Kanser Kontrolsüz hücre çoğalması Kanser hücrelerinin özellikleri; - Bölünme sinyallerinin üre8mi - Kontakt inhibisyon yokluğu - Apopitozisten kaçış

Transkript

1 BRCA1 ve BRCA2 Mutasyonlarının Araş6rılmasında Yeni Nesil Moleküler Yöntem Sonuçlarının Konvansiyonel Dizi Analizi Yöntemi Sonuçları ile Karşılaş6rılması Dr. Taha BAHSİ Gaziantep Dr. Ersin Arslan Eği8m ve Araş<rma Hastanesi

2 Kanser Kontrolsüz hücre çoğalması Kanser hücrelerinin özellikleri; - Bölünme sinyallerinin üre8mi - Kontakt inhibisyon yokluğu - Apopitozisten kaçış

3 Kanser Proto-onkogen onkogen Tümör süpresör gen mutasyonu Füzyon geni K-RAS mutasyonu DCC Mutasyonu P53 Mutasyonu APC mutasyonu Normal epitel Hiperprolifera8f epitelyum Erken adenom İleri adenom Karsinom

4 Kanser Onkogen Gain of func8on, proliferasyon ar<şı, vaskülarizasyon ar<şı Tümör süpresör genler Loss of func8on, - Gatekeeper ( Bekçi): apopitozis - Caretaker ( Bakıcı): DNA onarımı

5 Meme Kanseri Duktus ve/veya lobülleri örten epitelyal hücrelerin malign transformasyonudur. Dünya geneli insidans: 38-40/ Avrupa insidansı: 66-67/

6 Dünya genelinde 2012 yılında; yeni meme kanseri tanısı meme kanserine bağlı ölüm

7 Meme Kanseri Türkiye de; - Kadınlarda kansere bağlı ölümlerde ilk sırada - Doğu bölgelerde; 20/ Ba< bölgelerde; 40-50/

8 Meme Kanseri DeğişErilemez risk faktörleri DeğişErilebilir risk faktörleri Belirsiz faktörler Tar6şmalı faktörler Cinsiyet Yaş Gene8k risk faktörleri Ailede meme kanseri hikayesi Irk ve etnisite Yoğun meme dokusu Bazı iyi huylu meme lezyonları Erken menstruel periyod Göğüse radyasyon maruziye8 DES maruziye8 Az çocuk doğurma OKS kullanımı Postmenopozal hormon replasmanı Az emzirme-hiç emzirmeme Fazla kilo-obezite Azalmış fiziksel ak8vite Beslenme ve vitamin alımı Çevresel kimyasal ajanlar Tütün-sigara kullanımı Gece çalışma An8persipitant kullanımı Sütyen kullanımı Küretaj Meme protezi

9 Meme Kanseri

10 Meme Kanseri Bazal benzeri: - Bazal epitel hücrelerinin gen ekspresyonuna benzer - BRCA1 ve P53 mutasyonları görülür - ÖR (-) Moleküler sınıflandırma Luminal A: - Luminal epitel hücrelerinin gen ekspresyonuna benzer - BRCA2 mutasyonu görülür - ÖR (+) HER2: - HER2/neu (ERBB2) geninin aşırı ekspresyonu - Uzak metastazlar çok yaygındır - Prognozu en kötü Normal meme benzeri: - Normal meme dokusunun gen ekspresyonuna benzer Luminal B: - Luminal A ile benzerdir - Prognozu daha kötüdür Claudin-Low: - Claudin ve E-cadherin proteinlerinin azalmış ekspresyonları

11 Meme Kanseri Gen SitogeneEk Lokalizasyonu Fonksiyon Sorumlu olduğu hastalıklar HER2/neu (ERBB2) 17q12 Tirozin kinaz reseptörü Meme kanseri, nöroblastom RAS Meme kanserinden sorumlu onkogenler 3, 6, 19 ve diğer kromozomlarda birçok varyant GTPAZ süper ailesi Meme kanseri, GİS kanserleri, Kardiyofasiyokutanöz-Noonan- Costello sendromları AKT1 14q Kinaz reseptörü Meme kanseri, 8moma, Proteus sendromu EIF-4E 4q21-25 Ökaryo8k translasyon başla<cı faktör Meme kanseri, Larinks kanseri, Farinks kanseri CCND1 11q13 Hücre siklus mediatörü Meme kanseri, mantle cell lenfoma, B-cell lenfoma CCNE1 19q12 Hücre siklus mediatörü Meme kanseri, Fasial dermatozis, Kronik endoqalmi8s c-myc 8q24.21 Transkripsiyon faktörü Meme kanseri, Burkir lenfoma, Endometrium kanseri c-fos 14q24.3 Transkripsiyon faktör kompleks, çok nadiren apopitozis indüklenmesi Meme kanseri, odyojenik epilepsi, Coffin Lowry Sendromu

12 Meme Kanseri Meme kanserinden sorumlu Tümör Süpresör genler Gen SitogeneEk Lokalizasyonu Fonksiyon Sorumlu Olduğu Hastalık BRCA1 17q21 Tümör süpresör Meme kanseri, Over kanseri, Prostat kanseri BRCA2 13q12.3 Tümör süpresör Meme kanseri, erkekte meme kanseri, prostat kanseri, pankreas kanseri, Fankoni anemisi 8p D1 AR Xq12 Androjen üre8mi Meme kanseri, prostat kanseri, endometrium kanseri, Androjen duyarsızlık sendromu, androjenik alopesi, spinal-bulber müsküler atrofi, ATM 11q22-q23 DNA çiq zincir kırık onarımı, sinir sistemi ve immün sistem normal gelişimi Meme kanseri, Ataksia telenjektazi BARD1 2q34-q35 DNA tamir mekanizması Meme kanseri BRIP1 17q22.2 DNA çiq zincir kırık onarımı, tümör süpresör CDH1 16q22.1 Tümör süpresör, hücre hareket kontrolü Meme kanseri, Fankoni anemisi Meme kanseri, herediter diffüz gastrik kanser

13 Meme Kanseri Gen SitogeneEk Lokalizasyonu Meme kanserinden sorumlu Tümör Süpresör genler Fonksiyon Sorumlu Olduğu Hastalık CHEK2 22q12.1 Tümör süpresör Meme kanseri, prostat kanseri, akciğer kanseri, kolon kanseri, böbrek kanseri, Li- Fraumeni sendromu DRAS3 1p31 Tümör süpresör Meme kanseri, over kanseri ERBB2 17q12 Büyüme faktörlerinin düzenlenimi Meme kanseri, over kanseri, mide kanseri, akciğer kanseri, nöroblastom NBN 8q21 DNA çiq zincir kırık onarımı Meme kanseri, over kanseri, prostat kanseri, malign melanom, lösemi, Nijmegen kırık sendromu PALB2 16p12.2 DNA tamir mekanizması, tümör süpresör Meme kanseri, Fanconi anemisi, Willms tümörü, medullablastom RAD50 5q31 DNA çiq zincir kırık onarımı Meme kanseri? RAD51 15q15.1 DNA tamir mekanizması Meme kanseri STK11 19p13.3 Tümör süpresör, hücrede enerji kullanımını düzenleme Meme kanseri, pankreas kanseri, malign melanom, Peutz-Jeghers sendromu TP53 17p13.1 Tümör süpresör Meme kanseri, mesane kanseri, osteosarkom, adrenal karsinom,

14

15 Meme Kanseri Meme kanserlerinin %5-10 u ailesel meme kanseridir, - Birinci derece yakınında meme kanseri X 3 - Birden fazla birinci derece yakınında meme kanseri X 10 - Kırk yaşından önce meme kanseri olanların yakınlarında risk çok yüksek

16 BRCA1 ve BRCA2 Genleri BRCA1 geni; Otozomal dominant ailevi meme kanserinin %50 sinden BRCA2 geni ise %30-35 inden sorumlu BRCA1/BRCA2 mutasyonu taşıyanlar; hayat boyu meme kanserine yakalanma riski; %50-80 arasındadır.

17 BRCA1 ve BRCA2 Genleri BRCA1 ve BRCA2 Mutasyon Analiz Endikasyonları (NCCN kılavuzu) Kendisinde meme ve over kanseri olan kadınlar Kendisinde over kanseri olan ve birinci ile ikinci derece akrabalarında meme ya da over kanseri öyküsü olan kadınlar Kendisinde 50 yaş öncesi meme kanseri ortaya çıkan kadınlar ve birinci ile ikinci derece akrabalarında over kanseri öyküsü olan kadınlar ya da erkek bir akrabasında meme kanseri olanlar Birinci ile ikinci derece akrabalarında BRCA1/BRCA2 geninde mutasyon saptanmış olan kadınlar Sağlık Bakanlığı nın /B.10.0.THG tarih/sayılı

18 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-BRCA1 Caretaker tümör süpresör gendir 17q12 de lokalizedir 23 ekzon, 1863 a.a lik 220 kda ağırlığında fosfoprotein kodlar En büyük ekzon 10. ekzondur ve mutasyonlarda en sık burada görülür BRCA1 fosfoproteini Diğer tümör süp. proteinler, DNA onarımında görevli proteinler BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex)

19 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-BRCA1

20 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-BRCA1 İyonize radyasyona çok duyarlıdır Tümör süpresyonunda kri8k bölgeler BRCT domaini; kansere sebep olan truncaeng mutasyonların en çok görüldüğü yer

21 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-BRCA2 Hem caretaker hem de gatekeeper tümör süpresör gendir 13q12 de lokalize 27 ekzonludur, 3418 a.a lik 384 kda ağırlığında proteini kodlar 11. ekzon en büyük ekzonudur ve mutasyonlarda en sık bu ekzondadır

22 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-BRCA2 11. ekzonda BRC tekrar dizileri RAD51 bağlanma noktası ( BRC1- BRC4) BRCA2 en çok RAD51 ile etkileşimdedir Homolog rekombinasyon DNA onarımı Genomik stabilite

23 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-BRCA2 OCCR bölgesi mutasyonunda over kanser riski %19.5 OCCR dışındaki mutasyonlarda %10.5

24 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-Mutasyon İnsidansları BRCA1 geninde en sık; 5382insC ve 185delAG mutasyonları BRCA2 geninde ise; 6174delT mutasyonu Askenazi Yahudi lerinde; BRCA1 geninde 5382insC (%1.09), 185delAG (%0.13), BRCA2 geninde ise 6174delT (%1.52) (Roa BB ve ark. 1996) İzlanda lı kadınlarda ise BRCA2 geninde 999del5 (%0.6) (Johannesdo r G ve ark. 1997)

25 BRCA1 ve BRCA2 Genleri-Mutasyon İnsidansları Türk toplumunda; - Yazıcı ve ark. (2000), meme kanserli 53 hasta - Manguoğlu ve ark. (2003), meme ve over kanseri açısından yüksek risk taşıyan 106 hasta ile prostat kanseri açısından yüksek risk taşıyan 50 hasta - Purcu ve ark. (2013), meme kanseri aile hikayesi pozi8f 25 kadında; 5 hastada (4 ü aynı aile) BRCA1-5382insC

26 BRCA1 ve BRCA2 Mutasyonlarında Kullanılan Tanı Yöntemleri-MLPA MLPA (Mul8plex Liga8on Dependent Probe Amplifica8on) - MLPA, 50 kadar farklı genomik DNA veya RNA dizisindeki normal olmayan kopya sayısının tespi8ni sağlayan eş zamanlı bir mul8pleks PZR yöntemidir - Mikrodelesyon sendromları, BRCA1/BRCA2 genlerindeki gibi birkaç ekzonu kapsayan delesyonların tanısında

27 BRCA1 ve BRCA2 Mutasyonlarında Kullanılan Tanı Yöntemleri-Konvansiyonel Dizi Analizi 1977 de Sanger ve ark. Bir DNA kalıbından, tek zincirli, uzunluğu her seferinde bir öncekinden bir nükleo8d fazla olacak şekilde artan, sistem tara}ndan okunabilen bir dizi fragment oluşturulması esasına dayanır

28 BRCA1 ve BRCA2 Mutasyonlarında Kullanılan Tanı Yöntemleri-Mikroarray ile yeniden dizileme DNA parçacıklarından oluşan bir matriks üzerine, hasta DNA sının hibridize edilmesi esasına dayanmaktadır. - Tüm genom taraması - Submikroskobik değişimler - Gen ekspresyon analizi - Kanser araş<rmaları - SNP, CNV taramaları

29 BRCA1 ve BRCA2 Mutasyonlarında Kullanılan Tanı Yöntemleri-Next GeneraGon Sequencing Konvansiyonel yöntemin; - Pahalı, kısa dizileri analiz edebilme, uzun zaman alması; yeni nesil dizileme arayışı NGS yöntemi ile; - Genom, transkriptom, mrna, snrna profili - Transkripsiyon bağlanma bölgelerinin genom karakterizasyonu - Kroma8n yapısı - Atasal DNA araş<rmaları - Metagenomik araş<rmalar - Kanser genomu araş<rmaları - Birçok hastalığın moleküler tanısı

30 Gereç ve Yöntem Çalışmada kullanılan sekiz hasta ve bir kontrol örneğine ait DNA lar, İstanbul Acıbadem Hastanesi Gene8k Tanı Merkezinde daha önce konvansiyonel dizi analizi ve/veya MLPA yöntemi ile BRCA1/BRCA2 genlerine yönelik mutasyon analizi yapılmış hastalar arasından seçilmiş8r.

31 Gereç ve Yöntem Çalışmada kullanılan diğer kontrol hastasına ait DNA örneği ise, daha önce Bilkent Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Gene8k Bölümünde yapılan bir proje kapsamında, BRCA1/BRCA2 genlerine yönelik konvansiyonel dizi analizi yöntemi ile mutasyon analizi yapılmış ve mutasyon saptanmamış bir bireye ai r.

32 Gereç ve Yöntem Çalışma için E8k Kurul onayı, tarihli Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi (Girişimsel Olmayan) Klinik Araştrmalar E8k Kurulu nun 221 karar numarasıyla alınmış<r.

33 Gereç ve Yöntem Sekiz hasta ve iki kontrol örneğinin tamamına Mikroarray ile yeniden dizileme yöntemi (Affymetrix) ile BRCA1 ve BRCA2 genlerine mutasyon analizi yapılmış, elde edilen veriler GSeq 4.1 veri analiz programıyla analiz edilmiş8r.

34 Gereç ve Yöntem Ayrıca dört hasta örneğine Nex Genera8on Sequencing yöntemi (Roche GS Junior) ile BRCA1 ve BRCA2 genlerine mutasyon analizi yapılmış ve Genome Sequencer FLX (GS FLEX) veri analiz programıyla analiz edilmiş8r

35 Bulgular Konvansiyonel Dizi Analizi yöntemi ile saptanan mutasyon ve mutasyonun saptandığı ekzon Konvansiyonel Yöntem ile analiz edilen ekzonlar Mikroarray ile Yeniden Dizileme Yöntemi Next GeneraEon Sequencing Yöntemi Olgu 1 Olgu 2 Olgu 3 c.2863-_2867deltcatc/n BRCA1 geni 10. ekzon c.4987_4990delgtca/n BRCA2 geni 11. ekzon c.788_789insg/n BRCA1 geni 10. ekzon BRCA1 ve BRCA2 genlerinin tüm ekzonları BRCA1 ve BRCA2 genlerinin tüm ekzonları BRCA1 ve BRCA2 genlerinin tüm ekzonları Mutasyon saptanmadı Mutasyon saptanmadı Mutasyon saptanmadı Yöntem uygulanmadı Yöntem uygulanmadı Yöntem uygulanmadı Olgu 4 BRCA1exon 13-22del/N Yöntem uygulanmadı Mutasyon saptanmadı Yöntem uygulanmadı Olgu 5 Olgu 6 Olgu 7 Olgu 8 c.2019dela/n BRCA1 geni 10. ekzon c.843_846delctca/n BRCA1 geni 10. ekzon c.3794dela/n BRCA1 geni 10. ekzon c.5266insc/normal BRCA1 geni 20. ekzon BRCA1 geni 10. ekzon Mutasyon saptanmadı c.2019dela/n BRCA1 ve BRCA2 genlerinin tüm ekzonları Mutasyon saptanmadı c.843_846delctca/n BRCA1 geni 10. ekzon Mutasyon saptanmadı c.3794dela/n BRCA1 geni; 3, 5, 6, 7, 9-22, 24. ekzonlar BRCA2geni; 1-9, 11, 13-17, ekzonlar Mutasyon saptanmadı c.5266insc/normal

36 Bulgular-Olgu 5 (c.2019dela/n) Next GeneraEon Sequencing BRCA1: BRCA2 : c.779delc (10. ekzon) c.994dela (10. ekzon) c.961dela (10. ekzon) c.1114a>c (10. ekzon) c.3119g>a (10. ekzon) c.3807t>c (10. ekzon) c.4593dela (11. ekzon) c.6551g>a (11. ekzon) c.6566dela (11. ekzon) c.7173g>a (14. ekzon) c.8936dela (22. ekzon) Konvansiyonel Dizi Analizi BRCA1: c.3119g>a (10. ekzon) Sanger yöntemi ile BRCA1 geninin sadece 10. ekzonu analiz edilmiş8r. BRCA2 geni ise Sanger yöntemi ile analiz edilmemiş8r

37 Bulgular-Olgu 6 (c.843_846delctca/n) Next GeneraEon Sequencing Konvansiyonel Dizi Analizi BRCA1: c.779insc (10. ekzon) c.2612c>t (10. ekzon) c.4837a>g (13. ekzon) BRCA2: c.36delt (2. ekzon) c.3396a>g (11. ekzon) c.3807t>c (11. ekzon) c.6513g>c (11. ekzon) c.6566dela (11. ekzon) c.7242a>g (14. ekzon) BRCA1: c.2612c>t (10. ekzon) c.4837a>g (13. ekzon) BRCA2: c.3396a>g c.3807t>c c.6513g>c c.7242a>g NGS ve Sanger yöntemi ile; BRCA1 ve BRCA2 genlerinin tüm ekzonları analiz edilmiş8r

38 Bulgular-Olgu 7 (c.3794dela/n ) Next GeneraEn Sequencing Yöntemi BRCA1: c.779insc (10. ekzon) c.2082c>t (10.ekzon) c.2311t>c (10.ekzon) c.2612c>t (10.ekzon) c.3548a>g (10.ekzon) c.4837a>g (13. ekzon) BRCA2: c.36delt (2. ekzon) c.1593dela (10. ekzon) c.3396a>g (10. ekzon) c.3807t>c (10. ekzon) c.4563a>g (10. ekzon) c.4593dela (10. ekzon) c.6513g>c (10. ekzon) c.6566dela (10. ekzon) c.7242a>g (14. ekzon) c.8936dela (22. ekzon) Konvansiyonel Dizi Analizi Yöntemi BRCA1: c.2082c>t (10.ekzon) c.2311t>c (10.ekzon) c.2612c>t (10.ekzon) c.3548a>g (10.ekzon) Sanger yöntemi ile BRCA1 geninin sadece 10. ekzonu analiz edilmiş8r. BRCA2 geni ise Sanger yöntemi ile analiz edilmemiş8r

39 Bulgular-Olgu 8 (c.5266insc/normal) Next GeneraEn Sequencing Yöntemi Konvansiyonel Dizi Analizi Yöntemi BRCA1: c.779insc (10. ekzon) BRCA2: c.4563a>g (10. ekzon) c.4593dela (10. ekzon) c.5758insg (10. ekzon) c.5785insg (10. ekzon) c.3396a>g (10. ekzon) c.6513g>c (10. ekzon) c.5763inst (10. ekzon) c.7242a>g (10. ekzon) BRCA2: c.4563a>g (10. ekzon) c.3396a>g (10. ekzon) c.6513g>c (10. ekzon) c.7242a>g (14. ekzon) Sanger yöntemi ile BRCA1 geninin; 3, 5, 6, 7, 9-22, 24. ekzon BRCA2 geninin; 1-9, 11, 13-17, ekzonları analiz edilmiş8r

40 Tar[şma-Mikroarray ile yeniden dizileme Wen ve ark. (2000) 108 kanserli doku örneğinde TP53 analizi - Nokta mutasyonlarını 88 hastada (%81) - Delesyon ve insersiyonları ise %33 oranında - Delesyon ve insersiyon için özel prob gerekliliği

41 Tar[şma-Mikroarray ile yeniden dizileme Schroder ve ark. (2010) 33 ailesel meme ve over kanserli hasta BRCA1 ve BRCA2 mutasyon analizi - Özellikle 50 b.ç den büyük delesyon ve insersiyonları düşük oranda tespit e ğini - Delesyon ve insersiyon için özel probların gerekliliğini

42 Tar[şma-Mikroarray ile yeniden dizileme Çalışmamızda; 7 delesyon ve 1 insersiyonlu hasta + 2 kontrol hastası; - Mikroarray ile hiçbir hastada mutasyon tespit edilemedi - Delesyon ve insersiyonlar için prob gerekliliği

43 Tar[şma-Next GeneraGon Sequencing De Leneer ve ark. (2010) Roche GS Junior ile 30 hastada BRCA1 ve BRCA2 mutasyonu - Bulunan 5513 varyasyonun; 443 ü doğru, 5070 i ise yanlış, özgüllük <%10 - Homopolimer probu eklendikten sonra; özgüllük: %92 - HP dizileri için ek prob gerekliliği

44 Tar[şma-Next GeneraGon Sequencing Walsh ve ark. (2010) Illumina ile 20 meme kanserli hastada BRCA1/ BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, MLH1, MSH2, PALB2, STK11 - Konvansiyonel yöntemle belirlenemeyen 6 büyük delesyon tespit edilmiş - Konvansiyonel yöntem + MLPA nın yüksek maliye8 - NGS ile gen yeniden düzenlenim tespi8 - NGS nin konvansiyonel dizi analizi ile doğrulanarak raporlanması

45 Tar[şma-Next GeneraGon Sequencing Yeo ve ark. (2012) Ion Torrent PGM Benchtop Sequencing ile BRCA1 ve BRCA2 mutasyon araş<rması - HP dizilerinden kaynaklanan yanlış pozi8f sonuçlar - HP probları ve HP okuma filtreleri ile özgüllük ve duyarlılığın ar<şı

46 Tar[şma-Next GeneraGon Sequencing BRCA1 BRCA2 Olgu 5 c.779delc (AAAA HP* dizisi) c.961dela (GGGG HP dizisi) c.994dela (AAAAAAA HP dizisi) c.4593dela (AAAAAA HP dizisi) c.6566dela (AAAAA HP dizisi) c.7173dela (AAAAAA HP dizisi) c.8936dela (AAAA HP dizisi) Olgu 6 c.779insc (AAAA HP dizisi) c.36delt (TTTTTT HP dizisi) c.6566dela (AAAAAA dizisi) Olgu 7 c.779insc (AAAA HP dizisi) Olgu 8 c.4593dela (AAAAAA HP dizisi) c.5763inst (TTTTT HP dizisi) c.5758insg (TTTTTT HP dizisi) c.5785insg (TTTT dizisi)

47 Sonuç-Mikroarray İnsersiyonel ve delesyonel mutasyonlardaki başarısızlığı Özel prob gerekliliği, BRCA1/BRCA2 çok büyük, prob maliye8 çok fazla Analiz programları geliş8rilip, çok sayıda çalışma ile kanıtlanması

48 Sonuç-NGS Çok daha uzun dizileri analiz etme Büyük delesyon ve insersiyonları yakalama Sanger + MLPA, çok pahalı ve zaman alıcı HP dizi hataları NGS ile hızlı analiz, sonrasında şüpheli bölgelere Sanger

49 Meme Kanseri ve EGk Gene8k ayrımcılık; İşverenler, sigorta şirketleri, aile ve toplum tara}ndan uygulanmaktadır Gene8k ayrımcılık sonrası; - Test yap<rmaktan - Koruyucu önlemler - İzlem ve tedavi den kaçınılmakta

50 Meme Kanseri ve EGk A.B.D kongresi 2008 yılında; GINA (Gene8k Bilgi Ayrımcılık Yasası) - Risk analizi yapılırken; gene8k bilgi ve aile öyküsünün dikkate alınmasını yasaklar - Bireylerin genleri üzerinde hiçbir kontrollerinin olmadığı gerçeğine dayanır - Yasalara rağmen asıl olarak derin kültürel değişimler gerekmektedir