BİTKİLERE GEN TRANSFERİNDE KULLANILAN VEKTÖRLER

Transkript

1 BİTKİLERE GEN TRANSFERİNDE KULLANILAN VEKTÖRLER Feyza Tufan Yüksek Lisans Öğrencisi Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi

2 İÇERİK Vektörler Aktarılan Nükleik Asit Molekülünün Özellikleri Agrobacterium Aracılı Gen Transferinde Kullanılan Vektörler Vektör Olarak Bitki Virüslerinin Kullanımı Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 2

3 Vektörler Bir geni konak hücre içerisine transfer etmek için kullanılan DNA molekülleri Bitkilere gen transferinde kullanılan vektörler; Agrobacterium tumafaciens, Agrobacterium rhizogenes, virüsler Kullanılan vektör, konak hücre tipine ve deneyin amacına göre belirlenir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 3

4 Agrobacterium tumafaciens Bitkilerde görülen taç tümör hastalığı Ti plazmidinin üzerindeki hareketli bir T- DNA parçası ile ilişkili Agrobacterium enfeksiyonu sonucunda, T-DNA bölgesinin bitki hücrelerine aktarılması ve kromozomlarla stabil olarak bütünleşmesi T-DNA bölgesinde bulunan genlerin transkripsiyonu sonucunda tümör oluşumu ve opin sentezi gerçekleşmekte Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 4

5 Araştırmalar Sağ sınır ve sol sınır bölgesi olarak adlandırılan düzensiz tekrar dizilerinin arasına yerleştirilen DNA parçasının kolayca bitki hücresine aktarılabildiği Opin sentezini sağlayan ve tümör oluşturan genlerin T-DNA bölgesinden çıkarılmasının bitki hücresine gen aktarımını hiçbir şekilde engellemediği Vir genlerinin trans-hareket özelliği Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 5

6 Agrobacterium Aracılı Bitki Transformasyonu Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 6

7 Aktarılan Nükleik Asit Molekülünün Özellikleri Gen transferinde kullanılacak DNA parçası, aktarılmak istenen gene ilave olarak; Uygun promotör ve terminatör Seçici işaret genleri Haberci genler içermeli Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 7

8 Promotör ve Terminatörler Promotör; transkripsiyonu başlatmak için gerekli olan ve bununla ilgili işaretleri taşıyan başlatıcı nükleotid dizisi Gen transfer çalışmalarında kullanılan promotörler; bitki, virüs veya bakteri kökenli olabilir Promotör seçiminde, aktarılan gen istenilen etkiyi gösterebilmeli Transgenler aynı zamanda transkripsiyonu doğru pozisyonda durdurmayı sağlamak için 3 terminus ucunda uygun terminatör dizilerine sahip olmalı Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 8

9 Promotörler Konstitütif promotörler Doku spesifik promotörler Uyarılabilir promotörler Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 9

10 Konstitütif Promotörler Kararlı bir transformasyon çalışmasında seleksiyon için kullanılacak genlerin promotörleri yüksek düzeyde eksprese edilmeli ve gen aktarılan materyal kolayca seçilmeli Cauliflower mosaic virüs (CaMV) 35 S promotörü Agrobacterium un nopalin sentaz (nos) promotörü Mısır ubiquitin geni promotörü Pirinç aktin geni promotörü Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 10

11 Konstitütif Promotörler Nos geninin bitki transformasyon vektörlerinde geniş çapta kullanılması Mısır ubiquitin ve aktin promotörlerinin monokotillerde yüksek düzeyde anlatım sağlaması Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 11

12 Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotörü CaMV 35 S RNA geninin promotörü Geniş çapta kullanım Transgenik bitkilerin tüm dokularında anlatım yapması Yüksek düzeyde anlatım yapılması Gen aktarılan materyalin kolayca seçilmesi Monokotillerde düşük düzeyde anlatım yapmasına karşın dikotillerde yüksek seviyede anlatım göstermesi CaMV is a circular dsdna genome virus Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 12

13 Doku Spesifik Promotörler Aktarılan genlerin sadece bitkilerin tohum, yumru, meyve gibi yenen kısımlarında anlatımları istendiği durumlarda kullanım Ör: Glutenin promotörü Endosperm Patatin promotörü Yumru Faseolin promotörü Kotiledon Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 13

14 Uyarılabilir Promotörler Aktarılan genin gerekli olduğu zaman eksprese edilmesi Ör: Patojene karşı dayanıklılık sağlayan bir genin, bitki patojenle enfekte olduğu zaman eksprese edilmesi Patojene karşı dayanıklılık sağlayan böyle bir genin konstitütif olarak anlatımının bitkinin normal büyüme ve gelişimini engelleyebilmesi Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 14

15 Seçici İşaret Genleri Bitki transformasyonu, bir çok durumda çok düşük sıklıkta meydana gelen bir olaydır. Gen transferi sonrasında, transforme olmuş hücrelerin seçimi için aktarılan DNA parçasında seçici işaret genleri de bulunmalıdır. Böylelikle, gen aktarımı düşük frekansta gerçekleşse dahi gen aktarımı yapılan hücre ve dokulardan transgenik bitkiler elde edilmesi sağlanır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 15

16 Seçici İşaret Genleri İşaret geni olarak, genellikle; antibiyotik veya herbisitlere direnç veren genler kullanılır (Aminoglikozit antibiyotiklerinden kanamisin, higromisin; herbisitlerden fosfinotrisin, glufosinat). Bu işaret genleri bitki hücre ve dokularının bazı antibiyotik ve herbisitlere karşı direnç kazanmasını sağlamaktadır. Antibiyotik veya herbistlerin bulunduğu doku kültürü ortamında, normal bitki hücreleri antibiyotik ve herbisitlere duyarlı olduğu için gelişememekte, sadece işaret genlerinin aktarıldığı bitki hücreleri gelişip çoğalabilmektedir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 16

17 Seçici İşaret Genleri Kanamisin direnci, birçok dikotil bitkilerin transformasyonunda etkili Fosfinotrisin direnci, en çok mısırda etkili Higromisin direnci, en çok pirinç transformasyonunda etkili Seçici işaret genler genellikle konstitütif promotörler yoluyla çalıştırılır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 17

18 Haberci Genler Haberci genler, bitki transformasyon vektörlerinde geniş çapta kullanılır. Ekspresyonunun kolaylıkla izlenebilmesini sağlar. İdeal olarak, haberci genlerin belirlenmesi kolay olmalıdır (tercihen zarar verici olmayan bir belirleme sistemi). Agrobacterium la bitki hücrelerinin inokülasyonundan hemen sonra haberci genlerin ekspresyonu bakteri T-DNA sının bitki hücrelerinin nükleusuna transferinin iyi bir göstergesidir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 18

19 Haberci Genler Günümüzde, haberci genlerin az bir kısmı geniş çapta kullanılmaktadır. β-glukuronidaz (GUS) (E. coli) Birçok durumda avantajlı Geniş çapta kullanılmakta Kolay Radyoaktif değil B-glucuronidase (GUS) based selection Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 19

20 Haberci Genler GFP: Son yıllarda sıklıkla kullanılmaya başlanmış bir yöntem Gen, Aequorea victoria dan izole edildi (Deniz anasının yeşil ışıma veren proteinini kodlayan genin izolasyonu. Floresan mikroskobu altında ışıma gözlemlenmesi ve genin anlatımı). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 20

21 Haberci Genler Introduction of the gfp gene into different target tissues Petunia petal - cells Soybean seed whole seedling (on right) Wheat callus - cells Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 21

22 Haberci Genler GFP expression in wheat seeds and roots Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 22

23 Haberci Genler Lusiferaz: Ateşböceği (Vibrio herveyi) lusiferaz geni bir enzim kodluyor. Meydana gelen oksidasyon olayı ışığın yayılımını sağlıyor. Geniş çapta kullanılmamaktadır. A tobacco plant transformed with the firefly luciferase gene Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 23

24 Agrobacterium Aracılı Gen Transferinde Kullanılan Vektörler Ko-entegratif vektörler Binary vektörler Superbinary vektörler Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 24

25 Ko-entegratif Vektörler Geliştirilen ilk vektör sistemi T-DNA nın küçük bir parçasını taşıyan E. coli plazmid vektörünün kullanıldığı bir yöntem Her iki plazmid aynı Agrobacterium içerisinde yer alıyorsa, bu plazmidler arasında meydana gelen rekombinasyon yoluyla E. coli plazmid vektörü Ti plazmidinin T-DNA bölgesi içerisine entegre olur. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 25

26 Ko-entegratif Vektörler E. coli plazmid vektörünün özellikleri: Bu plazmid vektör yalnızca E. coli içerisinde replike olma özelliğine sahiptir (Aracı vektör Agrobacterium içerisinde replike olamadığından taşıdığı genlerle birlikte Ti plazidinin T-DNA sına entegre olmaktadır). Ko-entegratif vektörü taşıyan Agrobacterium hücrelerinin seçimi için E. coli plazmid vektöründe E. coli ve Agrobacterium da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni olmalı Ti plazmidindeki replikasyon orijini hem Ti plazmidinin hem de E. coli nin ve taşıdığı genlerin replikasyonunu sağlamaktadır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 26

27 Binary Vektörler 1983 yılında iki grup büyük bir buluş yaptı (Hoekema ve diğ. ve Framond ve diğ.), Ti plazmidinin vir ve T-DNA bölgelerinin iki ayrı replikona ayrılabildiğini saptadılar. Agrobacterium içerisinde birbirinden bağımsız olarak replike olan iki plazmid mevcuttur: Birincisi, yalnızca vir bölgesini içeren Ti plazmidi, İkincisi ise T-DNA sınır dizileri arasında bitkilere aktarılmak istenen geni içeren manüplasyonu kolay olan küçük ve hareketli binary plazmid Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 27

28 Binary Vektörler Vektörün Agrobacterium a aktarılması hareket etme yeteneğine sahip vir yardımcı ile konjugasyon sonucu olmaktadır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 28

29 Binary Vektörlerin Özellikleri 1- T-DNA yı tanımlamak ve sınırlandırmak için T-DNA sağ ve sol sınır dizileri (Şimdiye kadar incelenen tüm Ti/Ri plazmidlerinde yüksek oranda korunmuş 25 baz çiftlik tekrarlı diziler) 2- Bitkide işlev gören seçici işaret geni 3- Nadir kesim bölgeleri içeren restriksiyon endonükleazları 4- Hem E. coli hem de Agrobacterium da fonksiyonel olan replikasyon orijini 5- E. coli ve Agrobacterium da binary vektörün seçimi için antibiyotik direnç geni Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 29

30 Binary Vektörün Tipik Yapısı Bir binary vektör; T-DNA ve vektör omurgasından oluşur. T-DNA; sağ sınır ve sol sınır dizileriyle sınırlandırılmış parça. Multiple cloning bölgeleri, bitkiler için seçici işaret geni, bir haberci gen ve ilgili diğer genler içerebilir. Vektör omurgası; E. coli ve Agrobacterium için plazmid replikasyon fonksiyonu, bakteri için seçici işaret genleri Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 30

31 Ko-entegratif ve Binary Vektörlerin Karşılaştırılması Binary vektörler, ko-entegratif vektörlere göre birçok olumlu özelliklere sahiptir: İki plazmid arasında rekombinasyon meydana gelmemekte Sadece binary vektör Agrobacterium içerisine aktarılmakta Bundan dolayı transfer oranı daha fazla ve hızlı Manüplasyonları daha kolay Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 31

32 Superbinary Vektörler 1990 lı yılların başlarına kadar Agrobacterium aracılı transformasyon çoğunlukla dikotillerde kullanılıyordu ve bunu tahıllara uygulamak zordu. Superbinary vektörlerin geliştirilmesiyle monokotillerin (pirinç, mısır gibi) transformasyonu başarılı bir şekilde gerçekleştirildi (Yüksek etkinlikte transformasyon). Superbinary vektör, binary vektörün geliştirilmiş versiyonudur ve Ti plazmidinden (A281 denilen bir Agrobacterium suşunun supervirulans tipinden sorumlu olan ptibo542 ) türevlenen ilave virulans genleri (vir B, vir C, ve vir G genlerini kapsayan 14.8 kb KpnI fragmenti) taşır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 32

33 Superbinary Vektörler Agrobacterium tumafaciens de homolog rekombinasyon yoluyla bir aracı vektörün (psb11 gibi) ve bir alıcı vektörle (psb1 gibi) ko-entegrasyonu superbinary vektörün final yapım aşamasında kullanılır. Aracı vektör; T-DNA ve ColE1 in replikasyon orijinini içeren küçük bir plazmiddir ve yalnızca E. coli de replike olur. Alıcı vektör; bir IncP plazmididir. Hem E. coli de hem de Agrobacterium da replike olur. Ve 14.8 kb Kpn1 fragmenti taşır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 33

34 Vektör Olarak Bitki Virüslerinin Kullanımı İçin Girişimler Bitki virüslerinin klonlama vektörleri olarak potansiyeli araştırılmaktadır. Ancak büyük bir başarı elde edilmemiştir. Bitki virüslerinin çok büyük bir çoğunluğunun DNA yerine RNA genomuna sahip olması karşılaşılan bir problemdir. RNA virüsleri potansiyel klonlama vektörleri olarak çok kullanışlı değildir. Çünkü RNA ile manüplasyonlar çok daha zor gerçekleşir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 34

35 Klonlama Vektörü Olarak Virüsler Sadece DNA virüsünün iki sınıfının yüksek bitkileri enfekte ettiği bilinmektedir. Caulimovirus vektörleri Geminivirus vektörleri Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 35

36 Caulimovirus Vektörleri İlk başarılı bitki genetik mühendisliği deneylerinden biri 1984 yılında, Brassicarapa bitkisine yeni gen klonlamak için Caulimovirus vektörlerinin kullanılmasıdır. Bununla birlikte bu virüsün kullanışlılığını sınırlandıran iki faktör vardır: Birincisi, Caulimovirus genomunun taşıma kapasitesi sınırlıdır (Temel olmayan kısımları silinse bile eklenen dna nın taşınması çok sınırlı). İkincisi, CaMV virüsünün çok dar konak aralığına sahip olması. Bu klonlama deneylerinin sadece Brassicas gibi birkaç bitki türü üzeride yapılmasına yol açmaktadır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 36

37 Geminivirus Vektörleri Doğal konakları, mısır ve buğday gibi bitkilerdir. Bu nedenle bu bitkiler ve diğer monokotiller için potansiyel vektör olabilir ancak bu konuda da zorluklar vardır. Enfeksiyon döngüsü boyunca, bazı geminivirus genomlarında yeniden düzenleme ve delesyonlar görülür. Bu eklenen herhangi bir ilave DNA yı karıştırabilir. Bu da klonlama vektörünün bir olumsuz bir özelliğidir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 37

38 ÖZET Bitkilerde gen transferi, bazı özel gen dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak aktarılmasıdır. En fazla kullanılan vektörler, Agrobacterium aracılı plazmidlerdir. Vektörlerin, bitki transformasyonunda başarılı bir şekilde kullanılmasının nedeni; onkogenlerin kaldırılması ve vektörlere modifikasyon yapılabilmesidir. Agrobacterium aracılı transformasyon ve binary vektörler, bitki biyoteknolojisinde önemli bir başarı sağlamıştır ve bu vektörlerin geliştirilmesi için günümüzde çalışmalar devam etmektedir. Her deney için mükemmel olan bir vektör sistemi mevcut değildir. Vektörlerin yapımı veya modifikasyonları çalışmanın amacına uygun olmalıdır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 38

39 TEŞEKKÜRLER Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 39

40 REFERANSLAR LAN-YING, L., STANTON B. G., 2008, T-DNA binary vectors and systems, Plant Physiology, Vol. 146, TOSHİYUKİ K., TERUYUKİ I., 2007, Current status of binary vectors and Superbinary Vectors, Plant Physiology, Vol. 145, VACULKOVA, E., 2007, A modified low copy number binary vector pun for Agrobacterium-mediated plant transformastion, Biologia Plantarum, 51(3), ÖZCAN, S.,BABAOĞLU, M., 2001, Bitki Biyoteknolojisi II, Genetik Mühendisliği ve Uygulamaları, Selçuk Üniversitesi Basımevi BROWN, T., 2006, Gene Cloning and DNA Analysis, Cloning Vectors for Eukaryotes Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi 40