Analiz Yöntemleri E. coli O157:H7 (Kaynak 2) 1

Transkript

1 Analiz Yöntemleri E. coli O157:H7 (Kaynak 2) Standart Analiz Yöntemi Zenginleştirme İzolasyon Doğrulama Tanımlama 02. Diğer Klasik Yöntemler H7 Antiserum-Sorbitol Fermantayon Yöntemi Enzim Antikor İçeren Hidrofobik Grid Membran Filitrasyonu Antibadi Direk Epifloresan Tekniği 03. Hızlı Yöntemler GLISA Hızlı Arama ve Doğrulama Tekniği EZ Coli Hızlı Arama Sistemi İmmünomanyetik Ayırım Tekniği Diğer Hızlı Yöntemler 01. Standart Analiz Yöntemi FDA/BAM AOAC tarafından önerilen yönteme göre E. coli O157:H7 aranması zenginleştirme, izolasyon ve doğrulama aşamalarından oluşmaktadır Zenginleştirme E. coli O157:H7 'nin zenginleştirilmesinde kullanılan besiyerlerinden bazıları modifiye Tryptic Soy Broth (mtsb), EHEC Enrichment Broth (EEB), Trypticase Novobiocin (TN) Broth veya Lauryl Sulphate Triptose Broth besiyerlerinden biri veya birkaçı birlikte kullanılmaktadır. Buna göre g gıda maddesi ml sıvı besiyerinde homojenize edilmekte ve 37 o C 'da 6-24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. Zenginleştirme besiyerinde antibiyotik kullanımından başka inkübasyon sıcaklığının o C 'a çıkarılması ile de refakatçi flora baskılanabilmektedir. mtsb besiyerinin bileşimine filitre ile sterilize edilmek üzere cefixime 0,05 mg/l ; cefsulodin 10,0 mg/l ve vancomycin 8,0 mg/l ilavesi ile besiyerinin seçiciliği artırılmaktadır İzolasyon Katı besiyerleri kullanılarak E. coli O157:H7 izolasyonunda, bu serotipin sorbitol negatif, β- D-glukuronidaz negatif olma özelliğinden yararlanılmaktadır. Standart yönteme göre E. coli 1 Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü 1

2 O157:H7 izolasyonunda Sorbitol MacConkey Agar (SMAC), Hemorajik Kolitis (HC; hemorrhagic colitis) Agar ve Tellurite-Cefixime-SMAC (TC SMAC) Agar besiyerleri kullanılması önerilmektedir. SMAC Agar besiyerinde 35 o C' da 18 saat inkübasyon sonunda sorbitol negatif koloniler soluk pembe veya renksiz, pozitif E. coli türleri ve diğer enterikler ise parlak pembe renkte koloni oluşturmaktadırlar. SMAC Agar besiyerinin bileşimine MUG katılarak glukuronidaz aktivitesi de tespit edilebileceği gibi, bileşiminde MUG bulunan Fluorocult E. coli O157 Agar gibi bir besiyerine sorbitol negatif kolonilerden sürme yapılarak da fluoresan negatif koloniler izole edilebilmektedir. E. coli O157:H7 aranmasında kullanılan diğer besiyeri, sorbitol ve MUG içeren HC Agar besiyeridir. HC Agar besiyerinin bileşiminde MUG yerine 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-Dglucuronide (BCGI) de kullanılabilmektedir. Burada dikkat edilmesi gereken nokta inkübasyon süresi uzar ise fluoresansın tüm besiyerinin yüzeyine yayılacağıdır. Son zamanlarda E. coli O157:H7 izolasyonunda TC SMAC besiyerinin kullanımı giderek yaygınlaşmaktadır. Besiyerinin bileşiminde bulunan antibiyotikler diğer mikroorganizmaların gelişmesini etkili bir şekilde önlemektedir. Bu besiyerinin bileşimi SMAC Agar ile aynı olup, sterilizasyon işleminden sonra filitre ile sterilize edilmiş potasyum tellürit (2,50 mg/l) ve sefiksim (0,05 mg/l) katılarak hazırlanmaktadır. TC SMAC Agar besiyeri kullanılması durumunda standart yönteme göre önce 25 g gıda örneği 225 ml EEB içerisinde homojenize edildikten sonra 37 o C 'da çalkalamalı inkübatörde 6 saat inkübe edilir. Buradan 0,1 ml örnek alınıp TC SMAC Agar üzerine ekim yapılırken, başka bir petri kutusuna da sürme yapılarak 37 o C 'da bir gece inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda sorbitol pozitif koloniler pembe veya kırmızı renkte, tipik O157:H7 kolonileri ise renksiz veya dumanımsı gri renkte 1-2 mm çapında koloniler oluşturmaktadır. Eğer TC SMAC Agar üzerinde tipik koloniler yoksa zenginleştirme aşaması 24 saate çıkarılarak analiz tekrarlanır Doğrulama Selektif besiyerinde gelişen tipik kolonilerden birkaç tane alınarak içerisinde % 0,6 oranında maya ekstraktı bulunan yatık Tryptic Soy Agar (TSAYE; Tryptic Soy Agar Yeast Extract) besiyerine ekim yapılır. 37 o C 'da bir gece inkübasyonun ardından gelişen mikroorganizmalara nokta indol testi uygulanır. Bunun için yatık agardan bir öze örnek alınarak Kovac's ayıracı ile ıslatılmış filitre kağıdı üzerine konulur ve renk değişimi gözlenir. Enterohemorajik E. coli türleri reaksiyona pozitif sonuç vermektedir. Doğrulama amacıyla kullanılan diğer testler; Lateks aglütinasyon testleri, Shiga-like toksin (SLT I ve SLT) I ve II testleri, koloni hibridizasyonu ve çizelge 1'de görülen ticari testlerdir. Zenginleştirme aşamasında kullanılan mtsb besiyerinde, izolasyonda kullanılan SMAC Agar ve HC Agar besiyerlerinde eğer örnekte koliform sayısı çok fazla ise O157 'nin gelişimi maskelenebilmektedir. Ayrıca Escherichia hermani ve Citrobacter freundii gibi bazı enterik bakteriler benzer biyokimyasal özelliklerinden dolayı izolasyonda yanlış negatif sonuçların alınmasına neden olabilmektedir. E. coli türlerinin büyük çoğunluğu sorbitolü fermente edebilmelerine karşın izolatların %6 'sının sorbitolü fermente edemedikleri bilinmektedir. Gıda örneğinde böyle atipik suşların bulunması durumunda TC SMAC Agar besiyerinde O157:H7' ye benzer koloniler oluşturmaktadırlar. Bu durumda yapılması gereken glukuronidaz aktivitelerine göre yanlış negatif sonuç veren kolonilerin ayırt edilmesidir. 2

3 E. coli O157:H7 aranmasında kullanılan diğer bazı besiyerleri arasında Phenol Red Sorbitol (PRS) Agar, modifiye Eosine Methylen Blue (memb) Agar sayılabilir Tanımlama Selektif zenginleştirme ve katı besiyerinde inkübasyon aşamalarından sonra izolasyonu yapılan kültürlerin E. coli O157:H7 serotipi olduklarının, E. coli O157:H7 lateks test kitleri (Oxoid), E. coli O157 ve E. coli H7 antiserumları ve biyokimyasal testler uygulanarak doğrulanması gerekmektedir. Lateks aglütinasyon doğrulama testi E. coli O157:H7 'nin hızlı identifikasyonu için kullanılan bir test kitidir. E. coli O157:H7 lateks testi gıda sanayiinin kullanımına sunulan, yüksek duyarlığa sahip bir yöntemdir. Kit, iki adet lateks solüsyonu içermektedir. Test solüsyonu, E. coli O157 antijenine özel, tavşandan elde edilen antikorlarla kaplanmış lateks partiküllerinden oluşmaktadır. Kontrol solüsyonu ise pre-immün halde tavşan globulinleri içermektedir. Test edilen kültürler SMAC Agar üzerinde geliştirildikten sonra sorbitol negatif olan kolonilere lateks testi uygulanmakta ve test sonucu bir dakika içinde tespit edilebilmektedir. Ancak bu testte dikkat edilmesi gereken bir nokta; çiğ süt ve dana eti gibi gıdalardan izole edilen E. hermannii 'nin de sorbitol negatif olup, E. coli O157 antiserumu ile aglütine olabilmesi ve böylece E. coli O157:H7 ile karıştırılabilmesidir. Bunu önlemek için, özellikle gıdalarda bulunan E. hermannii 'nin izolasyonunda, SMAC Agar besiyeri ile birlikte Sellobiyoz- MacConkey Agar besiyerinin de kullanılması gerekmektedir. Ayrıca mutlaka H7 antiserumu ile kontrol edilmesi ve KCN 'de üreme testlerinin yapılması gerekmektedir. E. coli O157:H7 sellobiyoz ve KCN 'de üreme negatif, H7 antiserum kontrolünde ise pozitif sonuç vermektedir. 02. Diğer Klasik Yöntemler H7 Antiserum-Sorbitol Fermentasyonu Yöntemi E. coli O157:H7 serotipini E. coli serotiplerinden ayıran bir diğer özellik ise H7 antijeni içermesidir. E. coli tip-1 suşlarından sadece %10 'u H7 antijenine sahipken E. coli O157:H7 serotipinin tamamı bu antijene sahiptir. Bu özellikten yararlanılarak E. coli O157:H7' nin aranmasında, H7 antiserum-sorbitol fermentasyon besiyeri geliştirilmiştir. Bu besiyerinin bileşimi; 18 g enterik fermentasyon base, 10 g D-sorbitol, 4 g agar, 10 ml Andrae indikatörü ve 989 ml saf su olacak şekilde belirlenmiştir. Bileşenler suda iyice eritildikten sonra otoklavlanmakta ve o C 'ye kadar soğutulduktan sonra 1 ml H7 antiserumu ilave edilip tüplere dağıtılıp dik agar olarak katılaştırılmaktadır. Daha sonra incelenecek koloniler bu besiyerine inoküle edilmektedir. İnkübasyondan sonra E. coli O157:H7 serotipleri sorbitolü fermente edemeyip ve flagellaları flagella antiserumu ile reaksiyona girdiği için hareketsiz kalırken, H7 antijeni içermeyen diğer E. coli tip-1 suşları sorbitol ve hareket pozitif sonuç vermektedirler. Bu yönteme göre daha duyarlı sonuçlar elde edebilmek için sorbitol negatif suşlara lisin ve ornitin dekarboksilasyon testlerinin uygulanması önerilmektedir. Ayrıca E. coli O157:H7 olması muhtemel suşlar, E. coli O157 serumu kullanılarak lam ya da tüp aglütinasyon testleri ile doğrulanabilmektedirler. 3

4 Enzim-Antikor İçeren Hidrofobik Grid Membran Filitrasyonu Bu yöntem doğal olarak kontamine olmuş taze et ve çiğ sütten izolasyonda başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Bu yönteme göre: - Laboratuvara gelen örnekten 25 g alınarak 225 ml selektif besiyeri içinde homojenize edilir ve 37 o C ' de saat inkübasyona bırakılarak zenginleştirilir. - Kültürün uygun dilüsyonları hazırlanarak hidrofobik grid membran filitreden geçirilir. - Filitreler selektif katı besiyeri yüzeyine yerleştirilmiş olan nitrosellüloz membran üzerinde 37 o C 'de saat inkübe edilir. Burada kullanılan nitrosellüloz membranlar üzerinde immünoblot yöntemi ile tutundurulmuş E. coli O157:H7 antiserumları bulunmaktadır. - İmmünopozitif olan koloniler seçilerek filitre üzerinden alınmakta ve Vero-sitotoksik E. coli O157:H7 'ye benzer izolatlar biyokimyasal, serolojik, Vero-cell sitotoksisiti testleri ile tanımlanmaktadır. Bu yönteme göre çiğ ette 1,5 adet/g 'dan daha az E. coli O157:H7 bakterisi izole edilebilmektedir. Ancak yöntem çok yoğun ve kompleks çalışmaları gerektirdiğinden dolayı rutin analizlerde yaygın olarak kullanılamamaktadır Antibadi Direkt Epifluoresan Tekniği Antibadi Direkt Epifloresan Tekniği (Ab-DEFT), süt ve meyve sularında E. coli O157:H7 'nin tanımlanması için geliştirilmiş, modifiye bir yöntemdir. Bu yöntemde örnek, direkt olarak homojenize edildikten sonra, 15 dakika tripsin ve Triton X-100 ile muamele edilmekte, ilk önce 5 µm por çaplı ön filitreden, daha sonra 0,2 µm por çaplı siyah polikarbonat filitresinden geçirilmekte ve son filitre doğrudan fluorescein ile işaretlenmiş anti-o-157 poliklonal antikor ile boyandıktan sonra yıkanmakta ve epifluoresans mikroskopta incelenmektedir. Ab-DEFT yönteminin duyarlılığı standart yöntemle aynı olup, 16 kob/g düzeyinde E. coli O157:H7 varlığında güvenilir bir şekilde kullanılabilmektedir. 03. E. coli O157:H7 Aranmasında Kullanılan Hızlı Yöntemler GLISA Hızlı Arama ve Doğrulama Testi (Merck) GLISA (Gold Labelled Immuno Sorbent Assay) testi, gıdalarda E. coli O157:H7 aranması ve doğrulanması için immün akış prensibine dayanılarak geliştirilmiş immünolojik bir tarama testidir. Bu yöntem hızlı, herkes tarafından kolayca uygulanabilen, %99,9 hassasiyet ve %99,4 spesifikliğe sahip, zenginleştirme aşamasından sonra 20 dakikada uygulanabilen tek aşamalı bir test yöntemidir. Yönteme göre süt ve süt ürünleri ile çevresel örneklerde E. coli O157:H7 aranmasında; 25 g-ml katı ya da sıvı örnek 225 ml mtsb+novobiosin ile homojenize edilmekte ve o C' de saat inkübasyona bırakılarak zenginleştirilmektedir. Daha sonra bu zenginleştirme ortamından bir pipet yardımı ile alınan üç damla örnek, daha önceden oda sıcaklığına getirilmiş GLISA test kiti identifikasyon aygıtının örnek yükleme bölmesine aktarılır. 20 dakika beklendikten sonra sonuç kontrol edilir. Buna göre, örnek yükleme haznesinden sonra gelen her iki bölmede de kırmızı bir hat oluşmuş ise sonuç pozitif, yalnızca ikinci bölmede kırmızı hat oluşmuş ise sonuç negatif olarak değerlendirilir. Et ve kanatlı eti ürünlerinde E. coli O157:H7 aranmasında zenginleştirme besiyeri olarak mec Broth+novobiosin önerilmektedir. Bu yönteme göre 4

5 tanımlanan E. coli O157:H7 'nin doğrulanması için, zenginleştirme kültüründen Fluorocult E. coli O157:H7 Agar, Fluorocult HC Agar, CT-SMAC Agar veya SMAC Agar besiyerlerinden herhangi birine sürme yapılıp 37 o C' de saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda 1-5 adet renksiz, şüpheli koloni alınıp 0,2 ml saf su içinde çözündürüldükten sonra identifikasyon aygıtı ile kontrolü yapılıp doğrulanmaktadır EZ Coli Hızlı Arama Sistemi (Difco) EZ Coli, standart mikropipette bulunan E. coli O157 için spesifik hızlı immün analiz yöntemidir. Bu test kiti; E. coli O157 ve laktozu fermente eden diğer koliform bakteriler için selektif olan tek aşamalı zenginleştirme sıvı besiyeri ve E. coli O157 aranmasına yönelik olan EZ Coli detektör uç olmak üzere iki unsurdan oluşmaktadır. EZ Coli detektör uç, 6 aylık raf ömrüne sahip mikropipet ucu formunda bir mikroflament ELISA testidir. Bu testte kullanılan zenginleştirme sıvı besiyeri içinde, istenmeyen mikrofloranın gelişimini önlemek için besiyerinin bileşimine, kullanılan örneğe bağlı olmak üzere akriflavin ve/veya novobiosin ilave edilmektedir. Analize alınan 25 g örnekte 1 kob E. coli O157 olsa dahi 42 o C' de 24 saat inkübasyondan sonra bakteri sayısı 10 6 kob/ml 'ye ulaşabilmektedir. Zenginleştirme besiyerinde inkübasyondan sonra EZ Coli detektör uç ile test sonuçlandırılmaktadır. EZ Coli detektör uç; bir pozitif ve bir negatif renk değişim alanı ve bir örnek test alanı olmak üzere üç adet reaksiyon bölmesinden oluşmaktadır. Test alanında E. coli O157 'ye özgü primer antikor bulunmaktadır. EZ Coli detektör ucun test alanında eflatun rengin gelişmesi, E. coli O157 'nin varlığını göstermektedir. Toplam test süresi 24 saat inkübasyon hariç 10 dakika sürmektedir İmmünomanyetik Ayırım Tekniği İmmünomanyetik ayırım (Immunomagnetic separation) tekniği gıda maddelerinde ve diğer örneklerde mikroorganizmaların aranmasında kullanılan hızlı, yüksek spesifikliğe sahip ve uygulaması basit bir yöntemdir. Bu yöntemin prensibi spesifik immünokimyasal ajanlar (monoklonal, poliklonal ve rekombinant antikorlar) ile kaplanmış manyetize olabilir boncuklar kullanılarak istenen mikroorganizmanın belirlenmesi esasına dayanmaktadır. Bu boncuklar karışık bir süspansiyon içinde bile spesifik olarak aranan mikroorganizmayı yakalayabilmektedir. Bu yönteme göre geliştirilmiş, E. coli O157 aranmasında kullanılan Dynabeads anti E. coli O157 kitleri bulunmaktadır Diğer Hızlı Yöntemler Bu hızlı test yöntemleri dışında DNA probları kullanılarak yapılan testler ve E. coli suşlarına ait spesifik yapısal veya toksin proteinlerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılarak elektroforez işlemi ile tespit edilmesi esasına dayalı yöntemler de bulunmaktadır. Ancak bu yöntemler henüz gıda sanayiinde yaygın olarak kullanılmamaktadır. Enterohemorajik E. coli O157:H7 aranmasında kullanılan bazı hızlı test yöntemleri çizelge 1 'de verilmiştir. Çizelge 1. E. coli O157:H7 aranmasında kullanılan test kitleri Testin adı Prensibi üretici firma RIM Lateks aglütinasyon REMEL 5

6 E. coli O157 Lateks aglütinasyon Oxoid Prolex Lateks aglütinasyon PRO-LAB Ecolex O157 Lateks aglütinasyon Orion Diagnostica Petrifilm HEC Immunobloting 3M EZ COLI Tüp-EIA Difco Dynabeads Immunomanyetik ayırım Dynal HEC O157 ELISA 3M EHEC-TEK ELISA Organon-Teknika Assurance ELISA BioControl TECRA ELISA TECRA E. coli O157 ELISA LMD VIP Immunopresipitasyon BioControl Reveal Immunopresipitasyon Neogen NOW Immunopresipitasyon Binax GLISA Immun akış Merck Q-Trol E. coli O157 Sandvich-EIA Dynatech Lab. Inc. 6