attomol Parvovirus B19-DNA-LINA

Transkript

1 attomol Parvovirus B19-DNA-LINA Kan yada amniyotik sıvıda Parvovirus B19- genotiplerin 1-3 tespitine yönelik test Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 20 tespit sipariş numarası: Giriş İnsan patojenik virüs Parvovirus B19 eritrovirüsler grubuna girer ve son derece çevresel dirençlidir. Farklı izole virüs çalışmaları son yıllarda farklı genotipin insan eritrovirüslerinde üç grubunun teşhisine neden olur. Genotype-1 (G1) Parvovirus B19 in ortak izolesidir. Genotip 2(G2) ve genotip 3 (G3) diğer izole eritrovirüse girer(v9-, Laliisolates). B19 virüsüne kıyasla yaklaşık 11% in DNA-dizisinde farklılık gösterir, fakat genotip 1(B19- prototype) in benzer klinik belirtilerini gösterir. Avrupalılarda genotip 1 in aksine genotipler 2 ve 3 nadirdir(servant et al., 2002, J Virol, 76: ; Gallinella et al., 2003, J Clin Virol, 28:1-13; Hokynar et al., 2004, J Clin Microbiol, 42: ). Eritema infectiosuma indüklenen Parvovirus B19, damlacık enfeksiyonu veya kan, kan ürünleri ile transfer edilebilir. Bu enfeksiyon çoğunlukla çocuklukta 6 ve 15 yaş arasında olur ve tipik bir kelebeğe benzeyen erithema şeklindedir. Belirtiler bacaklarda kısmen kaşınan halka veya çelenk-şeklinde kırmızı lekelerdir. Yetişkinler için enfeksiyon çoğunlukla, arthralgia ve articular romatizmasıyla bağlantılıdır ve egzantem olmadan gribe benzer (Kellermayer et al., 2003, Pediatr Infect Dis J, 22: ). Parvovirus B19 enfeksiyonu ile birlikte, farklı komplikasyonlar bilinir. Virüs serbest kaldıktan sonra, eritrositlerin dağılması hızlıca dengeyi sağlamak için enfeksiyonlu hastalarda anemiye neden olur. Önceki hastalıkla geçmişleri olan hastalar bir rahatsızlığın tehlikeli devrelerini geliştirebilir. Örneğin, kronik hemolitik anemi hastasında bir aplastik kriz oluşabilir. Üstelik, kronik anemiye neden olan immunodefisient hastalarda enfeksiyon devam edebilir çünkü hastalarda enfeksiyonu kontrol altında tutmak mümkün değildir (Isselbacher et al., 1995, Harrisons Innere Medizin 1, 13. Auflage, Blackwell-Wissenschaftsverlag, S ). Ayrıca, hamile kadınlarda fetüsun transplacental enfeksiyonundan sonra uterada ölüme sebep olan konjenital hidropsun (Hidrops fetalis), tehlikesi vardır(malley et al., 2003, Pediatr Dev Pathol 5: ). Yaklaşık 400 gebelikte bir Parvovirus B19'den dolayı komplikasyonlar oluşur(eickhoff, 2005, BioTec 5-6:40-42). Özellikle hamile kadınlar ve bağışıklık sistemi baskılanmış hastalar doğru ve çabuk bir tanıya ihtiyaç duyarlar ve bu nedenle uygun bir tedaviye başlanabilir.

2 Test Endikasyonu: Parvovirus B19 enfeksiyonun tanısı Belirsiz serolojik hastalarda Parvovirus B19 enfeksiyonunun tanısı veya ayrımlanması (immunosuppresse hastalar gibi) Parvovirus B19 enfeksiyonuyla ilgili gebeliğin ayrı tutulması Belirsiz serolojik sonuçları açıklama Sürekli ya da spesifik olmayan IgM antikorunu açıklama 2. Genel Açıklamalar Belirtilen saklama sıcaklığında her kit bileşenini tutun Plastik çantayı açmadan önce oda sıcaklığına adapte olması için test striplerine izin verin Parmaklarla test şeritlere dokunmayın, bir pens kullanın Bir bıçak veya neşter kullanarak bloktan stripleri kesin Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalıdır. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Özetle kullanmadan önce sıvıların küçük miktarlarını içeren tüm tüpleri santrifüjleyin Ilımlı ısıtma ile 5 kez yıkanan solüsyon da çökeltileri çözün Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat edin Test uygulamasının tüm adımlarında steril filtre uçlarını kullanın ve eldiven giyin Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir.. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın. PCR reaksiyonları ile amplife edilmiş numuneleri pipetlerken filtre uçlu farklı pipet setleri kullanın. Hibridizasyon solüsyon(# 127) kullanırken dikkatli olun. Bu solüsyon aşağıdaki R ve S- sınıflandırmaya bağlı olan formamide içerir: R61, S53-24/ Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim/ Kantite Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 118 PCR buffer E 0.7 ml -20 C 168 PVB19 Primer 2 tüplü bir 8.5 μl primer solusyon, primer karışımı hazırlamak için 300 μl PCR buffer E -20 C

3 169 Iç standard PVB19 (yeşil renkli tüpler) 125 Denatürasyon solüsyonu (#118) ile her birini doldurun 2 tüplü bir 8.5 μl iç -20 C standard solusyon, 300 μl primer karışımı ile her birini doldurun ml 4 C 170 PVB19 test strips 20 strips 4 C 127 Hibridizasyon solüsyonu (2 x konsantre) 211 Yıkama solüsyonu D* (5 x konsantre) 212 Konjugat buffer (ready to use) 214 Konjugat C* (500 x konsantre) 14 ml 4 C 24 ml (2 x 12 ml) 4 C 14 ml 4 C 40 μl 4 C 75 Substrate 12 ml 4 C *Terim yıkama solusyonu ve konjugat için yukarıdaki tabloda açıklanan ürüne bu manuelde bakınız. a dahil olan üreticiden sipariş edilebilir yada defalarca kullanılabilir(# 124). Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler EDTA-kan (göbek bağı or foetal kan), plazma, serum yada amniyotik sıvısından (Qiagen dan spin kolonlar kullanılarak hazırlanır) hastaların DNA numuneleri Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template (Parvovirus B19 pozitif DNA hazırlama) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Thermoshaker Pens, beher, Falcon tüpler, distile su

4 5. Test Prensibi, Test sonuçlarının yorumlanması DNA LINA, saflaştırılan DNA numunesinin ve DNA iç standardının aynı reaksiyon karışımı içindeki PCR amplifikasyonuyla başlar. Spesifik patojen PCRin hedef dizisi tüm üç farklı Parvovirus B19 genotip grupları bulunan VP1-geninin bir parçasıdır(g1-g3). Amplifiye olan DNA nın tespiti ve genotiplerin (G1 and G1-G3) arasında ayrım strip yüzeyinde sabitlenmiş yakalama problarının yönlendirdiği ters hibridizasyon ve sonraki aşamadaki işaretleme reaksiyonu ile gerçekleşir. Eğer hastanın numunesi G1 DNA içerirse, G1 and G1-G3 patojen-spesifik bantları test şeridinde görünür(fig. 1). Buna karşılık, G2 veya G3 içeren numuneler sadece şeritte G1-G3 patojen-spesifik bant oluşturur. Test şeridi üzerinde üçüncü bant bütün patojen-negatif numunelerde ve negatif kontrollerde tek bant olarak lekelenmek zorunda olan bir kontrol bandıdır(amplifikasyon için kontrol olan iç standart) (fig. 1, strip 63 and 66). Ancak hasta numunesi çok yüksek pozitifliğe sahipse iç kontrol DNA sı ile yarışır ve onu tamamıyla veya kısmen inhibe eder bu durumda iç konrol bandında ya hiç renklenme olmaz ya da çok az renklenme olur. Bu durumda sadece kuvvetlice koyulaşan patojen-spesifik bant görünür. Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. Özellikle, sınırlı test sonuçlarıyla ciddi bulaşıcı hastalıklardan dertli olan hastalar için numuneler diğer metotlarla yada bu test tahlillerle defalarca analiz edilmelidir. 6. Manuel Test protokolü için gerekli iki adım: (6,1) patojen DNA amplifikasyonu ve (6.2) test şeritleri için amplifike olan DNA nın ters hibridizasyonudur. Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank)

5 2. Pozitif kontrol (Parvovirus B19 pozitif kontrol template) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(sipariş numaranızı 171). 6.1 Amplifikasyon EDTA-kan (göbek bağı or foetal kan), plazma, serum yada amniyotik sıvısından (Qiagen dan spin kolonlar kullanılarak hazırlanır) hastaların DNA hazırlama Primer karışımı hazırlama: kısaca primer solüsyonu içeren renksiz reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#168) ve 300 μl PCR buffer E ile her bir tüpü doldurun(#118). Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Premix hazırlama: kısaca iç standart solüsyonu içeren yeşil reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#169) ve 300 μl primer karışımıyla her tüpü doldurun. Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Dikkat: 300 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz. PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (25 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (5 reaksiyon için örnek: 5 x 25 μl + 15 μl fazladan hacim = 140 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 140 μl PCR premix + 1,4 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix + 10 μl PCR-H2O + 10 μl kontrol template + 10 μl DNA (ca. 20 ng/μl) (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: 40 döngü: 35 s 95 C 35 s 65 C 60 s 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok Dikkat: a) Qiagendan hot start Taq DNA polimeraz kullanılırsa aktivasyon adımları firmanın protokolünde detaylı olarak tanıtılmalıdır(15 min at 95 C).

6 b)bu testin PCR premixi dutpi içerir, bundan dolayı uracil-dna glycosylase (UDG)- dekontaminasyonu, 8 mu/μl reaksiyonu karışımının tavsiye edilen UDG enzim konsantrasyonu kullanılarak yapılabilir. Bu durumda iki başlangıç inkübasyon adımı 10 min için 37 C'de, (UDG-reaksiyon) ve ondan sonra 10 min için 95 C'de (UDG de inactivati), PCR-sıcaklık profiline eklenmelidir. c) Amplificatelerin tespiti her zaman tavsiye edilen PCR inkübasyonundan sonra PCR reaksiyonları için UDG ile ele alınmalıdır. Ayrıca UDG'in kalan aktivitesi PCR ürünlerinin bozulmasına ve amplifikasyon ürünlerinin tespitinin imkansız olmasına neden olur. 6.2 Test şeritleri için ters hybridisation tarafından amplifikasyon ürünleri tespit etme Aşağıda listelenen indüksiyon adımları için reaktiflerin miktarları, başlayıcı kit ile sağlanan indüksiyon larının türü için geçerlidir. Diğer indüksiyon ları kullanılırsa, reaktif miktarı ona göre adapte edilmelidir. Bu durumda üretici firmadan toptan eşya gibi ek reaktifler sipariş etmek mümkündür. Protokol adımları 1.2xhibridizasyon solüsyonun 1:2 seyreltilmesi 2. 5xyıkama solüsyonun 1:2 seyreltilmesi İhtiyaç duyulan solüsyonlar ve bileşenler Reaksiyon ampül Sıcaklık Zaman Aletler 14ml 2xhibridizasyon solüsyonu + 14ml distile su=28 ml kullanıma hazır 1xhibridizasyon solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti 1 ml 1xhibridizasyon solüsyonuyla inkübe edilmelidir. 12 ml 5xyıkama solüsyonu + 48ml distile su=60 ml kullanıma hazır 1xyıkama solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti için 4.5 ml 1xyıkama solüsyonunun toplam miktarına ihtiyaç vardır. 3. Solüsyonun RT dengesi 1xhibridizasyon solüsyonu 1 kullanıma hazır (line 1 bak ) 1xyıkama solüsyonu kullanıma hazır (line 2 bak ) konjugat buffer kullanıma hazır Falcon tüpü gibi RT 4.Amplifikasyon ürününün denatürasyonu 5.hibridizasyon 30 μl amplifikasyon ürünü + 30 μl denatürasyon solüsyonu 42 C 5 dak. Termo Çalkalayıcı (0 rpm) 42 C 60 dak. Termo Çalkalayıcı

7 6. Hibridizasyon solüsyonu başka bir yere boşaltın 7.Yıkama adımaları (iki Her şerit için 1 ml 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın 8.Konjugat dilusyonu Konjugat buffer da 1:500 (RT) (5 şerit için örnek: 5.4 μl konjugat ml konjugat buffer [RT]) 9. Konjugat Her şerit için 500 μl inkübasyonu konjugat dilusyonu ekleyin 10. Konjugat dilusyonunu başka bir yere boşaltın 11. Yıkama Her şerit için 1 ml adımaları (iki 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın Falcon tüp yada küçük beher 12. Substrat Her şerit için 500 μl reaksiyonu substrat ekleyin 13. Substrat başka bir yere boşaltın 14. Stop substrat Şeritler için 1 ml reaksiyonu distile su ekleyin 15. Test şeritlerini kurutun(ışıktan koruyun) ve test sonuçlarını yorumlayın 42 C 2x6 dak. Termo Çalkalayıcı RT RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 2 x 1 dak. Çalkalayıcı RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 5 dak. Çalkalayıcı İlk kez her test kiti kullanmadan önce, sadece bir kez gerçekleşmesi için istenen protokol adımları gri ile vurgulanmıştır. RT = oda sıcaklığı *) Eğer 3x konsantre yıkama solüsyonunda çökelti oluşmuşsa hafif ısıtma ile seyreltmeden önce çözün. (30-50 C, su banyosu için). Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici

8 Lot numarası Son kullanma tarihi 2 C ve 6 C arasında saklayın Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> determinations için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız