aspartik asit, 0.1 mm pirüvik asit, %0.1 Tween-20 içeren girdi karışımı ve g yaş biyokütle kullanılarak, T- 310 K, ph= 5.5 ve N~ 105 d k 1 koşullarında, t- 29 st kalma süresinde L-aspartik asitin %81.5 dönüşümü ile C0= 72.5 g/dm3derişimde L-alanin üretilmiştir. TEŞEKKÜR Bu çalışma 89K No'lu "Blyopolimer ve Amino Asit Üretimi" konulu proje ile desteklenmiştir. Ankara Üniversitesi Biyoteknöloji Araştırma ve Uygulama Merkezi'ne sağladığı desteklerden dolayı teşekkür ederiz. KAYNAKLAR 1. I. Chibata, T. Kakimoto ve J. Kato, "Enzymatic Production of L-Alanine by Pseudomonas dacunhae", Appl. Microbiol. 13 (1965) Chibata T. Tosa ve S. Takamatsu, "Continuous L-Alanine Production Using Two Different immobilized Microbial Cell Preparations on Industrial Scale", Methods in Eitzymol., 136 (1987) M. Furui ve K. Yamashita, "Pressurized Reaction Method for Continuous Production of L-AIanine by Immobilized P. dacunhae Cells", J. Ferment. Technol,, 61 (1983) S. Takamatsu ve D.Y. Ryu, "Recirculating Bioreactor-Separator System for Simultaneous Bio transformation and Recovery of Product- Immobilized L-Asparate ^-Decarboxylase Reactor System", Biotechnol, Bio eng. 32 (1988)