ÖZET Doktora Tezi TARIM YAPILAN ALANLARDA, PESTİSİT KİRLİLİĞİNİ DEĞERLENDİRMEK İÇİN İNDİKATÖR ARTHROPODLARDA, UYGUN BİYOBELİRTEÇLERİN (BİYOMARKIR) ARA

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ TARIM YAPILAN ALANLARDA, PESTİSİT KİRLİLİĞİNİ DEĞERLENDİRMEK İÇİN İNDİKATÖR ARTHROPODLARDA, UYGUN BİYOBELİRTEÇLERİN (BİOMARKER) ARAŞTIRILMASI Ahmed MOHAMMED ALI HAMMAD BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Doktora Tezi TARIM YAPILAN ALANLARDA, PESTİSİT KİRLİLİĞİNİ DEĞERLENDİRMEK İÇİN İNDİKATÖR ARTHROPODLARDA, UYGUN BİYOBELİRTEÇLERİN (BİYOMARKIR) ARAŞTIRILMASI Ahmed Mohammed Ali HAMMAD Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. M. Oktay GÜRKAN Bu çalışma, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Armut Bahçesi (AÜZF), Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Bahçesi ve Haymana Çiftliği nden alınan örnekler ile Bitki Koruma Bölümü bahçesinde kurulan denemeden elde edilen Collembola populasyonları ile yıllarında yürütülmüştür. Toprak altında bulunan arthropodların takım veya familyaları binoküler mikroskop ile incelenip, 13 farklı canlının bulunduğu belirlenirken, canlıların değişimlerinde Collembola takımı biyomarkır olarak kullanılmıştır. Haymana Çiftliği'ndeki farklı alanlarda genel olarak Collembola populasyonlarının diğer canlı organizmalardan daha yüksek olduğu görülmüştür. AÜZF Bitki Koruma Bölümü yapılan denemesinde Collembolaların diğer bazı arthropodalara göre Bordo bulamacı, Glyphosate, İmidacloprid ve Methiocarb gibi pestisit uygulanmalarına daha duyarlı olmuştur. Genel olarak Armut Bahçesi nden alınan örnekleri kontrolle karşılaştığımızda karboksilesteraz aktivitelerinin ve glutatyon- S-transferaz aktivitesinin yüksek olduğu tespit edilirken, mikrozomal esteraz ve asetilkolinesteraz (AChE) aktiviteleri kontrol grubunun armut örneklerinden oldukça yüksek olduğu görülmüştür. Kontrolün genel olarak Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası ndan alınan Collembola populasyonuna göre karboksilesteraz aktivitesinin yüksek, mikrozomal esteraz ve glutatyon-s-transferaz aktiviteleri kontrol grubunun, Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre daha düşükken, AChE aktivitesi bakımından istatistiki olarak bir fark saptanmamıştır. Bitki Koruma Bölümü Bahçesi ndeki deneme süresince uygulanan farklı ilaçların Collembola populasyonunda karboksilesteraz i

3 aktivitesinin kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu belirlenirken, kontrol grubunun AChE aktivitesinin Armut Bahçesi nden alınan örneklere göre daha yüksek, GST aktivitelerinin istatistiğinde herhangi bir fark bulunmamıştır. Bütün toplanan populasyonların farklı alanlardan karboksilesteraz bant dizilişlerinin poliakrilamid jel elekroforezi (PAGE) kullanılarak görüntülerinin değerlendirilmesi, bant desenlerinin koyu olma durumlarına ve kalınlıklarına bakılarak yapılmıştır. Yapılan bu araştırmada Collembola örneklerinin oluşturduğu hücrelerdeki DNA kırıkları ve kuyruk uzunluklarının sonuçları gösterilmiştir. Ekim sayfa Anahtar Kelimeler: Toprakta hedef dışı organizmalar, biyomarkır, Collembola, karboksilesteraz, GST, AChE, PAGE ve DNA hasarı ii

4 ABSTRACT Ph.D Thesis STUDİES ON ESTİMATE PESTİCİDE POLLUTİONS OF AGRİCULTURAL SOİL WİTH BİOMARKERS ON ARTHROPODS INDİCATORS Ahmed Mohammed Ali HAMMAD Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. M.Oktay GÜRKAN In this study, the samples collected from Ankara University Faculty of Agriculture pear garden, Haymana s Farm and trail designed at the Plant Protection Department of Ankara University demonstration field over two years. Fifteen different organisms were identified and Collembolan populations were used as a biomarker. In Haymana s Farm, the samples collected from different areas Collembolan populations were showed high significant difference when compared with other organisms. Pesticides like bordeaux mixture, glyphosate, Imidacloprid and methiocarb applied on trial, Collembolan populations showed a higher sensitivity when compared with some other organisms. Generally carboxylesterase and glutathione -S- tranferase for the collembolans samples collected from pear garden showed high activities when compared with their controls. In contrast, no significant differences observed of microsomal esterase and acetylcholine esterase s activities when compared with their controls. High activities of carboxylesterase were observed in control compared with wheat and maize Collembolan samples. In contrast, microsomal esterases and GST were showed low activities in control samples compared with wheat and maize fields but no significant differences observed in AChE activities among all different samples. Carboxylesterase in demonstration farm trial showed high activities when compared with control. In contrast, AChE activities for samples collected from pear garden showed low activities compared with control but statistically no significant differences in GST activities iii

5 between all samples. All population samples were characterized using polyacrylamide gel electrophoresis to determine the carboxylesterase banding patterns. Single cell gel electrophoresis or comet assay procedure was used to detect DNA damages in cells contaminated with various pesticides. October pages Key Words: soil non-target organisms, biomarker, Collembola, carboxylesterase, GST, AChE, PAGE and DNA damage iv

6 TEŞEKKÜR Tez hazırlama sürecinde beni yönlendiren, çalışmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve desteğini esirgemeyen, öğrencisi olmaktan onur ve gurur duyduğum danışman hocam Prof. Dr. M. Oktay GÜRKAN (A. Ü. Z. F. Bitki Koruma Bölümü) a Tez İzleme Komitesi nde bulunan ve bana her zaman yol gösteren, destek olan sayın hocalarım Prof. Dr. Şerife BAYRAM (A. Ü. Z. F. Bitki Koruma Bölümü) ve Prof. Dr. Ayten KARACA (A. Ü. Z. F. Toprak Bölümü) ya ve Tez Savunma Jürisi olarak katkılarını sunan Doç. Dr. Recep AY (Süleyman Demirel Üniversitesi, Z. F. Bitki Koruma Bölümü) ve Prof. Dr. Avni UĞUR a (A. Ü. Z. F. Bitki Koruma Bölümü) teşekkürü bir borç bilirim. Tez çalışmalarıma sağladığı destek ve yardımlardan dolayı bölüm başkanımız Prof. Dr. Sultan ÇOBANOĞLU na, Dr. Nurper GÜZ e ve tez yazma sürecimde, kontrol ve düzeltmeler yaparak yardımda bulunan Dr. Banu AVCIOĞLU, Aslı DAĞERİ, Didem SAĞLAM, Yağmur TÜRKMEN ve Ecem KONCA ya teşekkürlerimi sunarım. Türkiye de bulunduğum dönem boyunca burs desteği sağlayan Türk Milli Eğitim Bakanlığı na, Sudan Milli Eğitim Bakanlığı na; doktora eğitimim süresince beni sabırla bekleyen ve bana her türlü desteği sağlayan aileme; eşim Nawadir, kızım Azza ya teşekkür ederim. Ahmed Mohammed Ali HAMMAD Ankara, Eylül 2011 v

7 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... iii TEŞEKKÜRLER... v ŞEKİLLER DİZİNİ... ix ÇİZELGELER DİZİNİ... xi 1. GİRİŞ Toprak ve Pestisitler Toprak ekotoksikolojisi Detoksifikasyon Mekanizmaları Esterazlar Glutatyon S-Transferazlar (GST) Asetilkolinesteraz (AChE) Hücrelerde DNA hasarı ve DNA Komet Analizi KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Farklı alanlarda ilaç kullanılmış topraklardan alınmış örnekler Metod Çeşitli alanlardan alınan örnekler Bitki Koruma Bölümü nün bahçesindeki deneme Toprak yıkama yöntemi; Elekmetodu Toprak Özelliklerinin belirlenmesi Toprak reaksiyonu (ph) nun yöntemi Toprak Organik madde (%) ölçüm yöntemi Toprak nemi ölçüm yöntemi Collembola yetiştirme yöntemi Biyokimyasal Çalışmalar Protein Miktarının Belirlenmesi Karboksilesteraz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Mikrozomal esteraz enzim aktivitesinin belirlenmesi vi

8 Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ile Esteraz Enzimlerinin İncelenmesi Ornstein ve Davis (1964) Yöntemi Poliakrilamit Jel Elektroforez Hazırlanması Küçük delikli jel Büyük delikli jel Örneklerin Hazırlanması Glutatyon S-Transferaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Asetilkolinesteraz enzim aktivitesinin belirlenmesi Genotoksikolojik Çalışmalar Comet Assay Protokolü BULGULAR VE TARTIŞMA Deneme Parsellerinin Toprak Özellikleri Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nin toprak özelliklerinin belirlenmesi Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi ndeki toprak özelliklerinin belirlenmesi Haymana Çiftliği Buğday, Mısır tarlaları ve ilaç kullanılmamış alanlarda toprak özelliklerinin belirlenmesi Deneme Parselleri Toprak Canlıları Sayımları Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nde toprak canlılarının değişimleri Haymana Çiftliği Buğday ve Mısır Tarlaları toprak canlılarının eğişimleri Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde yapılan denemede toprak canlılarının pestisitlere karşı duyarlılığı Biyokimyasal Sonuçlar Karboksilesteraz aktivitesinin ölçüm sonuçları Mikrozomal esteraz aktivitesinin ölçüm sonuçları Glutatyon- S- transferaz aktivitesinin ölçüm sonuçları Asetilkolinesteraz aktivitesinin ölçüm sonuçları Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ile esteraz enzimlerinin incelenmesi vii

9 4.4 Genotoksikolojik Çalışmalar SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ viii

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 İnsektisit kimyasal sınıflarının detoksifikasyonuna etkili fizyolojik mekanizmalar 7 Sekil 1.2 Comet testi adımları Şekil 1.3 Comet testi sonuçları.. 13 Şekil 3.1Alpha-cypermethrin in açık formülü Şekil 3.2 Thiram ın açık formülü Şekil 3.3 Methomyl v in açık formülü Şekil 3.4 Prodigy 240 SC formülü Şekil 3.5 Thiamine nin formülü Şekil 3.6 Azadirachtin in açık formülü Şekil 3.7 Cyfluthrin in açık formülü Şekil 3.8 Kaolin WP nin açık formülü Şekil 3.9 Canlı sayımının yapıldığı petri kabı Şekil 3.10 Tez çalışması kapsamında denenen parselinin kurulduğu alan Şekil 3.11 Toprak elemek için elek düzeneği Şekil 3.12 Örnekleme toprağın yıkanması Şekil 3.13 Collembola yetiştirme kapları Şekil 3.14 Armut bahçesinden alınan Collembola örnekleri Şekil3.15 Haymana çiftlipinden alınan Collembola örnekleri(familya: Neanuridae) Şekil 4. 1 Farklı pestisitlerin Şekil 4.2 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin esteraz enzimlerinin PAGE deki görüntüsü (30 Haziran 2010) Şekil 4.3 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü. 93 Şekil 4.4 In-vitro denemesinden alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü Şekil 4.5 Bitki Koruma Bölümü ve Armut Bahçesi nden denemeye alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü ix

11 Şekil 4.6 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü Şekil 4.7 Bitki Koruma Bahçesi nden alınan Collembola örneklerinde Şekil 4.8 Armut Bahçesi nden alınan Collembola örneklerinde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçümü grafiği Şekil 4.9 Haymana Mısır Tarlası ndan alınan örneklerde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.10 Haymana Buğday Tarlası ndan alınan örneklerde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.11 Haymana ilaç uygulanmamış alandan alınan örneklerde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.12 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde kontrolden denemeye alınan örneklerde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.13 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan glyphosate örneklerinde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.14 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan bordo bulamacı örneklerinde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.15 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan imidacloprid örneklerinde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği Şekil 4.16 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan metyiokarb örneklerinde oluşan DNA hasarlarının comet testi ile görünümü ve ölçüm grafiği x

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1Bitki Koruma Bölümü Bahçesi toprak özellikleri Çizelge 4.2 Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi toprak özellikleri Çizelge 4.3 Haymana Çiftliği Buğday Tarlası Toprak Özellikleri Çizelge 4.4 Mısır tarlası, toprak özelliklerinin belirlenmesi Çizelge 4.5 Haymana ilaç kullanılmamış alanında, toprak özelliklerinin belirlenmesi Çizelge 4.6 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan örneklerden toprak canlılarının..48 Çizelge 4.7 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan Collembola populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.8 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan dipluraların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.9 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan proturaların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.10 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan crustacealerin populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.11 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan akarların populasyonlarındaki 52 değişimler... Çizelge 4.12 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan solucanların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.13 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan yalancı akreplerin populasyonlarındaki değişimler xi

13 Çizelge 4.14 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan örümceklerin populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.15 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan karıncaların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.16 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan diplopodaların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.17 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan chilopodaların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.18 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan dipteraların populasyonlarındaki değişimler Çizelge 4.19 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden collembola sayımı Çizelge 4.20 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden Dipluralarının sayımı Çizelge 4.21 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden proturaların sayımı Çizelge 4.22 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden crustaceaların sayımı Çizelge 4.23 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden akarların sayımı Çizelge 4.24 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden solucanların sayımı Çizelge 4.25 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden yalancı akreplerin sayımı Çizelge 4.26 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden örümceklerin sayımı xii

14 Çizelge 4.27 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden karıncaların sayımı Çizelge 4.28 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden Diplopodaların sayımı Çizelge 4.29 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden chilopodaların sayımı Çizelge 4.30 Haymana Çiftliğindeki topraktan alınan örneklerin coleopteralarının saymı Çizelge 4.31 Haymana Çiftliğindeki topraktan alınan örneklerin Dipteralarının saymı Çizelge 4.32 Bazı toprak omurgasızlarına (collembola, toprak solcanları, akarlar ve karıncalar) uygulanan dört farklı pestisitin (bordo bulamacı, glyphosate, methiocarb ve imidacloprid) etkisi Çizelge 4.33 Bazı toprak omurgasızları (collembola, toprak solcanları, akarlar, karıncalar) ile farklı örnekleme dönemlerinin (Mayıs, Haziran ve Ağustos, 2010) etkileşimi Çizelge 4.34 Deneme alanlarından alınan toprak örneklerinden izole edilen collembola populasyonlarının farklı örnekleme zamanı Çizelge 4.35 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi (mod/µl/µg protein ) Çizelge 4.36 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarı belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.37 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.38 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, derinlikler arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.40 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, mod/µl/µg protein (derinlik ve dönemler arasında). 71 xiii

15 Çizelge 4.41 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, derinlik arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.42 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, farklı derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.43 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesi Çizelge 4.44 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin derinlikler arasında karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesi Çizelge 4.45 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.46 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein). 74 Çizelge 4.47 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlik ve dönemler arasında mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.48 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.49 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlikler arasında mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.50 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin derinlik ve dönemler arasında mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi Çizelge 4.51 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi Çizelge 4.52 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (genel olarak) Çizelge 4.53 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) xiv

16 Çizelge 4.54 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.55 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.56 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.57 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi,derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.58 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.59 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlikler arasında Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.60 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.61 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin derinlik ve dönemler arasında Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.62 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.63 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Glutatyon- S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg Çizelge 4.64 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg rotein) xv

17 Çizelge 4.65 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.66 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.67 Armut Bahçesi nden alınan örneklerde Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.68 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.69 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlikler arasında Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.70 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.71 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.72 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.73 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik ve farklı dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.74 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Çizelge 4.75 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik arasında (mod/µl/µg protein) xvi

18 1. GİRİŞ 1.1 Toprak ve Pestisitler Toprak organizmalarının karasal ekosistemlerde önemli rolü vardır. Bitki koruma ürünlerinin toprak organizmalarına etkisi bilinmektedir ve bu ürünler organizmaların topraktaki işlevlerini de olumsuz olarak etkileyebilmektedirler. Fauna toprağın en önemli parçalarından birisidir. Toprak faunası birçok organik bileşiği barındırmasının yanı sıra, mikrobiyal aktivitenin kısmi olarak düzenlenmesinde ve toprağın ufalanmasında rol oynar. Bu rol, onların beslenme şekilleriyle de ilgilidir (saprofit, fitofag ya da avcı). Toprak faunası, toprak ve bitkiyi mikroorganizmalarla sıkı sıkıya birleştirir. Bunlar toprak ekosistemini anlamak için gerekli öğelerdir (Tomlin, 1975). Pestisitlerin kullanımıyla doğal düşmanların istenmeyen ölümü, gelişmiş etkin pestisit yönetiminde en önemli sorundur. Erken kullanılan çoğu pestisit, uygulandıkları alanlarda geniş yelpazeli ve genel böcek öldürücüdür. Hassas olan ürünlerde görülen yan etkiler, bu uygulamanın kaçınılmaz bir sonucudur. Birçok çalışma, pestisitlerin doğal düşmanlar üzerindeki etkisini araştırmaktadır; ancak pestisitlerin zararsız türler üzerindeki etkisiyle ilgili yapılan çalışmalar nispeten daha azdır (Moreby vd.1997). Bazı pestisitlerin kullanımından kaynaklanan yan etkiler, hedef dışı organizmalar üzerinde olumsuz sonuçlara neden olurlar. Topraktaki kirleticilerin çevreye etkilerini araştıran birçok girişim mevcuttur; bunlar özellikle pestisitlerin agroekosistemlere uygulanmalarıyla ilişkilidir. Kimyasal kirleticilerle ilgili daha kapsamlı holistik, hiyerarşik ve entegre olmuş tutumlara ihtiyaç vardır (Edwards vd., 1998, Edwards vd., 1996, Morgan ve Knacker 1994). Pestisitlerin çevrede yavaş bozunması ya da çiftçiler tarafından yanlış kullanımı su, toprak, hava ve ürünlerin kirlenmesine neden olur (Navalón vd. 2002). Çoğu kimyasal kirletici, toprağa doğrudan toksik etkilidir. Bu kirleticiler, toprak organizmalarının populasyonu ve topluluğu üzerinde büyük bir etki yapabilir (Edwards and Thompson 1973). 1

19 Çevremiz doğal hayata, bitki örtüsüne ve tarımsal üretime olumlu etkisi bulunan toprak arthropodlarının gelişmesine ve varlığına uygundur. Bazı pestisitlerin hedef alınmayan organizmalara olumsuz etkisi nedeniyle, uygulama yapmadan önce uygulanacak alanın ve çevresinin bilinmesi ve alanın uygulamaya uygun olması önemlidir. Türkiye de birçok ürünün üretimin sürdürülebilmesi, kullanılan pestisitin devamlılığına bağlıdır. Bu nedenle büyük miktarlarda kullanılan pestisitler, kara ve su yaşamına zarar vermektedir. Tarım ilaçları doğrudan toprak yüzeyine ve içine, bitki üzerine veya tohum ilaçlaması şeklinde tohumluk üzerine uygulanırlar. Genel olarak atılan ilacın, uygulama tekniği, bitkinin fenolojik durumu ve bitki sıklığına bağlı olarak % nin toprağa ulaştığı bildirilmektedir (Courshee 1960, Cilgi ve Jepson 1992). Modern uygulama teknikleri ile bu maddelerin sadece hedef organizmalara ulaştırılmaya çalışılmasına karşın; pestisitler sürüklenme, toprakta kalıntı etkileri gibi nedenlerle bazen hedef dışına çıkmaktadır. Bunun dışında yüzey akışı gibi bazı fiziksel olaylar nedeniyle çevrede yayılma eğilimi gösterirler. Tarım ilaçları, hedef dışına taşınsa da, taşınmasa da agroekosistemdeki ve bu sistemlere yakın ekosistemlerdeki canlılar bu kimyasallardan etkilenmektedirler. Günümüzde bitki koruma alanında kullanılan aktif maddelerin hedef canlılar üzerinde etkinliğini artıracak çalışmaların yanı sıra, bu aktif maddelerin doğal çevrede yarattığı riski belirlemeye yönelik araştırmalar da önem kazanmıştır. Buna bağlı olarak mücadelede kullanılabilecek yeni aktif madde sentezleme çalışmalarında, sentezlenecek aktif maddelerin ekotoksikolojik olarak en az risk taşıması çok daha önemli bir amaç haline gelmiştir. Bu risk ne kadar yüksek olursa çevrede uzun yıllar geri dönüşümü olmayan kirlenmeye neden olacağı bir gerçektir. Bugün Türkiye de ve dünyada ürün artışını sağlayabilmek için çeşitli zararlılarla mücadelede pestisitler kullanılmaktadır. Dünyada tarım ilacı üretimi 3 milyon ton civarındadır. Türkiye de ise yılda ortalama ton tarım ilacı formülasyonu üretilmektedir. Türkiye de 2002 yılı itibarıyla yaklaşık 2000 ruhsatlı ilaç olup bunlar 2

20 içerisinde yer alan aktif madde sayısı 386 dir, 20 adet karışım petisit ruhsatlı olup bunun %70 i fiili dolaşımdadır. Hektar başına tüketilen ilaç miktarı 1521 gr, aktif madde tüketimi ise 598 gr dır (TİSİT 2003). İnsektisitler yararlı böcekleri öldürerek, suda sürüklenme veya kaçma yoluyla geçiş yaparak ya da yabani hayvanlara temas etme ve yenme yoluyla vejetasyonu çökerterek çevreyi etkileme potansiyeline sahiptir. Bu potansiyel etkiler, uzun yıllar sonunda fark edilmiştir. İnsektisitlerin kullanımı, tüm dünyada kanunlar ve endüstri standartları tarafından dikkatli bir şekilde kontrol edilmeye çalışılmaktadır. Ayrıca zararlı böcekler, birçok insektisite karşı dirençli hale gelmektedir. Pestisitlerin sürekli kullanımı birçok diğer problemi de beraberinde getirmiştir. Bunlar: 1) Sağlık problemleri Çiftçiler, çiftlik çalışanları ve onların aileleri, seyirci kalanlar ve tüketiciler tehlikeli sentetik pestisitlere maruz kalmaktadır. 2) Sosyal ve ekonomik problemler Sentetik pestisitlerin kullanımı mali ve buna ek olarak kredi girdilerine bağımlılık yaratır. İnsektisit kullanımı çiftçi ailelerin ve kırsal toplulukların ekonomilerini olumsuz yönde etkileyerek borçlarının artmasına, buna bağlı olarak da topraklarını kaybetmelerine ve şehirlere göç etmelerine neden olur. Geleneksel (konvansiyonel) tarımda sentetik pestisitlerin kullanımı, yararlı organizmaların öldürülmesiyle bir bağımlılık döngüsü yaratır. Zararlı organizmalarda direnci artırarak ve yararlı organizmaların biyoçeşitliliğinde kayıplara neden olarak daha yeni ve daha pahalı pestisitler için ihtiyaç oluşturur. Ekin, tohum ve üretim sistemi seçimi açısından çiftçiler ve aileleri için seçenek azlığı, kimyasal pestisitlere bağımlılık yaratır. Pestisitler, tarım ekosistemini dengede tutan doğal fauna ve flora, biyoçeşitlilik, su kaynakları ve ekosistem üzerinde daha az olumsuz etkiye sahip hemen hemen bütün doğal habitatlarda bulunabilir (El Hasani vd. 2008). 3

21 1.1.1 Toprak ekotoksikolojisi Toprak, organizma topluluklarını barındıran önemli bir yaşam alanıdır. Toprakta meydana gelen kontaminasyon çoğunlukla pestisit uygulamaları ile yayılan kimyasal bileşikler, gübreleme, atık su geri dönüşümü ya da atmosferik çökelmeden kaynaklanır. Flora, fauna ve mikroorganizmalar doğrudan eylemle ya da başka faktörlerin birleşiminden etkilenebilir. Buna bağlı olarak biyoçeşitlilik değişebilir. Toprak verimliliği, tarım ürünleri, gıda dışı ürünler, yüzey suları ve yeraltı suları etkilenebilir. Geçirgen bir ortam olarak çok sınırlı bir işlevi olsa bile toprak, yeraltı sularının kirlenmesinde ya da uçucu kimyasal madde emisyonu açısından atmosferin kirlenmesinde önemli bir kaynak olabilir (Løkke ve van Gestel, 1998). Bu nedenle toprak kalitesini ve ksenobiyotiklerin etkilerini ölçmek için uygun test yöntemlerine duyulan ihtiyaç giderek artmaktadır. Diğerlerine kıyasla yeni bir bilim dalı olan toprak ekotoksikolojisinde uluslararası standartlarla tanımlanan ve rutin belirlemede toprak omurgasızlarıyla kullanılan Solucan Eisenia fetida (OECD, 1984; ISO, 1993), Enchytraeids ve Collembola Folsomia candida ile ilgili ölçümler (ISO, 1999) olmak üzere sadece üç standart biyoassay vardır: Öte yandan, OECD collembolaların ve birçok diğer organizmaların toprak kirliliği ile ilgili biyomarkör olarak kullanılması için ISO standartları geliştirilmektedir. Collembola türlerinin çoğu serin iklime sahip ülkelerde bulunsa da bunlara kuzey kutbundan güney kutbuna kadar dünyanın her tarafında rastlanır ve toprak faunasının en önemli unsurlarından birisini oluştururlar. Bazı türler topraktaki bitkisel artıkların humusa dönüştürülmesinde önemli rol oynar. Toprakta bulunan Collembola faunasının türleri ile miktarlarının saptanması suretiyle çeşitli toprakların karakterleri dahi tespit edilebilmektedir (Gisin, 1951). Collembolaların toprak ve besinler aracılığıyla pestisitler gibi kirleticilere maruz kalıp kalmadıkları yaşam parametreleri, davranışları incelenerek ve vücutlarındaki bazı biyokimyasallar ölçülerek belirlenebilir. Bu testler, organik ve inorganik pestisitlerin toksisitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek ve kirlenmiş toprakları iyileştirme amacıyla yapılan çalışmaların başarısını izlemek üzere biyoassay olarak kullanılmıştır (Fountain ve Hopkin, 2001). Bu maddelerin kullanılmasıyla ürün miktarında artışlar görülmektedir. Ancak bu tarım ilaçları suda, toprakta, meyve ve sebzeler üzerinde uzun süre bozulmadan kalarak çevre kirliğine neden olmakta ve dolayısıyla besin zinciri 4

22 yoluyla insanlara kadar ulaşabilen çeşitli zararlar oluşturmaktadır. Günümüzde, pestisitlerin birçoğu için toprakta bulunmasına izin verilecek sınır değerleri belirlenmiştir. Bu sınır değerlerin üzerindeki konsantrasyonlarda belirli canlı grupları ölmekte ve bazı canlı gruplarının da işlevlerinde gerileme olmaktadır. Pestisitler topraktaki canlı populasyonunun tür dağılımını da değiştirebilir; belirli türlerin yok olması nedeniyle rekabet eden türlerin sayısı artabilir; yok olan türleri besin kaynağı olarak kullanan doğal düşmanların populasyonlarının da azalmasına neden olabilirler. Bu nedenle pestisitlerin hedef dışındaki alanlarda hareketinin izlenmesi, özellikle yaban hayatın ve insan sağlığının nasıl bir riskle karşı karşıya kaldığının bilinmesi açısından önemlidir. Tüm bu gerçeklerden yola çıkarak yaptığımız çalışmanın temel hedefi, toprak altı zararlılarına karşı kullanılan bazı bitki koruma ürünlerin toprak içerisinde bulunan hedef dışı canlılara etkilerinin araştırılması olarak belirlenmiştir. Yaptığımız bu çalışma, pestisitlerin bazı toprak arthropodları üzerindeki etkilerinin belirlenmesini kapsamaktadır. Detoksifikasyon Mekanizmaları Detoksifikasyon mekanizmaları, insektisitlerin hedef bölgeye ulaşmadan parçalanması esasına dayanan mekanizmalardır. Yaşayan organizmalarda ksenobiotiklerin detoksifikasyonundan sorumlu enzimler olan esterazlar, oksidazlar ve glutatyon-s- Transferaz (GST) nin büyük multigen ailelerinin üyeleri tarafından kodlandığı bilinmektedir (Cygler vd. 1993) Esterazlar Esteraz enzimleri, feromon ve hormon metabolizması, sindirim sistemi ve sinir iletimi, üreme davranışı ve insektisitlere direnç gibi birçok mekanizmada rol oynamaktadır. Organofosfatlar esterazların inhibitörleri olarak bilinir. Esteraz enzimlerinin asetil esterazlar, aril esterazlar, karboksil esterazlar ve kolin esterazlar olmak üzere 4 sınıfı vardır. Bunlardan asetil esteraz enzimleri hiçbir inhibitörle etkileşmezler ve genellikle alifatik substratları tercih ederler. Aril esterazlar yalnızca sülfidril ayraçlarınca inhibe 5

23 edilir ve genellikle aromatik substratları tercih ederler. Karboksil esterazlar yalnız organofosfatlarca inhibe edilirler ve genellikle asetik asitten daha uzun alifatik esterleri tercih ederler. Kolin esterazlar, organofosfatlarca ve eserin sülfatlarca inhibe edilirler ve diğer alifatik ve aromatik esterler dışında kolinesterleri tercih ederler. Bu esteraz gruplarından karboksil ve kolin esterazlar organofosfat inhibisyonunda önemlidir. Karboksil/kolin esterazlar, aynı zamanda α/β hidrolazların da üyeleridir ve α/β ünitelerinde organize olmuş β tabakasından köken almışlardır (Oekeshott vd. 1993). Karboksil/kolin esteraz enzimleri organofosfat insektisitlerince tersinmez olarak inhibe edilir. Organofosfatlı insektisitlerin aktive olmuş okson formları bu enzimlerle tepkime gösterirler. Bu nedenle organofosfatlı insektisitler esteraz inhibitörleri olarak tanımlanır (Oekeshott vd. 1993). α Esteraz grubu genlerin tümü Drosophila melanogaster'de, çoğu D. buzzatii de bir kısmı da Musca domestica ve Lucilia cuprina da tespit edilmiştir (Oakeshott vd.1999). L. cuprina asetilkolinesteraz aminoasit sekansı D. melanogaster ile %85,3 ve M. domestica ile %92,4 oranında homoloji göstermektedir (Oakeshott vd. 1999). Böcekler yaşam döngüleri boyunca insanlar tarafından yapay olarak üretilen pestisitler (organik fosforlular, karbamatlılar, piretroitler vb.) veya bitkiler tarafından doğal olarak üretilen allelokimyasallar gibi toksinlere (ksenobiotik) maruz kalmaktadırlar. Böceklerin bu toksinlere karşı kendilerini korumak için geliştirdikleri detoksifikasyon mekanizmaları Şekil 1.1 de gösterilmektedir. Karboksilesteraz, P450, GST ve hidrolaz gibi bazı enzimler, insektisitlerin böceğin vücuduna girmesinin ardından bu kimyasalların zehirliliğini giderilmesini sağlamaktadır (Tsagkarakou vd. 2009). 6

24 Şekil 1.1 İnsektisit kimyasal sınıflarının detoksifikasyonuna etkili fizyolojik mekanizmalar (Brodgon ve McAllister, 1998). Kısaltmalar: Ache, (asetilkolin esteraz); kdr (Kinaz eklemek etki alanı reseptör), DDT (diklorodifenyltrikloroetan) ve IGR (Zararlı Gelişim Düzenleyicileri). Özellikle son 25 yıldır böceklerde insektisitlere karşı oluşan direncin mekanizmalarının belirlenmesinde biyokimyasal yöntemler oldukça yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Biyokimyasal çalışmaların invitro koşullarda yapılması ve sonucun daha kısa sürede alınması sebebiyle, invivoda yürütülen biyoassay çalışmalara göre daha avantajlı durumdadır. Biyokimyasal çalışmalar sonucunda direnç daha erken dönemde belirlenerek gerekli önlemler alınabilmektedir Glutatyon S-transferazlar (GST) Glutatyon S-transferaz lar, glutatyon sulfat (GSH) ile elektrofilik gruplar taşıyan bileşikler arasındaki konjugasyonu katalizleyen, çok fonksiyonlu faz II biyotransformasyon multigen enzim ailesinin üyeleridir (Hamed vd. 2003). Bu reaksiyonun sonucunda, bileşiğin hidrofilitesi artar ve molekülün lipid tabakası içerisindeki dağılımı ile hücre içi birikimi engellenmiş olur (Hudson vd. 1998). Enzimin suda çözünebilir formları, moleküler ağırlığı 25 kda olan alt ünitelerden oluşan dimerik yapılı proteinlerdir. Dimerik enzimin her alt ünitesi farklı iki fonksiyonel bölge içeren bir aktif merkeze sahiptir. Hidrofilik G bölgesi, fizyolojik substrat GSH ı 7

25 bağlarken komşu H bölgesi farklı yapıdaki elektrofilik substratların bağlanabilmesi için hidrofobik bir ortam sağlar. G bölgesi yüksek GSH spesifitesi nedeniyle bütün GST lerde oldukça benzerdir. GST ler arasında tamamen farklı yapıda olan H bölgesinin substrat bağlama kapasitesi ve çeşitliliği son derece değişkendir. GST ler; GSH + R-X GSR + HX şeklindeki genel bir reaksiyonu katalizlemektedirler. Enzimin fonksiyonu: 1. Aktif merkezine hem GSH hem de elektrofilik substratı bağlayarak GSH ile substratın etkileşimi sağlamak, 2. Glutatyonun sülfidril grubunu aktive ederek GSH ın elektrofilik substrat üzerindeki nükleofilik atağını sağlamaktır (Armstrong, 1997). Substratların elektrofilik fonksiyonel merkezleri karbon, nitrojen veya sülfür olabilmektedir. GSH ın sistein rezidüsü ile elektrofilik substrat arasında kurulan tiyoeter bağı genellikle daha az reaktif ve suda daha çok çözünebilir ürünlerin oluşumuyla sonuçlandığı için, GST reaksiyonları genellikle detoksifikasyon mekanizmalarında yer alır (Eaton ve Bammler, 1999). Glutatyon S-transferazlar; bitkiler ve hayvanlar alemi (hem omurgalılar ve hem omurgasızlarda) ve bakterilerde bulunur. Detoksifikasyonun yoğun olarak gerçekleştiği bölgelerde yüksek aktivite gösterirler ve endoplazmik retikulum membranı ile nükleustaki interkromatin bölgeye yerleşirler. Ancak enzimin en bol bulunan formları, homo ya da heterodimerik yapıdaki sitoplazmik GST lerdir. GST ler merkaptürik asit biyosentezinin başlangıç reaksiyonlarına aracılık etmektedirler. Merkaptürik asit biyosentezi başlangıçta GSH konjugatı ile başlayan ve sonra γ-gt tarafından glutamik asitin uzaklaştırılması ile sonuçlanan, sisteinilglisin konjugatının oluşumu ile devam eden birkaç basamaktan oluşmaktadır. Bu reaksiyonu glisinin uzaklaştırılması ile sisteinil S- konjugatının yani pre-merkaptürik asidin oluşumu izler. N-asetiltransferazlar tarafından sisteinil S-konjugatının asetilasyonu N- 8

26 asetil türevi olan merkaptürik asit oluşumu ile sonuçlanır (Leblanc ve Dauterman, 2001). Glutatyon S-transferazlar; çevre kirleticilerinden ilaçlara, karsinojenlerden pestisitlere kadar birçok bileşiği metabolize edebilirler. GST ile reaksiyona girecek pestisitlerin genel özellikleri; hidrofobik olmaları, elektrofilik bir atom çekirdeği içermeleri ve GSH ile enzimatik olmayan koşullarda reaksiyona girebilmeleridir Asetilkolinesteraz (AChE) Formülü CH 3 COOCH 2 CH 2 N+(CH 3 ) 3 olan asetilkolin, asetik asit ile kolinin esteridir. İlk kez 1914 yılında İngiliz bilimadamı Henry Hallet Dale tarafından tanımlanmıştır. Asetilkolinesteraz enzimi (AChE) sinirsel iletiminin kolinerjik sinapsta sonlanmasını sağlayan bir enzimdir. Bu enzim nörotransmitter olan asetilkolini hidrolize eder. Asetik asit ve kolin, AChE ni tek yönde engellemektedir. AChE nin engellenmesi, kolinerjik sinapsta asetilkolinin birikerek sinyal iletiminin engellenmesine neden olur. Bazı insektisitler asetilkolinesteraz enzimini inhibe ederler. Bunun sonucunda merkezi sinir sistemi, kaslar ve bezler sürekli olarak uyarılırlar (Cassanellia vd. 2006). Bir zararlıya karşı belirli bir pestisitin uzun süre kullanılması sonucunda, bu zararlı populasyonunda pestiside karşı direnç meydana gelir. Asetilkolin (ACh), arthropodların sinir ve nöromuskular sistemlerindeki başilica nörotransmitterdir (Kirby vd. 2000). ACh nin sentezi, yıkımı ve depolanması bütün kolinerjik nöronlarda benzerdir. Asetil koenzim A ile kolinden, kolin asetiltransferaz (ChAT) enzimin katalizlediği reaksiyon sonucunda tek bir adımda sentezlenir. Asetil Koenzim A + Kolin ChAT ACh = Koenzim A + H2O Reaksiyonda kullanılan asetil koenzim A nın büyük çoğunluğu, mitokondri iç membranında, glikolizis sırasında, pürivat dehidrojenaz enzimi tarafından oluşturularak ChAT nin bulunduğu sitoplazmaya taşınır. Bazı nöronlarda, kolinin de novo sentezi yapılmakla birlikte, merkezi sinir sisteminde, ACh sentezinde kullanılan kolinin üçte 9

27 biri diğer kaynaklardan sağlanır. Kolinin yaklaşık %35 ile %50 si, sinaps aralığında AChE tarafından yeniden oluşturulup, ACh sentezinde kullanılan kolinin yarısını içeren akson ucuna taşınır. Kolinesterazlar; ACh, bütirilkolin ve asetiltiyokoliniyodid gibi çeşitli kolin türlerinin ayrıştırılma reaksiyonlarını katalizleyen enzimlerdir. AChE ve bütirikolinesteraz (BchE; E.C ) en bilinen kolinesteraz enzimleridir. Bir adet AChE enzim molekülü dakikada 4 x 10 5 adet ACh molekülünü hidrolize eder ve 150 µs lik turnover (çevrim) süresi, onu en etkin hidrolitik enzim yapar (Chang ve Strichartz, 2005). AChE, ACh nin hidrolizinde görev alan aktif bölgesinde serin hidroksil grubu içerir ve bu bölge türler arasında farklı konfigürasyonlara sahiptir. Enzimin çeşitli inhibitörlere olan afinitesini de sağlayan aktif bölgedeki farklar, aynı bileşiğin teleost türleri arasındaki toksisite farklılığına neden olmaktadır (Carr ve Chambers, 2001). Yaygın olarak kullanılan insektisitler organik klorlular, organik fosforlular, karbamatlılar ve piretroitler olmak üzere 4 grupta toplanmaktadır. Organik fosforlular ve karbamatlılar grubundaki insektisitlerin asetilkolinesteraz (AChE) enzimini engelleyerek etkili oldukları bilinmektedir. Bu bileşikler sinir sistemindeki sinapsislerde elektriksel sinir uyarılarının iletimini bozarak böceğin ölümüne neden olmaktadırlar. Organik klorlular ve piretroidler sinir sistemi üzerinde etkili olmakla birlikte AChE bağlayıcısı değillerdir. Organik klorlular, sodyum kanallarındaki iyon geçişini engelleyerek sinirsel iletimi bozmakta ve böceğin ölümüne sebep olmaktadırlar (Uğurlu, 2001). Organofosfat (OP) ve karbamat bileşikleri, canlılarda öncelikle AChE yi inhibisyona uğratarak toksisite mekanizmalarını indüklemektedir. İnhibisyon, enzimin aktif bölgesindeki serin rezidüsü ile OP insektisit arasında kurulan kovalent bağ sonucunda nörotansmitterin doğal katabolizmasının engellenmesiyle gerçekleşir (Klaassen, 2001; Barr ve Needham, 2002). İnhibisyona bağlı olarak sinapslarda aşırı ACh birikimi sonucunda, nikotinik ve muskarinik reseptörlerin aktivasyonları artar ve kolinerjik 10

28 sistem sürekli uyarılır (Hazarika vd. 2003). AChE aktivitesindeki inhibitör etki, pestisitlerin aynı zamanda, sinir hücrelerindeki enerji metabolizması gibi önemli yaşamsal süreçleri de etkilediğini göstermektedir (Nath ve Kumar, 1999). Karbamatlı pestisitlerle gerçekleşen AChE inhibisyonu dönüşümlü olduğu halde, OP pestisitlerle gerçekleşen inhibisyon dönüşümsüzdür. AChE enziminin inhibisyonunun ölçülmesi, OP bileşikleriyle etkilenmenin belirlenmesinde kullanılan yararlı bir biyomarkördür (Adams, 2002). Yaygın olarak kullanılan böcek ilaçları içerisinde organofosfatlar ve karbamatlar başta gelir. Organofosfatlı insektisitler, sinir sisteminde özellikle asetilkolinesteraz üzerinde etki gösterirler. Asetilkolin sinir impulslarının sinapslardan geçişini kolaylaştıran bir nörotransmitter maddedir. Asetilkolin esteraz (AchE), böceklerdeki merkezi sinir sisteminin kolinergik synapsisinde neurotransmitter asetilkolini hidrolizler. Asetilkolin, AchE enzimi tarafından kolin ve asetik asite dönüştürülür. Organofosfatlar ve karbamatlar Ach in analoğu olarak çalışırlar (benzer yapısal formüle sahiptirler ve böylece reseptör ile aynı yerlerden bağ yapabilirler). AchE in aktif bölgesine bağlanırlar. Asetilkolin hidroliz olmasına rağmen insektisitler, enzim-substrat kompleksi olarak sabit kalırlar. Bu insektisitler asetilkolinesteraz inhibisyonuyla sinir impulslarının geçişini engeller ve asetilkolin reseptörlerinin uyuşmasına neden olurlar. Sinapsislerdeki asetilkolinin konsantrasyonundaki artış ve daha fazla uyarılmış merkezi sinir sistemi ölüme yol açabilir (Chen vd. 2001). 1.2 Hücrelerde DNA Hasarı ve DNA Comet Analizi Tek hücre jel elektroforezi veya DNA comet analizi, elektroforez sonucu jelde oluşan DNA bantlarının göçünün ölçülmesiyle tek hücre düzeyinde (Singh vd., 1988) DNA hasarını (tek çift zincir kırılması ve alkali labil alanları) araştırmaya yarayan bir yöntemdir. Comet ismi, DNA parçalarının, kırık zincirleri tarafından oluşan kuyruğuyla birlikte bir kuyruklu yıldıza benzemesi nedeniyle verilmiştir. Bu analiz son 10 yıldır yaygın olarak kullanılmakta ve (Tice, 1995; Fairbarn vd. 1995) bulaşık ortamlarda bir alet kullanılarak izlenmesi de dahil olmak üzere geniş bir potansiyel uygulama alanına sahiptir. Analiz, birkaç balık türünde (Nacci vd.1996; Belpaeme vd. 1996; Mitchelmore and Chipman, 1998) kırmızı kan hücreleri nükleotitlerinde başarıyla uygulanmaktadır. 11

29 Genotoksik ajanlara maruz kalan balıkların DNA sındaki hasar, alkali elektroforezden sonra DNA nın bir kuyruklu yıldıza benzer şekil almasıyla açıkça görünür. Yeni kimyasallar nedeniyle, ortamdaki toksik maddelerin varlığı her yıl artmaktadır. Artan bu kirlilik, ekosistemlerin yanı sıra hava, su ve toprak kalitesinin bozulmasına yol açmıştır. Aşırı tarımsal ve endüstriyel faaliyetler biyoçeşitliliği olumsuz yönde etkilemekte; insanlarda hastalık riskinin artmasının yanı sıra habitatlardaki türlerin hayatta kalmasını da tehdit etmektedir. Kimyasalların bazıları, örneğin pestisitler ve ağır metaller, hedef dışı türler için genotoksik olabilir; somatik veya eşey hücrelerine zarar verebilir. Ortama salınan veya ticari olarak kullanılan kimyasalların genotoksik potansiyellerinin, kirlenmiş habitatlardan örnek alarak ve piyasaya çıkarmadan önce zararın önceden tahmin edilmesinde ve risk değerlendirmelerinde yardımcı olan analiz yöntemleriyle değerlendirilmesi gerekmektedir. Comet analizi, bazı prokaryotik hücrelerin yanı sıra tekil olarak ökaryotik hücrelerde de onarım ve DNA hasarını değerlendirmek için hassas, basit, hızlı bir araç olarak kabul edilmektedir. İnsan epidemiyolojisinden genetik toksikolojiye kadar sıralanan farklı alanlarda uygulama bulmaktadır. Sekil 1.2 Comet testi adımları 12

30 Şekil 1.3 Comet testi sonuçları 0. Normal hücre, 1. Az hasarlı hücre, 2. Hasarlı olan hücre, 3. Çok hasarlı hücre, 4. Tamamen hasarlı olan hücre 13

31 2. KAYNAK ÖZETLERİ İlk sentetik pestisitler 1940 larda yapılmış ve artan gıda üretiminde büyük faydalar sağlamıştır. Pestisitlerin çevre ve insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri hakkındaki endişeler 1960 ların başında dile getirilmeye başlanmıştır (Carson, 1962). O zamandan beri pestisitlerin riskleri ve yararları üzerine olan tartışmalar sona ermemiştir. Araştırmanın büyük bir kısmı pestisitlerin çevre üzerindeki etkileri için yapılmıştır. Dünya çapında her yıl 2,5 milyon ton pestisit tarımsal ürünlere uygulanmaktadır. Doğrudan temasla içeri giren ya da hedef zararlılar tarafından tüketilen pestisit miktarı, uygulanan bu miktarın çok küçük bir yüzdesidir. Critchley (1972), yaptığı çalışmada patates tarlasında tiyonazinin toprağa uygulanmasından 8 hafta sonra Carabit sayısında önemli düşüşler tespit etmiş ve insektisitin kalıntı etkisinden dolayı bu olumsuzluğun patates hasatından sonra da görüldüğünü bildirmiştir. Vickerman ve Sunderland (1977), buğdaylarda afitlere karşı dimethoate ile yaptıkları çalışmada, ilaçlamadan bir hafta sonra akar populasyonlarında % 90 oranında düşüş tespit etmişler ve bu olumsuz etkinin ilaçlamadan 6 hafta sonra ile % 76 oranında devam ettiğini bildirmişlerdir. Matcham ve Hawkes (1985), yine buğdayda yaptıkları çalışmada afitlere karşı deltamethrin uygulaması sonucu carabit, staphylinid ve akar populasyonunda toplam % 30 oranında azalma olduğunu tespit etmişlerdir. Powell vd. (1985), yaptıkları çalışmada herbisitlerin, avcı larvaları için daha nemli bir habitat oluşturan yabancı otların ortadan kalkmasına sebep olduğundan, dolaylı olarak avcı populasyonlarında azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir. Agnello vd. (1986), bazı herbisitlerin avcılar doğrudan toksik etki gösterebildiği gibi deri değiştirme süresini uzattığını, yumurta üretimini ve canlılığı azalttığını ve repellent etki yaptığını saptamıştır. 14

32 Floate vd. (1989), yaptıkları çalışmada deltamethrin, dimethoate ve carbofuran ın carabit populasyonlarında sırasıyla %30, %73 ve % oranlarında ölümlere sebep olduğunu tespit etmişlerdir. Birçok çalışmada, uygulanan pestisitin hedef zararlıya ulaşma oranının %0,3 ten daha az olduğu bulunmuştur, yani %99.7 si doğada herhangi bir yere gitmektedir Tarımda pestisit kullanımının kaçınılmaz olması, hedef dışı organizmaları (insanlar dahil) bu kimyasallara maruz bırakmaktadır. Bazı türlerde, topluluklarda ve bir bütün olarak ekosistemlerde istenmeyen yan etkiler meydana gelebilir (Pimentel, 1995) li yılların sonundan itibaren; gübre, fosil yakıt ve zirai mücadele ilaçları gibi girdilerin azaltılmasına yönelik entegre tarla tarımı sistemlerine ciddi şekilde ilgi olmuştur (Holland ve ark, 1994). Konvansiyonel tarla tarımı sistemlerinde çiftçilerin belli bir pestisiti kullanmaya karar vermelerini etkileyen temel faktörler; zararlıya karşı beklenen tesir, bitkilere olan fitotoksite riski ve uygulama maliyetidir. Entegre tarımda, pestisitin çevresel etkisi dikkate alınması gereken dördüncü ana kriter olmalıdır. Sadece son birkaç yıl içinde, çiftçilere pestisitlerin çevresel zararlarını hesaplamalarına yardım etmek için metotlar teklif edilmiştir. Bir pestisitin çevresel etkisinin, maruz kalma derecesine (ayrışması ve çevrede kalan konsantrasyonu) ve toksikolojik içeriğine bağlı olduğuna dair fikir birliği vardır. Düzenleyici planlarındaki çevresel risk düzenlemeleri ilaca maruz kalma ve etkilerinin değerlendirilmesini içermektedir (Severn ve Ballard, 1990; Emans vd. 1992). Maruz kalmanın değerlendirilmesi, bir kimyasalın çevrede ayrışması anlayışını geliştirmeyi ve organizmaların maruz kalacağı tahmin edilen çevresel konsantrasyonun (PEC) hesaplanmasını içermektedir. Pestisitlerin etki şekli, biyoloji ve kimya gibi birçok alanı kapsayan ve pratikte birçok uygulaması olan yüksek derecede kompleks bir öğedir. İkinci Dünya Savaşı ndan sonra, DDT gibi birçok sentetik pestisit çıkmıştır. O zamanlarda, organizmalardaki biyokimyasal işlemlere yönelik bilgiler, pestisitlerin hedefe etki şekli ya da alımları, dağılımları ve doğada parçalanmalarını doğru bir şekilde anlaşılmasını mümkün kılmak için yeteri kadar açık değildi (Stenersen, 2004). 15

33 Pestisitlerin hedef dışı organizmalar üzerindeki kontaminasyonunun ve biyolojik etkilerini çalışmak için Jepson (1989) tarafından mekan-zamansal bir model geliştirilmiştir. Kronolojik sıralama, maruz kalma ve alım ile başlar. Bu, ilaçlama anında pestisit damlacıklarının alımıyla gerçekleşen doğrudan maruz kalma ile sonradan yüzeydeki kalıntılarla temas ya da bulaşık kusmuğun mideye alınmasıyla gerçekleşen dolaylı alım gibi doğrudan ve dolaylı öğeleri içerir. Sonrasında pestisitin etkileri, öldürücü ya da öldürücü olmayan zehirlilikle doğrudan veya yiyecek kaynaklarının tüketimiyle dolaylı olarak ortaya çıkar. Son aşama ise, uygulanan bölge içinde populasyonun orijinal yoğunluğuna döndüğü iyileşme safhasına denk gelir. Mısır böceklerinde geniş spektruma sahip bir piretroit insektisit olan deltametrinin hedef dışı etkisi Badji ve arkadaşları (2006) tarafından çalışılmıştır. Tropik bölgelerde başlıca mısır zararlısı olan sonbahar pamuk yaprak kurdunu kontrol etmek için bitkinin saçağı üzerine insektisit püskürtülmesiyle, bu kimyasalın toprağa ulaşarak epigeic arthropodları etkilemesi kaçınılmazdır. Bu arthropotların toprakta organik madde birikmesinde, ayrıştırıcı mikroorganizmaların faaliyetinde, toprak yapısı ve besin döngüsünde, toprak nematodları ve fungal bitki hastalıklarının kontrolünde ayrıca bitki kök gelişimini teşvik etmedeki işlevlerinden dolayı tropikal agro-ekosistemlerin oluşmasında önemli rolleri vardır. Benzer bir çalışma, organoklorin bir insektisit olan lindanın Afrika mısır agroekosistemlerindeki hedef dışı organizmalar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için Wiktelius ve arkadaşları tarafından 1999 da yürütülmüştür. Lindan ın; collembola sayısını %80 nin üzerinde, karınca sayısını %64 civarında, örümcek sayısını ise %53 azalttığı sonucuna varmışlardır. Başka bir bulgu ise lindanın, denemelerin %45 inden fazlasında organik madde parçalanmasını önemli derecede azalttığıdır. Arthropodlar toprakta yaşayan omurgasız faunasının temel öğesidir ve organik maddenin ayrışmasında önemli rol oynarlar (Benckiser 1997). Arthropodlar ekosistemdeki besin ağını değiştirirler. Bazı pestisitlerin, arthropod populasyonları üzerinde kısa vadeli etkiler ortaya koyarken diğerlerinin uzun vadeli etkileri vardır (Prasse 1985; Bamaszkiewicz 1993; Larink 1997). Pestisitlerin uygulandığı meyve bahçelerindeki toprak ve yaprak artığında yaşayan arthropodların üzerine ilacın etkisi 16

34 hakkında çok az şey bilinmektedir. Ancak Thomas ve Meats (1999), meyve bahçesindeki fauna üzerindeki pestisit etkisinin diğer tarım topraklarında görülenle benzer olduğunu rapor etmiştir. Pestisitler ve diğer kimyasal tarım ürünlerinin kullanımı zararlıları, patojenleri ve yabancı otları kontrol etmede yarar sağlamaları nedeniyle artmaktadır. Bu maddeler aşırı kullanım ve uygulama tekniklerine bağlı olarak hedef dışı sistemlerin önemli bir bulaşma kaynağını oluştururlar. Farklı çevresel matrislerin (örneğin su, toprak); ilacın sürüklenmesi, uçması, akması veya sızmasıyla bulaşması literatürde geniş olarak rapor edilmiştir (Cerejeira ve ark. 2003; Wilson ve Foos 2006; Tariq vd. 2007). Lannat (insektisit), Spasor (herbisit), Stam Novel Flo (herbisit) pestisitlerinin ve bunlarla bağlantılı Metomil, Glyphosate ve Propanil etken maddelerinin hedef dışı türler (sucul ve karasal) üzerindeki toksiteleri araştırılmaktadır. Son zamanlarda Avrupa da (EEC 1991) pestisit pazarlamasında yetkilendirme, hedef dışı karasal (EC 2002a) ve sucul (EC 2002b) organizmalar üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerin test edilmesini gerektirmektedir. Ek olarak, tahmin edilebilir ya da geçmişle ilgili bir Çevresel Risk Faktörü (ERA; Environmental Risk Agent) çerçevesinde çevresel toksite verisidir. Toprakta hayvanların mekansal dağılımı, hem dış (canlı ve cansız) hem de iç (topluluk yapısı, sıklığı, bireysel özellikler) faktörlere bağlı olan populasyonlarının önemli bir parametresidir. Toprak kirliliği, topraktaki hayvan komünitelerinin yapısını etkileyen önemli faktörlerden biridir. Birçok yayın (Robertson vd.1993; Ginocchio vd. 2004; Gongalsky vd.2005), hem kirleticilerin hem de toprak biyotasındaki dağılımın heterojenliğini tarif eden jeostatik bilimine önemli oranda dayalıdır. Mekansal temelli verilere dayalı bu yöntem; toprak ekolojisinde geniş olarak uygulanır (Ettema ve Wardle, 2002). Bu yöntem, böcekler ve diğer organizmalar üzerinde kirleticilerin etkisini çalışmak için yeni yaklaşımları temsil etmektedir. Yaygın detoksifikasyon enzimleri olarak bilinen genel esterazlar, organofosfat ve piretroit gibi pestisitleri (Anspaugh vd. 1995; Valles, 1998) parçalama yeteneğine sahiptir. Spesifik olarak bazı böceklerin, organofosfat direncinde karboksilesteraz üretimi vardır. 17

35 Organizmalar toksik bileşiklerin etkilerinden korunmak için bir dizi hücresel mekanizma ortaya koyar. Bazı mekanizmalar detoksifikasyon enzimlerinin [esterazlar ve glutatyon S-transferaz (GST)] aktivitesinde artış içerir. Bazı eklembacaklılarda (Kozlowsky vd. 2009) genel olarak gözlenen mideye alınmış toksinlerin düşük olması, bu durumla açıklanabilmektedir. Bununla birlikte, eğer taşıyıcı protein (örneğin, P- glikoprotein) yüksek bir dozda insektiside maruz kalırsa hücrelerde yabancı bileşik birikimi meydana gelebilir. Organizmalar daha sonra, detoksifikasyon enzimleri gibi fonksiyon gösteren metabolik enzimler aracılığıyla ikinci bir hat savunmaya sahip olurlar. Sitokrom P450 ile bağlı enzimler (örneğin, 7-etoksiyresorufin-o-deetilaz (EROD) faz I) aracılığıyla olan oksidasyon süreçleri ve konjugasyon reaksiyonları (örneğin, glutatyon S-transferaz (GST) faz II), yabancı kimyasalı hücreden kolaylıkla çıkarılabileceği daha çözülebilir bir bileşene dönüştürmektedir (Brattsten, 1992; Epel, 1998; Bard, 2000). Karboksilesterazlar yaygın bir esteraz grubudur (Barron vd. 1999) ve bazı tip insektisitlerin detoksifikasyonunda iki temel mekanizmayla rol alırlar: i) CB ve bazı OP lerde varolan karboksilik esterlerin hidrolizi ile ii) asetilkolinesterazın aktif kısmına etkili bir şekilde ulaşan insektisit miktarının azaltılmasını kendilerinin engellemesi ile (Jokanoviç 2001). Serin içeren bu enzimler, ya OP ile fosforilasyona uğrar ya da CB ile karbamilasyon edilir ve böylece baskılanmış olur. Glutatyon-S-transferaz (GST), sitokrom P450 monooksigenaz (CYP) ve karboksiesteraz (CE) gibi detoksifikasyon enzimlerinin gelişmiş aktivitesinin, insektisit duyarlılığını uyaran birçok durum için sorumlu olduğu kanıtlanmıştır (Wilson 2001). Mikrozomal oksidazlar, glutatyon-s-transferaz ve hidrolazlar gibi detoksifikasyon enzimleri böceklerdeki insektisitlere karşı dayanıklılık metabolizmasında önemli rol oynarlar (Agosin, 1985 ; Yu, 2004). Mikrozomal oksidazların indüksiyonu daha önce varolan enzimin aktivasyonundan veya parçalanma oranındaki engelden ziyade, de novo protein sentezi gibi yeni enzimlerin sentezinden kaynaklanmaktadır (Agosin, 1985). 18

36 Detoksifikasyon enzimlerinin yapılmasının amacı toksik maddelerin metabolizmasını gerçekleştirmektir. Böceklerde mikrozomal oksidazlar; DDT ve siklodieneler gibi insektisitleri, 20- hidroksiekdison ve juvenil hormon gibi böcek hormonları ve büyüme düzenleyicilerini, fenobarbital, 3-metilkolantren, bütil hidroksitoluen ve trifenil fosfat gibi uyuşturucuları, terpenoitindoller, flavanoitler ve furanokoumarinler gibi allelo kimyasalları içeren çeşitli organik kimyasallar tarafından teşvik edilebilir. Diğer taraftan, GST ler, DDT ve dieldrin gibi insektisitleri, piperonil bütoksit gibi metilendioksifenil bileşiklerini, fenobarbital gibi barbitüratları, ksantotoksin ve indol-3- asetonitril gibi allelo kimyasalları içeren çeşitli ksenobiotikler tarafından teşvik edilirler. Herbisitlerin detoksifikasyon enzimlerini teşvik etmesi hakkında çok az şey bilinmektedir. Son zamanlarda, atrazinin böceklerde mikrozomal oksidazları teşvik ettiği gösterilmiştir (Egaas vd.1993 ; Miota vd. 2000). Afit ve diğer böceklerdeki karboksil esterazlar; hem organofosfatlar gibi bitki ikincil metabolitlerine hem de diğer insan yapımı insektisitlere karşı hidroliz olurlar (Field, 2000; Li ve arkadaşları, 2007). Karboksilesteraz süperfamilyasının diğer üyeleri önemli nörolojik ve gelişimsel fonksiyonlara sahiptir ya da feromon süreci içinde yer alırlar (Oakeshott vd. 1999). Her ökaryotik organizmada bulunan GST enzimleri, birleştirici ksenobiotikler ve indirgenmiş glutatyonların tiyol grubuna karşı içsel aktive olan bileşiklerle fonksiyon göstererek böylece onların daha hızlı salgılanmalarını ya da parçalanmalarını sağlarlar Organofosfat ve karbamat insektisitler kolinesteraz inhibitörleri olarak bilinirler. Bunlar, ACh mesajını sinaps karşısına taşıdıktan sonra onu parçalamaktan sorumlu olan enzime bağlanırlar. Bir böcek kolinesteraz inhibitörüden zehirlendiğinde, kolinesteraz ACh yi parçalamaya yardım etmeye uygun durumda değildir ve sinir ileticisi nöronun yangına neden olması için devam eder ya da elektriksel yükünü gönderir. Bu sinir sisteminin aşırı uyarılmasına neden olur ve böcek ölür (Li vd. 2007). 19

37 Kimyasalların sağlık risklerinin değerlendirilmesi, tek bir temas yoluyla tek bir kimyasal bileşenin potansiyel riskinin değerlendirilmesiyle sınırlıdır (National Research Council 1983). Son 15 yıl içinde, kimyasal karışımların biyolojik etkileri ve çeşitli pestisitlerin endokrin sistemini bozma özelliği üzerinde yoğunlaşılmıştır. Yakın zamanda yapılan birçok çalışma sonucunda, atrazin gibi belirli herbisitler, su tatarcığı yani Chironomus tentans daki belirli OP lerinin toksitesini sinerjitik ya da antagonistik olarak etkileyebilirler (Belden ve Lydy 2000; Anderson ve Lydy, 200; Anderson ve Zhu, 2004). Atrazinle ikili komibasyonlarında belirli OP lerin yükselen toksitesi, artan AChE inhibasyonuna ve artan sitokrom P450 monooksijenaz (P450) aktivitesiyle ilişkilidir (Anderson ve Zhu, 2004; Rakotondravelo vd. 2006). Yükseltilmiş P450 aktivitesinin, belirli OP lerin artan antikolinesteraz aktivitesiyle ilgili ya da sülfoksit analoglarının içine oksidatif aktivitesini geliştirmekten sorumlu olduğu görülür. OP lerin toksitesi ayrıca, tatarcıklardaki atrazin kaynaklı GST değişiklikleri ve genel esteraz (GE) aktiviteleri ile modifiye olabilir (Rakotondravelo vd. 2006). Bununla birlikte, chloroacetanilide herbisitlerin (örneğin; alachlor ve metolachlor) OP ler ile bir arada bulunmasının hedef dışı organizmlara karşı sinerjitik ya da antogonistik toksiteyle sonuçlanıp sonuçlanmayacağı bilinmemektedir. Young ve McMillian (1979), Georgia Tifton daki bir mısır tarlasından toplanan yer solucanı populasyonunun karbarile karşı dayanıklı olduğunu ilk rapor eden kişilerdir. McCord ve Yu (1987), bu straindeki biyokimyasal dayanıklılığın temel olarak, karbarilin mikrozomal oksidazlar ile detoksifikasyonu tarafından geliştirildiğini göstermişlerdir. Dayanıklılığın, kütikular penetrasyon ve asetilkolinesteraz yoğunluğu ile ilişkili olmadığı bulunmuştur. Kuzey, orta ve güney Florida daki mısır tarlalarından toplanan sonbahar pamuk yaprak kurdu ırklarının; çeşitli karbamatlı, organik fosforlu, piretroitli insektisitlere karşı dayanıklı oluşu ayrıca gözlenmiştir (Yu, 1991; Yu, 1992). Detoksifikasyon enzim deneyleri; mikrozomal oksidazlar, GST ler ve hidrolazların aktivitelerinin sahadaki ırklarda hassas ırklarda olduğundan daha yüksek olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bunun yanında, asetilkolinesterazların diklorvos ve karbaril tarafından inhibasyonu için binoleküler hız değişimi hassas ırklarda sahadaki ırklarda 20

38 olandan 3 ila 8 kat daha fazladır. Kuzeyli ırkda karbarilin kütikular penetrasyonunda hiçbir farklılık yoktur. Tarladaki ırklarda gözlenen geniş insektisit dayanıkılığı spektrumları; bu insektisitlerin mikrozomal oksidazlar, GST ler ve esterazlar tarafından artan detoksifikasyonunu, duyarsız asetilkolinesterazlar gibi hedef kısmı duyarsızlığını içeren çoklu dayanıklılık mekanizmalarına bağlı olduğu sonucuna varılmıştır (Yu, 1991; Yu, 1992). Yer solucanlarında biyoizlemesi yapılan kirleticilerin izlenmesinde kolinesterazlar (ChE ler), pestisitler için biyomarkör olarak ön görülmektedir. Çünkü ChE ler, organik fosforlu ve karbamatlı pestisitler için anahtar hedeftirler. Bu kapsamda, Eisenia fetida ile çok sayıda deney yürütülmüştür (Stenersen, 1979a, Stenersen, 1979b, Stenersen vd. 1992). Diğer taraftan, ağır metallerin yer solucanı E. fetida daki ChE aktivitesine etkisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Labrot ve arkadaşları (1996) yakın zamanda, E. andrei nin asetilkolinesteraz aktivitesinin in vitro ve in vivo ortamlarda çelik ve uranyuma maruz kaldıktan sonra düştüğünü göstermişlerdir. Üstelik spesifik olmayan esterazlar, ester ve fosfatların bağlantı bölgesine saldırarak pestisit metabolizmasında önemli bir rol oynarlar (Hassall, 1982). Çelik ve kadmiyumun, E. fetida daki bu aktiviteler üzerindeki etkileri hakkında hiçbirşey bilinmemektedir. Ostling and Johanson (1984) Comet analizi veya tek hücre jel elektroforezi gibi bilinen bir mikrojel elektroforez tekniğini kullanılarak hücrelerde DNA hasarını ilk ölçenlerdir. Ancak, kullanılan nötr koşullar sadece DNA çift sarmal kırılmalarını tespit etmeye izin vermektedir. Daha sonra, Singh et al (1988) alkali koşullar altında uyarladığı analizini hem çift hem de tek DNA sarmalında deneyerek, alkali değişim alanındaki DNA kırılmalarını görmüştür. Comet analizi, toprak canlıları üzerine uygulanarak kara ekosistemlerinde genotoksik bileşiklerin tespit edilmesi ve izlenmesi için değerli bir araçtır (Salagovic vd., 1996; Zang vd., 2000). Solucanlar ve diğer omurgasızlar toprakta yaşadıklarından dolayı, toprakta bulunan potansiyel genotoksik bulaşıklık için iyi birer indikatördürler. Toprak kirliliğinin bir göstergesi olarak çeşitli kimyasallarla bulaşık topraklardan alınan toprak solcanı (Eisenia foetida) nında coelomic lencocytes (colomocytes) in görülen DNA hasarından, kimyasalın dozunun sorumluğu olduğunu göstermiştir. Solcanların (E. 21

39 foetida) kirli kömür alanından alınan toprağa, sanayi artıklarıyla kirlenmiş alanlara (Xiao vd. 2006) ve kirli nehirlerden alınan çökelti örneklerine maruz bırakıldığında; coelomocyte lerindeki (Salagovic vd. 1996) DNA hasarının yükseldiği gösterilmiştir (Rajaguru vd, 2003). E. foetida nın (Bustos vd. 2002) sperm hücrelerindeki parathionun DNA sarmal kırılmaları oluşturduğu saptanmıştır. Aynı tür üzerinde doz-etki ilişkisi, imidacloprid ve RH-5849 gibi 2 pestisitte de gösterilmiştir (Zang vd. 2000). Bu çalışmalar, pestisitlerin hedef alınmayan türleri de olumsuz olarak etkilediğini göstermektedir. Laboratuvar koşullarında nikelklorürün, hayvanların bulunduğu alandaki yapay toprak suyu veya sığır gübresi substratlarına maruz bırakılan coelomocytes ana kültüründe pestisitlerden kaynaklanan DNA sarmal kırılmalarını arttırdığı gösterilmiştir (Reinecke and Reinecke 2004). Coelomocytes lerin alt kümeleri olan Eleocyteler (chloragocytes, yağ ve glikojin metabolizm yapan hücreler) de, in vitro ve invivo koşulları altında DNA sarmal kırılmalarının arttığını gösterilmiştir (Di Marzio vd. 2005). Bir diğer solucan, Aporrectodea longa (Ude), B(a)P ve/veya lindane katılmış toprak örneğine maruz kaldığında, bağırsak hücrelerinin genotoksikant etkiye karşı mide hücrelerinden daha hassas olduğunu göstermiştir (Martin vd. 2005). Fourie vd. (2007) kalsiyum sülfatın subletal konsantrasyonunu belirmek üzere yaptığı çalışmada 5 solcan türü (Amynthas diffringens, Aporrectodea caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Eisenia foetida ve Microchaetus benhami) kullanmış; E. foetida da ve ardından D. rubidus ve A. caliginos ta önemli derecede DNA hasarı tespit etmiştir. Çalışmada çevrede bulunan türlerin duyarlılık farkı ve genotoksisite risk değerlendirilmesi üzerine etkisi saptanmıştır. Ostling ve Johanson (1984) comet analizi veya tek hücre jel elektoroforez tekniği (SCGE) olarak bilinen mikrojel elektroforezi kullanarak hücrelerdeki DNA hasarını belirlemiştir. Ancak nötr koşullarda sadece çift sarmal kırılmalarının belirlenmesinde kullanmışlardır. Daha sonra Singh vd. 1988), daha hassas versiyonu olan alkali ortama uyarladıkları bu analizle hem çift sarmal hem de tek sarmal DNA kırılmalarına ek olarak; düzensiz alkali alanlarda DNA iplikçik kırılmalarını da değerlendirmişlerdir. Daha sonra, bu analizin çeşitli adımları geliştirilerek (liziz, elektroforez) farklı 22

40 hücrelerin çeşitli hasarlarının tespiti için uygun hale getirilmiştir (Collins, 2004, Speit ; Hartmann, 2005). Hem nicelik hem de nitelik bakımından tek hücre populasyonlarındaki DNA hasarını ve onarımını tespit eden bu analiz; şu anda basit, çok yönlü, hızlı, hassas ve yaygın olarak kullanılmaktadır (Olive ve Banath, 2006). Comet analizinde bazı DNA lezyonlarındaki, DNA çapraz linki (örneğin thymidine dimmers) gibi hasarlar ve oksidatif DNA hasarı özel lezyon antikorları veya spesifik DNA onarım enzimleri kullanılarak da değerlendirilebilir. Bu yöntem temel DNA hasarı ve onarımı çalışmalarında ve genotoksisite testinde (Moller 2005) ve insan biyoizlenmesinde (Kassie vd ; Moller, 2006a) değerli bir araç olarak geniş alanlarda kabul görmüştür (Speit ve Hartmann, 2006). Fourie ve ark. (2007), 5 toprak solucanı türünü (Amynthas diffringens, Aporrectodea caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Eisenia foetida and Microchaetus benhami) kullarak kadmium sülfatın subletal konsantrasyonunun genotoksisite çalışmasında DNA hasarı belirgin şekilde E. foetida da göstermiştir. Bunu D. rubidus ve A. caliginosa takip etmiştir. Çalışma, çevrede bulunan türlerin hassasiyetinde farklılıkların olduğunu ve genotoksisite risk değerlendirmesinin etkisinin bulunduğunu göstermiştir. Bu nedenle, belirli türler üzerinde olumsuz etkilerin azaltılması için çevrenin izlenerek, gözlem altında tutulması gerekmektedir. 23

41 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmanın ana materyalini Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Armut Bahçesi (AÜZF), Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Bahçesi ve Haymana Çiftliği nden (buğday tarlası, mısır tarlası ve pestisit uygulanmamış alan) alınan örnekler ile Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde yapılan denemeden elde edilen örnekler oluşturmaktadır. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi ndeki Armut Bahçesi ndeki denemelerde fungusit olarak Bordo bulamacı %2 (w/v) ve Pomarsol forte WP 80; insektisit olarak Methomyl (karbamatlı), Prodigy 240 SC, Fastac 100 EC (piretroit) ve Decis 2.5 EC (sentetik piretroit); tohum olarak (Haymana da bulunan armut bahçesinde) Pyrinex 25 WP, Gaocho (imidacloprid) ve son olarak çeşitli kimyasallar (Kaolin, Thiamine, Laser, Neem) farklı mevsimlerde uygulanmıştır. Bitki Koruma Bölümü ndeki deneme parseline, Glyphosate (herbisit), Bordo bulamacı (fungusit), Imidacloprid (Neonicotinoid) ve Methiocarb (karbamatlı) ilaçları yılda iki defa önerilen tarla dozunda uygulanmıştır. Biyokimyasal çalışmalarda, santrifüj tüpüne uyan ezici çubuklar, soğutmalı santrifüj, tek ve çok kanallı mikropipetler, whatman 1 nolu kağıt, manyetik karıştırıcı, 96 kuyulu ve düz tabanlı mikroplakalar, UV spektrofotometre, GSH, CDNB (1-chloro-2,4- dinitrobenzene), soğutmalı vertikal elektroforez sistemi (Biorad), vortex, 80 C lik derin dondurucu, Biorad marka elektroforez seti (Pharmasia GE 2/4), VERSAmax Kinetik Mikroplate Reader (Kinetik mikroplaka okuyucu) (Molecular Devices), dijital fotoğraf makinesi, hassas terazi (Sartorius) ve değişik cam ve plastik malzemeler gibi materyaller kullanılmıştır. Kimyasal malzeme olarak 100 mm α naftil asetat, fast blue RR, Bradford Reagent, sodyum dihidrojenfosfat dihidrat (NaH 2 PO 4.2H 2 O), disodyum hidrojen ortofosfat 24

42 (Na 2 HPO 4.12H 2 O), potasyum dihidrojen fosfat dihidrat (KH 2 PO 4.2H 2 O), tris-baz, trishidroklorik asit (tris-hcl), glutathione (GSH), 1-kloro-2,4- dinitrobenzen (CDNB), 1,2- dikloro-4-nitrobenzen (DCNB), 5,5-ditiobis (2-nitro-benzoic acid) (DTNB), asetiyokolin iodid (ATCHI), potasyum klorit(kcl), etilendiamin tetraasetikasit (EDTA), sükroz, temed (N,N,N,N -tetrametiletilendiamin), amonyumpersülfat, akrilamid, N, N - metilen bis akrilamid, amonyumpersülfat, bromokrezolpurple, triton X-100, glisin, riboflavin, n-bütanol ve asetik asit kullanılmıştır. Genotoksikoloji çalışmalarda, dimetilsülfoksit (DMSO), EDTA, etidyum bromit, fosfat buffer saline (PBS), sodyum klorit (NaCl), sodyum hidroksit (NaOH), triton X-100, Trizma Base, etanol, normal melting agarose (NMA), ve low melting point agarose (LMPA) kimyasal olarak kullanılmıştır. Lam, lamel, mikrosantrifüj tüp, mikropipetler ve uçları, yatay jel elektroforez cihazi, mikro jel elektroforez lamlar, floresanmikroskop ve lamlar kullanılmıştır. Collembola yetiştirme calışmalarında ise, kaplar, Kalsiyum sülfat (CaSO 4 ), aktive kül, ekmek mayasi, distile su ve nemlendirici materyaller kullanılmıştır Farklı alanlarda ilaç kullanılmış topraklardan alınmış örnekler Tarım yapılan alanlarla, tarım yapılmayan alanlar arasındaki farklılıkları belirlemek amacıyla AÜZF Bahçe Bitkileri Bölümü armut bahçesinden ve Haymana Uygulama Çiftliği mısır ve buğday tarlalarından periyodik olarak alınan örneklerde çalışmalar yürütülmüştür. AÜZF Armut Bahçesi nde kullanılmış olan kimyasallardan birisi, Bordo bulamacıdır; patojenlere karşı esas toksik madde olan bakır iyonlarını içeren ve asit karakterli bakırın ph sını nötrleştirerek, fitotoksik etkiyi gidermek amacıyla kireç katılarak kullanılan ve kolay hazırlanabilen bir fungusittir. Bu iyonlar fungus sporlarının üzerinde etkilidir ve fungusun çimlenmesini engellemektedir. 25

43 Bu ilaç fungus enfeksiyonuna karşı bağlarda, patates küfü, şeftali yaprak kıvırcıklığı ve elma kabuğundaki hastalıkları engellenmek için geniş ölçüde kullanılmaktadır. Bordo bulamacı armut bahçesinde yılda bir defa kasım ayında kullanılmıştır. Diğer bir kimyasal ise, Fastac 100 EC dir[(kimyasal ismi; alpha-cypermethrin), IUPAC ismi; (S)-a-cyano-3-phenoxybenzyl (1R,3R)-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2- dimethylcyclopropanecarboxylate and (R) -a-cyano-3-phenoxybenzyl (1S,3S)-3-(2,2- dichlorovinyl) -2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate)] (Şekil 3.1) Sistemik olmayan bir insektisittir. Çok az dozda bile, vücuda teması halinde sindirim sistemini, periferal ve merkez sinir sistemini etkileyen bir piretroittir. Geniş ölçüde farklı sebze ve meyve tarlasında, emici ve çiğneyici ağız yapısına sahip böceklerin mücadelesinde kullanılabilmektedir. Fastac 100 EC, armut bahçesinde yılda bir sefer Mayıs ayında kullanılmıştır. Şekil 3.1 Alpha-cypermethrin in açık formülü Çalışmada kullanılan diğer kimyasal ise, Pomarsol Forte 80 WP dir [(Kimyasal ismi; dimethylcarbamothioylsulfanyl N,N-dimethylcarbamodithioate), Kimyasal formülü; C 6 H 12 N 2 S 4, Ürünün Etken Maddesi; THIRAM] (Şekil 3.2 ). Şeftalide yaprak delen; monilya, elma ve armutta karaleke, kayısı, kiraz, monilya ve erikte cep hastalığı; soğanda sürme; nohut, kavun ve karpuzda antraknoz; sebze fidelerinde çökerten; fındıkta yediuyur; fidan ve omcalarda, tarla tavşanı ve tütün fidelerinde çökerten, 26

44 şekrepancarında kök boğazı yanıklığı alanlarında kullanılan bir fungusittir. Tez çalışması kapsamında armut bahçesinde yılda bir sefer Mayıs ayında kullanılmıştır. Şekil 3.2 Thiram ın açık formülü Çalışmada kullanılan bir diğer kimyasal Methomyl dir (Genel ismi; Methomyl, IUPAC ismi; S-methyl N-(methylcarbamoyloxy) thioacetimidate, kimyasal formülü; C 5 H 10 N 2 O 2 S) (Şekil 3.3) yılında EPA tarafından kaydedilmiştir. Yüksek toksisiteye sahip olup vücuda temas ettiğinde sindirim sistemini etkileyen, kolinesterazı inhibe eden, geniş ölçüde farklı ürünlerde kullanılan, örneğin; organofosforlu pestisitlere karşı gelişmiş dirence sahip zararlıları etkileyen, karbamatlı bir insektisittir. Tez çalışması kapsamında armut bahçesinde yılda bir defa Haziran ayında kullanılmıştır. Şekil 3.3 Methomyl v in açık formülü 27

45 Prodigy 240 SC ise (Kimyasal ismi; methoxyfenozide, IUPAC ismi; N-tert-butyl-N -(3- methoxy-o-toluoyl)-3,5-xylohydrazide, kimyasal formülü; C 22 H 28 N 2 O 3 ) deri değiştirme hormonunu taklit eden bir insektisittir (Şekil 3.4). Tez çalışması kapsamında armut bahçesinde yılın Haziran ve Temmuz aylarında kullanılmıştır. Şekil 3.4 Prodigy 240 SC formülü Thiamine, renksiz bileşik yapıda, kimyasal formülü; C 12 H 17 N 4 OS, su ile çözünebilir bir vitamindir. (Mahan vd. 2000) (Şekil 3.5).. Şekil 3.5 Thiamine nin formülü Neem yağı, [IUPAC ismi; dimethyl (2aR,3S,4S,4aR,5S,7aS,8S,10R,10aS,10bR)-10- acetoxy-3,5-dihydroxy-4-[(1ar,2s,3as,6as,7s,7as)-6a-hydroxy-7a-methyl-3a,6a,7,7atetrahydro-2,7-methanofuro [2,3-b] oxireno[e]oxepin-1a(2h)-yl]-4-methyl-8-{[(2e)-2- methylbut-2-enoyl]oxy}octahydro-1h-naphtho[1,8a-c:4,5-b c ]difuran-5,10a(8h)- dicarboxylate; Kimyasal formülü; C 35 H 44 O 16 ] (Şekil 3.6 ) Neem ağacının (Azadirachta indica) tohumundan ektrakte edilmiştir. Hafif koyu kahverengi bitkisel bir insektisittir. Uygulama zamanında su ile çözülebilmektedir. Neem yağı içinde steroitler, 28

46 triterpenoitler ve azadirachtin vardır. Azadirachtin in diğer bir işlevi ise, bir çok zararlının yaşam dönemlerine etki etmesidir. Şekil 3.6 Azadirachtin in açık formülü Laser 20 WP, aktif maddesi Cyfluthrin, göz ve cilt tahrişine neden olanpirotriot bir insektisittir (Şekil 3.7). Centipedes, millipedes, keneler, akrepler, sinekler ve karıncalara karşı kullanılmaktadır. Şekil 3.7 Cyfluthrin in açık formülü Kaolin WP, aktif maddesi kaolin claydir (Şekil 3.8). Kaolin, mineral alüminyum silikatlarına aittir. Spodopterler, akarlar, tahtakurusu, tripsler gibi bahçe bitkileri zararlılarına karşı IPM mücadelesine kullnılmaktadır. Thiamine, Neem yağı, Laser ve kaolin armut bahçesinde yılın Mayıs ve Ağustos aylarında kullanılmaktadır. 29

47 Şekil 3.8 Kaolin WP nin açık formülü 3.2 Metod Çeşitli alanlardan alınan örnekler AÜZF Armut Bahçesi nden, Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nden, Haymana Çiftliği ndeki mısır tarlası, buğday tarlası ve kimyasal kullanılmamış alanlardan toprak örnekleri plastik poşetlere alınmıştır. Örneklemeler W harfi çizilir gibi farklı 3 derinlikten (5 cm, 10 cm ve 15 cm olarak) yapılmıştır. Araziden alınan toprak örnekleri plastik poşetlerle laboratuvara getirilip toprak yıkama yöntemiyle yıkanmıştır. Farklı derinliklerdeki topraklar yıkandıktan sonra petriye (çapı 9 cm olan petrinin kaymaması için kenarları bantlanıp ve 2 ambalaj lastiği ile sabitlenmiş) alınarak sayım yapılmıştır (Şekil 3.9 ). Toprak altında bulunan omurgasızlar, takım veya familya olarak sayılmıştır. Sayım yapıldıktan sonra Collembola lar, 1.5 ml lik onar tane santrifüj tüpüne aktarılmış ve kullanılacağı zamana kadar -80 C de saklanmışlardır. 30

48 Şekil 3.9. Canlı sayımının yapıldığı petri kabı Bitki koruma bölümü nün bahçesindeki deneme Tez çalışmasının bu aşamasına kadar olan dönemde örnek alınan alanlarda pestisitlerin kullanımı, çalışmamızdan bağımsız yapıldığı için çalışmanın amaçları doğrultusunda kontrollü bir deneme kurulmasına karar verilmiştir (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1 Tez çalışması kapsamında kurulan tesadüf parselleri deneme deseni (G=Glyphosate (herbisit), 300mL\da, denemedeki kullanılan doz 3mL\L; B=Bordo bulamacı (Bordeaux) fungusit, 300g\da denemedeki kullanılan doz 3g\L, I=Imidacloprid (Neonicotinoid) 20mL\da, denemede kullanılan doz 200µL\L; M=Methiocarb (Carbamate), 100g\da, denemede kullanılan doz 1g\L; K=Kontrol, da = dekar = 1000 m 2 ) K 5 I 5 G 5 B 5 M 5 G 4 K 4 I 4 M 4 B 4 K 3 M3 B 3 G 3 I 3 Fitopatoloji Ve Entomoloji Laboratuarları I 2 B 2 G 2 K 2 M 2 M1 I 1 K1 B1 G1 31

49 Denemeler 2010 yılı boyunca AÜZF Bitki Koruma Bölümü uygulama bahçesinde 100 m 2 yapılmıştır. Bahsedilen uygulama bahçesinde en az 5 yıl boyunca pestisit uygulaması yapılmamıştır. Deneme alanının coğrafik konumu enlem ve boylam olarak N, W dır (Şekil 3.10). Şekil Tez çalışması kapsamında denem parselinin kurulduğu alan Deneme tesadüf parselleri yöntemine göre 5 parsel olarak düzenlenmiştir. Her parsel 1,5 m 2 lik 5 tekerrüre ayrılmıştır. Tekerrür parsellerinin arası, sürüklenme ve bulaşmaya engel olmak için 0,5 m 2 olarak belirlenmiştir. Uygulama alanına 18 Mayıs ve 11 Ağutos tarihlerinde iki kez pestisit uygulaması yapılmıştır. Böcekler, yabancı ot ve hastalık mücadelesini kontrol etmek için aşağıda adı geçen çeşitli kimyasal ürünler kullanılmıştır. Örneğin, fungusit olarak bordo bulamacı (300g/da), karbamet grubundan methiocarb (100g/ da) (METCAR 500 WP), herbisit olarak glyphosate (300mL/da) (ARMAGEDDON 48 SL) ve neonikotinoit olarak imidacloprid 60% (20mL/da) kullanılmıştır. Pestisitler, sırt pülverizatörüyle akşam saatlerinde iki kez uygulanmıştır. Deneme alanı haftada 2 kez sulanmıştır. Hava sıcaklığı ve nem örnekler alınırken kaydedilmiştir. Toprak örnekleri, 10 cm çapındaki 2 farklı derinlikten alınmıştır (0-7,5 cm ve 7,5-15 cm). Her derinlikten tesadüfi olarak 5 tekerrürlük örnek alınmıştır. Bu örnekler laboratuvara getirilerek her poşetten 1 kg toprak tartılmıştır. Toprak örnekleri 3 katlı elek ile yıkadıktan sonra invertebratlar izole edilmiştir. Toprağa uygulanan çeşitli pestisitlerin toprak invertebralarına etkisi olup olmadığının belirlenmesi için tesadüf parselleri deneme deseni kullanılmıştır. Bu deneme Mayıs ile 32

50 Ağustos 2010 yılı arasında yapılmıştır. Dolayısıyla her pestisit uygulama peryodun 1 hafta sonrasında toprak örnekleri tesadüfi olarak alınmıştır. İlk pestisit uygulamasından 45 gün sonra 2010 un Haziran ayında 3. kere örnek toplanmıştır. Toprak örnekleri, yüzey toprağını almamaya dikkat ederek yüzeyin ilk 1 cm i atıldıktan sonra topraktan örnekler alınmıştır. Pestisit çalışmalarında etkinliği % olarak hesaplamak için elde edilen verilerin analizinde Henderson-Tilton s formulasyonu kullanılmıştır. Toprak omurgasızları ve sabit faktörlerin (pestisitler, dönemler ve derinlikler) ilişkilerinin ortaya konması için denemede tesadüf blokları deneme deseni kullanılmıştır. Tüm analizler Genel liner modeli (GLM) kullanılarak SPSS 18 programıyla yapılmıştır. Daha sonra MSTAT program ve Duncan çoklu karşılaştırma testi kullanılarak pestisitlerin hedef alınmayan organizmalara etkisi ve farklı dönemler ve derinliğin etkileşimi araştırılmıştır Toprak yıkama yöntemi; Elekmetodu Araziden alınan toprak örnekleri plastik poşetlerle labarotuvara getirilmiştir. Her örnekten 1 er kg tartılarak silindir plastik kaplara konularak kabın ¾ ü suyla doldurulmuştur. Kap içerisindeki toprak ve su iyice karıştırılmış ve 30 saniye bekletilmiştir. Daha sonra 1 mm, 850 nm ve 250 nm delik çaplarındaki elekler büyükten küçüğe sıralanarak toprak elek düzeneğinden süzülmüştür (Şekil 3.2.3a). Karıştırma ve süzme işlemi 3 kez tekrarlanmıştır. Süzme işlemleri bittikten sonra elekli düzenek tazyikli su ile temizlenmiş (Şekil 3.11) ve elekler üzerinde kalan materyaller tek tek alınarak petri kaplarına yerleştirilmiştir. Bu işlemin amacı petri kaplarına konulan materyallerdeki canlı organizmaları saymaktır. (Coyne D.L. vd. 2007). 33

51 250nm lik olan elek 850nm lik olan elek 1nm lik olan elek Elekler üst üste kullanıldığı şekli Şekil 3.11 Toprak elemek için elek düzeneği Şekil 3.12 Örnekleme toprağın yıkanması 34

52 Toprak özelliklerinin belirlenmesi Toprak reaksiyonu (ph) nun belirlenmesi Toprak reaksiyonu (ph), doygunluk çözeltisinde ph metre (ORION 720 A Model) ile belirlenmiştir (Jackson, 1958). 1:2.5 luk toprak su karışımında ph belirlenmiştir. Havada toprak örnekleri kurtulduktan sonra 2 mm (10 mesh) lik elekten elenmiştir. 10 g toprak örneği üzerine 25 ml saf su eklenmiş ve süspansiyon dakika belli aralıklarda karıştırılmıştır. Daha sonra ölçüm öncesi yeniden karıştırılarak cam elektrotlu ph metre ile ölçüm yapılmıştır Toprak organik madde (%) ölçüm yöntemi Yüzde olarak organik madde (%OM), modifiye edilmiş Walkley-Black yöntemine göre volumetrik olarak belirlenmiştir (Bremner, 1996). Bu yönteme göre; 0,5 g toprak 500 ml erlene konulmuştur. Üzerlerine 10 ml potasyum dikromat eklenmiş daha sonra 10 ml derişik H 2 SO 4 ilave edilerek bir dakika el ile çalkalanmıştır. Solüsyon üzerine 10 ml H 3 PO 4 (fosforik asit) eklendikten sonra 180 ml saf su konularak çalkalanmıştır. Spatulanın ucuyla biraz NaF (sodyum florit) eklenmiş ardından 30 damla baryum difenilamin sülfanat damlatılmıştır. Daha sonra bu karışım demir sülfat ile titre edilerek tartılmıştır (Titrasyon ile oluşan yeşil renk, reaksiyonun dengeye geldiğini göstermektedir). % OM= 10*(1-O/T)*1,34 (O=ÖRNEK T=TANIK) Toprak nemi ölçüm yöntemi Nem Tayini: U.S. Salinity Laboratory Staff (1954) e göre miktarı belli olan toprak örneği 105 ºC de sabit ağırlığa kadar kurutma fırınında bekletilerek bulunmuştur. Nem kaplarının darası alınıp kapak veya gövde numarası yazılmıştır (dara). 35

53 Alınan toprak örneği nem kabının içine konularak tartılmıştır (dara+hkt). Kutunun kapağı açık olarak 105 derecede bırakılmış ve 24 saat sabit ağırlığa gelinceye kadar bu sıcaklıkta kurutulmuştur. Dara Ağırlığının Ölçümü Fırından çıkan nem kabının kapağı kapatılır, tartılmadan önce desikatöre konulup soğuması beklettikten sonra tartılmıştır (DARA+FKT). HKT-FKT %nem= *100 FKT [HKT: hava kuru toprak; FKT: fırın kuru toprak] Collembola yetiştirme yöntemi Stok kültür yetiştirmek için kullanılan kabın çapı 9 cm ve yüksekliği 12 cm dir. Kaplara Paris Plasterin pudrası ve aktive edilmiş kül ve 2:1:1.45 (Paris Plasterinin 8 parçası, Aktive edilmiş külden 4 parça ve 5.5 oranında saf su) oranında distile su ile karıştırılarak kullanılmıştır. Paris Plasterin pudrası ve Charcool kuruyuncaya dek karıştırılmıştır. Paris Plasterin ve aktive kül suyun içine dökülmüştür. Beş dakika boyunca hareket ettirilmeden bekletilmiş ve solüsyon yoğun kıvama gelinceye dek karıştırılmıştır. Kaplara tabandan 2 cm seviyesine kadar dökülmüştür. Solüsyonun üst yüzeyi su damlatılıp düzleştirilmiştir. Bir hafta boyunca kurutulmaya bırakıldıktan sonra hazır hale getirilmişledir. Collembola besini olarak haftada bir ya da iki haftada bir ekmek mayası kullanılmıştır. Nemlenmeyi sağlamak için distile su kullanılmış ve collembolaların kültürleri 30 C optimum sıcaklıkta yetiştirilmiştir (Şekil 3.13). 36

54 Şekil 3.13 Collembola yetiştirme kapları Şekil 3.14 Armut bahçesinden alınan collembola örnekleri (Familya: Isotomidae ) 37

55 Şekil 3.15Haymana çiftliğinden alınan collembola örnekleri (Familya: Neanuridae) Biyokimyasal çalışmalar Biyokimyasal çalışmalarda insektisitlere karşı kirlilikte önemli rolleri olan detoksifikasyon enzimlerinden karboksilesteraz, glutatyon S-transferaz, AchE ve mikrozomal esteraz enzimlerinin aktivitesi ölçülmüştür. Ayrıca Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ile esteraz enzimlerinin varlığı incelenmiş; Bradford yöntemiyle protein miktarları belirlenmiştir Protein miktarının belirlenmesi Enzim kaynağında bulunan protein miktarı Bradford (1976) un orijinal yöntemine uygun olarak belirlenmiştir. VERSAmax Kinetik Mikroplaka Okuyucuda (Molecular Devices), Standart Bradford boya çözeltisi ile 620 nm dalga boyunda absorbans okumaları yapılmıştır. Standart protein olarak bovine serum albumin (BSA) kullanılarak (1g/100mL), 0-14 µl arasındaki dilisyonlarda protein miktarı belirlenmiştir. Örneklerin homojenatlarından 5 µl alınarak mikroplakadaki kuyucuklara uygun sıralarda konulmuştur. Bütün kuyucukların üzerine toplam hacim 250 µl olacak şekilde Bradford 38

56 çözeltisi konulmuştur. Reaksiyonun gerçekleşmesi için 10 dakika beklenmiştir. Mikroplaka, VERSAmax Kinetik Mikroplaka Okuyucuya yerleştirilmiştir. Kinetik mikroplaka okuyucu 25 C de 620 nm dalga boyunda tek okuma (end point) yapacak şekilde programlanmış ve okuma yapılmıştır. Protein miktarı, ölçüm sonucu elde edilen standart eğriye göre değerlendirilerek mg olarak hesaplanmıştır (Rothamsted Research Molecular Biology Insect Biology Laboratory Methods) Karbok silesteraz enzim aktivitesinin belirlenmesi -80 C de saklanmış Collembola ların 10 tanesi bir santrifüj tüpü içine alınarak üzerine 80 µl 0.1 mol (ph 7.6) sodyum fosfat tamponu ( g NaHPO 4.12H 2 O g NaH 2 PO ml distile su) ilave edilerek iyice ezilmiştir. Solubilizasyon için 10 dakika beklenmiştir. Homojenat, rpm de 4 C de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjden sonra tüplerin üzerinde kalan sıvı (süpernatant) enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Substrat-boya solüsyonu, 50 ml 0.2 mol (ph 6.0) sodyum fosfat tamponu (31,158 g NaHPO 4.12H 2 O+2,028 g NaH 2 PO ml su distile su) üzerine 30 mg Fast Blue RR tuzu ilave edilerek elde edilmiştir. Bu solüsyon whatman 1 nolu kâğıttan süzülerek küçük partiküllerinden arındırılmıştır. Daha sonra bu solüsyon üzerine 500 µl 100 mm α-naftil Asetat eklenmiştir. Bu solüsyon hazırlandıktan sonra 96 hücrelik elisa plakalarının her bir kuyucuğuna 50 µl süpernatant konulmuştur. Üzerine 200 µl substrat-boya konularak 450 nm dalga boyunda 20 dakika 10 saniye boyunca Elisa Reader da esteraz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Karboksilesteraz enzim aktivitesi, VERSAmax Kinetik Mikroplaka Okuyucuda 25 C de sıcaklıkta okunmuştur. Esteraz ölçümü bütün toplanan örneklere uygulanmıştır. Değerleri daha önce elde edilmiş olan protein miktarına oranlanarak Collembola toplam karboksilesteraz enzim aktivitesi mod/min/µg protein olarak elde edilmiştir (Kranthi, 2005; Rothamsted Research Molecular Insect Biology Laboratory Methods) Mikrozomal esteraz enzim aktivitesinin belirlenmesi Karboksilesteraz enzim aktivitesinin yanında ayrıca mikrozomal esteraz aktivitesi de ölçülmüştür. Mikrozomal esteraz için 30 adet Collembola bireyi santrifüj tüplerine alınmıştır. Üzerlerine 200 µl 0,1 M fosfat tamponu (PH 7,0; %1,6 lık Triton X

57 içeren) konularak santrifüj tüplerine uyumlu ezici çubuklar ile homojenize edilmiştir. Katı partikülleri çöktürmek için 4 C de, rpm de 10 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatant alınarak 4 C de, rpm de 1,5 saat santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant, enzim kinetiği çalışmalarında kullanılmak üzere santrifüj tüplerine alınmıştır. Kalan pellet, 50 µl %1,6 lik Triton X-100 lü fosfat tamponunda iyice çözülmüş ve enzim kinetiği çalışmalarında enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Mikroplakanın her kuyucuğuna 25 µl mikrozomal pellet, üzerine de 225 µl substrat solüsyonu eklenmiştir. Mikrozomal esteraz enzim aktivitesi mikroplaka okuyucuda 450 nm dalga, 20 dakika 10 saniye boyunda Elisa Reader da esteraz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Mikrozomal esteraz enzim aktivitesi VERSAmax Kinetik Mikroplaka Okuyucu da 25 C sıcaklıkta okutulmuştır. Mikrozomal esteraz yöntemi bütün toplanan örneklere uygulanmıştır. Değerleri daha önce elde edilmiş olan protein miktarına oranlanarak Collembola toplam mikrozomal esteraz enzim aktivitesi mod/min/µg protein olarak elde edilmiştir (Kranthi 2005, Rothamsted Research Molecular Insect Biology Laboratory Methods) Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ile esteraz enzimlerinin incelenmesi Karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesinde kullanılan yöntemlerden birisi PAGE dir. Imidacloprid, methiocarb, Bordo bulamacı ve glyphosate pestisitleri uygulaması yapılan örneklerin karboksilesteraz bantları Ornstein ve Davis (1964) yöntemi kullanılarak incelenmiştir Ornstein ve Davis (1964) yöntemi Bu amaçla dikey jel sistemi kullanılmıştır. Cam plakalar jel dökme standına yerleştirildikten sonra üst kısmı 2 cm boşluk bırakılarak, % 7.5 luk küçük delikli poliakrilamid jel dökülmüştür. Bu jelin üzerine hava ile temasını kesip, daha iyi polimerize olabilmesi için çok az miktarda n-bütanol ilave edilmiştir. Yaklaşık 60 dakika süren polimerizasyonu takiben n-bütanol ortamdan uzaklaştırılarak jelin üst kısmı saf su ile yıkanmıştır. Hazırlanan % 2.5 luk büyük delikli jel küçük delikli jelin üzerine pastör pipeti yardımı ile ilave edilmiş ve taraklar yerleştirilmiştir. Jelin bu şekilde soğuk ışık kaynağının altında yaklaşık 1 gün süre ile iyice donması sağlanmıştır. 40

58 Poliakrilamit Jel Elektroforez hazırlanması Küçük delikli jel 10 ml bisakrilamit (% 2 lik g/ml çözeltisinden)+19 ml akrilamit (%40 lik çözelti)+3,85 g Tris-base+0,923 mg Tris-HCL+60 µl TEMED 88 ml steril distile suda çözülmüştür. Üzerine 0,075g amonyumpersülfat ve 12,5 ml Triton X-100 (1,6 lik çözelti) eklenerek iyice karıştırılmıştır. Bu karışım üzerine jelin düzgün donması için az miktarda N- bütanol eklenmiştir. Cam plakalar arasına dökülerek donması için yaklaşık bir saat beklenmiştir Büyük delikli jel 19 ml bisakrilamit [% 2 lik çözelti+4ml akrilamit % 40 lık çözelti)+ 0,02g Tris base+0,566 g Tris HCL+40 µl TEMED 45 ml steril distile suda çözülmüştür. Üzerine % 0,005lik (5mg 100ml su) 7,5 ml Riboflavin ve 7,5 ml Triton X-100 (% 1,6 lık çözelti)] konarak iyice karıştırılmıştır. Cam plakalar arasına dökülerek bir gün soğuk ışık altında donması beklenmiştir. Bu karışım küçük delikli jelin üzerine dökülmeden önce N-butanol dökülerek jel distile su ile birkaç defa yıkanmıştır Örneklerin hazırlanması Homojenizasyon sıvısı olarak 0.1 g sukroz, 1 ml Triton X 100 (% 1.6 lık çözelti) ve çok az miktarda bromocresol purple karışımı kullanılmıştır. Homojenizasyon çözeltisi içerisine katılan bromocresol purple izleme boyası olarak kullanılmıştır. 10 adet collembola santrifüj tüplerine aktarılarak her birinin üzerine 20 µl homojenizasyon çözeltisi ilave edilmiştir. Örnekler santrifüj tüpüne uyan bir ezici ile iyice homojenize edilmiştir. Polimerizasyondan sonra alt ve üst tanka glisin tamponu (14.4g glisin, 3g trisbase ve 5l ye su ile tamamlanmıştır) dökülmüş ve her homojenattan 10 µl alınarak ayrı ayrı jel kuyucuklarına konulmuştur. Örnekler aynı anda 2 jel koşturabilen jel elektroforez tankında (Bio-Rad) +4 o C de, en az 1.5 saat süre ile 250 voltta koşturulmuştur. Bu sürenin sonuna doğru boya (fast blue RR salt 0.100g, fast blue tamponu ph 6, 50mL 100mM naphtyl acetate 1 ml) hazırlanmış ve cam plakalar 41

59 arasından çıkarılan jel bu boyanın içerisine aktarılmıştır. Jel, oda sıcaklığında karanlık bir ortamda yaklaşık 20 dakika boyandıktan sonra fiksasyon için % 7 lik asetik asit içerisine alınmıştır. Jel üzerinde oluşan bantların fotoğrafları çekilerek bilgisayar ortamına aktarılmıştır Glutatyon S-transferaz enzim aktivitesinin belirlenmesi -80 C te saklanmış collembolaların 10 tanesi santrifüj tüpüne alınmıştır. Üzerlerine 80 µl Tris-HCL tamponu (ph 7.5) konarak, örnekler ezilmiştir. 10 dakika beklendikten sonra homojenat rpm de 7 C de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjden sonra tüplerin üzerinde kalan sıvıdan 50 şer µl alınarak enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Önce substrat solüsyonu olarak 100 µl 0.4 mm CDNB (1-kloro-2,4-dinitrobenzen) eklenmiş, daha sonra boya solüsyonu olarak 100 µl 4 mm GSH kullanılmıştır. 96 hücrelik elisa plate in kuyucuklarına 50 er µl süpernatant konulmuştur. Üzerine 100 µl substrat ve 100 µl boya solüsyonu konularak 340 nm dalga boyunda Elisa Reader da enzim aktivitesi belirlenmiştir. Glutatyon S-transferaz enzim aktivitesi Molecular Devices marka Thermomax Kinetik Microplate Reader da 25 C de toplam 20 dakikada 10 saniyelik aralıklarla 121 okuma sonucu elde edilmiştir. Değerleri daha önce elde edilmiş olan protein miktarına oranlanarak Collembola toplam Glutatyon S-Transferaz enzim aktivitesi mod/min/µg protein olarak elde edilmiştir (Kranthi, 2005; Rothamsted Research Molecular Insect Biology Laboratory Methods) Asetilkolinesteraz enzim aktivitesinin belirlenmesi -80 C de saklanmış Collembolaların 10 tanesi santrifüj tüplerine alınmıştır. Üzerlerine 50 µl sodyum fosfat triton tamponu (PBT) ( ph 7,3) ( 3,58g NaHPO 4 +1,36g KH 2 PO 4 +1 g Triton X l distile su) eklenerek santrifüj tüplerine uyumlu ezici çubuklar ile homojenize edilmiştir. Solübilizasyon için 15 dakika beklendikten sonra 4 C te rpm de 5 dakika santrifüj edilmişlerdir. Mikroplaka kuyucuklarına elde edilen supernatanttan 50 µl konularak üzerlerine 100 µl DTNB (15 mg DTNB, 25 ml fosfat tamponu içinde çözüldürülmüş, bundan 2,5 ml alınıp fosfat tamponu ile 50 ml ye 42

60 tamamlanarak üzerine 100 µl acetylthiocholin iodide (22 mg ATChI + 50 ml PBT) eklenmiştir. Mikroplaka okuyucuda 405 nm dalgaboyunda 25 C te, toplam 20 dakika süresince 10 saniye aralıklarla okunarak enzım aktivitesi belirlenmiştir. Kinetik okuma sonucunda elde edilen optik yoğunluk değerleri daha önce elde edilmiş olan protein miktarına oranlanarak Collembola toplam asetilkolinesteraz enzim aktivitesi mod/min/µg protein olarak elde edilmiştir (Kranthi 2005, Rothamsted Research Molecular Insect Biology Laboratory Methods) Genotoksikolojik çalışmalar DNA daki hasarı tespit etmek için Tek Hücre Jel Elektroforez Yöntemi (Comet Yöntem) kullanılmıştır Comet assay protokolü Düşük erime sıcaklığında %1 lik agaroz hazırlanmıştır. Bu amaçla jel önce ısıtılmış daha sonra 40 C de soğutulmuştur. Tamamen donmuş lamlar ince bir agaroz tabakasıyla (200µl veya daha az) kaplanmıştır ve kurumaya bırakılmıştır. Bu aşama agarozun hücre bulunduran lamlara tutunmasındaki dayanıklılığını arttırmak için yapılmıştır. Tek hücreli süspansiyonlar yaklaşık olarak 5x10000 hücre/ml olacak şekilde sulandırılmış ve merkezkaç kuvveti uygulanarak 100µl ye düşürülmüştür. 400µl yavaş eriyen agaroza, kalan süspansiyonlardan 80 er µl eklenip 90µl kapatılmış lamların üzerine pipetle konulmuştur. Hücre bulundurmayan ek agaroz tabakası katılaştıktan sonra birinci tabakanın üzerine eklenmiştir. Lamlar katılaştıktan sonra alkalin lizis solüsyonu içerisine yerleştirilmiştir. Hücreler 4 C de 3 saat karanlıkta lize edildikten sonra, sodyum klorürü tamamen çıkartmak için, lamlar 20 dakika boyunca alkalin çalkalama solüsyonu (0.03M NaOH, 2mM EDTA, ph:13) içerisinde çalkalanmıştır. Çalkalamanın ardından, lamlar yatay elektroforez tankı içerisine yan yana yerleştirilmiştir. Tank, agaroz tabakasının üzerinde 2mm olacak şekilde, yeni hazırlanmış alkalin çalkalama solüsyonu ile doldurulmuştur. Lamlar 0.6V/cm de 25 dakika elektroforeze maruz bırakılmıştır. Elektroforezin ardından, lamlar nötralizasyon tampon suyu ile çalkalanmış ve kurumaya bırakılmıştır. Lamları aynı anda floresent mikroskop ile incelenmeyecekse bu aşamada %100 etanol veya %100 metanol ile 43

61 dehidrasyon yapılmıştır. Lamlar floresent mikroskopta incelenmeden önce 20µl etidium bromid ile koyulaştırılmıştır. Lamlar görüntüleme için kuru olarak saklanmıştır (Singh vd. 1988). 44

62 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1 Deneme Parsellerinin Toprak Özellikleri Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nin toprak özelliklerinin belirlenmesi Toprak profilinin yüzeyden itibaren ölçülen 0-5 cm arası derinliğindeki ph değeri 7,76; 5-10 cm arası derinliğindeki ph değeri 7,89; cm arası derinliğin ph değeri ise 8,03 olarak belirlenmiştir. Toprağın % nem oranı 0-5 cm ve 5-10 cm arası derinliklerde % 2,51 ve %4,41 olarak, cm arası derinlikteki değeri ise %7,85 olarak ölçülmüştür. Organik madde kapsam değerleri ise 0-5 cm arası derinlikte toprak katmanında %1.14; 5-10 cm derinliğindeki toprak katmanında %1.07 ve cm derinliğindeki toprak katmanında ise diğerlerine kıyasla düşük, %0.80 olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi toprak özellikleri Derinlik PH değeri %Nem ortalaması %Organik madde ortalaması 0-5 cm 7,76 4, cm 7,89 2, cm 8,03 7, Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi ndeki toprak özelliklerinin belirlenmesi Toprak profilinin yüzeyden itibaren ölçülen 0-5 cm arası derinliğindeki ph değeri 7,70; 5-10 cm derinliğindeki ph değeri 7,26; cm arası derinliğin ph değeri ise 7,68 olarak belirlenmiştir. Toprağın % nem oranı 0-5 cm ve 5-10 cm arası derinliklerde %4,46 ve %4,53 olarak, cm arası derinlikte ise %4,66 olarak ölçülmüştür. Organik madde kapsam değerleri ise 0-5 cm arası derinlikteki toprak katmanında %1,27; 5-10 cm derinliğindeki toprak katmanında %1,08 ve cm derinliğindeki 45

63 toprak katmanında ise diğerlerine kıyasla düşük, %1 olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.2). Çizelge 4.2 Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi toprak özellikleri Derinlik PH değeri %Nem ortalaması %Organik Madde ortalaması 0-5 cm 7,70 4,46 1, cm 7,26 4,53 1, cm 7,68 4,66 1, Haymana Çiftliği Buğday, Mısır tarlaları ve ilaç kullanılmamış alanlarda toprak özelliklerinin belirlenmesi Haymana Çiftliğindeki Buğday tarlasından alınan toprak örneklerinin derinliklerine göre 0-5 cm arası toprak ph değeri 8.00; 5-10 cm 7.92 ve cm arasında ise 7.85 olduğu saptandı. Mısır tarlasında toprak ph si alkali olarak tespit edilmiştir. İlaç kullanılmamış alanda toprak ph değerleri 0-5 cm ve 5-10 cm arasında 8.13 ve 8.03 olarak, cm arası derinlikte ise 8.02 olarak ölçülmüştür. Buğday tarlasında toprak % nem oranı genel olarak yüksek, Mısır tarlasında normal, ilaç kullanılmamış alanda ise oldukça düşük olduğu tespit edilmiştir. Organik madde kapsamı Buğday tarlasında 0-5 cm ve 5-10 cm arası derinliklerde %1,27 ve %1,08; cm arası derinlikte ise %1; Mısır tarlasında 0-5 cm ve 5-10 cm arası derinliklerde %0.94 ve %1.01; cm arası derinlikte ise %1.94 iken, ilaç kullanılmamış alanda bu derinliklere ait değerler sırası ile %0.74, %0.54 ve %0.07 olarak ölçülmüştür (Çizelge ). 46

64 Çizelge 4.3 Haymana Çiftliği Buğday Tarlası Toprak Özellikleri Derinlik ph değeri %Nem ortalaması %Organik Madde ortalaması 0-5 cm , cm , cm ,00 Çizelge 4.4 Mısır tarlası, toprak özelliklerinin belirlenmesi Derinlik ph değeri %Nem ortalaması %Organik Madde ortalaması 0-5 cm cm cm Çizelge 4.5 Haymana ilaç kullanılmamış alanında, toprak özelliklerinin belirlenmesi Derinlik PH değeri %Nem ortalaması %Organik Madde ortalaması 0-5 cm cm cm Deneme Parselleri Toprak Canlıları Sayımları Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nde toprak canlılarının değişimleri Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nde ve ilaç uygulanmamış alanlarda (kontrol) beş farklı dönemde (Ağustos 2009, Aralık 2009, Şubat 2010, Nisan 2010 ve Ekim 2010) ve 3 farklı derinlikte (0-5 cm, 5-10 cm ve cm arası) toprak 47

65 örnekleri toplandıktan sonra yıkanıp, canlıların sınıfladırılması ve sayımı yapılmıştır. Toprak altında bulunan arthropodların takım veya familyaları binoküler mikroskop ile incelenip, 13 farklı canlının bulunduğu belirlenmiştir. Bunlar; Scorpionidea, Araneidea, Acarina (Arachnida); Diplopoda, Chilopoda (Mytriapoda),Crustacea; Collembola, Diplura, Protura, Annelida, Coleoptera ve Isoptera ( Insecta) dır (Çizelge 4.6). Çizelge 4.6 incelendiğinde Armut Bahçesi ndeki collembola takımından birey sayısının, ilaç uygulanmamış alana (kontrol) göre düşük miktarda bulunduğu gözlemlenmiştir. İlaç uygulanmamış alanda karınca populasyonları, Armut Bahçesi ne göre önemli derecede farklı iken, Armut Bahçesi ve kontrol alanlarında collembola ve karıncalar dışında topraktaki diğer canlılar arasında önemli bir fark belirlenmemiştir. Yukarıda belirtilen 13 canlı grubundan kontrol ve Armut Bahçesi nden alınan canlıların değişimlerinde collembola takımı biyomarkör olarak kullanılmıştır. Çizelge 4.6 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan örneklerden toprak canlılarının sayımı Organizma ( Armut ) (ilaç uygulanmamış alan) Collembola 17,12 ± 1,78 B 55,32 ± 10,32 A Diplura 2,56 ± 0,33 C 5,90 ± 0,77 C Protura 2,90 ± 0,44 C 3,5 ± 0,43 C Crusacacea 0,29 ± 0,06 C 1,19 ± 0,24 C Akar 5,55 ± 0,68 C 5.95 ± 0,57 C Solucan 1,01 ± 0,14 C 2,22 ± 0,21 C Yalancı akrepler 0,41 ± 0,10 C 0,64 ± 0,14 C Örümcek 0,48 ± 0,08 C 1,27 ± 0,19 C Karınca 9,65 ± 1,52 C 16,65 ± 2,46 B Diplopoda 0,07 ± 0,04 C 0,31 ± 0,09 C Chillopoda 0,77 ± 0,12 C 1,20 ± 0,22 C Coleoptera 2,11± 0,19 C 1,50 ± 0,14 C Diptera 0,36 ± 0,04 C 0,46 ± 0,07 C 48

66 Ağustos, Aralık, Şubat, Nisan ve Ekim aylarında birinci derinlikteki collembola populasyonları Armut Bahçesi ndeki kontrol grubundan daha düşük miktarda çıkmıştır. Ağustos, Şubat ve Ekim aylarında collembola populasyonları ikinci derinlikte Armut Bahçesi ndeki kontrol grubundan daha düşük, Nisan ayındakinden farksız, Aralık ayındakinin ise Armut Bahçesi ndeki kontrol grubuna göre fazla olduğu gözlemlenmiştir. Ağustos ayında üçüncü derinlikte kontrol grubu Armut Bahçesi nden yüksekken, Şubat ve Ekim aylarında önemli bir fark görülmemiştir. Aralık ve Nisan aylarında Armut Bahçesi ndeki collembola populasyonları kontrol grubuna göre önemli derecede farklı bulunmuştur (Çizelge 4.7). Çizelge 4.7 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan collembola populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinli k Armut Kontrol 5,2 ± 13,7 E 49,8 ±13,7 ABC 22,2 ±13,7 CD 89,25±13,7 AB 20,6 ±13,7 CD 109,4 ±13,7 A 39,6 ±13,7 BC 53,2±13,7ABC 14,0 ±13,7 CD 118,8±13,7 A 2.derinli k Armut Kontrol 1,4 ± 13,7 E 95,0 ± 13,7AB 23,2 ±13,7 CD 9,0 ±13,7 D 15,2 ±13,7 CD 45,2 ±13,7 ABC 28,8±13,7 CD 16,8±13,7 CD 9,0 ±13,7 D 48,4 ±13,7 ABC 3.derinli k Armut Kontrol 0,6 ± 13,7 E 12,8 ± 13,7 CD 21,4 ±13,7 CD 10,8 ±13,7 D 13,4±13,7CD 21,6±13,7CD 24,0±13,7 CD 11,6±13,7 D 18,2 ±13,7 CD 22,0 ±13,7 CD Diplura bireylerinde ise Nisan dışındaki diğer ayların, farklı derinliklerdeki kontrol gruplarının Armut Bahçesi populasyonlarına göre önemli derecede farklı olduğu gözlenirken, Ekim ayı üçüncü derinlikte Armut Bahçesi nin kontrole göre yüksek olduğu saptanmıştır (çizelge 4.8). 49

67 Çizelge 4.8 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan dipluraların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,6 ±1,4 CD 1,6 ± 1,4 C 2,0 ± 1,4 C 5,4 ± 1,4 B 1,2 ± 1,4 C Kontrol 4,2 ± 1,4 B 14,5 ± 1,4 A 10,0 ± 1,4 A 3,6 ± 1,4 B 6,2 ± 1,4 B 2.derinlik Armut 0,4 ± 1,4 CD 1,6 ± 1,4 C 1,2 ± 1,4 C 6,8 ± 1,4 B 1,8 ± 1,4 C Kontrol 3,4 ± 1,4 B 3,0 ± 1,4 B 7,6 ± 1,4 AB 2,8 ± 1,4 B 5,4 ± 1,4 B 3.derinlik Armut 0,2 ± 1,4 D 1,6 ± 1,4 C 0,8 ± 1,4 CD 5,4 ± 1,4 B 7,8 ± 1,4 A Kontrol 3,8 ± 1,4 B 7,6 ± 1,4 AB 8,6 ± 1,4 A 3,8 ± 1,4 B 5,8 ± 1,4 B Protura bireylerinin Ağustos ayında farklı derinliklerde, Şubat ve Ekim aylarında birinci ve üçüncü derinliklerde Armut Bahçesi nden alınan kontrol protura populasyonlarında istatistiki olarak önemli bir farka rastlanmamıştır. Aralık ve Şubat aylarında ikinci derinlikteki proturaların, Armut Bahçesi ndeki kontrolden daha düşük olduğu belirlenmiştir. Nisan ayındaki ikinci derinlikte, Armut Bahçesi ndeki proturaların kontrole göre daha düşük olduğu görülmüştür (çizelge 4.9). Çizelge 4.9Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan proturaların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,8± 1,1 C 1,0±1,1 C 1,6±1,1 C 10,6±1,1 A 3,2±1,1 C Kontrol 2,6±1,1 C 4,0±1,1 B 1,8±1,1 C 10,8±1,1 A 2,6±1,1 C 2.derinlik Armut 0,6±1,1 C 1,2±1,1 C 0,8±1,1 C 8,8±1,1 B 2,2±1,1 B Kontrol 1,4±1,1 C 4,2±1,1 B 3,4±1,1 B 5,0±1,1 A 3,2±1,1 C 3.derinlik Armut 0,4±1,1 C 1,4±1,1 C 0,6±1,1 C 9,2±1,1 A 1,2±1,1 C Kontrol 1,0±1,1 C 1,0±1,1 C 2,8±1,1 C 7,0±1,1 B 1,8±1,1 C 50

68 Ağustos ayında farklı derinliklerde, Aralık ayının birinci derinliğinde ve Şubat ayının üçüncü derinliğindeki Crustacea populasyonlarının Armut Bahçesindeki kontrol gruplarında daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Diğer dönem ve derinlikler arasındaki crustacea populasyonlarının kontrol ve Armut Bahçesi nden önemli derecede farklılığına rastlanmamıştır (çizelge 4.9). Çizelge 4.9 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan crustacealerin populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut Kontrol 0,6 ±0,6B 4,6 ±0,6A 0,0 ±0,6C 1,8 ±0,6B 0,4 ±0,6B 0,4 ±0,6B 0,8 ±0,6B 0,8 ±0,6B 0,4 ±0,6B 1,2 ±0,6B 2.derinlik Armut Kontrol 0,0 ±0,6C 2,4 ±0,6B 0,0 ±0,6C 0,0 ±0,6C 0,4 ±0,6B 0,6 ±0,6B 0,2 ±0,6B 0,6 ±0,6B 0,8 ±0,6B 1,0 ±0,6B 3.derinlik Armut Kontrol 0,0 ±0,6C 2,4 ±0,6B 0,0 ±0,6C 0,0 ±0,6C 0,0 ±0,6C 0,4 ±0,6B 0,2 ±0,6B 0,6 ±0,6B 0,6 ±0,6B 1,2 ±0,6B Akarlarlarda Ağustos ve Şubat aylarındaki birinci derinlik kontrol populasyonlarının Armut Bahçesi ne göre önemli derecede farklı olduğu gözlemlenirken, Nisan ayındaki farklı derinliklerin Armut Bahçesindeki kontrole göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Diğer dönemlerin farklı derinlikleri için, armut ve kontrol populasyonları arasında önemli bir fark saptanmamıştır (çizelge 4.10). Çizelge 4.10 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan akarların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 1.derinlik 2.derinlik 3.derinlik Armut Kontrol Armut Kontrol Armut Kontrol 2,0 ± 1,4C 7,6 ±1,4B 2,0 ±1,4C 3,2 ±1,4C 0,0 ±1,4C 1,0 ±1,4C Aralık 09 1,4 ±1,4C 4,7 ±1,4C 1,2 ±1,4C 2,2 ±1,4C 1,6 ±1,4C 1,6 ±1,4C 51 Şubat 10 3,6 ±1,4C 12,4 ±1,A 3,4 ±1,4C 6,4 ±1,4C 2,2 ±1,4C 10,6 ±1,4B Nisan 10 15,8 ±1,4A 5,6 ±1,4C 13,4 ±1,4A 2,4 ±1,4C 8,2 ±1,4B 1,6 ±1,4C Ekim 10 12,4 ±1,4A 12,6 ±1,4A 5,2 ±1,4C 6,6 ±1,4C 10,8 ±1,4A 10,4 ±1,4A

69 Solucan populasyonları Ağustos ve Ekim aylarında farklı derinliklerde Armut Bahçesi kontrol grubunda daha yüksek, Aralık ve Şubat aylarında birinci derinliklerde de yüksek olduğu görülmüştür (Çizelge 4.11). Çizelge 4.11 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan solucanların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,4±0,4C 1,0±0,4C 1,0±0,4C 3,2±0,4A 0,6±0,4C Kontrol 1,4±0,4B 1,3±0,4B 3,0±0,4A 3,2±0,4A 3,8±0,4A 2.derinlik Armut 0,4±0,4C 0,6±0,4C 0,8±0,4C 2,8±0,4A 0,4±0,4C Kontrol 3,2±0,4A 1,0±0,4C 2,6±0,4C 1,6±0,4B 2,2±0,4A 3.derinlik Armut 0,0±0,4C 0,0±0,4C 1,2±0,4B 0,6±0,4C 0,6±0,4C Kontrol 2,6±0,4A 1,2±0,4B 2,6±0,4A 1,0±0,4C 2,4±0,4A Yalancı akrep populasyonlarında deneme süresince genel olarak önemli bir değişklik saptanmamıştır (Çizelge 4.12). Çizelge 4.12 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan yalancıakreplerinin populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 1,2± 0,3 B 0,4± 0,3 C Kontrol 3,6 ± 0,3 A 0,0 ± 0,3 C 0,6± 0,3 C 1,2± 0,3 B 0,8± 0,3 C 2.derinlik Armut 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 0,0± 0,3 C 0,6± 0,3 C 2,4± 0,3 AB Kontrol 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 0,2± 0,3 C 1,2± 0,3 B 0,8± 0,3 C 3.derinlik Armut 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 0,2± 0,3 C 1,4± 0,3B Kontrol 0,0 ± 0,3 C 0,0 ± 0,3 C 0,2 ± 0,3 C 0,4± 0,3 C 0,4± 0,3 C Örümcekler Ağustos, Nisan ve Ekim aylarında birinci ve ikinci derinliklerde kontrol grupları Armut Bahçesinin populasyonlarına göre daha yüksek bulunmuştur. Diğer dönem ve derinlikler arasında çok önemli bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Aralık ve 52

70 Şubat aylarında ikinci derinlikte, Ekim ayında bütün derinliklerde kontrol populasyonlarının Armut Bahçesi ne kıyasla daha yüksek olduğu saptanmıştır. Diğer dönemler ve derinlikler arasında çok önemli bir farklılığın olmadığı gözlemlenmiştir (Çizelge 4.13). Çizelge 4.13 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan örümceklerin populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamel e Ağustos 09 Aralık 09 Ortalama+S E Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,6± 0,3 B 0,8± 0,3 B 0,0± 0,3 C 0,6± 0,3 B 0,6± 0,3 B Kontrol 3,0± 0,3 A 0,5± 0,3 B 0,0± 0,3 C 3,4± 0,3 A 1,2± 0,3 AB 2.derinlik Armut 0,6± 0,3 B 0,6± 0,3 B 0,0± 0,3 C 0,6 ± 0,3 B 0,8± 0,3 B Kontrol 2,0± 0,3 A 2,0± 0,3 A 2,0± 0,3 A 1,0 ± 0,3AB 2,2± 0,3 A 3.derinlik Armut 0,6± 0,3 B 0,0± 0,3 C 0,0± 0,3 B 0,4± 0,3 B 0,6± 0,3 B Kontrol 0,0± 0,3 C 0,0± 0,3 C 0,6± 0,3 B 0,6± 0,3 B 1,0± 0,3 AB Karıncaların Şubat ayı üçüncü derinlikte, Nisan ve Ekim ayları birinci ve ikinci derinliklerde kontrol populasyonlarının Armut Bahçesindekine göre fazla olduğu görülürken, diğer dönemler ve derinlikler arasında önemli bir farka raslanmamıştır (Çizelge 4.14). Çizelge 4.14 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan karıncaların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 1.derinlik 2.derinlik 3.derinlik Armut Kontrol Armut Kontrol Armut Kontrol 16,4 ± 4,4 C 5,8± 4,4 C 13,8± 4,4 C 3,0± 4,4 C 1,8± 4,4 C 1,0± 4,4 C Aralık 09 0,0± 4,4 C 1,8± 4,4 C 13,8± 4,4 C 3,0± 4,4 C 0,0± 4,4 C 0,8± 4,4 C Şubat 10 19,8± 4,4 BC 15,6± 4,4 C 5,6± 4,4 C 9,2± 4,4 C 2,0± 4,4 C 52,8± 4,4 A Nisan 10 19,2± 4,4 BC 40,2± 4,4 AB 13,8± 4,4 C 19,2± 4,4 BC 12,8± 4,4 C 14,2± 4,4 C Ekim 10 9,0± 4,4 C 20,0± 4,4 BC 7,2± 4,4 C 12,0± 4,4 C 9,6± 4,4 C 48,2± 4,4 A 53

71 Diplopodaların Ağustos ve Aralık aylarında birinci derinlikte, Nisan ayı ikinci derinlikte Armut Bahçesi populasyonlarının kontrole kıyasla daha fazla, Ağustos ve Şubat aylarında ikinci derinlikte düşük, diğer dönemler ve derinlikler arasında önemli bir fark olmadığı gözlenmiştir (Çizelge 4.15). Çizelge 4.15 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan diplopodaların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 2,0 ± 0,2 A 2,0± 0,2 A 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C Kontrol 0,80± 0,2 B 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,4± 0,2 C 2.derinlik Armut 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,2± 0,2 BC 0,0± 0,2 C Kontrol 1,20± 0,2 AB 0,0± 0,2 C 1,2± 0,2 AB 0,0± 0,2 C 1,0± 0,2 B 3.derinlik Armut 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,2± 0,2 BC 0,2± 0,2 C Kontrol 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C Chilopopdaların Ağustos ayı ikinci derinlikte, Nisan ayı birinci ve üçüncü derinliklerde, Ekim ayı üçüncü derinlikteki kontrol grupları Armut Bahçesi ndeki populasyonlara göre yüksek, diğer dönemler ve derinlikler için ise aralarında önemli bir fark olmadığı belirlenmemiştir (Çizelge 4.16). Çizelge 4.16 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan chilopodaların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,6 ± 0,5 BC 0,8± 0,5 BC 0,4± 0,5 C 1,6± 0,5 B 0,6± 0,5 BC Kontrol 0,8± 0,5 BC 0,0± 0,5 D 0,4± 0,5 C 2,6± 0,5 AB 1,0± 0,5 B 2.derinlik Armut 0,6± 0,5 BC 0,4± 0,5 C 0,4± 0,5 C 2,4± 0,5 AB 0,8± 0,5 BC Kontrol 4,2± 0,5 A 0,0± 0,5 D 0,4± 0,5 C 2,4± 0,5 AB 0,6± 0,5 BC 3.derinlik Armut 0,2± 0,5 C 0,0± 0,5 C 1,0± 0,5 B 1,6± 0,5 B 0,4± 0,5 C Kontrol 0,0± 0,5 D 0,0± 0,5 D 0,8± 0,5 BC 3,6± 0,5 A 1,0± 0,5 B 54

72 Coleopterler Ağustos birinci derinlikte, Aralık ayında birinci ve ikinci derinliklerde, Şubat ayı üçüncü derinlikte, Nisan ayında farklı derinliklerdeki, Armut Bahçesi populasyonlarının kontrol grubuna göre yüksek olduğu belirlenirken, diğer dönemler ve derinlikleri arasında önemli bir fark saptanmamıştır (Çizelge 4.17). Çizelge 4.17 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan coleopteraların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 1.derinlik 2.derinlik 3.derinlik Armut Kontrol Armut Kontrol Armut Kontrol 2,2± 0,5 B 1,0± 0,5 C 1,0± 0,5 C 1,0± 0,5 C 0,0± 0,5 D 0,6± 0,5 CD Aralık 09 3,2± 0,5 AB 1,3± 0,5 C 3,2± 0,5 AB 1,0± 0,5 C 1,2± 0,5 C 0,6± 0,5 CD Şubat 10 0,8± 0,5 CD 1,8± 0,5 BC 1,0± 0,5 C 1,8± 0,5 BC 1,8± 0,5 BC 1,4± 0,5 C Nisan 10 3,8± 0,5 AB 2,0± 0,5 B 3,4± 0,5 AB 1,4± 0,5 C 4,0± 0,5 A 1,6± 0,5 C Ekim 10 0,8± 0,5 CD 2,6± 0,5 B 1,8± 0,5 BC 2,4± 0,5 B 2,0± 0,5 B 2,0± 0,5 B Dipterler Aralık ayının 1. derinliğinde ve Nisan ayının 1. derinliğinde Armut Bahçesi populasyonlarının kontrol gruplarına göre yüksek; Ağustos ayında 1. ve 2. derinliklerde, Şubat 3. derinliğinde, Nisan 2. ve 3. derinliklerde daha düşük olduğu, diğer dönemler ve derinlikler arasında önemli bir fark olmadığı saptanmıştır (Çizelge 4.18). Çizelge 4.18 Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi nden ve ilaç uygulanmamış alanlardan alınan dipteraların populasyonlarındaki değişimler Derinlik Muamele Ağustos 09 Aralık 09 Şubat 10 Nisan 10 Ekim 10 1.derinlik Armut 0,4 ± 0,2 0,6± 0,2 B 0,8± 0,2 B 0,6± 0,2 B 1,4± 0,2 A Kontrol 0,6± 0,2 B 0,0± 0,2 C 0,4± 0,2 B 0,0± 0,2 C 1,0± 0,2 A 2.derinlik Armut 0,2± 0,2 BC 0,0± 0,2 C 0,2± 0,2 BC 0,0± 0,2 C 0,4± 0,2 B Kontrol 0,6± 0,2 B 0,4± 0,2 B 0,4± 0,2 B 0,4± 0,2 B 1,4± 0,2 A 3.derinlik Armut 0,4± 0,2 B 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,0± 0,2 C 0,4±± 0,2 B Kontrol 0,0± 0,2 C 0,4± 0,2 B 0,4± 0,2 B 0,4± 0,2 B 0,4± 0,2 B 55

73 4.2.2 Haymana Çiftliği Buğday ve Mısır Tarlaları toprak canlılarının değişimleri Haymana Çiftliği nde bulunan Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası ndaki üç farklı derinlikten (0 5, 5 10 ve cm) toprak örnekleri toplandıktan sonra, yıkanıp canlılarının sınıfladırılması ve sayımı yapılmıştır. Toprak altında bulunan arthropodların takım veya familyaları binoküler mikroskop ile incelenip, 13 farklı canlı bulunduğu belirlenmiştir. Bunlar; Collembola, Diplura,Protura, Crustacea, akar, solucan, yalancı akrepler, örümcek, karınca, Diplopoda, Chilopoda, Coleoptera, Dipteradır. Haymana Çiftliği nde Mısır Tarlası nda farklı derinliklerde bulunan collembola populasyonları ilaç uygulanmamış alana göre daha fazla, Buğday Tarlası ikinci ve üçüncü derinliklerinde oldukça yüksek, birinci derinlikteki miktarda ise önemli bir fark bulunmamıştır. Collembola populasyonlarının genel olarak ilaç uygulanmamış alanda, Buğday Tarlası ve Mısır Tarlası na göre oldukça yüksek olduğu görülmüştür (Çizelge 4.19). Çizelge 4.19 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden elde edilen collembola sayısı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 18,8 ± 3,1 A 9,2 ± 3,1 C 20 ± 3,1 A 2.Derinlik 16 ± 3,1 AB 14.4 ± 3,1 AB 24 ± 3,1 A 3.Derinlik 8,4 ± 3,1 C 8,2 ± 3,1 C 10,8 ± 3,1 B Toplam 14,4 ± 1,8 AB 10,6 ± 1,8 B 18,3 ± 1,8 A Çizelge incelendiğinde diplura ve protura populasyonlarının ilaç uygulanmamış alanda farklı derinliklerde Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre daha yüksek, Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası nın farklı derinlikleri arasında ise önemli derecede farklılık gözlenmiştir. 56

74 Çizelge 4.20 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden Diplura sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 2,2 ± 0,4 BC 1 ± 0,4 C 4 ± 0,4 A 2.Derinlik 1,2 ± 0,4 C 1,4 ± 0,4 C 3,6 ± 0,4 AB 3.Derinlik 2 ± 0,4 C 1 ± 0,4 C 2,4 ± 0,4 B Toplam 1,8 ±0,2 B 1,1±0,2 B 3,3 ±0,2 A Çizelge 4.21 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden proturaların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 1,4 ± 0,4 B 1,4 ± 0,4 B 3 ± 0,4 A 2.Derinlik 1 ± 0,4 B 1,4 ± 0,4 B 3 ± 0,4 A 3.Derinlik 1 ± 0,4 B 0,6 ± 0,4 B 1,8 ± 0,4 AB Toplam 1,1 ±0,2 B 1,1 ±0,2 B 2,6 ±0,2 A Crustacealar ilaç uygulanmamış alanında birinci derinlikte Mısır Tarlası na göre yüksek iken, Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası nın farklı derinliklerinde önemli bir fark yoktur. İlaç uygulanmamış alan populasyonlarının Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre oldukça yüksek olduğu görülmüştür (Çizelge 4.22). 57

75 Çizelge 4.22 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden crustaceaların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 1 ± 0,4 AB 0,6 ± 0,4 B 2 ± 0,4 AB 2.Derinlik 1 ± 0,4 AB 0,8 ± 0,4 AB 0,8 ± 0,4 AB 3.Derinlik 1 ± 0,4 AB 0,8 ± 0,4 AB 2,2 ± 0,4 B Toplam 1 ±0,2 AB 0,7 ±0,2 B 1,6 ±0,2 A Çizelge 4.23 incelendiğinde akarlar Mısır ve Buğday tarlalarında ikinci derinlikte ilaç uygulanmamış alana göre oldukça yüksek, Buğday Tarlası nın populasyonlarının ise Mısır Tarlası ndakinden daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Çizelge 4.23 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden akarların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 8,2 ± 0,8 A 4,6 ± 0,8 B 6,2 ± 0,8 A 2.Derinlik 5,6 ± 0,8 AB 5,4 ± 0,8 AB 4,6 ± 0,8 B 3.Derinlik 7 ± 0,8 A 3,2 ± 0,8 C 4,8 ± 0,8 B Toplam 6,9 ±0,5 A 4,4 ± 0,5 B 5,2 ± 0,5 AB Solucanlar, yalancı akrepler, örümcekler, karıncalar için farklı muameleler ve derinlikler arasında çok önemli bir fark saptanmamıştır (Çizelge ). 58

76 Çizelge 4.24 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden solucanların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 2,8 ± 0,4 A 2,2 ± 0,4 AB 2,4 ± 0,4 AB 2.Derinlik 1,2 ± 0,4 B 2,6 ± 0,4 AB 1,8 ± 0,4 AB 3.Derinlik 2,2 ± 0,4 AB 1,8 ± 0,4 AB 2 ± 0,4 AB Toplam 2,1 ±0,2 A 2,2± 0,2 A 2,1 ±0,2 A Çizelge 4.25 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden yalancı akreplerin sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 0,8 ± 0,3 A 1 ± 0,3 A 1,2 ± 0,3 A 2.Derinlik 0,6 ± 0,3 A 0,8 ± 0,3 A 1,2 ± 0,3 A 3.Derinlik 1 ± 0,3 A 0,4 ± 0,3 A 0,6 ± 0,3 A Toplam 0,7 ±0,2 A 0,8 ±0,2 A 1± 0,2 A 59

77 Çizelge 4.26 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden örümceklerin sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 0,8 ± 0,4 AB 1 ± 0,4 AB 2 ± 0,4 A 2.Derinlik 1,2 ± 0,4 AB 1,2 ± 0,4 AB 1,6 ± 0,4 AB 3.Derinlik 1,6 ± 0,4 AB 0,4 ± 0,4 B 1,2 ± 0,4 AB Toplam 0,8 ±0,2 A 1,2± 0,2 A 1,6 ±0,2 A Çizelge 4.27 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden karıncaların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 8,2 ± 2,9 AB 6,8 ± 2,9 B 5,8 ± 2,9 C 2.Derinlik 14,8 ± 2,9 A 17 ± 2,9 A 8,4 ± 2,9 AB 3.Derinlik 9,4 ± 2,9 AB 9 ± 2,9 AB 16,4 ± 2,9 A Toplam 10,8 ±1,7 A 10,9 ±1,7 A 10,2 ±1,7 A Çizelge 4.28 incelendiğinde diplopodların ilaç uygulanmamış alanlarında birinci ve ikinci derinliklerde önemli derecede bir fark belirlenmemiştir. Diplopoda populasyonlarının ilaç uygulanmamış alanda Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre yüksek olduğu belirlenmiştir. 60

78 Çizelge 4.28 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden Diplopodaların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 0,2 ± 0,2 A 0± 0,2 A 0,6 ±0,2 A 2.Derinlik 0 ±0,2 A 0,2 ±0,2 A 0,4±0,2 A 3.Derinlik 0 ±0,2 C 0 ±0,2 C 0,6 ±0,2 A Toplam 0,06 ±0,1 B 0,06± 0,1 B 0,5± 0,1 A Chilopodlar ve dipterler arasında uygulanan farklı muamelelere ve derinliklere göre önemli bir farklılık olmadığı saptanmıştır. Coleoptera populasyonlarının ilaç uygulanmamış alanlarda, Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası ndakine göre daha fazla olduğu gözlenmiştir (çizelge ). Çizelge 4.29 Haymana Çiftliği ndeki topraktan alınan örneklerden chilopodaların sayımı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 0,8 ± 0,4 A 0,4 ± 0,4 A 1,2 ±0,4 A 2.Derinlik 0,4 ±0,4 A 0,8 ±0,4 A 1 ±0,4 A 3.Derinlik 0,6 ±0,4 A 0,8 ±0,4 A 0,8 ±0,4 A Toplam 0,6 ±0,2 A 0,6±0,2 A 1 ±0,2 A 61

79 Çizelge 4.30 Haymana Çiftliğindeki topraktan alınan örneklerin coleopteralarının saymı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 3,4 ± 0,5 A 2,8 ± 0,5 B 4,4 ±0,5 A 2.Derinlik 2,4 ±0,5 B 1,6 ±0,5 B 3,4±0,5 A 3.Derinlik 2,6 ±0,5 B 2 ±0,5 B 3,2 ±0,5 A Toplam 2,8 ±0,2 B 2,1 ±0,2 B 3,6 ±0,2 A Çizelge 4.31 Haymana Çiftliğindeki topraktan alınan örneklerin Dipteralarının saymı Derinlik Bugday Tarlası Mısır Tarlası İlaç uygulanmamış alanı 1.Derinlik 1 ± 0,4 A 0,4 ± 0,4 A 1,2 ±0,4 A 2.Derinlik 0,8 ±0,4 A 0,4 ±0,4 A 1 ±0,4 A 3.Derinlik 1 ±0,4 A 0,4 ±0,4 A 0,8 ±0,4 A Toplam 0,9 ±0,2 A 0,4 ±0,2 A 1 ±0,2 A Birçok herbisitin toprak faunası üzerinde tahrip edici etkileri belirlenmiştir (Eijsackers,1980). Glyphosate tarladaki (Santillo, 1989 ve Brust, 1990) ve laboratuardaki arthropodlara karşı zararlı bulunmuştur (Eijsackers, 1985, Hassan vd. 1988). Tarla sınırlarına glyphosate uygulanmasının, glyphosate konsantrasyonunun artmasıyla, miktarın azalması şeklinde; örümceklerin, karabid arılarının ve böceklerin miktarını azalttığı rapor edilmiştir (Haughton vd. 1999). 62

80 4.2.3 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde yapılan denemede toprak canlılarının pestisitlere karşı duyarlılığı Geniş spekturumlu insektisit (Imidacloprid and Methiocarb), fungisit (Bordo bulamacı) ve herbisitlerin (Glyphosate) hedef alınmayan organizmalara olan etkisini belirlemek için Ankara Üniversitesi Bitki Koruma Bölümü nde 2010 yılında deneme kurulmuştur. İstatistiksel analiz ile elde edilen sonuçlara göre; belirtilen üç farklı dönemde uygulanan farklı kimyasallar ve toprakta yaşayan bazı omurgasızlar arasındaki etkileşimin (F: 3.733, P: ve N: 30) yanı sıra, dönemler ile toprak omurgasızları arasında etkileşim (F: 2.675, P: 0.016, N: 40) arasındaki fark dikkate değer bulunmuştur. Pestisit ve farklı toprak derinliklerinde (F: 2.386, P: ve N: 10), ayrıca örnekleme dönemi; pestisitler, toprak ormurgasızları ve derinlikler arasındaki etkileşim arasında önemli bir fark gözlenmiştir (F: 0.759, P: 0.747). Bu çalışmada toprak derinlikleri ve örnekleme dönemleri arasında önemli bir istatistiki fark tespit edilmemiştir (F: 0.67, P: 0.512). Çizelge de bütün pestisitlerin (Bordo bulamacı, Glyphosate, Methiocarb ve Imidacloprid) uygulandığı collembollerin hassasiyetinin, Bordo bulamacı ve methiocarb uygulanmış toprak solucanlarının yanı sıra akar ve karıncalara kıyasla oldukça yüksek olduğu gösterilmiştir. Ancak glyphosate ve imidacloprid uygulanmış toprak solucanlarında dikkate değer bir fark gözlenmemektedir. Buna karşın, bu çalışmada akarların sadece imidacloprid uygulamasına yüksek hassasiyet gösterdiği, bunun dışındaki pestisitlere herhangi bir etki göstermediği tespit edilmiştir. 63

81 Çizelge 4.32 Bazı toprak omurgasızlarına (collembola, toprak solcanları, akarlar ve karıncalar) uygulanan dört farklı pestisitin (bordo bulamacı, glyphosate, methiocarb ve imidacloprid) etkisi Uygulanan Pestisitler Collembolalar Ortalama + SE Toprak Solcanları Ortalama+ SE Akarlar Ortalama + SE Karıncalar Ortalama + SE Bordeaux 84.11±2.97 A a ± 5.13 B b ± 5.49 B c ± 6.02 A ab Glyphosate ± 3.08 A a ± 5.32 A a 8.55 ± 3.27 B c ± 7.27 BC b Methiocarb ± 4.46 A a ± 5.53 B b ± 4.75 B c ± 6.92 C b Imidacloprid ± 3.35 A a ± 4.48 A a 67.63±4.58 Ab ± 6.00 AB b *Büyük harfler yukarıdan aşağı farklılaşmaları, küçük harfler ise soldan sağa doğru farklılaşmaları göstermektedir. Yanyana bulunan aynı harfler dikkate değer bir farklılık olmadığı anlamına gelmektedir. (P<0.05). Şekil 4.1 Farklı pestisitlerin (bordo bulamacı, glyphosate, methiyokarb ve imidacloprid) uygulandığı deneme parsellerinde üç farklı dönemde (Mayıs, Temmuz ve Ağustos, 2010) hedef dışı toprak ormurgasızları (collembola, toprak solucanları, akarlar ve karıncalar) üzerine etkisi 64

82 Çizelge 4.33 Bazı toprak omurgasızları (collembola, toprak solcanları, akarlar, karıncalar) ile farklı örnekleme dönemlerinin (Mayıs, Haziran ve Ağustos, 2010) etkileşimi Örnekleme Dönemleri Collembolalar Mean + SE Toprak Solcanları Mean + SE Akarlar Mean + SE Karıncalar Mean + SE Mayıs ± 3.56 A a 64.31±5.67 B b ± 5.34 B c ± 6.10 A b Temmuz ± 2.34 A a ± 4.41 AB ± 5.84 A c ± 5.76 A b Ağustos ± 3.14 A a ± 4.02 A a ± 5.19 AB c ± 5.53 B b *Büyük harfler yukarıdan aşağı farklılaşmaları, küçük harfler ise soldan sağa doğru farklılaşmaları göstermektedir. Yanyana bulunan aynı harfler dikkate değer bir farklılık olmadığı anlamına gelmektedir (P<0.05). Bu çalışma süresince elde edilen bilgiler, toprak omurgasızlarının (collembola, toprak solcanı, akar ve karıncalar) hassasiyetinin farklı kimyasalların uygulanışı ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. Sonuç olarak collembolalar farklı dönemlerde uygulanan bütün pestisitlerden zarar görmüş ve yüksek duyarlılık göstermiştir. Bu durum pestisit risklerinin yanı sıra collembolaların toprakta hareketlerinin az olmasından da kaynaklanabilir (Şekil 4.1). Bu çalışmada, collembolalar, akar, karınca ve toprak solucanlarına göre fungusit (bordo bulamacı), neonikotinoit (imidacloprid) ve karbamatlı (methiocarb) pestisit uygulamalarında daha fazla etkilenmişlerdir. Fakat, herbisit uygulamalarında herhangi bir farklılık gözlemlenmemiştir. Bu durum collembolaları kronik (chlorpyrifos) ve aralıklı (azinphos methyl) şekilde pestisitlere maruz bırakarak denemeler yürüten Reinecke ve Reinecke (2007) nin sonuçları ile uyuşmaktadır. Elde edilen sonuçlar Geoff. vd. (2006) nın toprak omurgasızlarının pestisit riskini tahmin etmek için yaptığı çalışmada elde edilen bulgulardan çok farklı değildir. Toplam olarak 250 pestisit ve 67 omurgasız taksonunun bulunduğu 1950 laboratuvar toksisite verisi bulunmuştur. Pestisitlerin büyük oranı (%96) beş veya daha az hedef dışı organizma için toksisite verisine sahiptir. Bu çalışmada ayrıca arthropodalar ve oligoketlerin bu pestisitlerin çoğuna farklı hassasiyet sergiledikleri belirtilmiştir. 65

83 Standart test toprak solucanı türü Eisenia fetida sensu lato, akut toksisite üzerine pestisitlere karşı en az duyarlı olan türü iken, standart collembolan test türü, Folsomia candida, toksik etkisi geniş alana sahip pestisitlere (biyosit, fungusit, herbisit ve insektisit) karşı en hassas türler içinde yer aldığı belirlenmiştir. Bu bulgular, toprak arthropodlarının pestisit risklerinin değerlendirmesinde rutin olarak test edilmeleri gerektiğini düşündürmektedir. Bu çalışmada, toprak solucanlarının duyarlılığı üç kez fungisit uygulanan collembolalar ile karşılaştırıldığında daha yüksek bulunmuştur. Bu sonuç toprak solucanlarına bir kez uygulanan fungisitlerin dikkate değer bir toksisite göstermediğini, ancak uygulamanın sıkça tekrarlanması durumunda toksisitenin artış gösterdiğini belirten Cong vd. (2010) çalışması ile desteklenmektedir. Santi vd. (2001), organikfosforlu ve karbamatlı pestisitlerin yoğun kullanımının bazı su kuşlarının ölümüne sebep olduğunu ve diğer hedef alınmayan organizmalar üzerinde direkt veya dolaylı yoldan etkileri olabileceğini kaydetmişlerdir. Önceki çalışmalarla 3 haftadan fazla bir sürede Lexington, Kentucky de toprak solucanlarına pestisitlerin bir kere uygulanması sonucunda dikkate değer bir baskılanmanın ortaya çıktığı rapor edilmiştir. (Potter vd. 1990, 1994). Ancak yürütülen tez çalışmasının sonuçları pestisitlerin birden fazla yapılan uygulamalarının collembolaların (yüksek hassasiyet), onları takiben sırası ile karıncalar, toprak solucanları ve akarların, varlıklarını azalttığını göstermiştir. Pestisitlerin Ağustos ayında görülen toprak solucanları için negatif etkileri varken, Mayıs ve Temmuz ayları için daha uzun bir negatif etkileri tespit edilememiştir. Ek olarak, toksik maddelerin olumsuz etkileri tüm uygulama dönemleri içerisinde akarlar ve karıncalar üzerinde görülmemiştir (Çizelge 4.34). Elde edilen sonuçlar, Cypermethrin in etkilerinin avcı arhtropodlar için negatif, diğer toprak organizmaları için pozitif, kloropirifos un etkilerinin arthropodanın varlığı ve taksonomik zenginliği üzerine bazı toprak omurgasızlarında sürekli negatif olduğunu çalışan Geoff (2007) ile benzerlik arz etmektedir. 66

84 Santos ve ark. (2010) aynı anda uygulanan farklı bitki koruma ürünlerinin toprakta yaşayan hedef dışı organizmalar üzerindeki toksikolojik etkilerini ve risklerini degerlendirmişlerdir. Dimetoat, glyphosate ve spirodiklofenin tarlalarda yapılan çalışmalar için tavsiye edilen dozlarda birlikte karıştırılması ve uygulanmasının, toprakta yaşayan hedef dışı organizmalar üzerindeki toksisitenin artmasına neden olmadığını, ancak sınırlı bir riskin bu pestisitlerin birlikte uygulanması ile ilişkili olduğunu da ayrıca belirtmişlerdir. 4.3 Biyokimyasal Sonuçlar Farklı örnekleme ve deneme alanlarından değişik dönemlerde alınan toprak örneklerinden izole edilen Collembola populasyonlarında biyokimyasal denemeler yürütülmüştür (Çizelge 4.35). Biyokimyasal çalışmalarda karboksilesteraz, mikrozomal esteraz, glutatyon S-transferaz ve asetilkolinesteraz enzimlerinin aktiviteleri uygun metotlarla saptanmıştır. Karboksilesteraz enzimi poliakrilamid jel elektroforez yöntemiyle bant desen profilleri bakımından incelenmiştir. Çizelge 4.34 Deneme alanlarından alınan toprak örneklerinden izole edilen collembola populasyonlarının farklı örnekleme zamanı Örnekleme yeri 1.örnekleme zamanı 2. örnekleme zamanı 3. örnekleme zamanı Haymana Haziran 2009 Ocak Ağustos 2010 Şubat x B.B.Armut Bahcesi Haziran Ocak 2010 Şubat Ağustos 2010 Ağustos 2010 Şubat 2011 Bitki Koruma Şubat Ağustos Ağustos 2010 Şubat x denemesi Karboksilesteraz aktivitesinin ölçüm sonuçları Karboksilesterazlar, aralarında piretroitler, organik fosforlular ve karbamatlıların da bulunduğu birçok pestisitin detoksifikasyonunda görev alırlar (Konno vd. 1990). 67

85 Böceklerde büyük bir enzim grubunu oluşturan karboksilesterazlar elektroforetik hareketlilikleri, substrat ve inhibitör spesifikliklerine göre ayırt edilebilmektedirler (Gölpınar, 2004). Armut Bahçesi, Haymana Çiftliği ve Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembolaların karboksilesteraz aktiviteleri α-naftil asetat (α-na) substratı kullanılarak mod/min/µg protein cinsinden ölçülmüştür. Armut bahçesinden izole edilen örneklerde karboksil esteraz aktivitesi tarım yapılmayan alandan izole edilen örneklerden istatistiki olarak önemli oranda farklıdır (p > 0.05). Çizelge 4.35 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme Yeri Ortalama ± SE Armut 13,31 ± 2,21 A Kontrol 6,81 ± 2,21 B Çizelge 4.36 incelendiğinde Armut Bahçesi nden (ilaç kullanılmış) izole edilen collembola populasyonunun enzim aktiviteleri, dönemler ve derinliklere bağlı olarak önemli oranda değişmektedir (p > 0.05). Birinci dönem ve birinci derinlikte, kontrole (ilaç kullanılmamış) göre esteraz aktivitelerinin yüksek olduğu gözlenirken, ikinci derinlikte ise istatistiki olarak önemli bir fark görülmemiştir. İkinci ve üçüncü dönemler arasında Armut Bahçesi nden alınan örnekler kontrol ile karşılaştırıldığında herhangi bir önemli fark gözlenmemiştir. 68

86 Çizelge 4.36 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarı belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği Örnekleme dönemi 1.dönem Armut Kontrol 2.dönem Armut Kontrol 3.dönem Armut Kontrol 1.Derinlik(Ortalama± SE) 2.Derinlik(Ortalama± SE) 3.Derinlik(Ortalama± SE) 48,33 ± 6,63 A 3,67 ± 6,63 BC 14,21 ± 6,63 BC 13,42 ± 6,63 BC 1,54 ± 6,63 C 1,43 ± 6,63 C 16,56 ± 6,63 B 9,29 ± 6,63 BC 12,18 ± 6,63 BC 11,12 ± 6,63 BC 3,17 ± 6,63 C 1,98 ± 6,63 C 9,84 ± 6,63 BC 7,29 ± 6,63 BC 11,62 ± 6,63 BC 11,25 ± 6,63 BC 2,34 ± 6,63 C 1,87 ± 6,63 C Armut Bahçesi örneklerinin karboksilesteraz aktivitesinin kontrole göre sadece birinci dönemde yüksek olduğu belirlenmiştir (Çizelge a baktığımızda deneme boyunca birinci ve ikinci derinliklerinde Armut Bahçesi nden alınan collembollerin karboksilesteraz aktivitesinin kontrole göre yüksek olduğunu görülmektedir. Çizelge 4.37 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme Dönemi 1.dönem (Ortalama± 2.dönem (Ortalama± 3.dönem (Ortalama± Örnekleme Yeri SE) SE) SE) Armut 24,91 ± 3,83 A 12,67 ± 3,83 B 2,35 ± 3,83 B Kontrol 6,75 ± 3,83 B 11,93 ± 3,83 B 1,76 ± 3,83 B 69

87 Çizelge 4.38 Armut Bahçesi nden farklı derinliklerden alınan collembollerin karboksilesteraz miktarlarının ortalama sonuçları (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği 1. derinlik Ortalama± SE 2. derinlik Ortalama ± SE 3. derinlik Ortalama ± SE Armut 21,36 ± 3,83 A 10,64 ± 3,83 AB 7,93 ± 3,83 B Kontrol 6,17 ± 3,83 B 7,46 ± 3,83 B 6,80 ± 3,83 B Haymana Çiftliği nde Buğday Tarlası ve Mısır Tarlası ndan alınan collembola populasyonlarının karboksilesteraz aktivitesi mod/µl/µg protein cinsinden oranı belirlenmiştir. Kontrolden alınan collembola populasyonunun genel olarak Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre karboksilesteraz aktivitesinin yüksek olduğu tespit edilmiştir (p > 0.05, Çizelge 4.41). Birinci dönem ve ikinci derinlikte kontrolün karboksilesteraz aktivitesinin, Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre yüksek olduğu görülmüştür. İkinci dönemin farklı derinliklerinin karboksilesteraz aktivitesi değerleri arasında istatistiki olarak önemli bir fark gözlenmemiştir (Çizelge 4.40). Kontrolün farklı derinlikler arasında Mısır ve Buğday Tarlaları na göre karboksilesteraz aktivitesinin yüksek olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.41). Kontroldeki yüksek artış nedeni Haymana Çifliği nde kullanılmamış alanların kimyasal ürünlerle bulaşık olmasıdır. Çizelge 4.39 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Ürün (Ortalama± SE) Buğday 3,25 ± 1,06 B Mısır 3,84 ± 1,06 B kontrol 7,14 ± 1,06 A 70

88 Çizelge 4.40 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, mod/µl/µg protein (derinlik ve dönemler arasında) Örnekleme derinliği Örnekleme dönemi 1.dönem Buğday Mısır Kontrol 2.dönem Buğday Mısır Kontrol 1.Derinlik Ortalama± SE 2.Derinlik Ortalama± SE 3.Derinlik Ortalama± SE 2,62 ± 1,59 C 3,00 ± 1,59 C 6,36 ± 1,59 BC 7,83 ± 2,59 BC 3,90 ± 2,59 BC 3,33 ± 1,59 BC 6,13 ± 1,59 BC 19,64 ± 1,59 A 11,68 ±1,59 B 2,78 ± 1,59 C 2,22 ± 1,59 C 2,53 ± 1,59 C 2,93 ± 1,59 C 2,87 ± 1,59 C 2,19 ± 1,59 C 1,88 ± 1,59 C 1,74 ± 1,59 C 1,74 ± 1,59 C Çizelge 4.41 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, derinlik arasında (mod/µl/µg protein) Ürün 1.derinlik Ortalama± SE 2. derinlik Ortalama ± SE 3. derinlik Ortalama ± SE Buğday 2,70 ± 1,49 B 2,6 ± 1,49 B 4,45 ± 1,49 B Mısır 5,38 ± 1,49 AB 3,36 ± 1,49 B 2,76 ± 1,49 B Kontrol 4,00 ± 1,49 B 10,70 ± 1,49 A 6,71 ±1,49 AB Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembola populasyonlarının karboksilesteraz aktivitesi oranı mod/µl/µg protein cinsinden belirlenmiştir. Bordo bulamacının birinci dönemde glyphosate, metyokarb, imidacloprid ve kontrol ile karşılaştırıldığında karboksilesteraz aktivitesinin yüksek olduğu saptanmıştır. Bu ilaçlarda ve kontrol grubu birinci derinlikte ikinci derinliğe göre artış olduğu gözlenmiştir. İkinci dönemde farklı derinlikler, ilaçlar ve kontrol grubu arasında karboksilesteraz aktivitesi değerlerinde çok önemli bir fark gözlemlenmemiştir. Çizelge incelendiğinde Bitki Koruma Bölümü Bahçesi ndeki collembola 71

89 populasyonuna deneme süresince uygulanan farklı ilaçların kontrol grubuna göre karboksilesteraz aktivitesinin yüksek olduğu ortaya çıkmıştır (p > 0.05). Böceklerin artan karboksilesteraz aktivitesinin organik fosforlu bileşiklere karşı direnç oluşturması önceki çalışmalarla belirlenmiştir (Mouches vd ve Devonshire and Field, 1991). Stone vd. (2002) kronik kirlenmeye maruz kalan karabidlerin, kirli çevrelerde yaşamak için daha fazla enerjiye ihtiyaç duyduğu ve potansiyel tehlike için daha az rezerv bıraktığını, karabidlerin ek kimyasal etkileyicilere karşı yüksek hassasiyet sergilediğini belirtmiştir. Diğer taraftan Stone vd. (2002) başka bir çalışmalarında metal kirlilik değişimi boyunca lokalize olmuş kuvvetli bir şekilde kirlenmiş alanlardaki Pterostichus oblongopunctatus un, daha az kirlenmiş habitatlardan olan bu böcek türlerinden daha yüksek detoksifiye edici enzim aktivitesine sahip olduğunu rapor etmiştir. Enzimlerin yükseltilmiş seviyeleri enerji rezervlerini azaltmaya katkıda bulunabilir. Onun çalışmalarında Stone'nun bulgularına zıt olarak (Babczyńska vd. 2006), tek bir herbisit zehirlenmesinden sonra fazlaca kirlenmiş iki alandan olan Agelena labyrinthica detoksifiye edici enzimlerin basal bir seviyesini sürdürebilme yeteneğindedir. Daha az kirli ekosistemlerden hemen zehirlenen bireylerdeki bu enzimlerin aktivitesi kontrol örümceklerinde olduğundan ciddi derecede daha düşüktür. Çizelge 4.42 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin karboksilesteraz miktarının belirlenmesi, farklı derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) İlaçlar Örnekleme zamani 1.Dönem 1.Derinlik 2.Derinlik Bordo bulamacı Ortalama± SE 8,99 ± 1,01 A 7,72 ± 1,01 A Glyphosate Ortalama± SE 6,10 ± 1,01 ABC 8,70 ± 1,01 A Metyokarb Ortalama± SE 7,44 ± 1,01 AB 11,68 ± 1,01 B İmidakloprit Ortalama± SE 6,56 ± 1,01 AB 6,81 ± AB Kontrol Ortalama± SE 7,22 ± 1,01 AB 4,74 ± 1,01 C 2.Dönem 1.Derinlik 2.Derinlik 3,12 ± 1,01 D 1,22 ± 1,01 F 1,65 ± 1,01 F 2,03 ± 1,01 E 3,23 ± 1,01 D 2,48 ± 1,01 E 3,55 ± 1,01 D 2,45 ± 1,01 E 1,68 ± 1,01 F 1,78 ± 1,01 F 72

90 Çizelge 4.43 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesi Örnekleme zamani İlaç 1.dönem Ortalama± SE 2.dönem Ortalama± SE Bordo bulamacı 8,36 ± 0,71 A 7,38 ± 0,71 B Glyphosate 7,00 ± 0,71 B 5,32 ± 0,71 BC Metyokarb 5,98 ±0,71 B 2,17 ± 0,71 C İmidakloprit 1,84 ± 0,71 D 2,86 ± 0,71 CD Kontrol 3,00 ±0,71 CD 1,73 ± 0,71 D Çizelge 4.44 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin derinlikler arasında karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesi Örnekleme derinliği ilaç 1.derinlik mod/µl/µg protein (Ortalama± SE) Bordo bulamacı 6,05 ± 0,71 A 4,47 ± 0,71 AB Glyphosate 3,86 ± 0,71 AB 5,36 ± 0,71 AB Metyokarb 5,34 ± 0,71 AB 4,53 ±0,71 AB İmidakloprit 5,18 ± 0,71 AB 3,14 ± 0,71 B Kontrol 4,45 ± 0,71 AB 3,26 ± 0,71 AB 2. derinlik mod/µl/µg protein (Ortalama± SE) Çizelge 4.45 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin karboksilesteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Muamele Bordo bulamacı Ortalama± SE 5,27 ± 0,50 A Glyphosate 4,61 ± 0,50 A Metyokarb İmidakloprit Kontrol 4,93 ± 0,50 A 4,16 ± 0,50 A 3,15 ± 0,50 B 73

91 4.3.2 Mikrozomal esteraz aktivitesinin ölçüm sonuçları Armut Bahçesi, Haymana çiftliği ve Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembollerin mikrozomal esteraz aktiviteleri belirlenerek, mod/min/µg protein cinsinden ölçülmüştür. Deneme süresince genel olarak kontrol grubunun Armut örneklerinden oldukça yüksek bir mikrozomal esteraz aktiviteye sahip olduğu görülmüştür (p > 0.05, çizelge 4.46). Çizelge incelenmesi sonucunda Armut Bahçesi nden (ilaç uygulanmış) alınan collembola populasyonlarının mikrozomal esteraz aktiviteleri birinci dönemde farklı derinlikler arasında kontrol grubuna (ilaç uygulanmamış) göre istatistiki olarak önemli bir farkı gözlenmemiştir. İkinci dönem üçüncü derinliğinde kontrol daha yüksek, diğer derinlikler arasında ise çok önemli bir değişiklik saptanmamıştır. Deneme süresinde farklı derinliklerde genel olarak kontrol grubunun Armut örneklerinden daha yüksek bir mikrozomal esteraz aktiviteye sahip olduğu gözlemlenmiştir (Çizelge 4.49). Çizelge 4.46 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Ürün Ortalama ± SE Armut 0,50 ± 0,0001 AB Kontrol 0,78 ± 0,0001 A Çizelge 4.47 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlik ve dönemler arasında mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği Örnekleme zamanı 1.dönem Armut Kontrol 2.dönem Armut Kontrol 1.Derinlik Ortalama± SE 2.Derinlik Ortalama± SE 3.Derinlik Ortalama± SE 0,12 ± 0,0001 C 0,31± 0,0001 C 1,14 ±0,0001 AB 1,60± 0,0001 A 0,17 ± 0,0001 C 0,23± 0,0001 C 1,04± 0,0001 AB 1,23 ± 0,0001 AB 0,37 ± 0,0001 C 0,31 ± 0,0001 C 0,15 ±0,0001 C 0,98±0,0001 B 74

92 Çizelge 4.48 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme zamanı Ürün 1.dönem Ortalama± SE 2.dönem Ortalama± SE Armut 0,22 ± 0,0001 C 0,78 ± 0,0001 B Kontrol 0,28 ± 0,0001 C 1,27 ± 0,0001 A Çizelge 4.49 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlikler arasında mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği 1.derinlik Ortalama± 2. derinlik Ortalama ± SE 3. derinlik Ortalama ± SE Ürün SE Armut 0,63 ± 0,0001 AB 0,60 ± 0,0001 B 0,26 ±0,0001 C Kontrol 0,96 ± 0,0001 A 0,73 ± 0,0001 AB 0,65 ± 0,0001 AB Haymana Çiftliği nde Buğday Tarlası ve Mısır Tarlası ndan alınan collembola populasyonların mikrozomal esteraz aktivitesinin mod/µl/µg cinsinden protein oranı incelenmiştir. Çizelge incelendiğinde farklı derinliklerde kontrol grubunun, Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası na göre daha düşük mikrozomal esteraz aktivitesine sahip olduğu gözlenmiştir. Buğday Tarlası nın ise Mısır Tarlası na göre mikrozomal esteraz aktivitesinin yüksek olduğu gözlenmiştir. Mikrozomal esteraz aktivitesi için birinci derinliğin, ikinci ve üçüncü derinliklere göre daha yüksek olduğu görülmüştür. 75

93 Çizelge 4.50 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin derinlik ve dönemler arasında mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği Ürün 1.Derinlik(Ortalama± SE) 2.Derinlik(Ortalama± SE) 3.Derinlik(Ortalama± SE) Buğday 2,39 ± 0,0001 B 2,95 ± 0,0001 A 1,61 ±0,0001 D Mısır 2,69 ± 0,0001 AB 2,09 ± 0,0001 C 2,13 ± 0,0001C Kontrol 1,45 ± 0,0001 DC 1,32 ± 0,0001 DC 1,18 ± 0,0001 E Çizelge 4.51 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi Örnekleme derinliği mod/µl/µg protein (Ortalama± SE) 1. derinlik 2,17 ± 0,0001 A 2.derinlik 2,12 ± 0,0001 B 3.derinlik 1,64 ± 0,0001 C Çizelge 4.52 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (genel olarak) Ürün mod/µl/µg protein (Ortalama± SE) Buğday 3,32 ± 0,0001 A Misir 2,30 ± 0,0001 B Kontrol 1,32 ± 0,0001 C Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembola populasyonlarının mikrozomal esteraz aktivitesinin mod/µl/µg cinsinden protein oranı ayrıca belirlenmiştir. Bordo bulamacı birinci dönemde glyphosate, metyokarb, imidacloprid ve kontrol grubu karşılaştırması yapıldığında bordo bulamacı birinci döneminin 76

94 mikrozomal esteraz aktivitesinin yüksek olduğu görülmüştür. Bu ilaçlar ve kontrol grubunun birinci derinlikte, ikinci derinliğe göre artış olduğu gözlenmiştir. İkinci dönem farklı derinlikler, ilaçlardan metyokarb dışında ve kontrol grubu arasında mikrozomal esteraz aktivitesinde çok önemli bir fark gözlemlenmemiştir. İkinci dönem metyokarb ilacı uygulanan örnekler, birinci derinliğin ikinci derinliğe göre yüksek olduğu tespit edilmiştir. Çizelge incelendiğinde Bitki Koruma Bölümü Bahçesi ndeki deneme süresince ikinci dönem farklı ilaçlar ve kontrol grubu arasında collembola populasyonunun mikrozomal esteraz aktivitesinde istatisitiki olarak fark bulunmamıştır. Sonuç olarak bordo bulamacının diğerlerine göre daha yüksek bir mikrozomal esteraz aktiviteye sahip olduğu görülmüştür (Çizelge 4.55). Gopalan vd. (1997) çalışmalarında farklı naftil substratları kullanılarak enzim aktivitesinin saptanmasıyla karboksilesteraz izoenzimlerinin tespiti için daha anlamlı olacağını ve sivrisineklerdeki dayanıklılık geliştirme mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacağını belirtmişlerdir. Çizelge 4.53 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) ilaç 1.dönem 1.Derinlik 2.Derinlik Bordo bulamacı (Ortalama± SE) 7,65 ± 0,51 A 7,39 ± 0,51 AB Glyphosate (Ortalama± SE) 5,29 ± 0,51 C 4,54 ± 0,51 CD Metyokarb (Ortalama± SE) 7,16 ± 0,51 AB 2,53 ± 0,51 D İmidakloprit (Ortalama± SE) 5,70 ± 0,51ABC 4,26 ± 0,51 CD Kontrol (Ortalama± SE) 5,45 ± 0,51 BC 3,90 ± 0,51 CD 2.dönem 1.Derinlik 2.Derinlik 0,82 ± 0,51 E 0.94 ± 0,51 E 0,89 ± 0,51 E 0,89 ± 0,51 E 2,03 ±0,51 C 1,12 ±0,51 E 0,80 ± 0,51 E 0,96 ± 0,51 E 0,97 ± 0,51 E 0,69 ± 0,51 E 77

95 Çizelge 4.54 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme zamanı ilaç 1.dönem (Ortalama± SE) 2.dönem (Ortalama± SE) Bordo bulamacı 7,52 ± 0,36 A 0,88 ± 0,36 C Glyphosate 4,91 ± 0,36 B 0,76 ± 0,36 C Metyokarb 4,85 ± 0,36 B 1,58 ± 0,36 C İmidakloprit 4,98 ± 0,36 B 0,88 ± 0,36 C Kontrol 4,67 ± 0,36 B 0,83 ± 0,36 C Çizelge 4.55 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin mikrozomal esteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) İlaç Bordo bulamacı Glyphosate Metyokarb İmidakloprit Kontrol (Ortalama± SE) 4,20 ± 0,25 A 2,83± 0,25 B 3,21 ± 0,25 B 2,93 ± 0,25 B 2,76 ± 0,25 B Glutatyon- S- transferaz aktivitesinin ölçüm sonuçları Böceklerde GST aktivitesi genellikle yapay substrat CDNB ile ölçülmektedir. Bu bileşik glutatyon ile konjugasyona girerek böceklerde test edilen tüm GST izoenzimlerini katalizlemektedir (Clark, 1989). İnsektisit metabolizmasında GST lerin önemi ilk kez organik fosforlu bileşiklerin detoksifikasyonunda belirtilmiştir (Soderlund, 1997; Krishnan ve Kodrik, 2006). GST ler daha sonra böceklerde organik klorlu ve siklodien insektisitlere karşı çalışılmış ve bu insektisitler tarafından indüklendiği rapor edilmiştir (Clark, 1989, Lagadic vd. 1993; Yu, 2004). Çalışmamızda Armut Bahçesi nden alınan örneklere ait GST enzim aktiviteleri, substrat CDNB ile girdiği reaksiyonda kinetik olarak belirlenmiş ve 20 dakikadaki toplam enzim aktivite Optikal Dansitesi (O. D.) ortaya konulmuştur. 78

96 Armut Bahçesi, Haymana Çiftliği ve Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembollerin Glutatyon-S-Transferaz (GST) aktiviteleri belirlenerek, mod/min/µg protein cinsinden ölçülmüştür. Deneme süresince Armut Bahçesi nden alınan collembola örneklerinin glutatyon-stransferaz aktivitesinin kontrol grubuna göre genel olarak oldukça yüksek olduğu görülmüştür (p>0.05, Çizelge incelendiğinde Armut Bahçesi nden alınan collembola örneklerinin birinci derinlikte, ikinci ve üçüncü derinliklere göre glutatyon- S-transferaz aktivitesinde daha fazla artış olduğu görülmüştür. Armut Bahçesi nden alınan örnekler birinci dönemde birinci, ikinci ve üçüncü derinliklerde glutatyon-stransferaz aktivitesinin aynı derinliklerde olan kontrol grubundan daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Armut Bahçesi nden alınan örneklerin enzim aktivitesi birinci dönemde kontrol grubuna göre yüksek iken, ikinci ve üçüncü dönemlerinde Armut ve kontrol grubu arasında glutatyon-s-transferaz aktivitesinde önemli bir farka rastlanmamıştır (Çizelge 4.58). Deneme süresinde birinci derinlikte Armut Bahçesi nden alınan collembola örneklerinin glutatyon-s-transferaz aktivitesinin kontrol grubuna göre genel olarak oldukça yüksek olduğu görülmüştür (Çizelge 4.59). Çizelge 4.56 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Ürün Ortalama ± SE Armut 1,61 ± 0,14 A kontrol 1,27 ± 0,14 AB 79

97 Çizelge 4.57 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi,derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği 1.Derinlik(Ortalama± 2.Derinlik(Ortalama± 3.Derinlik(Ortalama± Örnekleme zamanı SE) SE) SE) 1.dönem Armut 3,49 ± 0,42 A 1,48 ± 0,42 C 1,12 ± 0,42 C Kontrol 1,19 ± 0,42 C 1,04 ± 0,42 CD 0,28 ± 0,42 D 2.dönem Armut 2,44 ± 0,42 BC 2,39 ± 0,42 BC 2,22 ± 0,42 BCD Kontrol 2,03 ± 0,42 BC 2,78 ± 0,42 B 2,65 ± 0,42 B 3.dönem Armut 0,42 ± 0,42 D 0,34 ± 0,42 D 0,59 ± 0,42 D Kontro 0,51 ± 0,42 D 0,44 ± 0,42 D 0,57 ± 0,42 D Çizelge 4.58 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Ürün 1.dönem (Ortalama± 2.dönem (Ortalama± 3.dönem (Ortalama± SE) SE) SE) Armut 2,03 ± 0,29 A 2,35 ± 0,29 A 0,45 ± 0,29 B Kontrol 0,84 ± 0,29 B 2,49 ± 0,29 A 0,51 ± 0,29 B Çizelge 4.59 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlikler arasında Glutatyon-S- Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Ürün 1.derinlik (Ortalama± SE) 2. derinlik (Ortalama ± SE) 3. derinlik (Ortalama ± SE) Armut 2,12 ± 0,24 A 1,40 ± 0,24 B 1,31 ± 0,24 B kontrol 1,24 ± 0,24 B 1,42 ± 0,24 B 1,17 ± 0,24 B 80

98 Deneme süresince Haymana Çiftliği nde Mısır Tarlası ve Buğday Tarlası ndan alınan örneklerin glutatyon-s-transferaz aktivitesinin kontrol grubuna göre genel olarak oldukça yüksek olduğu görülmüştür (p>0.05, Çizelge 4.60). Haymana Çiftliğinden alınan örneklerin birinci dönem üçüncü derinliğinde glutatyon-stransferaz aktivitesinin en yüksek oranı sırasıyla; Buğday, Mısır ve kontrol grubunda kaydedilmiştir. Örneklemelerde birinci ve ikinci derinlikler arasında GST aktivitesinin istatistiğinde çok önemli bir fark saptanmamıştır. İkinci dönemde bütün ürünlerden alınan örneklerde GST aktivitelerinde önemli bir fark yoktur (Çizelge 461). Mısır, Buğday ve kontrol grubunun GST aktivitelerinde birinci dönemde ikinci dönemden daha fazla artış olduğu görülmüştür (Çizelge 4.62). Çizelge 4.60 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Ürün Buğday (Ortalama± SE) 2,37 ± 0,31 A Mısır 2,07 ± 0,31 AB Kontrol 1,90 ± 0,31 ABC Çizelge 4.61 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin derinlik ve dönemler arasında Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği Örnekleme zamanı 1.dönem Buğday Misir Kontrol 2.dönem Buğday Mısır Kontrol 1.Derinlik(Ortalama± SE) 2,57 ± 0,75 BC 3,62 ± 0,75 B 3,88 ± 0,75 B 0,52 ± 0,75 CD 0,70 ± 0,75 CD 0,62 ± 0,75 CD 2.Derinlik(Ortalama±SE) 3,24 ± 0,75 B 3,38 ± 0,75 B 3,85 ± 10,75 B 0,53 ± 0,75 CD 0,69 ± 0,75 CD 0,54 ± 0,75 CD 3.Derinlik(Ortalama±SE) 6,81 ± 0,75 A 3,88 ± 0,75 B 1,90 ± 0,75 C 0,55 ± 0,75 CD 0,65 ± 0,75CD 0,59 ± 0,75 CD 81

99 Çizelge 4.62 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Glutatyon-S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme zamanı Ürün 1.dönem (Ortalama± SE) 2.dönem (Ortalama± SE) Buğday 4,21 ± 0,43 A 0,53 ± 0,43 B Mısır 3,46 ± 0,43 A 0,68 ± 0,43 B Kontrol 3,21 ± 0,43 A 0,58 ± 0,43 B Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembola populasyonlarının glutatyon-s-transferaz aktivitesinin mod/µl/µg cinsinden protein oranı ayrıca belirlenmiştir Çizelge 4.63 incelendiğinde Bitki Koruma Bölümü Bahçesi ndeki deneme süresince farklı ilaçlar ve kontrol grubu arasında collembola populasyonu GST aktivitesinin istatisitiğinde farklı bir sonuç bulunmamıştır. Bordo bulamacının mikrozomal esteraz aktivitesinin diğerlerine göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Glyphosate ve metyokarb birinci dönem ikinci derinlikte, birinci derinlik ile karşılaştırma yapıldığında glutatyon S- transferaz aktivitesinin yüksek olduğu görülmüştür. İmidakloprid birinci derinlik GST aktivitesinin, ikinci derinliğe göre daha yüksek belirlenmiştir. Bu ilaçlar ve kontrol grubunun ikinci dönem derinlikleri arasında istatistiki olarak önemli farklar gözlenmiştir (Çizelge 4.64). Çizelge 4.65 incelendiğinde imidaclopridin farklı dönemler arasında diğer ilaçlar ve kontrol grubuna göre enzim aktivitesi oranının yüksek olduğu tespit edilmiştir. Birçok araştırma bazı biyokimyasal ve fizyolojik işlemlerin yoğunluğunun çeşitli seviyelerde ağır metallerle kontamine olmuş bölgelerde yaşayan omurgasızlarda önemli derecede farklı olduğunu kanıtlamıştır. Bu hipotez böcekler (Stone vd. 2002), örümcekler (Wilczek vd. 2003, 2004) ve solucanlar (Łaszczyca vd. 2004) gibi çeşitli karasal omurgasız gruplarında doğrulanmıştır. Glutatyon (GSH) konsantrasyonu, genellikle glutatyon kökenli detoksifiye eden enzimlerin aktivitesi ve karboksilesteraz aktivitesi gibi parametrelerin seviyeleri daha kirli bölgelerde yaşayan organizmalarda temiz bölgelerde yaşayanlara göre daha yüksektir (Wilczek vd. 2003, 2004). 82

100 Çizelge 4.63 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Glutatyon- S- Transferaz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) İlaç Bordo bulamacı Glyphosate Metyokarb İmidakloprit Kontrol (Ortalama± SE) 1,11 ± 0,15 A 1,19 ± 0,15 A 1,10 ± 0,15 A 1,62 ± 0,15 A 1,05 ± 0,15 A Çizelge 4.64 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Glutatyon- S- Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) İlaç Bordo bulamacı Glyphosate Metyokarb İmidakloprit Kontrol (Ortalama± SE) (Ortalama± SE) (Ortalama± SE) (Ortalama± SE) (Ortalama± SE) 1.dönem 1.Derinlik 2.Derinlik 0,90 ± 0,21 BC 1,44 ± 0,21 BC 0,81 ± 0,21 C 1,17 ± 0,21 BC 0,55 ± 0,21 C 2,08 ± 0,21 AB 3,07 ± 0,21 A 1,53 ± 0,21 BC 1,08 ± 0,21 BC 1,59 ± 0,21 BC 2.dönem 1.Derinlik 2.Derinlik 1,16 ± 0,21 BC 0,93 ± 0,21 BC 1,52 ± 0,21 BC 1,28 ± 0,21 BC 0,82 ± 0,21 BC 0,95 ± 0,21 BC 1,11 ± 0,21 C 0,77 ± 0,21 BC 0,85 ± 0,21 BC 0,67 ± 0,21 C 83

101 Çizelge 4.65 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Glutatyon- S-Transferaz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme zamanı İlaç 1.dönem (Ortalama± SE) 2.dönem (Ortalama± SE) Bordo bulamacı 1,17 ± 0,21 B 1,05 ± 0,21 B Glyphosate 1,00 ± 0,21 B 1,40 ± 0,21 B Metyokarb 1,32 ±0,21 B 0,88 ± 0,21 B İmidakloprit 2,30 ± 0,21 A 0,94 ± 0,21 B Kontrol 1,34 ±0,21 B 0,76 ± 0,21 B Asetilkolinesteraz aktivitesinin ölçüm sonuçları Sinir sistemini etkileyen organik fosforlu ve karbamatlı insektisitler, hedef organizmaya uygulandıktan sonra vücut içine alınmakta ve sinir sistemine ulaştığında AChE enzimini etkisiz hale getirmektedir. AChE enziminin etkisiz hale gelmesi durumunda asetilkolin tarafından başlatılan sinirsel iletim durdurulamamakta ve böcek, sinir sistemindeki sürekli iletim nedeniyle yorgunluktan ölmektedir. İnsektisitin sinir sistemine ulaşmaması durumunda ise, AChE enzimi, ACh i hidrolize ederek sinirsel iletimin durdurulmasını sağlamaktadır. Böylece sinirlerde dalgalar halinde tekrarlayan iletim olmakta ve böcek normal yaşamını sürdürebilmektedir (Moores, 1995; Toutant 1989). Çizelge 4.66 Armut Bahçesi nden alınan örneklerde Asetilkolinesteraz aktivitesi bakımından genel olarak karşılaştırma yapıldığında, kontrol grubunun AChE aktivitesinin Armut Bahçesi nden alınan örneklere göre daha yüksek olduğu saptanmıştır (p>0.05). Çizelge 4.67 Armut Bahçesi nden alınan collembola örnekleri Asetilkolinesteraz aktivitesi derinlik ve dönemleri bakımından incelendiğinde birinci dönem birinci derinlikte kontrol grubu Armut Bahçesi nden alınan örneklere göre AChE aktivitesi az bir farkla düşük çıkmıştır. İkinci ve üçüncü derinliklerde AChE aktivitesinin kontrol grubunun Armut Bahçesi örneklerinden daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. İkinci 84

102 dönemde ise farklı derinliklerin AChE aktivitesi istatistik sonuçlarında önemli bir fark oluşturmamıştır. Çizelge 4.68 Armut Bahçesi nden alınan örnekler dönemler arası incelendiğinde Asetilkolinesteraz aktivitesi birinci dönem kontrol grubunda Armut Bahçesi örneklerine göre yüksek çıkarken, ikinci dönemde kontrol ve Armut Bahçesi örnekleri arasında AChE aktivitesi bakımından herhangi bir fark tespit edilmemiştir. Çizelge 4.69 Armut Bahçesi nden alınan örneklerde derinlikler arası Asetilkolinesteraz aktivitesine bakıldığında ikinci ve üçüncü derinliklerin kontrol grubu Armut Bahçesi örneklerine göre artış göstermiştir. Hedef yeri asetilkolinesteraz (AChE) enzimi olan bazı pestisitler, bu enzimleri inhibe ederek aktivitelerini engellenmektedirler (Devonshire ve Moores, 1984; Rufingier vd.1999; Tomia vd. 2000). Çizelge 4.66 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) Ürün (Ortalama ± SE) Armut 0,28 ± 0, 01 B Kontrol 0,39 ± 0, 01 A 85

103 Çizelge 4.67 Armut Bahçesi nden alınan örneklerde Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği 1.Derinlik(Ortalama± SE) 2.Derinlik(Ortalama± SE) 3.Derinlik(Ortalama± SE) Örnekleme zamanı 1.dönem Armut 0,76 ± 0,02 A 0,14 ± 0,02 B 0,15± 0,02 B Kontrol 0,48 ± 0,02 AB 0,64 ± 0,02 A 0,64 ± 0,02 A 2.dönem Armut 0,16 ± 0,02 B 0,29 ± 0,02 B 0,19 ± 0,02 B Kontrol 0,26 ± 0,02 B 0,20 ± 0,02 B 0,10 ± 0,02 B Çizelge 4.68 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme zamanı Ürün 1.dönem (Ortalama± SE) 2.dönem (Ortalama± SE) Armut 0,35 ± 0,02 B 0,21 ± 0,02 C Kontrol 0,59 ± 0.02 A 0,18 ± 0,02 C Çizelge 4.69 Armut Bahçesi nden alınan örneklerin derinlikler arasında Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği Ürün 1.derinlik SE Ortalama± 2. derinlikortalama ± SE) 3.derinlik Ortalama ± SE Armut 0,46 ± 0,02 A 0,21 ± 0,02 B 0,17 ± 0,02 B Kontrol 0,37 ± 0,02 A 0,42 ± 0,02 A 0,37 ± 0,02 A Çizelge 4.70 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin mod/µl/µg cinsinden protein değeri kontrol grubunda, Mısır ve Buğday örneklerine göre az bir farkla yüksek olmasına rağmen, AChE aktivitesi bakımından istatistiki olarak fark görülmemiştir. 86

104 Çizelge 4.71 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerde AChE aktivitesi bakımından birinci ve ikinci derinlikte Buğday, Mısır ve kontrol grubu arasında fark görülmezken, üçüncü derinlikte kontrol grubu, Buğday ve Mısır örneklerine göre daha yüksek çıkmıştır. Çizelge 4.70 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Ürün Buğday Mısır Kontrol Ortalama± SE 0,17 ± 0,07 A 0,12 ± 0,07 A 0,28 ± 0,07 A Çizelge 4.71 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik ve dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Ürün 1.Derinlik Ortalama± 2.Derinlik Ortalama± 3.Derinlik Ortalama± SE SE SE Buğday 0,22 ± 0,13 B 0,17 ± 0,13 B 0,12 ± 0,13 B Mısır 0,12 ± 0,13 B 0,12 ± 0,13 B 0,11 ± 0,13 B Kontrol 0,2 ± 0,13 B 0,15 ± 0,13 B 0,48 ± 0,75 A Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklere deneme süresince uygulanan ilaçlar ve kontrol grubunun genel olarak AChE aktivitesinin mod/µl/µg cinsinden protein değeri sırasıyla en yüksek miktardan düşüğe doğru; imidacloprid, methiocarb, bordo bulamacı kontrol grubu ve glysofat olduğu gözlemlenmiştir (Çizelge 4.72). 87

105 Çizelge 4.73 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklere uygulanan dört farklı ilaç ve kontrol grubu istatistik sonuçlarına bakıldığında AChE aktivitesinin 1. dönemde yapılan bordo bulamacı ve methiocarb ilaç uygulamasında birinci derinlikte ikinci derinliğe göre yüksek, imidacloprid ve kontrol grubunda düşük, glyphosate uygulamasında ise derinlikler arasında fark görülmemiştir. İkinci dönemde derinlikler arasında AChE aktivitesi bakımından önemli bir fark saptanmamıştır. Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklere birinci dönemde uygulanan ilaç grupları AChE aktivitesi sırasıyla yüksek miktardan düşüğe doğru; imidacloprid, methiocarb, bordo bulamacı, kontrol ve glyphosate olarak saptanmıştır (Çizelge 4.74). Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklere birinci derinlikte uygulanan ilaç gruplarında AChE aktivitesi en yüksek methiocarb en düşük olan glyphosate iken, ikinci derinlikte en yüksek imidacloprid en düşük glyphosate çıkmıştır (Çizelge 4.75). Solucanlarda biyoizlemesi yapılan kirleticilerin içeriğindeki kolinesterazlar (ChEs) organik fosforlu ve karbamat pestisitler için anahtar hedef olmalarından dolayı pestisit kirliliğinde biyomarkır olarak önerilmektedir. Bu alanda Eisenia fetida (Stenersen, 1979; Stenersen vd., 1992) ile çok sayıda deney yürütülmüştür. Diğer taraftan ağır metallerin Eisenia fetida solucanında ChE aktivetisi üzerindeki etkisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Labrot ve ark., (1996) yakın bir tarihte E. andrei nin asetilkolinesteraz aktivitesinin in-vitro ve in-vivoda kurşun ve uranyuma maruz kaldıktan sonra düştüğünü göstermiştir. Ayrıca spesifik olmayan esterazlar ester, amid ve fosfat bağlantı bölgelerine (Hassall, 1982) saldırarak, pestisit metabolizmasında önemli rol oynamaktadır ve E. fetida da kurşun ve kadmiyumun bu aktiviteler üzerindeki etkileri hakkında hiçbir şey bilinmemektedir. Bocquene vd. (1995) in rapor ettiği deniz omurgalıları ve omurgasızlarında dört türle elde edilen sonuçlar birbirine uymaktadır. Bu bilim adamları, kadmiyum kloritin farklı 88

106 deniz kısımlarında (su, sediment ve canlı madde) ölçülen konsantrasyonlarının ChE aktivitesini engellemediğini göstermişlerdir. Sonuç olarak, pestisitlerin aksine ChE aktivitesi, E. fetida solucan türlerindeki ağır metal kirliliğinin bir biyogöstergesi olarak görev alamaz. Patates böceğinin bazı ırklarında AChE enzimlerinin organik fosforlulara, bazı ırklarındaki AChE enzimlerinin ise karbamatlılara karşı duyarsız oldukları bildirilmiştir (Wierenga and Hollingworth, 1993). Çizelge 4.72 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, genel olarak (mod/µl/µg protein) İlaç Bordo bulamacı Glyphosate Metyokarb İmidakloprit Kontrol Ortalama± SE 0,18 ± 0,007 BC 0,08 ± 0,007 C 0,27 ± 0,007 AB 0,31 ± 0,007 A 0,18 ± 0,007 BC Çizelge 4.73 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik ve farklı dönemler arasında (mod/µl/µg protein) Muamele Örnekleme dönemi ve derinliği 1.dönem 1.Derinlik 2.Derinlik Bordo bulamacı Ortalama± SE 0,43 ± 0,01 B 0,18 ± 0,01 DE Glyphosate Ortalama± SE 0,15 ± 0,01 EF 0,08 ± 0,01 EF Metyokarb Ortalama± SE 0,73 ± 0,01A 0,29 ± 0,01 CD İmidakloprit Ortalama± SE 0,46 ± 0,01B 0,67 ± 0,01 A Kontrol Ortalama± SE 0,11 ± 0,01EF 0,40 ± 0,01BC 2.dönem 1.Derinlik 2.Derinlik 0,08 ± 0,01 EF 0,03 ± 0,01F 0,04 ± 0,01 F 0,07 ± 0,01 EF 0,05 ± 0,01 EF 0,03 ± 0,01 F 0,04 ± 0,01 F 0,07 ± 0,01EF 0,15 ± 0,01EF 0,07 ± 0,01EF 89

107 Çizelge 4.74 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi (mod/µl/µg protein) Örnekleme zamanı İlaç 1.dönem Ortalama± SE 2.dönem Ortalama± SE Bordo bulamacı 0,31 ± 0,01 B 0,05 ± 0,01 D Glyphosate 0,12 ± 0,01 CD 0,05 ± 0,01 D Metyokarb 0,51 ± 0,01 A 0,04 ± 0,01 D İmidakloprit 0,57 ± 0,01 A 0,05 ± 0,01 D Kontrol 0,25 ± 0,01 BC 0,11 ± 0,01 CD Çizelge 4.75 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Asetilkolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi, derinlik arasında (mod/µl/µg protein) Örnekleme derinliği İlaç 1.derinlik Ortalama ± SE 2. derinlik Ortalama ± SE Bordo bulamacı 0,25 ± 0,01 AB 0,11 ± 0,01 BC Glyphosate 0,09 ± 0,01 BC 0,07 ± 0,01 C Metyokarb 0,39 ± 0,01 A 0,16 ± 0,01 BC İmidakloprit 0,25 ± 0,01 AB 0,37 ± 0,01 A Kontrol 0,13 ± 0,01 BC 0,23 ± 0,01 ABC Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ile esteraz enzimlerinin incelenmesi Karboksilesterazların total enzimatik aktivitesi ayrıca poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile belirlenmiştir. Kırmızı örümceklerde elektroforez ile genetik farklılıkların yanı sıra dirençli ve hassas popülasyonlardaki esteraz bant desenleri arasındaki farklılıkları da ortaya koymak için bu yöntem kullanılmaktadır (Ay ve Gürkan, 2005). Populasyonlarda enzim aktivitelerinin ölçülmesinin haricinde, jel elektroforezinde bant desenlerinin incelenmesi de dirence neden olan mekanizmaların anlaşılmasında 90

108 yardımcı olmaktadır (Han vd. 1998). Hassas populasyonlara göre daha yüksek karboksilesteraz aktivitesine sahip dirençli populasyonların esteraz jel elektroforez deneyi sonucunda daha koyu ve daha kalın bant desenleri oluşturdukları bildirilmiştir (Van Asperen, 1962). Başka bir çalışmada belirli bir esteraz allelinin de dirence neden olduğu gözlenmiştir (Gürkan vd. 2004). Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü Armut Bahçesi (AÜZF), Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Bahçesi (pestisit uygulanmamış alan) ve Haymana Çiftliği nden (Buğday tarlası, Mısır tarlası ve pestisit uygulanmamış alan) alınan örnekler ile Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan collembola örnekleri ile yapılan denemede yüksek karboksilesteraz ve mikrozomal esteraz aktivitelerinin jel elektroforezinde bant desenleri ile de uyumlu olup olmadığı, belirli bantların varlığı ile gözlemlenmiştir. PAGE görüntüsünün değerlendirilmesi, bant desenlerinin koyu olma durumları ve kalınlıklarına bakılarak yapılmıştır. Buna bağlı olarak karboksilesterazların enzim aktivitesi de yine bu bant desenleri ile yorumlanmıştır. Şekil 4.2 de karboksilesteraz enzim aktiviteleri, collembola örneklerine uygulanan farklı ilaçların verdiği bantların kontrol grubuna kıyasla daha koyu ve kalın olduğu gözlenmiştir. Şekil 4.3 de karboksilesteraz enzim aktiviteleri, collembolla örneklerine uygulanan farklı ilaçların oluşturduğu bant desenlerine bağlı olarak kalınlıkları kalından inceye doğru, glyphosate, bordo bulamacı, imidaklorid ve methiocarb olarak sıralanmıştır. Kontrol grubunda ilaç uygulanmış olan örneklere göre, genel olarak bant desenleri daha ince ve açık olarak gözlemlenmiştir. 91

109 ExKc1 ExKc2 ExMc1 ExMc2 ExGc1 ExGc2 ExIc1 ExIc2 ExBc1 ExBc2 Şekil 4.2 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerin esteraz enzimlerinin PAGE deki görüntüsü (30 Haziran 2010) 92

110 Exk1 ExK2 ExBc1 ExI1 ExI 2 ExG1 ExBc2 ExMc1 ExMc2 ExGc1 ExGc2 ExIc1 ExIc2 ExG2 ExM ExM1 ExB2 ExB1 ExK1 ExK2 Şekil 4.3 Bitki Koruma Bölümü Bahçesi nde denemeye alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü. Exk = Kontrol, ExB = bordo bulamacı, ExM = methiocarb, ExG = glyphosate, ExI = imidacloprid. 93

111 Şekil 4.4 incelendiğinde karboksilesterazlar in-vitro denemede uygulanan imidacloprid bantları daha hızlı ilerlerken, kontrol grubundaki bantlar daha yavaş ilerlemiştir. Uygulanan bordo bulamacı, glyphosate ve methiocarb ilaçları bant desenleri kontrole göre daha kalın ve koyu görülmüştür. Invitro B Ivntro G Invitro K Invitro M Invitro I Şekil 4.4 In-vitro denemesinden alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü. Bitki Koruma Bölümü (ilaç uygulanmamış) ve Armut Bahçesi nden denemeye alınan örneklerde PAGE ile karboksilesteraz enzimlerinin bant desenleri belirlenmiştir. Armut Bahçesi nden alınan örneklerin; farklı derinlikler arasında özellikle birinci ve ikinci derinliklerde karboksilesterazlar aktivitesinin bantları daha kalın ve hızlı ilerlerken, kontrol grubundaki bantlar daha ince ve yavaş ilerlemiştir (Şekil 4.5) 94

112 A3 A3 A2 A2 A1 A1 B3 B3 B2 B2 B1 B1 A3 A3 A2 A2 A1 A1 B3 B3 B2 B2 B1 B1 Şekil 4.5 Bitki Koruma Bölümü ve Armut Bahçesi nden denemeye alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü A = Armut Bahçesi nden alınan örnekler, B = Bitki Koruma Bahçesi nden alınan örnekler (ilaç uygulanmamış ). 95

113 HK1 HK2 HK3 HM1 HM2 HM3 HB1 HB2 HB3 Şekil 4.6 Haymana Çiftliği nden alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin görüntüsü HK = Haymana ilaç uygulanmamış alan, HM = Haymana Mısır Tarlası, HB = Haymana Buğday Tarlası Hayamana Çiftliği nden alınan örneklerde PAGE ile esteraz enzimlerinin bantları gözlemlenmiştir. Buğday Tarlası nda alınan örneklerin farklı derinlikler arasında, Mısır Tarlası ndan alınan örneklere göre karboksilesteraz aktivitesinin bant desenleri daha kalın ve koyu görülmüştür. Mısır ve Buğday tarlalarından alınan örneklerin farklı derinliklerde, kontrol gruplarına göre karboksilesteraz aktivitesinin bant desenleri oldukça kalın ve koyu olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 4.6). Ay ve Gürkan (2005) bifenthrin e dirençli PAM ve URF populasyonlarında E4 bandının daha kalın olduğunu, buna karşılık hassas populasyonda bu bandın gözlenmediğini belirtmişlerdir. 4.4 Genotoksikolojik Çalışmalar Tek hücre jel elektroforezi veya DNA Comet Analizi, elektroforez sonucu jelde oluşan DNA bantlarının göçünün ölçülmesiyle, tek hücre düzeyinde (Singh vd. 1988) farklı alanlardan alınan collembola örneklerinin DNA hasarı (tek çift zincir kırılması ve alkali 96