ULUSAL MİKROBİYOLOJİ STANDARTLARI (UMS) Hareket Testi. Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.

Transkript

1 Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MİKROBİYOLOJİ STANDARTLARI (UMS) Hareket Testi Hazırlayan Birim Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Bakteriyoloji Bölüm Test Prosedürleri Standart No B-TP-04 Sürüm No 1.1 Onay tarihi Geçerlilik tarihi Sürüm no Tarih Değişiklik

2 İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ... 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR... 3 GENEL BİLGİ... 3 TEKNİK BİLGİLER Test için asgari laboratuvar koşulları Testin uygulanması Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması Olası sorunlar/kısıtlılıklar... 8 EKLER... 9 Ek-1 Hareket testi besiyerinin (HTB) hazırlanması KAYNAKLAR Sayfa 2 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji

3 Kapsam ve Amaç Bakterilerin hareket yeteneklerinin gösterilmesi değerli bir mikrobiyolojik tanımlama parametresidir. Bazı organizmalar (ör., Escherichia coli nin laktoz negatif kökenleri ve Shigella sp.) farklı türlere ait olmalarına rağmen benzer veya aynı biyokimyasal reaksiyonları gösterdiklerinde, onları hareket testi ile ayırt etmek mümkün olabilir. Çeşitli hareket testleri vardır. Bu UMS nin amacı hareket testlerinin uygulanması ve yorumlanması için bir rehber sunmaktır. Kısaltmalar ve Tanımlar BHI HTB Brain Heart Infusion (beyin kalp infüzyonu) Hareket Testi Besiyeri. Bir yarı-katı agar besiyeridir. Yabancı kaynaklarda Motility Test Medium (MTM) şeklinde aranır. KIA/TSI Kligler iron agar / Triple sugar iron agar; aynı amaçla kullanılabilecekleri için (metinde) biri veya diğeri anlamında. TSB TTC Triptik soya buyyonu Trifenil tetrazolyum klorid Genel Bilgi Bazı bakteriler hücre duvarına ait kamçı olarak adlandırılan hareket organellerine sahiptir. Hareket yeteneği genellikle çomak formundaki bakterilere özgüdür, ancak az sayıda kok türünde de görülür (1). Kamçı üretimi kültür şartlarına göre değişebilir; ör., Listeria monocytogenes oda sıcaklığında hareketli iken 30 C nin üzerinde inkübe edildiğinde hareket yeteneğini kaybeder (2). Bakterinin hareketinin gösterilmesi amacıyla hareket testleri kullanılır. Bir bakteriye uygulanan hareket testi kesin tür tanımlaması için karar verdirici olabildiğinden, laboratuvarın tanı kapasitesi için önemlidir. Hareket yeteneği, bir mikroskop alanında veya tüpte ya da plaktaki yarı-katı agarda bakterinin bir noktadan başka bir noktaya hareketinin gözlenmesi yoluyla test edilebilir. Tüp testinde bir yarı-katı agara (HTB) batırma ekimi yapılır. Hareketli bakterilerin agar boyunca bulanıklık oluşturarak ekim çizgisinin dışına çıktıkları gözlenirken, hareketsiz olanlar sadece ekim çizgisinde ürerler (1,3). Mikroskopi yönteminde ise bakteri süspansiyonu çukur lamda asılı-damla tekniği ile incelenir. Bu yöntem daha ziyade HTB de iyi üreyemeyen bakteriler için kullanışlıdır (2,4). HTB % agar içerir ve genellikle gram negatif enterik bakteriler için kullanılır. Diğer bazı maddelerin ilavesi ile, bakterinin başka özellikleri de paralel olarak test edilebilir (ör., Motilite-indol-ornitin besiyeri). Besiyerine istenirse tetrazolyum tuzları da (ör., TTC) eklenebilir. Besiyerinde çözünmüş halde ve renksiz bir vital boya olan TTC bakteri tarafından alındığında indirgenerek çözünmez kırmızı renkli bir maddeye (asit formazan) dönüşmektedir ve bakterinin hareketini daha iyi gözlenir hale getirir. Ancak bu madde bazı nazlı bakterilerin üremesini baskılayabildiği için, her durumda kullanılamaz (1,4). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 3 / 10 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 /

4 Teknik Bilgiler 1 Test için asgari laboratuvar koşulları 1.1. Laboratuvar güvenliği Bu UMS de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi ) Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır Örnek, Besiyeri, Donanım Test mikroorganizmaları Hareket incelemesi gerekli görülen her klinik izolat Asılı damla preparatı hazırlamak için besiyeri Sıvı besiyeri, karbonhidrat içermeyen (ör., Nitrat buyyonu, TSB, BHI) Herhangi bir yatık agar; zor üreyenler için TSB veya BHI eklenmiş SF veya distile su Yarı-katı agarda hareket testi için besiyeri / reaktif Hareket testi besiyeri (HTB) piyasadan hazır temin edilebilir veya laboratuvarda hazırlanabilir (bkz. Ek-1). TTC içermesi isteğe bağlıdır. Sülfit, indol, hareket (SIM) besiyeri - H 2 S i saptamak için sülfit içerir; indol reaksiyonunu da değerlendirmek mümkündür. Hareket-nitrat besiyeri İndol ve lizin içeren hareket besiyeri (motilite-indol-lizin; MIL) İndol ve ornitin içeren hareket besiyeri (motilite-indol-ornitin; MIO) TTC, %1 lik çözelti, steril Diğer gereç, donanım Çukur lam, asılı damla preparatı hazırlamak için (normal lam da lam üzerinde Vazelin ile halkadan çukur oluşturularak kullanılabilir). Lameller (22 22 mm) Mikroskop (ışık veya faz kontrast) İğne öze, steril tek kullanımlık veya nikrom, Sayfa 4 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji

5 1.4. Kalite kontrol Her yeni besiyeri lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif kalite kontrol suşları ile test edilmeli, sterilite kontrolü yapılmalıdır. Tüpler kullanım öncesi kontaminasyon yönünden incelenmelidir. Laboratuvar personelinin asılı-damla testi uygulama becerisi, bilinen hareketli suşların sıvı kültürlerinden yapılan egzersizlerle valide edilmelidir. Kontrol organizmaları aşağıdaki tabloda listelenmiştir (1). Organizmalar / ATCC Besiyeri Hareket Testler I H 2 S L O Escherichia coli Hepsi Klebsiella pneumoniae 13883, Hepsi Proteus vulgaris SIM * Kısaltmalar: I, indol; L, lizin; O, ornitin; SIM, sülfit-indol-motilite medium 2 Testin uygulanması 2.1. Asılı-damla tekniği İnokulumun hazırlanması Bakterinin taze agar kültüründen tek düşmüş bir koloniden sıvı kültür yapılır. İnokulum hafif olmalı; bulanıklık görülmemelidir. Besiyerinin seçimi etkene göre ve aşağıdaki ölçütler dikkate alınarak yapılır: (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) Organizmanın üremesini destekleyecek, karbonhidrat içermeyen bir besiyeri (BHI, nitrat buyyon vb.) seçilir. Gram-negatif çomaklar için serum fizyolojik kullanılabilir. Legionella için ılık, steril çeşme suyu kullanılır. Bacillus spp için daima bir sıvı besiyeri kullanılmalıdır. Enterokoklar için 0.5 ml BHI veya TSB kullanılır. Zor üreyen mikroorganizmalar için bir yatık agar ekimi yapılır ve dikkatlice yatık kısmın dibine, ekim çizgisini bir miktar kaplayacak şekilde birkaç damla BHI veya besleyici buyyon eklenir. Asılı damla, bir gecelik inkübasyon sonrasında sıvı kısımdan bir damla kullanarak hazırlanır. Bu teknik özellikle nonfermentatif gram negatif çomaklar için idealdir. Su kullanılabilir; ancak bazı hareketli organizmaların distile suda hareketsiz hale geldiklerine dair raporlar vardır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 5 / 10 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 /

6 Asılı-damla preparatın hazırlanması ve inceleme Bakteri süspansiyonundan küçük bir damla bir lamelin ortasına konur. Lamelin her bir köşesine çok küçük birer damla su konur. Çukur lam, çukur kısmı alta gelecek şekilde çevrilir ve lamelin üzerine getirilir; dikkatlice lamelin üzerine bırakılır (çukur kısım bakteri damlasının üzerine gelecek şekilde). NOT: Eğer çukur lam yoksa normal bir lam üzerine Vazelinden bir halka yapılarak çukur oluşturulur ve aynı amaçla kullanılır. Lamel lama yapışacaktır. Lam dikkatlice çevrilip düzeltildiğinde bakteri içeren damla çukurun üstünde asılı durumda olacaktır. Preparat mikroskopta 400 büyütmede bakteri hareketi yönünden incelenir. Preparat ışık mikroskobunda ışık şiddeti azaltılarak -diyafram kısılarak- veya faz kontrast mikroskobunda incelenmelidir. İncelemede hareket gözlenmez ise sıvı kültür inkübe edilir: (a) Nonfermenter gram negatif çomaklar 30 C de, 24 saat, (b) Enterokoklar ve Listeria 30 C de, 2 saat, (c) Diğer organizmalar için kendi optimal üreme şartlarında (genellikle 35 C de) inkübe edilirler. İnkübasyon sonrası sıvı kültürden tekrar preparat hazırlanır, incelenir Tüp besiyerinde hareket testi İnkübasyon öncesi tüp besiyeri oda ısısına getirilir. Besiyeri yüzeyi kuru olmalıdır. Yüzey ıslak ise hareketsiz bakteriler bu sıvı ile agar kenarından yayılarak üreyebilir ve bulanıklığa neden olabilirler. Bu nedenle eğer sıvı varsa ekimden önce tüp eğilerek dikkatlice dökülmelidir. Bakterinin taze agar kültüründen tek düşmüş bir koloniden veya yatık agar pasajından iğne öze ile inokulum alınır. Tüpteki yarı-katı agarın merkezinden daldırılarak yaklaşık 2 cm ilerlenir. Tek bir hareketle ekim yapılmalıdır. Hareket tüplerinin okunması bazen zordur. Bu nedenle eş zamanlı olarak pozitif ve negatif kontrol organizmaları için de tüpler inoküle edilmelidir. Testin değerlendirilmesi böylece daha kolay ve güvenilir olur. Tüp kapakları gevşek kapatılır ve bir gece inkübe edilirler. İnkübasyon şartları aşağıdaki gibidir: (a) Enterobacteriaceae; 35 C de 24 saat, (b) Nonfermenter gram negatifler ve enterokoklar; 30 C de, 24 saat, (c) Negatif sonuç ile ilgili bir soru işareti varsa, 25 C de inkübe edilir, (d) Listeria ve Yersinia lar için iki tüpe ekim yapılır; biri 35 C de, diğeri 25 C de 24 saat inkübe edilir. Sayfa 6 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji

7 2.3. Plak besiyerinde hareket testi Yarı-katı agar besiyeri içeren bir tüp alınır ve kaynar su banyosunda eritilir ve steril bir Petri kabına dökülür; katılaşması beklenir. NOT: Yarı-katı agar besiyeri önceden tüplere ml dağıtılarak hazırda bulunduruluyor olmalıdır (bkz. Ek-1). Bir iğne öze ile incelenecek bakterinin taze kültüründen, tek düşmüş koloninin üzerine veya KIA/TSI pasajına dokunarak inokulum alınır. Plaktaki besiyerinin ortasına dokunarak nokta ekim yapılır. Yukarıda 2.2 de belirtildiği gibi inkübe edilir. 3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması Asılı-damla preparatında hareketin değerlendirilmesi Pozitif sonuç aceleci, zikzak, yuvarlanma veya diğer anlamlı yer değiştirme şeklinde hareketlerin gözlenmesi. Negatif sonuç hareket görülmemesi veya sadece Brownian hareket NOT 1: Brownian hareket, bir sıvıda asılı haldeki partiküllerin (bakterilerin) moleküler bombardımana bağlı olarak titreşip salınmasıdır ve gerçek hareketlilik ile karıştırılmamalıdır. Brownian harekette organizmaların diğerlerine göre bağıl konumu değişmez. Gerçek hareketlilik durumunda ise, organizmaların birbirlerine göre yer değiştirdikleri ayırt edilir. NOT 2: Campylobacter lerde çok aktif bir hareketlilik gözlenir; alanın içine giren, alandan çıkan, koşuşturan minik noktalar gibi görünürler Tüp besiyerinde hareket testinin değerlendirilmesi Pozitif sonuç tüp besiyerinde ekim çizgisinden uzaklaşarak, yaygın üreme veya besiyerinde bulanıklık görülmesi: bakteri hareketli. Negatif sonuç tüp besiyerinde temiz/berrak bir görünüm ve sadece inokülasyon çizgisinde sınırlı üreme görülmesi: bakteri hareketsiz. NOT: TTC içeren besiyerinde bakterinin ürediği yerde kırmızı renk meydana gelir. Hareketli organizmalar -ekim çizgisinden yayılanpembe bir renk üretirler. Hareketsiz organizmalar ise ekim çizgisinde sınırlı bir pembe-kırmızı renk oluştururlar. Negatif tüpler, eğer gerek görülüyorsa 25 C de 5. güne kadar tutulur Plak besiyerinde hareket testinin değerlendirilmesi Pozitif sonuç agar plakta inokülasyon noktasından uzağa doğru (agar TTC li ise, pembe) difüzyon gözlenmesi: bakteri hareketli. Negatif sonuç sadece ekim noktasında üreme; dışa doğru bir yayılma olmaması: bakteri hareketsiz. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 10 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 /

8 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Asılı damla testinde, özellikle zayıf hareket yeteneği olan bakterilerde, bakteri hareketi ile Brownian hareket karıştırılabilmektedir. Her bir hücre daha uzun süre izlenerek hareketin niteliği ayırt edilmeye çalışılmalıdır. Mikroskop lamının aşırı ısınması gözlem sonuçlarını etkileyebilir. Eğer bakteriyel kamçılar ısıtma, çalkalama vb. bir travma ile hasar görmüş ise yanlış negatif sonuç alınabilir. Böyle çevresel etkiler bakterinin hareket yeteneğini kaybetmesine yol açabilmektedir. Bazı organizmalar (ör.,yersinia spp, Listeria spp) C de kamçı proteinlerini sentezleyemezler, fakat C de sentezleyebilirler. TTC bazı zor üreyen bakteri türleri için inhibitör olabilir. Bazı bakteriler kan kültürlerinden ilk izolasyonda hareket özelliği göstermezler. Bazı bakterilerin eski kültürlerinde hareket özellikleri azalır. Hareket testi taze kültürlerden tekrarlanmalıdır. Bacillus türleri en iyi taze plaklarından direkt test edilir. Eğer taze plak mevcut değilse bir plağa ekim yapılır ve 4 saat inkübe edilir; asılıdamla preparatı bu inkübasyondan sonra yapılır. Anaeroblar için hareketlilik sonuçlarını belirlemek zordur. Yalnızca pozitif sonuçlar anlamlı kabul edilir. Pseudomonas aeruginosa gibi üremek için oksijen gereksinimi yüksek olan organizmalar tüp besiyerinin yüzeyine yayılan bir film katman oluştururlar. Bu tür bakterilerin hareket testinde -özellikle oksijenin giderek azaldığı düzeylerde üremeyecekleri için- ekim çizgisinden yayılma gözlenmeyecektir. Pek çok organizma tüpte yarı-katı agarın derin kısımlarında üreyemez; bunlar için plak besiyerine nokta ekim daha uygun olabilir. Hareketsiz, mukoid Klebsiella kökenleri tüp besiyerinde yanlış pozitif hareket reaksiyonu verebilir; bu mukoid suşların tüp ile besiyeri arasına yayılması yüzünden olabilmektedir ve bulanık görünüm hareket reaksiyonu ile karıştırılabilmektedir. Sayfa 8 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji

9 Ekler Ek-1 Hareket testi besiyerinin (HTB) hazırlanması 1 Tüpte hareket testi için besiyerinin hazırlanması Sığır eti özütü Pankreatik kazein Sodyum klorür Agar Distile/deiyonize su 3.0 g 10.0 g 5.0 g 4.0 g 1000 ml 1. Maddeler bir erlene konur; bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırılarak ısıtılır (kaynama derecesinde), eritilir. 2. ph ölçülür ve gerekli ise 7.3 e ayarlanır. 121 C de 15 dakika otoklavlanır C ye soğutulur. NOT: TTC eğer isteniyorsa bu aşamada eklenir. Steril, %1 lik TTC den 5 ml 1000 ml besiyerine eklenir. 4. Besiyeri aseptik şartlarda, steril, burgu kapaklı tüplere (13x100-mm) 5 ml tevzi edilir. Kapakları gevşek kapatılır. 5. Tüpler dik pozisyonda donmaya bırakılır. Donduktan sonra da kapaklar bir süre daha gevşek bırakılarak besiyeri yüzeylerinin kuruması beklenir. 6. Besiyerinin adı ve son kullanma tarihi yazılarak tüplerin üzeri etiketlenir. Kapaklar sıkılaştırılır ve buzdolabında saklanırlar; saklama koşullarına uyulduğunda raf ömrü 6 aydır. Plakta hareket testi için tüplerin hazırlanması 1. Agar oranı hayli düşük (%0.4) olan HTB nin plaklara dökülmüş halde, bütünlüğü bozulmadan saklanması güçtür ve dolayısı ile plakta hareket testi için besiyerinin test yapılacağı zaman plağa dökülmesi tercih edilir. 2. Bu amaçla, besiyeri önce yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanır. Tüplere dağıtma aşamasında (4. adım) büyük tüplere (25x150 mm) 20 ml dağıtılır ve dik konumda dondurulduktan sonra saklanır. 3. Bu şekilde hazırlanmış her bir tüp daha sonra test yapılacağı zaman kaynar su banyosunda eritilecek ve bir Petri plağına dökülecektir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 10 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 /

10 Kaynaklar 1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic bacteria. Motility Test. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p Pratt-Rippin K, Pezzlo M. Identification of commonly isolated aerobic gram-positive bacteria: Broth motility test: Hanging drop. In: Isenberg HD (ed in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Press, Washington D.C. 1992, p Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. Center for Diseases Control and World Health Organisation Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (Eds). The Enterobacteriaceae. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia. 1992, p.125. Sayfa 10 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji