Genetik Yöntemlerle Bakterilere Gen Transferleri. (Cüneyt Akdeniz)

Transkript

1 Genetik Yöntemlerle Bakterilere Gen Transferleri (Cüneyt Akdeniz)

2 Bakterilerde genetik maddenin bir kısmı bakteriden bakteriye aktarılabilmekte ve bunun sonucunda önemli genetik değişmeler olmaktadır. Verici hücre ile alıcı hücre arasında gerçekleşen bu aktarılma olayının sonucunda her iki hücrenin genetik maddesi birleşerek melez bakteri oluşur. Gerçekleşen bu olaya rekombinasyon oluşan melez bakterilere de rekombinant bakteri adı verilir.

3 Gen transferi sonunda alıcı bakteriler kendi kromozomuna entegre olan yabancı DNA sekansında bulunan genin (veya genler) taşıdığı özel karakter yönünden pozitif hale dönüşür. Bakteriler arasında oluşan bu doğal gen transferi yanı sıra, biyoteknolojik yöntemlerle de (rekombinant DNA teknolojisi) gen aktarılması başarı ile gerçekleştirilmektedir.

4

5 Bakteriler arasında doğal gen transferi başlıca 3 mekanizma ile gerçekleşmektedir: 1- Transformasyon 2- Konjugasyon 3- Transdüksiyon

6 TRANSFORMASYON

7 Bir bakteri kendisine DNA yapısı bakımından çok yakın olan başka bir bakterinin genetik maddesi içeren uygun sıvı besi yerlerinde üretildikten sonra, bu sıvı ortamlardan katı besi yerine ekim yapılırsa, oluşan bazı kolonilerin morfolojik yapısının değişik olduğu ve bunların genetik maddeyi veren ölü bakterinin orjinal kolonilere benzediği görülür. Bu olaya transformasyon denir.

8 Bir başka deyişle de transformasyon serbest DNA nın alıcı bir hücreye katılması ve genetik değişiklik ortaya çıkarması işlemidir.

9 Örneğin; Pneumococ ların II-S suşu öldürülüp, elde edilen DNA sıvı besiyerlerine aktarıldıktan sonra aynı bakterinin canlı II-R suşu, II-S suşunun DNA sını içeren bu sıvı besiyerlerinde uygun bir süre bekletilerek katı besi yerlerine ekimler yapıldığında oluşan bazı kolonilerin II-S karakterinde olduğu görülür.

10 Bildirilen bu in vitro transformasyon aynı şekilde in vivo da oluşturulabilir. Örneğin; farelere önce canlı II-R suşu (kapsülsüz ve avirülent) bunun arkasından, ısı ile öldürülmüş olan II-S (kapsüllü ve virülent) suşundan fazla miktarda şırınga edilir. Ancak deneme sonunda ölen farelerden katı besi yerine yapılan ekimlerde üreyen koloniler arasında bazılarının II-S karakterinde (kapsüllü ve virülent) oldukları görülür. (Frederick-Griffith çalışması)

11 Avery ve çalışma arkadaşları, transformasyonun fare yerine test tüplerinde de yürütülebildiğini göstermişler ve ısıtılarak öldürülmüş hücreleri içeren özütün transformasyonu indüklediğini belirlemişlerdir.

12

13 Transformasyonda alıcı (resipient) ve verici (donör) hücrelerin DNA larının homolog olması önemlidir. Uygun ortam ve optimal koşullara ihtiyaç duyulur. Transforme edilecek DNA segmentlerinin belirli bir molekül ağırlığından aşağı olmaması gerekir. Ayrıca alıcı hücre yüzeyinde özel ve belli alıcı bölgeler (reseptörler) bulunmalıdır.

14 KOMPETANS DNA alabilen ve transforme olabilen hücrelere kompetant denir ve bu özellik genetik kontrol altındadır. Doğal olarak transforme olabilen pek çok bakterideki kompetans, kontrol edilebilen ve DNA nın alınmasında ve işlenmesinde özel proteinlerin rol aldığı bir işlemdir.

15 TRANSFORMASYONDA DNA NIN ALINIŞI Transformasyon sırasında kompetant bakteri DNA molekülüne geri dönüşümlü olarak bağlanmakta fakat kısa bir süre sonra bağlanma geri dönüşümsüz hale gelmektedir. Çok sayıda bakterinin kendi doğal ortamlarında kompetant olabildiklerinin gösterilmesi gerçeği, transformasyonun sadece laboratuvarda yapılan bir olgu olmadığını, aynı zamanda doğada yatay gen transferinde de önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

16 TRANSFORMASYON YAPAN DNA NIN ENTEGRASYONU Transformasyon yapacak olan DNA hücre yüzeyine bir DNA-bağlanma proteini ile bağlanır. Bundan sonra organizmaya göre ya çift zincirli DNA olduğu gibi alınır ya da zincirlerden biri nükleaz ile parçalanır ve geri kalan zincir içeri alınır.

17 Hücre içine alınan DNA molekülü kompetansspesifik bir proteine bağlanır. Bu protein, DNA molekülünü kromozoma ulaşıncaya kadar nükleaz saldırılarından korur. Kromozoma ulaşınca görevi RecA proteini devralır. DNA molekülü alıcı hücre genomuna rekombinasyon ile entegre olur.

18 KONJUGASYON

19 Verici hücre DNA sının ya da bakteri kromozomunun bir parçasının, alıcı hücreye seks pilusları aracılığıyla aktarılması olayıdır. Bazı bakteriler kendi kromozomlarının yanı sıra, bakteri içerisinde bulunan ve genetik maddeyi taşıyan ekstra kromozomal genetik elementler bulunmaktadır. Bunlar ya bağımsız olarak hücre DNA sı dışında bulunurlar (plazmit) ya da hücre DNA sı ile birleşirler. (epizom)

20 Plazmitler arasında F (fertilite) faktörü, R (dirençlilik) faktörü gibi faktörler yer almaktadır. İşte konjugasyon olayında bakteriye vericilik özelliğini, bir plazmit olan bu F faktörü sağlamaktadır ve bu faktöre seks faktörü de denilmektedir. Seks faktörü içeren bakterilere F+ hücre (erkek hücre), içermeyen bakterilere ise F- hücre (dişi hücre ) adı verilir.

21 F faktöründe bulunan genler, bilinen bakteri pilusları dışında, seks piluslarının oluşmasını sağlar ve bu pilus yalnızca F+ bakterilerde bulunur. Bazı durumlarda F faktörü bakteri kromozomunun uygun bir yerine yapışarak bakteri DNA sı ile bütünleşmektedir. Böyle hücrelere Hfr (high frequency recombination) hücreler denir. Bu hücrelerde seks pilusu bulunur ve bunlar bakteriden ayrılırken bakterinin kendi kromozom parçacıklarını alarak başka bir bakteriye aktarırlar. Sonuçta yine rekombinant bakteriler oluşur. Hfr hücrelerinin genetik maddeyi aktarma oranı daha yüksektir.

22 TRANSDÜKSİYON

23 Transdüksiyonda, bir hücreden diğerine DNA aktarımı bakteri virüsleri aracılığıyla gerçekleşir.

24 Konak genlerinin transferi iki şekilde olur: İlki genelleşmiş transdüksiyon olup, bu olayda konak genomunun herhangi bir bölgesinden gelen DNA, olgun virüslerin DNA sının bir kısmını oluşturacak şekilde virüs genomuna katılır.

25 İkincisi olan özelleşmiş transdüksiyon ise sadece bazı ılımlı virüslerde görülür. Özelleşmiş transdüksiyonda, konak kromozomunun belirli bir bölgesinden gelen DNA, genellikle bazı virüs genlerini yerinden ederek, doğrudan virüs genomuna entegre olur.

26 Bakteriyofajların Çoğalması Bakteriyofajların litik veya lizogenik hayat döngüleri olabilir, bazılarında her ikisi de olur. T4 fajı gibi öldürücü fajlarda görülen litik döngüde virionun çoğalmasının hemen ardından konak hücre parçalanır ve ölür. Hücre ölür ölmez virionların kendilerine yeni bir konak bulmaları gerekir.

27 Lizogenik döngü, buna tezat olarak, konak hücrenin parçalanmasına neden olmaz. Lizogenik olabilen fajlara ılımlı fajlar (temperate phage) denir. Viral genom konak genoma dahil olur ve oldukça zararsız bir şekilde onunla beraber eşlenir.

28 Konak hücrenin sağlığı yerinde olduğu sürece virüs sessiz bir şekilde varlığını sürdürür, ama konağın şartları bozulursa, örneğin besin kaynaklarının tükenmesi durumunda, endojen fajlar (profaj olarak adlandırılırlar) etkinleşirler. Bir çoğalma süreci başlar, sonucunda konak hücre parçalanır. İlginç bir şekilde lizogenik döngü konak hücrenin çoğalmasına izin verdiği için hücrenin yavrularında da virüs varlığını devam ettirir.

29

30 Plazmitler Plazmit, kendi kendini eşleyebilen kromozomdan ayrı bir DNA parçasıdır. Tipik olarak dairesel ve çift sarmallıdır. Genelde bakterilerde, bazen ökaryotlarda da (Saccharomyces cerevisiae de 2 mikrometre büyüklükte) bulunur.

31 Genetik mühendisliğinde kullanılan plazmitlere vektör denir. Bir canlıdan diğerine gen aktarımı için kullanılırlar ve genelde seleksiyon için kullanılabilecek bir fenotip oluşturan bir genetik işaret taşırlar.

32 Plazmitler biyokimya ve moleküler biyolojide kullanılan önemli araçlardır. Genlerin çoğaltılması (pek çok kopyasının elde edilmesi) veya ifadesi için kullanılan ticari kaynaklı pek çok plazmit mevcuttur.

33 Plazmitlerin bir diğer kullanımı çok miktarda protein üretimidir. Bu durumda arzu edilen geni taşıyan plazmidi içeren bakteriler büyütülür. Bakteriler antibiyotik direnci sağlayan proteinlerini üretmeye başlattıkları sırada eklenmiş genden bol miktarda protein üretmesini sağlayacak şekilde uyarılabilir. Bu şekilde bir gen veya onun kodladığı bir protein (örneğin insülin), hatta antibiyotikler ucuz ve kolay bir şekilde üretilebilir.

34 Elektroporasyon Elektroporasyon, hücreleri veya dokuları kısa süreli yüksek güçte bir elektriksel alan uygulayarak, hücre zarında DNA'nın geçebileceği nanometre boyutunda geçici gözenekler açılması mantığına dayanan gen aktarımı işlemidir. Elektroporasyon, moleküler biyolojide sıklıkla bakteri, maya ve bitki protoplastlarının genetiğini değiştirmek amacıyla kullanılır.

35 Elektroporasyon işlemi sırasında bir çok hücre zarar gördüğü için hücrelerin en kısa sürede zengin besin içerikli ortamlara aktarılması gereklidir. Bu şekilde az da olsa gen aktarımı başarılmış hücreler çoğaltılarak genetiği değiştirilmiş organizma elde edilir. Bu işlem aynı zamanda yüksek doku kültürüne sahip hücrelerde de yabancı genlerin girişini kolaylaştırır. Ökaryotik hücre içine yabancı DNA tanıtılması süreci ise transfeksiyon olarak bilinir.

36 Kaynaklar: Genetics of Bacteria and Bacteriophages Vikipedi