PROTEOMİK K VE GENOMİK. Ocak 2007

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "PROTEOMİK K VE GENOMİK. Ocak 2007"

Basak Karakaş
7 yıl önce
İzleme sayısı:

1 PROTEOMİK K VE GENOMİK IŞIK IK PERÇİN Ocak 2007

2 Kütle Spektrometrisi Elektrospray İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Proteomikte Elektrospray İyonizasyondan Yararlanan Kütle Çözümleyicileri Üçlü Dörtuçlu Kütle Spektrometresi İyon Tuzağı Kütle Spektrometrisi İyon HızlandH zlandırıcı Kütle Spektrometresi Hibrit Kütle Spektrometreleri ESI-MS/ MS/MS e Peptit Karışı ışımlarının n Sunulması İçin Teknikler

3 Kütle Spektrometrisi Kütle spektrometrisi,, proteinler ve peptitlerin tayininde çok değerli erli bir araçtır r ve modern kütle k spektrometreleri(ms), yüksek y kütle k dağı ğılım m ve doğrulukta analize imkan tanımas ması nedeniyle çok önemlidir. Aletlerdeki son gelişmeler proteinlerin, bir ve iki yönly nlü jellerden triptik parçalama alama sonrası kütle parmak izi analizi ile belirlenmesine olanak sağlar. Bu amaçla, PSD-MALDI MALDI-MS MS ve ESI-MS/MS gibi kütle k spektrometrilerinden yararlanılır. r. Edman degredasyonu ile dizi analizlerinde ise, internal peptitlerin HPLC kullanılarak larak ön fraksiyonlama ile saflaştırılmalar lmalarına ihtiyaç vardır. r.

4 Son zamanlarda, MALDI iyonizasyonuna dayanan, yeni bir takım m MS/MS yetenekli kütle k spektrometreleri geliştirilmi tirilmiştir. tir. Bu aletler MALDI iyonizasyon teknikleri ile çarpışma-indüklü ayrış ışma ile iyonların fragmentlerine ayrılmas lması tekniklerini birleştirir. Örneğin, son yıllarda y geliştirilen Sciex firmasına ait MALDI-Pulsar şekilde gösterilmiştir. tir. Bu hibrit yaklaşı şım, etkili fragmentasyon modeli ile, geleneksel MALDI-TOF TOF a göre önemli avantajlar sunar. Ayrıca örneklerin hızlh zlı görüntülenmesi ile de ESI-MS/MS yöntemine y üstünlük k sağlar.

5 Elektrospray İyonizasyon Kütle Spektrometrisi (ESI-MS)

6 Elektrospray iyonizasyonu, atmosferik basınç altında analitlerin, sıvı fazdan gaz fazına geçişine izin verir. Genel olarak, iyonizasyon işlemi, kütle spektrometrisinin girişi ile küçük bir tüpün ucu arasında elektriksel alan uygulanarak başarılır. Elektriksel alan, yüklü sıvıyı ucun sonunda bir koni oluşturması için zorlar. TAYLOR konisi adı verilen bu koni, yük/yüzey oranını azaltır. Koninin ucunda damlacıklar oluşur ve kütle spektrometresinin girişine doğru taşınır.

7 ESI çoğunlukla popülerdir, çünk nkü ESI, kütle k spektrometrisi ile atmosferik basınç arasında doğrudan bir arayüzey sağlar. ESI, ayrıca HPLC, sıvı kromatografisi (LC) ve kapiller zone elektroforezi (CZE) gibi ayırma teknikleri ile de kolaylıkla kla birleştirilebilir. ESI nın en önemli avantajı,, kolaylıkla kla ayırma teknikleri ile birleştirilebilir olmasıdır. Bu avantaj, elektrospray kütle spektrometrisi ile birleştirilmi tirilmiş ayırma teknikleri üzerine kurulu pek çok yöntemin y geliştirilmesi ile yıllar y boyunca örneklendirilmiştir.

8 Proteomikte Elektrospray İyonizasyondan Yararlanan Kütle K Çözümleyicileri Üçlü Dörtuçlu Kütle Spektrometresi İyon Tuzağı Kütle Spektrometresi İyon HızlandH zlandırıcı Kütle Spektrometresi Hibrit Kütle Spektrometreleri

9 Üçlü Dörtuçlu Kütle Spektrometresi Proteomik çalışmalarında kullanılan lan ilk kütle k analizötörü üçlü dörtuçlu kütle spektrometresidir. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresi, dedektöre doğru düz d z bir şekilde yerleşmi miş birbirini takip eden 3 takım dörtuçlu içerir. Üçlü dörtuçlu kütle spektrometresinin proteomikte uygulanması, iyon tuzağı kütle spektrometresi ve hibrit kütle spektrometresi gibi daha hassas yöntemlerin y ortaya çıkması ile yer değiştirmi tirmiştir. tir.

10 İyon Tuzağı Kütle Spektrometrisi Proteomik çalışmaları için in tanıtılan başka bir analizötör, iyon tuzağı kütle spektrometresidir. İyon tuzağı ğı,, merkezi halkasal elektrot ve iki sonuç elektrodu olmak üzere hiperbolik yüzeyli y 3 elektrot içerir. i Şematik gösterim g elektrotların n nasıl l hizalandığı ığını, seramik speysırlar kullanılarak larak nasıl l izole edildiğini ini göstermektedir. Alet ışınsal olarak simetriktir ve r 0 ve z 0 boyutlarını göstermektedir.

11 İyon tuzağı kütle spektrometresi, bir kevgir ile takip edilen ısıtılmış paslanmaz çelik bir kapiller,, bir iyon rehberi, iyon tuzağı ve bir dedektör içerir. İyon tuzağı kütle spektrometresi, özellikle otomasyon, hassasiyet ve fiyat düzeyi bakımından protein uygulamalarında geniş oranda kabul görür g

12 İyon HızlandH zlandırıcı Kütle Spektrometresi En basit düzeyde, d bu analizötör bir iyon tuzağı kütle spektrometresidir. Tipik olarak, bir iyon rehberi ve sonunda da süper s iletken bir mıknatıs s içinde i inde yer alan bir Fourier değişim im hücresi h ile takip edilen bir iyon tuzağı içerir. İyon tuzağı kütle spektrometresinde olduğu u gibi, iyon rehberinin amacı iyonları odaklamak ve onları Fourier değişim im hücresine h taşı şımaktır. Fourier değişim im hücresine h giren iyonlar manyetik alan ve tuzak plakalar tarafından yakalanır.

13 ESI-MS/ MS/MS e Peptit Karışı ışımlarının Sunulması İçin Teknikler Sürekli-Infüzyon ESI-MS/MS ESI-MS/MS ile Birleştirilen Ayırma Otomatik Kütle K Spektrometrileri High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-MS/MS Geleneksel HPLC Mikroflow HPLC Kolonların Üretimi

14 Sürekli-Infüzyon ESI-MS/MS Düşük k akış hızlı elektrospray yöntemler geliştirmek yönünde y nde çabalar artmış ıştır. Mikroelektrospray ( nl/dakika), nanoelectrospray ( nl/dakika), ve picoelectrospray (<1 nl/dakika) yöntemleri y geliştirilmi tirilmiştir. tir. Bu yöntemlerin y hepsi, püskürteçin iç ve dışd çapını küçülterek, genelde akış gerekliliğinin inin düşürülmesini d sağlarlar. Sürekli akış infüzyon nanoelektrosprayinde,, ilgilenilen peptit karışı ışımı 1 mm çapındaki, gittikçe e daralan, cam iğnenin i içine i ine pipet ile verilir. Nanoelektrospray iğnesinin ucuna ulaşan an peptit çözeltisi düşük d k akış hızında (nanolitre( nanolitre/dakika) kütle k spektrometrisine elektrospraylenir. 1 µl örneğin analizi yaklaşı şık k 30 dakika ile 1.5 saat arasında gerçekle ekleştirilir.

15 ESI-MS/MS ile Birleştirilen Ayırma Elektrospray iyonizasyonu ayırma teknikleri ile de birleştirilebilir. Bu çoğunlukla az miktardaki örnekler için i in ve kontamine olmuş örnekler için i in tercih edilir. Ayrıca, nanoelektrospray yaklaşı şımı otomasyondan kaçınırken, ayırma teknikleri kolaylıkla kla otomatikleştirilebilir. tirilebilir.

16 Otomatik Kütle K Spektrometrileri Geleneksel nanoelektrospreylerde yapıld ldığı gibi, kütle k spektrometrisinin manuel olarak tetiklenmesi, ayırma teknikleri ile birlikte mümkün n değildir. O nedenle, otomatik bir kütle spektrometrisinden faydalanmak bu deneylerin başar arısı için in gereklidir.

17 HPLC-MS/MS (High-Performance Liquid Chromatography) HPLC küçük üçük k boyutlu peptitlerin kompleks karışı ışımlarının n izolasyonunda çok yararlı bir analitik yöntemdir. HPLC, ESI kütle k spektrometrisi ile birlikte analitlerin ayrılmas lması için in seçilen bir yöntem y olmuştur. Uçucu ve UV geçirgen HPLC tamponlarının n kullanılmas lması, yüksek duyarlıkl klı ölçümlere, birbirini izleyen direk amino asit analizlerine ve mikro dizi analizine imkan sağlamas laması açısından avantajlıdır.

18 Ters faz düzeninde d, HPLC, analitleri onların hidrofobikliklerine göre konsantre eder ve ayırır. r. Peptitleri,, HPLC ile bir kütle k spektrometrisine sunmak için i in farklı yaklaşı şımlar geliştirilmi tirilmiştir. tir. Bu yaklaşı şımların n hepsi, C-18 C gibi materyallerden yapılan bir HPLC kolonuna yüklenen y ve onun üzerinde ayrılan genel peptit çözeltilerine sahiptir. Fakat bu yaklaşı şımlar, akış hızı, örnek yolları,, sağlaml lamlık k ve hassasiyet açısından a farklılık k gösterir. g

19 Geleneksel HPLC ESI-MS ile birleştirilen geneksel microbor HPLC, pikomolden daha yüksek y protein seviyelerinin tanımlanmas mlanması için in iyi tasarlanmış bir yaklaşı şımdır. Microbore HPLC, genellikle düşük d k akış hızlı HPLC sistemine yerleştirilmi tirilmiş,, 0.3 mm çapındaki HPLC kolonu kullanılarak larak gerçekle ekleştirilir. Bu kolonlar boyunca gerçekle ekleştirilen akış hızları,, tipik olarak µl/dakika dır. 10 µl den daha az örnek alma yeteneğinde olan bir otomatik örnekleyici (autosampler)) ile birleşme, işlemin i otomasyonunu tamamlar. O nedenle bu otomatize edilmiş sistemde, protein parçalar alarının n sırals ralı tanıtımı,, ayrılmas lması ve analizi rutin olarak gerçekle ekleştirilebilir. Geleneksel HPLC kolonları

20 Mikroflow HPLC Kütle spektrometrisi,, sabit akış hızı için, in, konsantrasyon bağı ğımlı bir düzenek d iken HPLC bir konsantre etme tekniğidir. idir. O nedenle, kütle k spektrometrisine sunulan örneklerin konsantre edilmesinin geliştirilmesi, daha iyi hassasiyet sağlar. Sınırlı miktarda analit olduğunda, unda, konsantrasyonu düzeltmek d için, in, kolonun akış hızı ve boyutu azaltılabilir. labilir. Örneğin bir HPLC kolonunun boyutunu 1 mm den 100 µm ye düşürmek, analitlerin konsantrasyonunu 100 kez arttırır. r. Bu düşük k seviyedeki örnekler için i in çok cazip bir alternatiftir.

21 Kolonların Üretimi Kapiller tüp p içinde i inde durgun fazın doğrudan polimerizasyonu yolu ile üretilen monolitik kolonlar çok yakın n bir zaman önce ortaya çıkmıştır. Bu monolitik kolonlar, styrene veya divinylbenzen gibi bir polimer karışı ışımının n in situ polimerizasyonu ile elde edilir. Monolitik kolonların n avantajı, geleneksel HPLC kolonlarına na göre üretiminin kolay olmasıdır. Monolitik kolonların n dezavantajı ise, dikkatle gerçekle ekleştirilmesi gereken bir organik senteze gereksinim duymasıdır.

22 Teşekk ekkürler

Benzer belgeler

Elektrospray İyonizasyon Kütle Spektrometrisi

Elektrospray İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Hibrit Enstrumanlar Geleneksel MALDI-TOF kütle spektrometreleri, ayrıca, bir peptitin amino asitlerine ayrılması gibi fragmentasyon özellikleri de sağlayabilir. Bu ayrıca postsource decay yöntemi ile de