Uzm. Bio. NUR YILDIRIM

Transkript

1 Uzm. Bio. NUR YILDIRIM

2 Genlerin çok büyük ve çok sayıda ekzondan oluştuğu göz önüne alındığında, bu genleri Sanger sekanslama ve genom boyu SNP genotiplemesi gibi klasik genetik metodlarla taramak hem maddi açıdan çok pahalı olmakta hem de zaman bakımından çok uzun sürmektedir. Tüm ekzom sekanslama, 2009 yılında klasik genetik metotlarına alternatif olarak tanımlanmış bir metotdur. Bu metot, yeni nesil teknolojiler yardımıyla dönüşümsel bir yaklaşım sağlayarak kompleks ve monogenik hastalıkdaki, etkili mutasyonu saptamakta kullanılmaktadır.

3 İnsan genomu yaklaşık 3 milyar bazdan meydana gelmektedir. Ancak bunun çok küçük yani yaklaşık %1.5 luk bir kısmı protein üretmektedir yani fonksiyoneldir. Ekzon kelimesi ifade olan bölge kelimelerinin İngilizce karşılıklarından (EXpressed region) oluşturulmuştur. Ekzom terimi ise genom içerisinde bulunan tüm protein kodlayan dizileri yani ekzonları tanımlamak amacıyla kullanılan bir terimdir.

4 Tüm ekzom sekanlama yöntemi, sık veya nadir olmasına bakmaksızın ekzomdaki her bazın tanımlanmasını sağlamaktadır. Bu nedenle bu yüksek çözünürlüklü sekanslama yöntemi gün geçtikçe bilim adamları tarafından nadir varyantları tanımlamada tercih edilen bir yöntem halini almaktadır.

5 Hastalık yapıcı mutasyonların yaklaşık olarak %85 i, proteinin amino asit dizisini etkileyecek şekilde, genlerin ekzon veya ekzon-intron birleşme bölgelerinde bulunmaktadır. Bu bölgeler de genomun %1,5 lik bir bölümünü oluşturmaktadır. Bu nedenle etkilenmiş bireylerde öncelikle tüm genom sekanslaması yapmak hem iş gücünü hem de maddi yükü arttırmaktadır. Öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemini kullanarak genomdaki sadece protein kodlayan bölgelerin sekanslanması daha uygundur. Bu yöntem yardımı ile çok çeşitli hastalıklara neden olan nadir varyantların tanımlanabileceği yapılan çalışmalarla kanıtlanmış ve günümüzde yaygın bir kullanım alanına sahip olmuştur.

6 Yöntem temel olarak hedef bölgelerin seçimi ve sekanslanması olmak üzere iki basamak içermektedir. Hedef bölgelerin seçimi yani capture aşamasında genomik DNA rastgele yerlerden parçalanarak fragmentlerine ayrılmaktadır. Bu parçalama işlemi sonikasyon (ses dalgalarının enerjisinden yararlanarak biyolojik maddenin parçalanması) tekniği kullanılarak gerçekleştirilmektedir.

7 Tüm ekzom sekanslama yönteminde hedef bölgelerin seçimi işlemi bir adet kalıp DNA üzerinden gerçekleşmemektedir. Yani işleme başlarken kullanılan 100 μl DNA nın içerisinde çok sayıda aynı kalıp DNA bulunmaktadır. Sonikasyon işleminden sonra rastgele yerlerinden parçalanan bu kalıp DNA lar, aynı bölgelerden parçalanmazlar. Bu nedenle tek bir baz üzerinden konuşursak, bu bazı farklı lokalizasyonlarda içeren çok sayıda farklı fragment oluşmaktadır. Bu baz; bazı fragmentlerde baş, bazı fragmentlerde orta, bazılarında ise son kısma denk gelmektedir. Böylelikle bu baz farklı fragmentlerce birden çok kez kapsamına alınmıştır. Bu bazın farklı fragmentler tarafından kapsanma sayısını (sekanslama aşamasında ise; kaç kere okunduğu yani sekanslandığı sayı) ifade etmek için coverage terimi kullanılmaktadır.

8 Kapsanma sayısı her baz için değişkenlik göstermektedir. Bunun sebeplerinden biri genomun o bölgesindeki GC baz içeriğidir. Diğer bir neden ise örneğin kalitesidir.

9 Bu yöntem için kullanılacak örneğin yüksek kalitede olması elde edilecek sonuç açısından çok önemlidir. Degrade olmuş yani bir takım sebeplerden dolayı parçalanmış bir DNA örneği, sonikasyon işlemi ile parçalanacağı için istenilenden çok daha küçük boyutta fragmentler oluşturmaktadır. Bu fragmentler de pürifikasyon aşamalarında atılmaktadır.

10 Sonikasyon aşamasından sonra elde edilen DNA fragmentleri

11 Elde edilen bu fragmentlerin uçlarına sekanslama işleminde kullanılmak amacıyla bir takım adaptörler bağlanmaktadır. Ardından bu fragmentlerin pürifikasyon aşaması gerçekleştirilir ve elde edilen ürün örneğinizin hazırlanmış kütüphanesidir. Ardından sekanslamak istediğiniz bölgeye özgü hazırlanmış kitler sayesinde elinizdeki kütüphaneden bu bölgelerin seçimi aşaması gerçekleştirilir. Bu seçim bir hibrid seçimidir. Bu işlem sonucunda hibrid oluşturmayan fragmentler temizlenerek uzaklaştırılır. Elde edilen hibridli fragmentler pürifiye edildikten sonra sekanslama aşamasına geçilmektedir.

12 Tüm ekzom sekanslama yönteminin akış şeması

13

14 Sekans örnekleri Örnek takibi Hazırlık basamakları Verilerin toplanması Veriler

15 Genetikte bir devrim niteliğindedir. Her bir yürütmede 1.4 milyar baz okuma yapılabilmektedir. Klonal olarak amplifiye edilip taneciklere bağlanan DNA fragmentlerinin, toplu ve paralel sekanslanması temeline dayanır.

16 Yeni nesil dizileme; genom, transkriptom, DNA-protein etkileşimlerinin geniş kapsamlı analizini ucuz (?), rutin ve yaygın hale dönüştürdüğü için biyolojik araştırmaları önemli ölçüde hızlandırmaktadır. Yeni nesil dizileme teknolojisi; mrna, küçük RNA profili, transkripsiyon faktörleri bağlanma bölgelerinin genom boyu karakterizasyonu, kromatin yapısı ve metilasyon paterni, atasal DNA mikrobiyolojisi ve metagenomik için yeni ve hızlı yollar sağlar.

17 Son yıllarda geliştirilen yeni nesil DNA dizileme teknolojisi, genetik/epigenetik düzenleyici ağların, kromatin yapısı, nükleer yapılanma ve genom varyasyonları (çeşitliliği) hakkında bilgi üretimini sağlayan önemli bir araçtır. Yeni nesil DNA dizileme sistemleriyle yüksek doğrulukla, hızlı bir şekilde dizileme yapılabilmektedir.

18 Bu yöntemle elde edilen bir mikrobiyal genom dizisi araştırmacılara başka hiçbir deneysel yöntem ile elde edilemeyecek kadar zengin ve özgün bilgi sağlamaktadır. Örneğin 4.6 Mb'lık E. coli genomu tek bir okuma ile tamamlanabilmektedir. Yapılan bir çalışmada E. coli genomu dört kere, herbir koşmada okuma yapılarak de novo dizilenmiş ve sekanslamalann % ila % arasında doğrulukla yapıldığı tespit edilmiştir.

19 Bütün Genom Dizileme Sistemi ile dizileme: Küçük DNA parçacıkları ve adaptör dizilerinin pikolitre hacimlerde büyük çaplı paralel dizileme ile dizilenmesi prensibine dayanmaktadır.

20 Applied Biosystem SOLID Illumina Genome Analyzer Roche 454 GS FLX Ion Torrent Yeni Nesil DNA Dizi Analizi Roche GS Junior Pasific Bioscience Helicos

21 Sanger metodu ile uzun DNA bölgelerinin dizilenmesi için dizileme öncesi uygulanması gereken klonlama ve koloni seçimi işlemlerinin çok uzun süre alan zahmetli işlemler olması bilim adamlarını alternatif dizileme yöntemleri arayışına sokmuştur. 1996'da Ronaghi ve arkadaşları "Sentez Yoluyla Dizileme" (sequencing by synthesis) prensibine dayalı "Pirodizileme" metodunu geliştirmiştir. Pirodizileme yüksek işlem hacmi ve düşük maaliyeti sayesinde geleneksel Sanger dizilemenin yerini almıştır.

22 Pirodizilemenin temeli, DNA polimeraz aktivitesinin kemilüminesan bir enzim aracılığıyla tespitine dayanmaktadır. Dizilenecek DNA'nın tek sarmalı (ssdna) üzerinde tamamlayıcı sarmalın sentezlenmesi şeklinde ilerler.

23 Çift zincirli DNA bç'lik küçük fragmanlara ayrılır. Bu fragmanlara dizileme primerlerini taşıyan adaptörler eklenir. Adaptörleri taşıyan DNA fragmanlarının mikroreaktörler içerisinde emülsiyon bazlı klonal amplifikasyonu (em-pcr) gerçekleştirilir.

24 Bu aşama sonucunda yaklaşık olarak 10 milyon kopyaya çıkarılmış DNA fragmanları sentez yoluyla dizileme yöntemiyle yaklaşık 3.6 milyon kuyu içeren bir platede dizilenir. Dizileme primeriyle sabitlenen tek sarmallı kalıp DNA üzerine ardışık olarak akan A, C, G, T nükleotitlerinin kalıp DNA dizisine tamamlayıcı olması durumunda ortamda bir ışık oluşur. Bu ışığı yaratan kemilüminesan sinyalin hangi nükleotidin bağlanması sırasında oluştuğu tespit edilir.

25 Sabitlenen ssdna, DNA polimeraz, ATP sülfirilaz, lüsiferaz, apiraz, APS ve lusiferin ile inkübe edilir. Nükleotid akışı sırasında tamamlayıcı nükleotidin gelmesi durumunda DNA polimeraz pirofosfat (PPi) açığa çıkmasını sağlar. ATP sülfirilaz enzimi bu PPi'ı kantitatif olarak ATP'ye dönüştürür. ATP, lüsiferaz enzimi aracılığıyla lusiferinin oksilusiferine dönüşmesini sağlar. Oksilusiferin görülebilir bir ışık yaratır. Bu ışığın şiddeti ATP miktarıyla doğru orantılıdır ve bu sayede aynı dizi üzerindeki tek nükleotid tekrarları (homopolimer) tespit edilir. Ortaya çıkan bu ışık CCD kamera tarafından kaydedilir ve bilgisayar programı yardımıyla dizi verilerine (flogram) dönüştürülür.

26 Pirodizileme yöntemi kullanılarak, klonlama yapmaksızın, 7.5 saatte milyon bazlık dizileme yapmak mümkündür. DNA'nın çift sarmallı yapısını bulan Nobel ödüllü araştırmacı Dr. James Watson'in genomu bu yöntemle dizilenmiştir. Yine Neandertal genomu ve nesli tükenen mamut türünün genomu bu yöntemlerle kısa sürelerde bütünüyle dizilenebilmiştir. Bu yöntem bu tip karmaşık genomların haricinde, bakteri ve virus gibi daha basit genomların da bir gün içinde tüm genomunun dizilenebilmesini sağlar.

27 DNA molekülleri öncelikle slide üzerindeki primerlere bağlanıp amplifiye edilir (bridge amplification). Dört tip ddntp eklenir ve yeni sentezlenen ipliğin yapısına girmeyen ddntp'ler yıkanarak uzaklaştırılır.

28 Pirodizilemeden farklı olarak, DNA her yıkamadan sonra, bir nükleotid uzar. Floresan işaretli nükleotidler kamera aracılığı ile tespit edildikten sonra, 3' ucundaki sonlandırıcı kimyasal olarak çıkartılır ve sonraki siklusa geçilir.

29 Bu metotta da pirodizilemedeki gibi emülsiyon PCR yapılır. Primerler adaptör diziler yardımıyla kalıp ipliğe hibridize olur. Farklı olarak DNA polimeraz yerine DNA ligaz enzimi kullanılır. Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır, problar kalıp DNA'ya hibridize olur ve primerle ligasyona girer. Floresan deteksiyonundan sonra oligonükleotid probların işaretleri 5' fosfat ucu kesilerek yeni bir ligasyon siklusuna geçilir. Ligasyon, deteksiyon ve ayrılma siklusları tekrarlanarak DNA dizisi belirlenir.

30 Bu metot DNA'nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan hidrojen iyonlarının saptanmasına dayanır. Tek bir kalıp DNA dizisini içeren mikro kuyuya tek tip nükleotid akışı uygulanır. Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu durumda yeni oluşan ipliğin yapısına katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur. Hidrojen iyonları hipersensitif iyon sensörleri tarafından algılanır. Kalıp DNA'da homopolimer tekrarların varlığı durumunda tek siklusta birden fazla nükleotid yeni ipliğin yapısına girecek ve salınan hidrojen iyonlarının sayısına göre daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir.

31 Polimeraz ve nükleotit trifosfatlar, DNA bazlarını tanımlamak için doğrudan moleküler algılayıcılar (nano-dizileme makineleri) olarak davranmak üzere kullanılır. DNA ipliği nano gözenekten geçerken, gözeneğin yanlarına yerleştirilmiş elektrotlar aracılığıyla elektrik akımı kaydedilir. Dört farklı baza karşılık gelen akım değişiklikleri belirlenmek suretiyle nano gözenekten geçen DNA nın dizisi belirlenir. Pacific Bioscience cihazı nano dizileme prensibi ile çalışmaktadır.

32

33 5500 W Series Genetic Analysis Systems: Next-Generation Sequencing Ion Personal Genome Machine Sequencer Applied Biosystems Ion Torrent Roche GS Junior System 454 sequencing

34 EMÜLSİYON PCR Adaptör takılı fragmentler yağın içerisindeki bir su damlasının içinde amplifiye olur. Primerler boncuk (bead) yüzeyine tutunur. Roche 454 ve SOLID Sistemler tarafından kullanılır.

36 Roche 454 Sequencing - GS Junior System Yeni nesil sekans sistemi kanıtlanmış teknolojisi, geniş uygulama alanları, pratik ve ekonomik olarak tasarlanmış bir sistemdir. Uzun okuma teknolojisi ile yüksek kalitede doğrulukla dizileme yapabilmektedir. Tüm genom dizileme, amplicon dizileme, alt tür ve türümsü tayini, mutasyon tespiti ve genotiplendirme gibi pek çok uygulama alanında kullanılmaktadır. Sistem multiplex çalışma yapmaya uygundur. Sisteme adapte edilmiş; onkoloji, genetik, viroloji, hematoloji panelleri mevcuttur. Amplifikasyon: Emulsiyon PCR Sekans Reaksiyonu: Pirodizileme Yürütme Başına Kalıp Molekül : 1 milyon 400 Mb /okuma / 7,5 8 saat

37 Roche 454 Sequencing - GS Junior System Pirodizilemenin paralelleştirilmiş bir versiyonu 454 Life Sciences tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde bir yağ solüsyonu içindeki su damlacıklarında yer alan DNA, PCR ile çoğaltılır (emülsiyon PCR). Tek bir DNA kalıbının tek bir primer kaplı boncuğa bağlı olduğu her damlacık, sonra klonal bir koloni oluşturur. Dizileme cihazı çok sayıda pikolitre hacimli kuyulara sahiptir, bunların her biri tek bir boncuk ve dizileme enzimleri içerir. Pirodizilemede lüsiferaz enzimi kullanılır, bu enzimin ürettiği ışık ile büyümekte olan DNA'ya eklenen her bir nükleotit tespit edilir. Veriler birleştirilerek dizi okumaları üretilir.

38 Roche 454 Sequencing - GS Junior System

39 DNA fragmentlerinin iki ucuna adaptör takılır ve bu adaptörler çiplere utturulur Bridging (köprü kurma) adı verilen yöntemle DNA fragmentleri çoğaltılıp kümeler haline getirilir. Illumina Solexa sisteminde kullanılır.

41 Illumina yeni nesil sekans sistemlerine yeni bir soluk getirmiştir. Sınıfında ilk ve tek yeni nesil sekanslama sistemi olan Hiseq2500, Hiseq sekans sistemlerinin en yeni üyesi olarak karşımıza çıkıyor. Aynı platformda sekans kütüphane hazırlama sistemini de bulunduran Hiseq2500, bir sekanslama çalışmasını en az süreye indirgeyerek yüksek kapasite ve hızı aynı anda gerçekleştirebiliyor. Yüksek output modülde, yüksek sayıda genome, exome ve transcriptomu tek bir run da sekanslar. Amplifikasyon: Bridge PCR Sekans Reaksiyonu: Reverse Terminator Hızlı modülde ise, bir genomu 30x de veya exome resekanslama ve RNA sekanslamayı bir günde tamamlar. Hızlı run modülünde sekans kütüphane hazırlama ve pairedend modül sisteme entegre olduğu için hiçbir şekilde kullanıcı müdahalesine gerek duymaksızın sistem otomatik olarak çalışır. Yürütme Başına Kalıp Molekül: 40 milyon Günlük Veri Üretimi: >17 Gb /okuma / 3-6 saat

42

43

44 Bu metotta da pirodizilemedeki gibi emülsiyon PCR yapılır. Primerler adaptör diziler yardımıyla kalıp ipliğe hibridize olur. Farklı olarak DNA polimeraz yerine DNA ligaz enzimi kullanılır. Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır, problar kalıp DNA'ya hibridize olur ve primerle ligasyona girer. Floresan deteksiyonundan sonra oligonükleotid probların işaretleri 5' fosfat ucu kesilerek yeni bir ligasyon siklusuna geçilir. Ligasyon, deteksiyon ve ayrılma siklusları tekrarlanarak DNA dizisi belirlenir.

46 Applied Biosystems'in SOLiD teknolojisinde ligasyon yoluyla dizileme yöntemi kullanılır. Burada, belli uzunluktaki tüm olası oligonükleotitlerin bir karışımı dizilenen konuma göre işaretlenir. Oligonükleotitler toplanır ve ligasyona uğrar; DNA ligazın birbiriyle eşleşen dizileri bağlanma tercihi nedeniyle, o pozisyon için bilgilendirici bir sinyal elde edilir. Dizilemeden önce DNA emülsiyonu PCR ile çoğaltılır. Elde edilen boncukların her birinde aynı DNA'nın kopyaları bulunmaktadır, bu boncuklar bir cam slaytın üzerine yerleştirilir. Amplifikasyon: Emülsiyon PCR Sekans Reaksiyonu: Ligasyon Yürütme Başına Kalıp Molekül: 85 milyon Günlük Veri Üretimi: Gb /okuma / 6 gün Veriler bilgisayar programı tarafından işlenir.

47

48

50

51

53 Nano boyuttaki karbon tüpler kullanılmaktadır. Tüm DNA zinciri geçirilir, parçalanıp birleştirmeye gerek yoktur. Elektrik tunneling adı verilen bir sistem ile sensörler aracılığı ile bazlar arasındaki elektrokimyasal farklılıklar belirlenmektedir. Veriler bilgisayarda işlenmektedir.

54 Amplifikasyon: YOK Sekans Reaksiyonu: Tek molekül gerçek zamanlı sekanslama Yürütme Başına Kalıp Molekül: - Günlük Veri Üretimi: -

55

56

57 Illumina Genome Analyzer Applied Biosystem SOLID Roche 454 Genome Analyzer Ion Torrent Yeni Nesil DNA Dizi Analizi Roche GS Junior Pasific Bioscience Helicos

58 Amplifikasyon: YOK Sekans Reaksiyonu: Sentezleterek molekül sekanslama Yürütme Başına Kalıp Molekül: 800 milyon Günlük Veri Üretimi: Gb /okuma / 8 gün

59

60 Yeni Nesil Dizileme Teknolojisinin Uygulama Alanları 1. Metagenomik 2. Bitkiler ve Tarımsal Biyoteknoloji 3. Atasal DNA 4. Transkriptom 5. Küçük RNA lar 6. Metilasyon Analizi 7. Kromatin İmmunpresipitasyon Dizileme (ChIP-Seq)

61 1. Metagenomik Çevresel ortamda hangi mikrop, ne miktarda (sadece kendi ortamında büyüyen mikroorganizmalar için) Toplu arı ölümleri Obezite-mide florası arasındaki ilişki Hastane enfeksiyonları Ağız-diş sağlığı

62 2. Bitkiler ve Tarımsal Biyoteknoloji

63 3. Atasal DNA Fosilden, saç, kemik gibi donmuş korunmuş örneklerden elde edilen DNA dan genomik analiz gerçekleştirilerek filogenetik analiz yapılabilir. Örneğin, yaşında Neandertal fosili ile modern insan ve şempanze genomu kıyaslanmış, yıl önce modern insan ile Neandertalin birbirinden ayrıldığı tespit edilmiştir.

64 4. Transkriptom - Transkriptom dizileme, - mrna transkripsiyon-ekspresyon analizi, - Yeni genlerin keşfi, - Henüz genomu tamamıyla tanımlanmamış organizmalarda gen bölgelerinin tanımlanması, - Tüm gen dizisinin oluşturulması, - Tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP) belirlenmesi, - İnsersiyon-delesyonlar ve splicing varyantların tespiti, - Allel spesifik ekspresyonların analizi ve kromozomal yeni düzenlenmelerin belirlenmesini kapsar.

65 5. Küçük RNA lar Küçük RNA'lar; microrna'lar, endojen sirna'lar ve Piwi-interacting RNA'ların dahil olduğu gruptur. Bu sistem sayesinde bakteri içerisinde klonlanma yapılmadan, yüzlerce hatta binlercesi tanımlanabilir ve miktarı belirlenebilir. Daha önce tanımlanmamış küçük RNA'lar tespit edilebilir ve farklı ekspresyon profili çıkartılabilir veya küçük RNA transkriptomları ile karşılaştırılabilir.

66 5. Küçük RNA lar Küçük RNA'ların analizi için öncelikle total RNA (~12.5%) denatüre poliakrilamid jelde yürütülerek fragmanların büyüklüklerine göre ayrılması sağlanır. Küçük RNA büyüklüğü baz arasında olduğu için bu büyüklüğe denk gelen bölge jelden alınarak RNA saflaştırılır. Önce 3' ucuna, sonra 5' ucuna T4 RNA ligaz ile adaptör eklenir ve oligo (dt)-adaptör primerleri kullanılarak tek iplik cdna sentezi yapılır. Daha sonra PCR yapılarak cdna'lar çoğaltılır. cdna lara adaptör eklenir, pirodizilemedeki basamaklar tekrar edilir.

67 6. Metilasyon Analizi Hedef genomik dizideki metilasyon belirlenir. Ayrıca hipermetile olan CpG dinükleotidlerinde birbirleri arasında metilasyon farkları da tespit edilebilir.

68 7. Kromatin İmmünpresipitasyon (ChIP-seq) Kromatin immunopresipitasyon (CHP) sonucu elde edilen kromatin materyalinin high-throughput paralel dizi analizi, ChIP-Seq olarak adlandılırmış olup ilk kez 2007 yılında uygulanmıştır. Bu yöntemde DNA'ya bağlanan proteinlerin (transkripsiyon faktörleri, histon proteinleri gibi), genom üzerindeki tüm bağlanma bölgelerinin dizilenmesi mümkündür. Genom boyunca bağlanma bölgelerinin analizi gen ekspresyonunu düzenleyici mekanizmaların anlaşılması için gereklidir.

69

70

71

72 Yeni nesil DNA dizileme teknolojisi çok fazla bilgi ve yeni yaklaşım sağladığından bu kadar çok bilginin depolanması, analizi ve değerlendirmesi oldukça zordur. Yeni nesil DNA dizileme teknolojisinin başarılı bir şekilde kullanılması için gelişmiş biyoinformatik analiz araçlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

73

74