Preimplantasyon Gene0k Tanı İlk kez 1990 yılında uygulandı ( FISH) Aşamalar : Embriyo Biyopsisi Gene0k Test ( PCR vb.) Normal Embriyoların hastaya tra

Transkript

1 Tek Gen Hastalıklarında PGT : Ru3n Uygulamalar ve Özel Durumlar Yard. Doç. Dr. Süleyman Aktuna

2 Preimplantasyon Gene0k Tanı İlk kez 1990 yılında uygulandı ( FISH) Aşamalar : Embriyo Biyopsisi Gene0k Test ( PCR vb.) Normal Embriyoların hastaya transferi

3 PGT Endikasyonları Bilinen nokta mutasyonlar veya küçük delesyon/ duplikasyonlar 3 lü Tekrar ArTşı Hastalıkları ( Miyotonik Distrofi) ( Aile Haplo0pleme) Büyük delesyon / duplikasyon görülen hastalıklar (DMD) ( Aile Haplo0pleme) HLA Tiplemesi Mitokondriyal Hastalıklar

4 Tek Gen Hastalık Taşıyıcıları İçin PGT Aşamaları 1 Hasta çocuk sahibi olma 2 Hastalığın Klinik Tanısı (*** TED) 3 Hastalığın Gene0k Tanı ile Teyidi

5 PGT Aşamaları Bildirilen mutasyonun teyidi 1 Hastaya özel PGT dizayn 2 PGT Set Up ( PGT hazırlık raporu) 3 Tüp Bebek Tedavisi 4 Embriyo Biyopsi 5

6 1. Polar Body Biyopsi Türleri Verlinsky et al., (1990) Human Reproduc0on 5: Polar body Verlinsky et al., (1990) Human Reproduc0on 5: Blastomeres Handyside et al., (1990) Nature 344: Trophectoderm Kokkali et al, (2005) Human Reproduc0on 20: McArthur et al., (2005) Fer0lity and Sterility 84(6):

7 Uygulama Nested PCR ile mutasyon bölgesinin ve bilgi verici STR markerların amplifikasyonu Mutasyon Tespi3 Mutasyona özgü primerler ile amplifiye edilen bölgenin RFLP Dizi Analizi Fragman Analizi Aile Haplo3plemesi

8 Lab. Akışı

9 (STR) Markerleri Tes0n Güvenirliği için Çok Önemli!!! Bugüne kadar > 900 STR markeri dizayn edildi

10 Allele Drop Out (ADO)

11 Allele Drop Out (ADO) Issue ADO oranı tüm genom amplifikasyonunda(wga) ve özellikle blastomere örneklerinde artyor!

12 Talasemi + HLA Raporu

13 PGT de Yeni Uygulamalar Tek Gen + Anöploidi Taraması Tüm Ekzom Teknolojisi Rehberliğinde PGT Uygulamaları Embriyo Vitrifikasyonu

14 Tek Gen + 24 Kromozom Anöploidi Taraması Endikasyonları İleri Anne Yaşı Acil HLA Tiplemesi Translokasyon Taşıyıcısı

15 Tek Gen Hastaları için 24 kromozom taraması gerekli mi? Tek gen hastaları genç ve infer3lite problemi olmayan bir hasta grubudur Bu rağmen spontan düşük oranı bu hasta grubunda %15 seviyesinde Artan implantasyon oranı 68.4 % ve 45.4 % Azalan spontan düşük 5.5 % vs 15.0 %

16 PGT Uygulamasinda HLA Uyumlu Embryo Orani Anne yaşi ETKEN FAKTÖRLER ve gene3k yapi ile oran3lidir MATERNAL YAŞ < > HLA UYUMLU % 25 % 25 EUPLOİD % 70 % 30 SUBTOTAL % 17.5 % 7.5 TAŞIYICI/SAĞLIKLI % 75 % 75 TOTAL % 13.1 % 5.6

17 Tek Gen + 24 kromozom tarama uygulamaları Karyomapping Perform PGD with WGA Two blastomere biopsy on day 3 Simultaneous biopsy on day 3 and on day 4 Splihng trophectoderm cells into two pieces

18 WGA Ürünü ile Simultane Tek Gen ve 24 Kromozom Tarama Although the use of WGA product provides a straightorward solu0on for performing any required test in the same biopsy material, it seems to be a real problem because of the extremely high ADO rate in WGA product

19 Allele Drop Out (ADO) Issue ADO oranı tüm genom amplifikasyonunda(wga) ve özellikle blastomere örneklerinde artyor!

20 Karyomapping

21 Bugüne kadar STR markerleri ile PGT uygulaması altn standart olarak kullanıldı Her hasta(lık) için bu testlerin op0mize edilmesi gereği

22 * Yaygın hastalıklar için Set up Hazır

23 Uygulamasını YapTğımız Tek Gen Hastalıkları ACHROMATOPSIA DUCHENE MUSCULAR DYSTROPHY (DMD) HYPOPHOSPHATEMIC RICKETS NON-KETOTIK HIPERGLISINEMI ADRENOLEUKODYSTROPHY DYSKERATOSIS CONGENITA ICHTHYOSIS BULLOSA NEUTROPENIA ACHONDROPLASIA EBV- SYNDROME (ITK) ICHTHYOSIS HARLEQUIN NEUROFIBROMATOSIS TYPE 1 ALFA THALASEMIA ECTODERMAL DYSPLASIA ICHTHYOSIS VULGARIS OMENN SYNDROME APERT SYNDROME EPIDERMOLYSIS BULLOSA DYSTROPHIC TYPE INFANTIL NEUROAXONAL DYSTROPHY OSTEOPOROSIS PSEUDOGLIMA SYNDROME ATAXIA TELANGIECTASIA EPIDERMOLYSIS BULLOSA JUNCTIONAL TYPE JANUSKINASE (JAK2) OSTEOGENESIS IMPERFECTA BARDET BIEDL SENDORUMU EXOCYTOSIS MULTIPLE TYPE 1 JOUBERT SYNDROME PELIZAEUS MERZBACHER BEST DISEASE BEST1 (VMD2) SEQUENCING FABRY DISEASE CONGENITAL NEUTROPENIA PHENYLKETONURIA BETA GALACTOSIDASE DEFICIENCY FAMILIAL HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY KAUFMANN SYNDROME POLICYTIC KIDNEY DISEASE (AD PKD1) BETA THALASSEMIA FAMILIAL ISOLATED GH DEFICIENCY KOSTMANN SYNDROME POLICYTIC KIDNEY DISEASE (AR PKHD1) BIOTIDINAZ DEFICIENCY FAMILIAL MEDITERENIAN FEVER (FMF) KRABBE DISEASE POMPE DISEASE BRCA1/2 FANCONI BICKEL SYNDROME LEIGH SYNDROME ( SURF1) PSEUDO TORCH SYNDROME BRUTTON DISEASE FOCAL DERMAL HYPOPLASIA LEIGH SYNDROME RENAL TUBULER DYSGENESIS CARNITINE ACYLCARNITINE TRANSLOCASE FRAGILE X SYNDROME LARON DWARFISM RETINISKISIS CANAVAN DISEASE FRUCTOSE INTOLERANCE MAPLE SYRUP URINE DISEASE RETINITIS PIGMENTOSA (AD, AR ) CEREBROFASCIOTHORACIC DYSPLASIA GALACTOSIALIDOSIS MECKEL-GRUBER SYNDROME RETT SYNDROME CHARCOT MARIE TOOTH TYPE 1A GALACTOSEMIA MENKES SYNDROME RH DEFICIENCY CHARCOT MARIE TOOTH TYPE 2A GANGLIOSIDOSIS MEROSIN DEFICIENT MUSCULAR DISTROPHY ROBERT SYNDROME CHRONIC GRANULOMATOSIS GAUCHER DISEASE METHYL MALONIC ACIDEMIA SCID SYNDROME CITRULINEMIA GLYCOGEN STORAGE DISEASE MHC DEFICIENCY SCWACHMAN DIAMOND SYNDROME CONE ROD DYSTROPHY G6PD/ BILIARY ATRESIA MUCOPOLYSACCHARIDOSIS TYPE 1 SECKEL SYNDROME COMBINED IMMUNODEFICIENCY GLUTARIC ACIDEMIA TYPE 2 MULIBREY NANISM SPINAL MUSCULAR ATROPHY (SMA) CONGENITAL DEAFNESS HAEMOPHILIA A MULTIPLE SYNOSTOSIS SYNDROME SCA TYPE 20 CONGENITAL DISORDER OF GLYCOSYLATION 2A HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS MYOTONIA CONGENITA SURFACTANT DEFICIENCY CONGENITAL DISORDER OF GLYCOSYLATION 1 HEREDITARY SPHEROCYTOSIS MYOTONIC DYSTROPHY TAY -SACH'S DISEASE CONGENITAL HYPOVENTILATION SYNDROME HOMOCYSTINURIA NEPHROTIC SYNDROME TUBEROUS SKLEROSIS CUTIS LAXA HUNTINGTON (ETHICAL APPROVAL IS NECESSARY) NEPHRONOPTHISIS TYROSINEMIA TYPE 1 CYSTIC FIBROSIS HYPER IgE (DOCK-8) NEUROFIBROMATOSIS VLCAD SYNDROME CYSTINOSIS HYPER IgM SYNDROME NIEMANN-PICK TYPE A/B VANISHING WHITE MATTER DONOHUE SYNDROME HYPERPHENYLALANINEMIA NIJMEGEN SYNDROME WILSON DISEASE DRAVET SYNDROME HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY NOONAN SYNDROME WISKOTT ALDRICH SYNDROME ZELLWEGER SYNDROME

24

25 Karyomapping Limitasyonları Ø Henüz çok yeni ve tek hasta olduğunda data sorunlu Ø Akraba evliliğnde data analizi sıkıntlı*** Ø Denovo mutasyonlar Ø Ek cihaz gerekliliği Ø Yaygın hastalıklar için gereksiz ek masraf *** Akraba evliliği Türkiye PGD talebinin en yaygın sebebi *** Bu ailelerde STR markerleri ortaklık ve homozigotlaşma gösteriyor. (PGS-IS 2015).

26 Consanguineous Marriages in Turkey Allows Efficient Preimplanta3on Gene3c Haplotyping ( PGD-IS 2015) Patient Disease Embryo # Homozygote Mutant Embryo # Affected Child Homozygosity of Mutation 1 Surfactant Dysfunction 10 4 present Homozygote 2 Congenital Deafness 7 3 present Homozygote 3 Infantil Neuroaxonal Distrophy 14 5 present Homozygote 4 Polycystic Kidney Disease (AR) 9 3 absent Homozygote 5 Achromatopsia 4 2 present Homozygote 6 Ataxia Telangiectasia 12 3 present Homozygote 7 Gluteric Acidemia 9 2 absent Homozygote 8 Mannose Intolerance 5 2 present Homozygote 9 Severe Combined Immunodeficiency 11 3 present Homozygote 10 Citrullinemia 12 4 absent Homozygote 11 Nonketotic Hyperglycinemia 11 3 absent Compound Heterozygote 12 Robert's syndrome 17 4 present Homozygote 13 Phenylketonuria 17 2 present Homozygote 14 Methylmalonic acidemia 4 3 absent Homozygote 15 Gluteric Acidemia 6 3 absent Homozygote 16 Polycystic Kidney Disease (AR) 13 3 absent Homozygote 17 Ataxia Telangiectasia 5 1 absent Homozygote 18 Ataxia Telangiectasia 7 3 absent Homozygote 19 Galactosemia 4 2 absent Homozygote 20 Vanishing White Matter 19 6 absent Homozygote 21 Polycystic Kidney Disease (AR) 5 0 absent Homozygote

27 3 PGT uygulamasının karşılaştrması KARYOMAPPING WGA+STR NESTED PCR SET UP NOT NEEDED NEEDED * NEEDED * WGA YES YES NOT MANDATORY PGD FOR MULTIPLE LOCI YES YES ** YES ** ADO RATE NA HIGH LOW ANEUPLOIDY SCREENING YES YES POSSIBLE *** INSTRUMENT NEEDED iscan ABI ABI * Yaygın hastalıklar ( Beta Talasemi, SMA vb.) için bir çok Set Up hazır * >100 gen bölgesi için >900 STR markeri dizayn edildi ** Farklı genler için aynı anda PGD STR markerleri kombine edilebilir. *** Ardışık Anöplodi Taraması yapılabilir

28

29

30 WHOLE EXOM SEQUENCING ENABLES PGD FOR COMPLICATED CASES WITHOUT MOLECULAR DIAGNOSIS

31 3 Mutasyon için PGT

32

33 FELLOWSHIP OF PGD & VITRIFICATION The first birth a{er human blastocysts vitrifica0on of biopsied embryos for PGD was reported by Parriego et al (2007). With this development the 0me limita0on was eliminated and an important improvement has been observed in the fields of PGD and especially PGS.

34 A total of 837 pa0ents underwent 998 cycles and an embryo transfer

35 Advantages of FET cycles over fresh IVF/ET cycles Freeze-all strategy offers an opportunity to control the implanta3on window. FET cycles increase the number of biopsied embryos for pa3ents u3lizing PGS and increase the chance of single embryo transfer in subsequent cycles. Decrease in mul3ple PRs. IRs of FET with a previous fresh ET group were the same as those in the Fresh Only group (50.9 vs %), but significantly lower than FET Only group (50.9 vs.59.5%). Elec3ve embryo cryopreserva3on has been described as a poten3al preven3on/risk-reducing approach for OHSS Your Logo

36

37 Ardışık Tek Gen PGT ve 24 Kromozom Taraması 3. günde çi{ biyopsi 3. gün ve 4. gün ardışık biyopsi Trophectoderm biyopsisini 2 ye bölme

38 Simultaneous biopsy on day 3 and on day 4

39 Spli ng trofectoderm cells into two pieces

40 Spli ng trophectoderm cells into two pieces