DNA Tamir Mekanizmaları. Ismail Bezirganoglu

Transkript

1 DNA Tamir Mekanizmaları Ismail Bezirganoglu

2

3 Mutasyonlar ve DNA hasarı Mutasyon, DNA nın nükleotit dizisindeki değişikliklerin veya delesyonların, insersiyonların yada genomdaki DNA dizilerinin yeniden düzenlenmleri sonucunda oluşurlar. Spontan bir mutasyon, DNA replikasyon hatalarında olduğu gibi hücrelerdeki doğal süreçlerin bir sonucu olarak ortaya çıkar. Spontan mutasyonlar, DNA hasarına neden olan dış kaynaklı bir ajan veya mutajen ile DNA nın etkileşiminin bir sonucu olarak indüklenmiş mutasyonlardan ayrılabilirler.

4 Mutasyonların moleküler biyoloji için önemi Mutasyonlar, evrimsel değişimi yönlendiren genetik varyasyonun ana kaynağı olduğu için önemlidir. Mutasyonlar zararlı olabilirler yada bir organizmaya veya onun sonraki nesillerine avantaj sağlayabilirler. Eşey hücrelerinde meydana gelen mutasyonlar kalıtsal genetik bozukluklara yol açarken, somatik hücrelerde oluşan mutasyon ise kanser veya nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıklara yol açabilirler. Mutant organizmalar, hücresel proseslerde rol alan genlerin karakterize edilmesi açısından moleküler biyologlar için önemli araçlardır.

5 Moleküler seviyede, mutasyonun en basit tipi nükleotit değişimidir ya da nokta mutasyonu olarak adlandırılır. DNA dubleksindeki bir nükleotit çiftinin yerine, farklı bir nükleotit çiftinin geçmesidir. Diğer mutasyon tipleri DNA da daha güçlü değişimlere neden olurlar. Örneğin, trinükleotit tekrarların sayısının artması, geniş insersiyonlar ve delesyonlar ve büyük kromozomal yeniden düzenlemeler. Böylesi değişimler, transposable DNA elementlerinin insersiyonuyla yada hücresel rekombinasyon sürecindeki hatalarla meydana gelebilir. Araştırmacıların belirttiği tuhaf bir durum vardır ki, kromozom üzerinde sıcak nokta adı verilen bazı bölgeler vardır ve bu bölgeler üzerinde mutasyonların oluşma frekansı DNA nın diğer bölgelerine oranla daha yüksektir.

6 Transisyonlar ve transversiyonlar sessiz, yanlış anlamlı veya anlamsız mutasyonlara yol açarlar. Transisyon mutasyonları bir primidin bazının başka bir primidin bazı ile yada bir pürin bazının başka bir pürin bazı ile yer değiştirmesi sonucu oluşurlar. Bunun aksine, transversiyon mutasyonlar ise bir primidin bazının bir pürin bazı ile veya tam tersi olarak bir pürin bazının bir primidin bazıyla yer değiştirmesi şeklinde gerçekleşirler.

7 Transisyon mutasyonu, Primidin primidin T C veya C T Pürin pürin A G veya G A Transversiyon mutasyonu, Primidin pürin T A, T G, C A veya C G Pürin pirimidin A T, A C, G T veya G C

8 Sessiz mutasyonlar protein kodlayan bir gendeki nükleotit değişimi, kodlanan proteindeki aminoasit değiştirilebilir de değiştirmeyebilir de. Aminoasit dizisinin değiştirmeksizin nükleotit dizisini değiştiren mutasyonlar sinonim mutasyonlar yada sessiz mutasyonlar olarak adlandırlırlar. Kodlama yapan bölgelerin dışındaki nükleotitlerde meydana gelen mutasyonel değişiklikler de sessiz olabilirler. Bu nedenle bu tip dizilerdeki mutasyonlar fenotipik etkilere sahip olabilirler.

9 Yanlış anlamlı mutasyonlar protein kodlayan dizilerde, amoniasit dizisinin değişmesine yol açan nükleotit değişimleri ise sinonim olamayan mutasyonlar veya yanlış anlamlı mutasyonlar olarak adlandırılır. Bir proteinin aminoasit dizisinde meydana gelen bir değişiklik ise, o proteinin biyolojik aktivitesini değiştirebilir. Tek amioasit değişikliğinin fenotipik etkisine verilen klasik bir örnek ise, kalıtsal olarak aktarılan insan orak hücre anemisine neden olan subtitisyondur. Orak hücre anemisinin moleküler temeli, A T transversiyonu mutasyonu olup, bu mutasyon hemoglobinin β-globin zincirinin yaban tip glutamik asit kodonunu mutant tip olan valin kodonuna çevirmektedir.

10 Anlamsız mutasyonlar yeni bir stop kodonu oluşturan nükleotit değişimlerine anlamsız mutasyonlar adı verilir. Anlamsız mutasyonlar, protein sentezi esnasında erken zincir sonlanmasına neden olduklarından, oluşan polipeptit parçası çoğu zaman fonksiyonel olamaz.

11 İnsersiyonlar ve delesyonlar, frameshift (çerçeve kayması) mutasyonlarına neden olurlar. DNA da nükleotit insersiyonları yada delesyonları da olabilmektedir fakat bu tip mutasyonların meydana gelme oranları, nükleotit değişimlerine oranla daha azdır. Küçük bir delesyonun fenotipik etkisine klasik bir örnek, insan kalıtsal hastalığı olan kistik fibrozdur. Şayet bir delesyonun yada insersiyonun uzunluğu, tam olarak üç nükleotit yada katları şeklinde değilse, ribozumun üçlü kodonları okuma özelliğinden dolayı okuma çerçevesi kayar ve sonuç olarak mutasyon bölgesinden sonraki bütün aminoasitler değişir. Bu tip mutasyonlar ise mrna daki kodonların okuma çerçevesinin kaymasına neden olduklarından çerçeve kayması mutasyonları olarak adlandırılırlar.

12 Trinükleotit tekrar sayılarının artışı, genetik kararsızlığa sebep olur. DNA nın bazı bölgeleri, trinükleotit tekrarlar nedeniyle olağanüstü bir genetik kararsızlığa sahiptirler. Trinükleotit tekrar artışlarının, üçlü heliks konformasyonuna uyum sağlayabildiği ve müstesna DNA ikincil yapılarını oluşturuduğunun varsayıldığını 2. bölümden hatırlayın. Bu ikincil yapılar, transkripsiyonu ve DNA replikasyonunu engelleyebilmektedirler. Bunun sonucu olarak da trinükleotit tekrarların aktif olarak sayısının artması, Fragile X sendromu, Huntigton hastalığı, Kennedy hastalığı, Friedreich ataksisi, spinoserebellar ataksi tip 1 ve miyotonik distrofi gibi belirli genetik nörolojik bozukluklara yol açmaktadırlar.

13 Tekrarların sayısının artması iki farklı mekanizma ile ortaya çıkar. dengesiz krossing over yada DNA replikasyonu esnasındaki kayma (patinaj) ile. Dengesiz krossing over, mayozdaki rekombinasyon sırasında bir kromozomdaki trinükleotit tekrar kopyasının yerine farklı bir trinükleotit tekrar kopyası ile yanlış hizalanması sonucu ortaya çıkar. Rekombinasyon bir kromoozmdaki tekrar kopya sayısını artırır. bu da dublikasyonla sonuçlanır. Diğer bir kromozomda ise tekrar sayısındaki mutabık bir azalmadan dolayı delesyon oluşur.

14 DNA Hasarının Genel Sınıfları Hermann Muller, ilk olarak 1927 yılında X ışınlarının Drosophila da mutajenik olduğunu göstermiştir. O zamandan beri, mutajenler çok sayıdaki fiziksel ajanın ve kimyasalların DNA da hasara yol açarak mutasyon oranını arttırıldıkları gösterilmiştir. Bir mutajen, spontan mutasyon oranının üzerinde mutasyon oranını arttıran, herhangi bir kimyasal yada fiziksel ajandır. DNA hasarı, olağan ikili sarmal yapıda bozulmaya sebep olacak herhangi bir değişikliktir. Üç büyük DNA hasarı sınıfı vardır. Tek baz değişiklikleri, yapısal bozukluklar ve DNA omurgasının hasarı.

15 Tek Baz Değişiklikleri Tek baz değişimi yada konversiyon, DNA dizisini etkiler fakat DNA nın tüm yapısı üzerine olan etkisi düşüktür. Örneğin, sitozinin amino grubunun oksijenle yer değiştirmesi, sitozini sadece RNA zincirlerinde bulunabilen bir baz olan urasile dönüştürür. Bu tipteki dönüştürme prosesleri ise deaminasyon olarak adlandırılır. Deaminasyon, hidrolitik hasarın en önemlisi ve en sık görüleni, suyun faaliyeti sebebiyle yada kimyasal bir mutajen sebebiyle spontan olarak ortaya çıkabilir. Bir CG baz çifti, UG baz çifti yerine geçerse, bu değişiklik DNA çift sarmalında sadece küçük bir yapısal bozulmaya neden olur. Bu yüzden bu tipteki hasar, replikasyonu yada transkripsiyonu tamamen bloke etmez. Fakat nokta mutasyonu, mutant bir RNA yada proteinin üretilmesine yol açabilir.

16

17 Omurgalı DNA sında sitozin yerine çoğunlukla 5- metilsitozin bulunur. 5-metilsitozinin deaminasyonu timin oluşturduğundan omurgalı DNA sındaki metillenmiş sitozinler spontan mutasyonlar için sıcak noktalardır. Bu durum hasarlı DNA replike olduğunda GC baz çiftinin AT baz çiftine değişmesine sebep olur. Alkilasyon, oksidasyon ve radyasyonda DNA ya hasar verir. Nitrozamin gibi alkilleyici ajanlar O 6 -metilguanin oluşmasına yol açar. Değişikliğe uğramış bu baz sıklıkla timin ile yanlış eşleşir ve hasarlı DNA replike olduğu zaman GC baz çiftinin AT baz çiftine dönüşmesine sebep olur.

18 Yapısal Bozulma Ultraviyole (UV) ışığı, UV ışınlarının seçilerek absorbsiyonundan dolayı, hücreler üzerinde zararlı etkilere sahiptir. Yaklaşık 260 nm dalga boyuna sahip radyasyon, bazlar tarafından güçlü bir şekilde absorblanır. En sık görülen UV uyarımlı DNA lezyonlarından olan komşu timinlerin 5. ve 6.karbon atomları arasındaki bağlarla bir siklobütan halkası oluşur. Bu halkalara aynı zamanda siklobütan primidin dimerleri de denilmektedir. DNA hasarına interkalasyon ajanları ve baz analogları da neden olabilir. Etidyum bromür gibi interkalasyon ajanları birkaç polisiklik halka içerirler. Bu yasssı halkalar DNA bazları arasına yerleşir. Tıpkı çift sarmal yapıdaki bazlar gibi, bazlar arasına istiflenirler. Çift sarmal yapısının bozulmasından dolayı, interkalasyon ajanları DNA replikasyonu esnasında bir veya daha fazla baz çiftinin insersiyonuna yada delesyonuna neden olabilirler. Baz analogları ise normal bazlar yerine geçebilen bileşiklerdir. Örmeğin, 5- bromourasil, timin bazının analoğudur.

19

20 DNA Omurgasının Hasarı Omurga hasarı, (bir nükleotitteki azotlu bazın kaybolması sonucu oluşan) abazik bölgeleri ve çift zincir DNA kırıkları ifade eder. Abazik bölgeleri, kararsız baz eklentilerinin oluşması nedeniyle spontan olarak oluştururlar. Örneğin, pürin nükleotitlerinde, şeker pürin bağları nispeten kararsızlardır. Suyun etkisiyle pürin bazındaki N-glikozil bağının hidrolizi, DNA daki pürinsiz kalan yerde bir hidroksil (OH) bırakır. Çift zincir kırıkları, iyonize radyasyon ve birçok kimyasal bileşik tarafından indüklenirler. İyonize radyasyon, DNA omurgasındaki deoksriboz şekere doğrudan yada reaktif oksijen türevleri oluşturarak dolaylı olarak saldırabilir. DNA nın her iki zinciri de bozulduğundan, çift zincir kırıkları en ağır DNA hassar tipi olarak değerlendirilir.

21 Lezyon Bypassı Ökaryoktik hücrelerde, normal replikasyon yüksek doğruluklu DNA polimerazları kullandığını bilmekteyiz. Bu yüksek doğruluklu polimerazlar, hasar görmemiş kalıp DNA yı kusursuzca kopyalar fakat DNA sarmalının yapısal bozulmasına neden olan DNA lezyonlarını bypass etme (atlama) yetenekleri yoktur. Özelleşmiş düşük doğruluklu hataya meyilli DNA polimerazlar, kısa süreliğine geçici olarak replikatif polimerazların yerine geçerler ve translezyon sentezi adı verilen bir işlemle hasarlı olan bölgeyi replike ederler.

22 En basit modellerde, DNA daki bir lezyonu bypass edemeyen bir replikatif polimeraz, ya DNA dan ayrılır yada replikasyona devam edebilmek için lezyonun daha ilerisine kayarak replikasyonu sürdürür. Bu durum, PCNA aracılığıyla lezyonu replike etme yeteneğinde olan başka bir DNA polimerazın ortama ilavesini sağlar. DNA replikasyonunun fabrika modeline uygun olarak, hata meyilli polimerazlar ve bunların yardımcı faktörleri, hızlı bir şekilde müdahale için subnükleer bölümlerde depolanırlar. Nihayetinde, replikatif polimeraz replikasyon tamamlanana kadar ya replikasyon engelleyici bir DNA lezyonuyla tekrar karşılana kadar kalıbın kontrolünü tekrar ele alır.

23 Çoğu lezyonun önceden var olan bazların eşleşme özelliklerini tamamen değiştirdiğini hatırlayınız. hataya meyilli polimerazlar bu tip lezyonların hakkında nasıl gelebiliyorlar: bu durumda polimerazlar lezyonların karşısına yanlış nükleotitler sokarlar ve nükleotit değişikliği (substitusyon) mutantları oluştururlar. Alternatif olarak polimerazlar kalıp olarak kullanıdıkları lezyonlu zinciri bırakmadan lezyon bölgesini atlayarak lezyonun ilerisindeki karşı baza doğru baz eklemeye devam ederler fakat frameshift mutasyonu oluştururlar. Hataya meyilli polimerazlarının hataya meyili açısından genel eğilimlerinin önemli bir istisnasını DNA polimeraz η oluşturmaktadır. DNA polimeraz η bir timin dimerinin karşısına iki adet adenin ekleyerek, timin-timin dimerini bypass eder bu durum ise lezyonun hatasız olarak bypassını sağlar.

24 Hataya meyilli DNA polimerazlar, hasarlı DNA kalıplarını müsamahalı ve verimli bir şekilde kopyalayabilirler. Bununla birlikte bu polimerazlar hataya meyilli olduklarından mutasyon üretebilirler. Tipik hata oranı, hasar görmemiş DNA üzerinde baz çifti başına 10-1 ile 10-3 dür. Yapısal çalışmalar bu polimerazların nasıl fonksiyon gösterdiklerinin detaylarının anlaşılmasını sağlamışlardır. Diğer polimerazlar gibi hataya meyilli DNA polimerazlar da el benzeri bir yapıya sahiptirler. Fakat bunların aktif bölgeleri daha geniştir. Halbuki, yüksek doğruluklu polimerazlarda ise parmaklar, yanlış eşleşmeleri kontrol etmek amacıyla yeni oluşmuş baz çiftlerini sıkıca sararlar.

25 DNA polimeraz bunu nasıl yapmaktadır. son çalışmalar göstermektedirlerki, DNA polimeraz ηetanın aktif bölgesi diğer hataya meyilli polimerazlara göre daha da geniştir. Çok geniş olan aktif bölge aynı anda bir yerine iki nükleotiti barındırabilmektedir. Timin- timin dimerlerini özellikle van der Walls kuvvetleri ve hidrojen bağı etkileşimleri tutar. Böylece iki timin her birisi birer adeninle eşleşebilir. Bu sayede DNA polimeraz etanın varlığı hücreleri UV hasarından korur. Translezyon sentezi daha yüksek bir mutasyon riskine rağmen replikasyonun engellenmesiyle ölümcül olabilecek bir durumu ortadan kaldırarak hücrenin hayatta kalmasını mümkün kılmaktadır.

26 Bu sebepten ötürü translezyon polimerazları olan DNA pol IV ve V E colide normal şartlar altında mevcut değildir. Bunların sentezi duruma uygun bir biçimde adlandırılmış olan SOS yanıtı olarak bilinen bir yolağının parçası olarak sadece DNA hasarı oluştuğunda indüklenmektedir.

27

28 Hata-eğilimli DNA pol duran replikasyon makinesine bağlanır

29 Bağlanma şekil değişimini artırır ve replikasyon başlar ve pol eta nt ekler

30 Pol eta ayrılır ve pol iota yanlış bazları hasarlı DNA nın karşısındaki zincire eklemeye devam eder

31 DNA Hasarının Doğrudan Geriye Döndürülmesi DNA hasarını geriye döndürme kabiliyetleri olan DNA tamir enzimleri, bu süreci şaşılacak derecede verimli olan işlemlerle başarırlar. Bunu iki örnek ile açıklayabiliriz. DNA fotoliyazlaz ve DNA metiltransferaz

32 Timin-Timin Dimerlerinin DNA Fotoliyazla Tamiri Çoğu organizmada, DNA da primidin dimerlerinin oluşumuyla sonuçlanan UV radyasyonunun verdiği hasarlar fotoreaktivasyon yada ışık tamiri adı verilen bir işlemle doğrudan tamir edilebilir. Fotoreaktivasyon esnasında ise DNA fotoliyaz enzimi, primidin dimerini bir arada tutan kovalent bağları kırmak için yakın UV den mavi ışığa kadar olan ışık spektrumunun enerjisini kullanırlar.

33 Yapısal çalışmalar DNA fotoliyazların gömülü iki kofaktöre sahip globüler proteinler olduğunu göstermiştir. Bu kofaktörlerden birisi bir pigment olup mavi/yakın UV ışığı absorblarken; diğeri ise tamamen indirgenmiş durumdaki flavin adenin dinükleotittir. enzimin bağlı olduğu timin-timin dimerindeki timinlerin birbirinden ayrılması ise ışıkla uyarılmış FADH den transfer edilen bir elektron ile başlatılır. Timin timin dimerinin enzimin subsrat bağlama cebine girmesi ve timin timin dimerinin kırılması olağanüstü bir olaydır. timin timin dimeri DNA çift sarmalının dışına doğru çevrilir. Böylece FAD kofaktörüne çok fazla yaklaşması sağlanır. Çok kısa sürede FADH - den bir elektron transfer edilir ve dimer ayrılır. Elektron ise daha sonra geçici olarak oluşan flavin radikaline döner; tüm işlem nanosaniyeden daha az bir sürede gerçekleşir. Fotoliyazlar UV nin neden olduğu DNA hasarlarının tamirinde kullanılan en antik ve etkili araçlardan birisi olarak görülürken, insan dahil olmak üzere plasentalı memelilerde fotoreaktivasyon tamir yolağı yoktur.

34 DNA Metiltransferazla Hasarın Tamiri DNA hasarının doğrudan geriye döndürülmesine başka bir örnek, metillenmiş O 6 metilguanin bazının tamiridir. DNA fotoliyazların aksine, metiltransferazlar ise E.coli den insanlara kadar tüm organizmalarda bulunurlar. Oldukça seçici olan bu enzimler, hasarlı guaninden metil grubunun uzaklaştırılmasını katalizler.

35 Enzim DNA çift sarmalının küçük oluğuna bağlanır. enzimin bağlanmasını takiben küçük oluk genişler ve DNA proteinden yaklaşık olarak 15 uzaklaşak şekilde bükülür. Çift sarmalın yapısındaki bu değişiklik hasarlı nükleotitin büyük oluktan aktif bölgeye dönmesini sağlar. Daha sonra aktif bölgedeki bir sistein kalıntısının sülfidril grubu guaninden metil grubunu alır. bu tamir çok verimli bir işlem olmasına rağmen biraz pahalıya mal olur. Metiltransferaz guaninden bir metil grubu aldıktan sonra tekrar kullanılmaz.

36 DNA Hasarının Uzaklaştırılması İle Yapısal Bozuklukların Ve Tek Baz Değişikliğinin Tamiri Hasarlı DNA nın uzaklaştırılmasını içeren tamir sistemleri, tek baz değişimlerinin yapısal bozuklukların ve çift zincirli DNA hasarlarının tamirini kapsamaktadır. Bu yolakların her birinin ana özelliği tamir sisteminde dinamik çoklu protein etkileşimlerinin bulunmasıdır. DNA nın sırayla bir protein yada kompleksten diğerine devredilmesi söz konusudur.

37 DNA tamir proteinleri modüler olup, başka başka biyokimyasal fonksiyonları olan çok sayıdaki yapısal domainlerden oluşmaktadırlar. Aynı zamanda başka tamir proteinleri ile etkileşime geçmeyi sağlayan düşük affiniteli çoklu bağlanma bölgeleri için doğrudan rekabet ile devretmeyi veya allosterik yapısal düzenlemeleri kolaylaştırır. Tek baz değişikliklerinin tamiri için iki temel yolak vardır. Bunlar baz ekzisyonu ve yanlış eşleşme tamiri. Baz ekzisyon tamiri, hasar nedeniyle oluşan tek baz değişikliklerinin düzeltilmesini kapsar. Replikasyon sırasında DNA polimerazın hatalarından kaynaklanan yanlış bozuklukların tamiri için kullanılır. Buna örnek, UV ışınıyla indüklenen timin-timin dimer kabarcıklarıdır.

38 Baz Ekzisyon Tamiri Baz ekzisyon tamiri, DNA glikozilazlar adı verilen bir grup enzim tarafından başlatılır. Bu enzimler deoksiriboz şekerini hasarlı baza bağlayan N- glikozidik bağı keserler. Daha sonra hasarlı baz DNA dan kesilip uzaklaştırılarak (ekzisyon) DNA üzerinde abazik bir bölge oluşturulur. Yükseltgenmiş, indirgenmiş, metillenmiş yada deamine edilmiş bazları tanıyan DNA glikosilatlar varıdr. Örneğin, urasil DNA glikozilaz, UA yada UG baz çiftindeki urasili uzaklaştırırken insan oxog tamir enzimi (hogg1),oxog nin ekzisyonunu katalizler.

39 Yanlış Eşleşme Tamiri Baz ekzisyon hasarlı bazları tamir ederken yanlış eşleşme tamiri ise DNA replikasyonu sırasında oluşan ve DNA polimerazların proofreading aktivitesiyle düzeltilemeyen hataları düzeltir. Yanlış eşleşme tamir yolağının temel özellikleri E. coli den insana kadar korunmuştur fakat bu yolaktaki proteinlerin sadece ikisinin homoloğunun MutS ve MutL- evrim sürecinde korunmuş olduğu görülmektedir. Bu tamir yolağının temel tabiatı çok açıktır. Yanlış eşleşme tamirindeki kalıtsal kusur gen mutasyonlarının miktarını arttırır ve kalıtsal non polipoz kolorektal kanser de dahil olmak üzere bazı kanser tiplerine olan yatkınlığı arttırır.

40 Nükleotit Ekzisyon Tamiri Güneş ışığı Dünya daki yaşam için enerji kaynağı sağlar. Fakat gördüğümüz gibi güneş ışığının UV kısmı DNA tarafından absorblandığında canlı organizmalara büyük ölçüde zarar verebilmektedir. Güneş ışığına sürekli maruz kaldığı için organizmalar UV kaynaklı DNA hasarını tamir etmek için birden fazla tamir yolağı geliştirmişlerdir. Daha önce gördüğümüz gibi hataya meyilli polimerazlar hatayı bypass edebilirler. Bizimde dahil olduğumuz plasentalı memelilerin dışındaki tüm organizmalarda ise DNA fotoliyazlar ise hasarı geri düzeltebilirler. E. coli den insana kadar bütün canlılarda korunmuş olan diğer önemli bir tamir yolu ise nükleotit ekzisyon tamiridir. İnsanın mükemmel bronzluğu elde etme arzusundan dolayı bu tamir yoluna özel bir ilgi duyulmaktadır. Nükleotit ekzisyon tamirindeki kusurlar ise oldukça yüksek deri kanseri riski ve UV ışığına karşı olağandışı yüksek bir duyarlılıkla karakterize edilen ve kalıtsal bir hastalık olan kseroderma pigmentosum nedenidir.

41 Nükleotit ekzisyon tamiri ve transkripsiyon birleşiktir ve tamir işlemi transkribe edilen genler aracılığıyla hızlı bir şekilde ilerler. Transkribsiyona birleşik tamir yolağı aktif olan genlerin transkribe olan kalıp zincirleri üzerindeki lezyonları tanırken, bütün genomdaki lezyonları tanımaktan sorumlu tamir yolağına ise global genom tamiri adı verilir. Bu iki metabolik yolak birlikte genomun bütünlüğünü yeniden sağlamak için çalışır ve organizmaların güçlü güneş ışınlarına rağmen hayatta kalmasını sağlar.

42 DNA Hasarının Uzaklaştırılması İle Çift Zincir Kırıklarının Tamiri Değişik tipteki DNA hasarlarının hücreye en zararlı olanı çift zincir kırıklarıdır. Çift zincir kırıkları genellikle hücre ölümü yada kanserle ilişkilidirler. Hücrelerin ise hayatta kalmayı garantilemek için bu tip hasarlara karşı kompleks çok adımlı cevaparl geliştirmiş olmalarına şaşırmamak gerekir. Reaktif oksijen türleri gibi ajanlar, X ışınları gibi iyonize radyasyonlar ve reaktif oksijen türleri üreten kimyasallar ise DNA da çift zincir kırıklarının oluşumunu teşvik ederler. Çift zincir kırıkları ya homolog rekombinasyonla yada homolog olmayan uç ekleme mekanizmalarıyla tamir edilirler. Homolog rekombinasyon, hasar görmemiş bir homolog kromozomdan genetik bilgiyi geri alarak çift zincir kırıklrini tamir ederler. Bunun aksine homolog olmayan uç ekleme tamir mekanizmasında ise çift zincir kırıklarının tamiri, dizi homolojisine gerek duymadan DNA uçlarının doğrudan doğruya birbirine yapıştırılmasıyla gerçekleştirilir.

43 Çift zincir kırıklarının tamir mekanizması evrim süresince korunmuş ve hem prokaryotlarda hemde ökaryotlarda kullanılmaktadır. homolog rekombinasyon prokaryotlarda hemde ökaryotlarda çift zincir kırıkların tamirinde önemli bir rol oynarken, çok hücreli ökaryotlarda önemli olmasına rağmen daha küçük rol oynar. Memeli hücrelerinin DNA sındaki çift zincir kırıkları esas olarak homolog olmayan uç ekleme mekanizmasıyla tamir edilirler. Bu tamir yolağı hücre döngüsü süresince fonksiyoneldir. Bunun aksine homolog rekombinasyonun ana fonksiyonu replikasyon çatalındaki çift zincir kırıklarını tamir etmektir.

44 Homolog rekombinasyon Homolog rekombinasyon ökaryotik organizmalarda çok önemli roller oynar. Bu proses mayoz esnasında kromozomların uygun olarak ayrılmasına aracılık ederek genomun bütünlüğünü muhafaza eder. Mayotik rekombinasyon genellikle iki homolog atasal kromozom üzerindeki genler arasında krossing overle sonuçlanır, böylece bir sonraki jenerasyonu geçen gen takımında varyasyonun garantilenmesini sağlar. homolog rekombinasyon aynı zamanda DNA daki çift zincir kırıklarını tamir etmede önemli bir mekanizmadır. Çift zincir kırıkları DNA hasarının ölümcül şeklidir.

45 Örnek: çift zincir kırıklarının tamirindeki kalıtsal kusurlar meme kanserine karşı duyarlılığı artırmaktadır. hücre döngüsünün ilerlemesiyle tamiri koordine etmek için bu türlü hasarlara karşı hücrenin cevabı hızlı ve iyi düzenlenmiş olmalıdır. Hücre çekirdeğinde bulunan ve ATM (ataksi telenjiektazi mutasyonlu) olarak adlandırılan bir serin-treonin kinaz anahtar bir sinyal aktarıcıdır (transdüktör). Hücrelerin iyonize radyasyona veya çift zincir kırığı oluşumuna sebep olan diğer ajanlara maruz kalması, ATM kinaz aktivitesinin artmasını tetikler. ATM kırık bölgede toplanır hücre döngüsü kontrolünde ve DNA tamirinde görev alan bazı proteinleri fosforiller. ATM nin önemli bir hedefide tümör süpressörü p53 proteinidir.

46 ATM si olmayan insanlar ise ataksi telenjiektazi adı verilen bir sendroma sahip olurlar. Bu sendrom ise radyasyona olan aşırı duyarlılık kanser olma eğiliminde artış immün yetmezlik, erken yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıklar ile karakterize edilir. Çift zincir kırıklarına hücresel yanıt kırık bölgelerin tamir odaklarında lokalize olmasıyla sonuçlanır. tamir odakları toplanmış olan ATM nin yanında tamir proteini olan Rad 52 nin hücrede bulunan miktarının çoğunluğuna sahiptir. Bu odaklar bir DNA lezyonundan fazlasını bulundurabilir. Müteakiben, Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) kompleksi çift zincir kırık bölgesine birikir ve tamiri başlatır.

47 DNA ilk önce MRN kompleksindeki Mre11 in 3-5 ekzonükleaz aktivitesiyle muamele edilerek tek zincirli kuyruklar oluşturulur. MRN kompleksi ise yapısında bulunan Rad 50 dimerlerinin sarmal bobin domainleri aracılığıyla DNA uçları arasında bir köprü oluşturur. Daha sonra tek zincirli DNA kuyrukları Rad 52 tarafından tanınır. 3 kuyrukların sağlam homolog dizilerle olan istilası ise Rad51 tarafından başlatılır. Rad54, Rad55, Rad57, BRCA1 ve BRCA2 proteinleride homolog rekombinasyonda görev alırlar, fakat bu proteinlerin kesin rolleri tam olarak anlaşılmamıştır. Zincir takası hasarlı ve hasarsız DNA dubleksleri arasında bir bileşik molekül üretir. DNA replikasyon mekanizmasını kullanarak DNA sentezi ile dizi bilgisi tekrar eski haline getirilir. Daha sonra birbirine bağlı olan bileşik moleküller, dal göçü ve holiday bağlantısı ayrışması işlemlerine tabi tutulur ve tamir edilmiş DNA zincirleri ligasyon ile birleştirilir.

48 Holiday bağlantıları Heterodubleks=kiazma benzeri yapı=holiday bağlantısı Heterodubleks DNA: orjinal olarak farklı homologlardan türevlenen tek zincirlerinin rekombinasyon sırasında birleşmesiyle oluşan dubleks DNA dır. holiday bağlantısı bir ara ürün olup, rekombine olmakta olan iki dubleks DNA nın tek zincirleri arasındaki çapraz geçişlerin kovalent olarak birleşmesi ile oluşmaktadır. Holiday bağlantısı rezolvazom denilen bir enzim kompleksiyle iki dublekse ayrışır.

49 Homolog olmayan uç birleştirme Memelilerde DNA daki çift zincir kırıkları öncelikli olarak homolog olmayan uç birleştirme yoluyla tamir edilir. Bunun iyonize radyasyon sebebiyle oluşan çift zincir kırıkların ana tamir yolu olduğu düşünülür. Homolog olmayan uç birleştirmenin kilit enzimatik adımalrı ise nükleolitik etki, polimerizasyon ve ligasyondan oluşmaktadır. memelilerde homolog olmayan uç birleştirme tamir yolağının biyokimyasal olarak daha iyi anlaşılmasını sağlayan yeni bir sistem geliştirilmiştir. Bu in vitro çalışmalar bu üç kilit enzimatik adım sırasında esnekliğin var olduğuna işaret etmektedir. Örneğin bir zincirdeki ligasyon diğer zincirdeki nükleolitik veya polimerazyon etkisinden önce gelebilmektedir.

50 DNA da çift zincir kırığı oluştuktan sonra, DNA nın kırık uçları Ku70 ve Ku80 heterodimerlerinin ikisi tarafından tanınır. heterodimerler kırık uçları birbirine yakın mesafede tutan bir yapı oluşturarak diğer enzimlerin çalışmasına imkan oluştururlar. Ku heterodimeri hasarlı bölgeye nükleazın (Artemis/DNA-PK CS ) polimerazın (DNA polimeraz μ ve λ) ve ligaz kompleksinin (XRCC4-DNA ligaz IV) toplanmasını sağlar. Endonükleaz artemis ise DNA-bağımlı protein kinazın katalitik alt birimi (DNA-PK CS ) tarafından fosforile dildikten sonra aktive edilir. Daha sonra aktive edilmiş Artemis/DNA-PK CS kompleksi kırık bölgesindeki fazla yada hasarlı DNA yı kırpar. Her homolog olmayan uç birleştirme olayında gerçekleşen 3 veya 5 sarkık uçların uzatılması yada boşlukların doldurulması için DNA polimeraz μ ve λ veya enzin TdT gereklidir. Kırık uçların tekrar birleştirilmesi ise XRCC4 ile irtibatlı DNA ligaz IV tarafından gerçekleştirilir.

51 Çift zincir kırıklarının tamiri genom bütünlüğünün muhafazası için önemlidir fakat tamir işleminin kendisi mutasyona neden olabilir. Örneğin, aynı kromozoma ait olup olmadığına bakılmaksızın iki kırık uç tamir mekanizması tarafından yapıştırılabilir ve homolog olmayan uç birleştirme, kırık bölgesinde genellikle insersiyon ve delesyonla sonuçlanır. hücreler ise hayatta kalmalı ve yaşam devam etmelidir. Bazı mutasyonların birikmesi ise hatalı da olsa tair edilmedikleri takdirde ölümcül olabilen genomdaki kırıklara karşı ödenen bir bedeldir.

52

53