MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I. Mikroorganizmaları Klasik ve Moleküler Tanılama Metotları

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I Mikroorganizmaları Klasik ve Moleküler Tanılama Metotları

2 Taksonomi ve İsimlendirme Sistematik, canlıların çeşitliliğini araştırıp onları sınıflandıran bir bilim dalıdır. Sistematik üç alanda aktivite gösterir. 1- Taksonomi; organizmaların tanımını ve isimlendirilmesini yapar. 2- Filogenetik sınıflandırma; organizmaların evrimsel olarak akrabalık ilişkilerini araştırır. Taksonomi buradan elde edilen bilgiye göre yapılmaktadır. 3- Klasifikasyon elde edilen filogenetik bilgiyi çok sayıda hiyerarşik kademelerden oluşan bir sisteme yerleştirir.

3 Bilimsel Adlandırma Günümüzde kullanılan klasifikasyon sistemi; tür, cins, familya, takım, sınıf, filum (bölüm) ve âlem olarak sıralanırlar. Günümüzde kullanılan isimlendirme sistemi, 1735 ʼ te Linnaeus tarafından bulunmuştur. Bilimsel adlandırma her organizmada 2 ismin kullanılmasıyla tayin edilir. Cins ismi, daima baştadır ve tür ismi onu takip eder. Organizma her iki etiketle belirtilir ve her iki ismin de altı çizilir. Bilimsel isimler diğer canlılar arasında bir organizmayı tanımlar. Bir araştırmacının adını veya türün yaşadığı habitatını belirtebilir.

4 Bilimsel Adlandırma ** Ör: Staphylococcus aureus insan derisi florasında yaşayan bir bakteridir. - Staphylo, hücrelerin düzenli bir demeti anlamına gelir, - coccus hücre şekillerini belirtir. - aureus, altının latincesidir, bakterinin koloni rengini belirtir. ** E. coli bakterisinin cins ismi bir bilim adamının adıdır; Thedor Escherich, coli; ismi bakterinin yaşadığı bağırsağı işaret eder.

5 Günümüzde Sınıflandırma 1978 ʼ de Carl WOESE organizmaların hücresel organizasyonunu temel alan bir sınıflandırma sistemi öne sürdü. Bu sisteme göre bütün organizmalar 3 kısımda incelenmeliydi. 1. Bacteria (Hücre duvarı peptidoglikandan oluşmuş prokaryotlar) 2. Archaea (Peptidoglikandan yoksun prokaryotlar) 3. Eukarya (Protistalar, Mantarlar, Bitkiler, Hayvanlar)

6 Prokaryot organizmaların sınıflandırılması DNA benzerlikleri Filogenetik sınıflandırma Polifazik taksonomi G- C oranı DNA homolojisi Yağ asit profili Metabolik profili Morfolojik- biyokimyasal ve fizyolojik özellikler İmza DNA dizileri

7 Filogenetik Sınıflandırma Filogenetik sınıflandırma; kromozomal DNA benzerlikleri ve dolayısıyla genetik ilişki üzerine temellenir. organizmaların belli bir şekilde kategorize edilmesi, evrimsel ilişkiler temeline dayalı bir soyağacının oluşturulması, Prokaryot organizmaların genetik yapılarına göre filogenetik sınıflandırılmasında; nükleik asit yapılarının araştırılması ve birbirleriyle karşılaştırılması esas alınır.

8 1. DNA baz kompozisyonları Genetik sınıflandırmada araştırılan konulardan birisi organizmaların DNA baz kompozisyonlarıdır. Guanin ve sitozin miktarları belirlenir. guanin+sitozin yüzdesi denilen bir değer elde edilir. Bir organizmanın DNAʼ sındaki guanin ve sitozinin toplam değeri nesilden nesile değişmez. G+C oranları aynı olan organizmaların birbirleriyle akrabalık derecesinin belirlenmesi için DNA homolojisi adı verilen çok daha sıkı bir testten geçirilmeleri gerekir.

9 2. DNA Homolojisi Bir organizmanın DNA baz sırasının, diğer organizmanın DNA baz sırası ile benzerlik göstermesidir. İki bakteri aynı tipte ise bunların DNA baz sıralarının da benzer olması gerekir. DNA homolojisi bakımından; %20-60 aynı cins içerisinde, %60ʼ dan fazla olan fertler ise aynı türün fertleri, bir tür içerisinde kabul edilen fertler arasında bile %40 oranında farklılıklar olabilmektedir. Bu farklılık fenotipe immünolojik, yapısal ve fizyolojik farklılıklar olarak yansır. ırk; Bir tür içerisinde; biyokimyasal ve morfolojik özellikleri farklı, farklı konakçıları enfekte eden ve farklı antikorlara reaksiyon gösteren strainlerdir.

10 3. Yağ Asit Profilleri Yağ Asitlerinin Hangi Özelliği Bu Tanılamayı Sağlamaktadır? Yağ asitleri, hidrokarbon [CH 3 - (CH 2 ) n - COOH] yapısında olan makromoleküllerdir. Fosfolipid, glikolipid, lipopolisakkarit Yağ asitlerinin sayısı, çeşitliliği ve % olarak miktarları organizmalarda farklılık göstermektedir. Bu farklılık ise genetiksel akrabalığı ifade etmede kullanılan bir özellik olmaktadır. FAMEs (Fatty Acid Methyl Esters)=YAMEs (Yağ asidi Metil esterleri)

11 Glikoprotein Kollesterol Glikolipit Yağ asidi Fosfolipit Hücre membranınınyapısı Stoplazma Protein Peptidoglikan Stoplazmik Membran Teikoik Asit Yüzeysel Protein Lipoteikoik Asit G (+) BAKTERİ HÜCRE DUVARI MEMBRAN Dış Membran Peptidoglikan Stoplazmik Membran Lipopolisakkarit Lipoprotein G (-) BAKTERİ HÜCRE DUVARI Periplazmik Bölge

12 Yağ Asitlerinde Çeşitliliği Sağlayan Özellikler C atomlarının sayısı, C atomları arasında oluşan çift bağ sayısı Hangi C atomları arasında çift bağ olduğu C atomlarının hidrojenle doyurulup doyurulmamaları Dallanmış veya tek zincirli olmaları

13 MIS (Microbial Identification System) Genetik olarak aynı olan mikroorganizmaların hücrelerindeki yağ asitlerinin sayısı, çeşitliliği ve yağ asitleri profili aynı olup çevre koşulları stabil olduğu sürece aynı kalmaktadır. Canlıları yağ asiti (YA) profillerindeki farklılıklara göre karakterize eden ve sisteme ait kütüphanesindeki canlılara olan benzerlik ve farklılıkları veren bir sistemdir. MIDI Inc. firması tarafından geliştirilen IDENTIFICATION SYSTEM (MIS) olarak bilinir. bu yöntem MICROBIAL Kütüphanesi sayesinde veriler değerlendirilir ve tanı sonucu alınır.

14 FAMEs Yöntemi Mikroorganizmaların yağ asit profillerinin belirlenmesi amacıyla; - Bakteriler, TSBA katı besiyerine 4 fazlı çizgi ekim yöntemiyle ekilerek 24 saat süreyle inkübatörde inkübasyona bırakılır. Yağ asit metil ester ekstraksiyonu (FAME) yani yağ asidi metil esterlerinin saflaştırılmasında; önce canlı hücreler parçalanarak, yağ asitlerinin serbest kalması sağlanır. Serbest kalan yağ asitlerine ester bağları ile metil eklenerek, yağ asitlerinden yağ asit metil esterler elde edilir. Son saflaştırmalar yapılarak yağ asit metil esterleri içeren faz pastör pipeti ile alınarak 2 ml'lik gaz kromotografi tüplerine transfer edilir ve cihazın örnek tepsisine yerleştirilir. Böylece bilgisayar kontrollü gaz kromatografi sistemi olan Mikrobiyal Identifikasyon Sistemi (MIDI, Inc., Newark, DE) kullanılarak strainlerin yağ asit profilleri belirlenir.

15 MIDI sistemi (GS- MS)

16

17 4. Metabolik Profilleri Mikroorganizmaların metabolik enzimlerinin çeşitliliğine bağlı olarak göstermiş olduğu farklılıklar metabolik profil olarak adlandırılmakta ve mikroorganizma türleri arasında değişkenlik göstermektedir. Bunun en iyi örneği; kullanmış oldukları farklı C kaynakları sayesinde metabolik profillerinde farklılık sergilemeleridir. API, BIOLOG yöntemleri bu amaçla rutin uygulanan yöntemlerdir. Her iki yöntem de mikroorganizmaların kullanmış oldukları C kaynaklarına göre tanı ve karakterizasyon yapmaktadır. Bu amaçla geliştirilen BIOLOG sistemiyle; patojenik mikroorganizmaların tür altı seviyede tanı, mutasyonların enzim yolunda herhangi bir değişikliğe neden olup olmadığının tespiti ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi mümkün olmaktadır.

18 BIOLOG Testi 1. Çalışılan bakteriler BUG+M besiyerine ekilerek geliştirilir. 2. Uygun sıcaklıkta 24 saat inkübasyona bırakılan bakteriler eküvyonla alınarak, içerinde %0.85ʼ lik NaCl bulunan tüplerde süspanse edilir. 3. Turbidimetre ile yoğunlukları ayarlanan mikroorganizma süspansiyonlarından uygun mikroplate üzerindeki her bir çukurcuğa 150 µl eklenerek, 16 saat süreyle uygun sıcaklıkta inkübasyona bırakılır. 4. İnkübasyon sonrası mikroplateler üzerinde gelişen metabolik reaksiyon renklenme şeklinde (mor) gözlenerek test edilen mikroorganizmaların metabolik reaksiyon profilleri biolog kinetik (Program: Biolog MicroLog3 4.20, λ1=405 nm λ2=750 nm) ile okunur. 5. Sistemin paket programındaki bilinen mikroorganizmaların metabolik profilleri, test edilen mikroorganizmaların profilleri ile karşılaştırılarak tanı ve karakterizasyonu yapılır.

19 BIOLOG PLATE

20 BIOLOG sistemi

21

22 5. Signatür (imza) sekansları Signatür (imza) sekansları adı verilen diziler; 16 S ribozomal RNA ların belli bölgelerinde bulunan kısa oligonükleotitlerdir ve belirli bir organizmanın veya ilişkili organizma grubunun teşhisi için çok seçicidir. (urokaryot hücreler), eubacteria ve archaeobacteria gibi hücrelerin her birisinin kendisine özel 16 S rrna nükleotid sıraları vardır. Bu temel hücre tiplerinin belirlenmesinden sonra; canlılar âlemi üç temel hücre tipine göre üç âlem şeklinde sınıflandırılmıştır. Bu sekanslar ile yapılan sınıflandırma aynı zamanda endosimbiyont teorisini de desteklemektedir. Bu hücre tiplerinin Sinyal dizileri; özel filogenetik probların oluşturulmasında kullanılabildiği gibi, FlSH veya mikrobiyal topluluk analizleri için de kullanışlıdır.

23 Determinatif Sınıflandırma Determinatif sınıflandırma; daha çok gözlenebilen özelliklere göre yapılmaktadır. Bu özellikler; morfoloji, gram reaksiyonu, beslenme şekli, hücre duvarının kimyasal özellikleri vb. gibi klasik yöntemelere dayalı sınıflandırma olarak bilinir.

24 Mikrobiyoloji de Tanı Yöntemleri : minyatu rize biyokimyasal identifikasyon yo ntemlerinin (cȩs itli sıvı veya katı besiyerlerine saf ku ltu rler inokule edilip inku be edilir ve enzim- substrat ilis kisine bag lı olus an renk degĭs imi ya da gaz olus umu ile bakteri) gelis imi, : immunolojik testlerin gelis imi, : moleku ler sistemlerin ve polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) uygulanması, : dizi sekanslama, hibridizasyon, biyosenso r ve mikroarray gibi sistemlerin gelis imi

25 TANI YÖNTEMLERİ Klasik Yöntemler Moleküler yöntemler Morfolojik Fizyolojik Patolojik Biyokimyasal vb.

26 1. Konvensiyonel (Klasik Testler) I. Morfolojik testler a. Hücre ve koloni morfolojisi b. Hareketlilik testi II. Fizyolojik Testler O 2, sıcaklık, ph, tuzluluk istekleri vb. III. Patolojik Testler Hastalık yapma yeteneğinin tespiti IV. Biyokimyasal testler a. Oksidaz testi b. Potasyum hidroksit (KOH) testi c. Katalaz testi d. Arginine dehydrolase testi e. Levan (Fructan) testi f. Nitrat üretimi testi g. Amilaz testi h. Üreaz testi i. Floresan pigment testi j. Pektolitik aktivite testi vb.

27 Klasik Yöntemin Dezavantajları Nelerdir? Bakterilerin geleneksel olarak morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerine göre sınıflandırılmaları, strainler arası farklılıklar ile tür ve tür altı taksonomik gruplarını belirlemede yetersiz kalmaktadır. Sadece fenotipik özellikler hakkında bilgi verir. Klasik testlerin uzun süreli deneylere, fazla iş gücüne, tecrübeli ve yetişmiş araştırmacılara ihtiyaç oluşturması, ekonomik olmaması ve alınan sonuçların yorumlara açıklığı gibi birçok dezavantajları bulunmaktadır. Klasik yöntemlerin bu tür dezavantajlarını ortadan kaldırmak amacıyla mikroorganizmaların tanısında moleküler yöntemler geliştirilmiştir.

28 2. Moleküler yöntemler Moleküler yöntemler; karbonhidratları, lipidleri, proteinleri ve genetik materyalleri (DNA ve RNA) çalışma materyali olarak kabul etmekte ve bunlardan birinin veya kombinasyonlarının kullanımıyla mikroorganizmaların tanı ve karakterizasyonunu gerçekleştirilmektedir. Mikroorganizmaların tanımlanması ve sınıflandırılması amacıyla birçok fenotipik ve genotipik metot uygulanmakta olup, bu metotların her biri sırasıyla cinsten, türe, alt türe, biovara kadar belirli oranlarda filogenetik sınıflamaya imkan sağlamaktadır. DNA temelli metotlar, mikropların tanılanması ve sınıflandırılmalarında daha uygun ve pahalı olmayan, evrensel olarak uygulanabilen, oldukça güvenilir ve basit metotlardır.

29 2. Moleküler yöntemler Moleküler teknikler, hızlı sonuç vermesi, güvenilir olması, kolay uygulanabilirliği ve çok sayıda mikroorganizmanın tanısına imkan sağlamasından dolayı hemen hemen tüm tanı ve araştırma laboratuvarlarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Canlı organizmaları meydana getiren makromoleküllerin içeriklerine, çeşitliliklerine ve oranlarına bağlı olarak elde edilen farklılıklardan hareket edilerek oluşturulmuştur. Lipidler (MIS- FAMEs) Karbonhidratlar (API, BIOLOG) Proteinler (Serolojik testler, SDS- PAGE) Genetik Materyal (DNA- RNA)

30 Nükleik Asitlere Dayalı Moleküler Tanı Teknikleri DNA Baz Kompozisyonu (G+C oranı) Hibridizasyon Teknikleri Baz Sekanslama Analizi (Dizi Analizi) PCR Yöntemi LFRFA-RFLP AFLP Fingerprinting (Genomik parmak izi analizi)

31 Genotipik özelliklerine göre tanıda; DNA homoloji denemeleri ve 16S rdna dizi analiz yöntemi mikroorganizmaların sınıflandırılmasında önemli bir rol oynarken, taksonomik veya filogenetik seviyede tanılanmamış olan bakterileri sınıflandırmada yeterli değildir. Tür tanısında DNA dizi analizi, hibridizasyon yeterli olabilirken, Tür içindeki çeşitliliğin ortaya çıkarılmasında bunlardan ziyade dört farklı genomik parmakizi analiz yöntemi daha kullanılır. 1. LFRFA (Low- frequency restriction fragment analysis) 2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 3. PCR- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 4. PCR a dayalı genomik parmak izi analizleri

32 Karry Mullis, Saiki et al. ve PCR 1988ʼ de Thermus aquaticus bakterisinden yüksek sıcaklıklara dayanıklı olan Taq DNA polimeraz enziminin izolasyonu ve bu enzimin DNA amplifikasyonunda kullanılmasıyla PCR ʼ ın uygulanabilirliği artmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu; bakteri, viru s, fungus, parazit ve protozoon gibi hastalık etmenlerine ait hedef nu kleik asit zincirlerinin, primerler (o zgu l tamamlayıcı oligonu kleotitler) ile ısıya dayanıklı enzimleri kullanarak laboratuvar ortamında c ogăltılmasını sag layan o zgu n ve gu venilir bir yo ntemdir. U zerinde c alıs ma yapılan genetik materyal, c ok az sayıda ve hatta birc ok ilgisiz DNA moleku llerinin arasında olsa bile c ogăltılabilir, homojen bir DNA materyali haline getirilebilir ve boÿleliklekolayca tanımlanabilir.

33 PCR PCR tekniği günümüzde, temel moleküler biyolojik araştırmalarda, klinik tıpta, analık babalık tayininde, tıbbın diğer kollarında, in vitro şartlarda çoğalabilen veya çoğalamayan patojen mikroorganizmaların neden oldukları hastalıkların tespitinde, tohum saflığının belirlenmesinde, doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısında, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR a dayalı; imza sekanslarının çoğaltılması, RFLP, AFLP, genomik parmak izi analiz yöntemleri, sekanslama vb.

34 Genotipik özelliklerin araştırıldığı moleküler yöntemler 2 temel esasa dayandırılır. 1. Her mikroorganizmanın genomunda çok iyi korunmuş, sadece o mikroorganizmaya özgü dizilerin bulunması 2. Bu iyi korunmuş diziler içinde türden türe göre değişiklik gösteren daha küçük dizilerin bulunmasıdır. Türler arasındaki polimorfizm; imza sekansları, ERIC, REP, BOX, (GTG) 5

35 BOX PCR Elektroforez Sonuçları. M: Marker REP PCR sonuçlarına göre cluster analizi

36 HİBRİDİZASYON TEKNİKLERİ Hibridizasyon teknikleri; patolojik materyallerde (doku, organ, hücre kültürü) hastalık ajanlarının genetik maddelerini işaretli problar yardımıyla tespit etmeyi amaçlamaktadır. Bu sebeple bu yöntemler prob hibridizasyon yöntemleri olarak da tanınır. Southern Blot Hibrizidasyon, Nouthern Blot Hibridizasyon, İn Situ Hibridizasyon, Dot Blot Hibridizasyon olarak 4 çeşittir.

37 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Geleneksel jel elektroforez yo ntemleri, DNA o rneklerinin katı matrikse (agaroz ya da poliakrilamit) yerlesţirilmesi ve jel ic indeki moleku llerin statik elektrik alanında go c ettirilmesidir. DNA moleku lleri bu elektrik alanında uzayıp bir hizaya girer ve anota dog ru go c eder. Bu olaya su ru nme denir. DNA nın jelde go c u ne etki eden bir dizi parametre vardır: jelin yog unlugŭ ve icȩrigĭ, tampon c o zelti, sıcaklık ve elektrik alanının voltaj farkı. Standart yo ntemli DNA elektroforezinde, 20kb dan buÿu k DNA moleku lleri elektrik alanında aynı hareketliligĭ go sterdig inden DNA moleku lleri arasındaki farkı go rmek imkansızdır. Bu buÿu k kesitleri c o zmeye yo nelik ilk giris imler, du s u k yogŭnlukta agaroz jel ve du s u k voltaj farkının kullanımıdır. Bu uc kos ullar altında bile buÿu k DNA moleku llerinin birbirinden ayrılması zordur yılında David Schwartz yeni bir teknik o nermis tir. O nerisine go re elektrik alanının yo nu nu du zenli olarak degĭsţirmek, ilk elektrik alanının ortadan kalkmasından dolayı jel ic indeki DNA moleku llerini gevs emesine ve yeni alanda uzayarak hizaya girmesine neden olacaktır. Darbeli alan jel elektroforezi ilk kez 1982 de isļevsel hale getirilmis ve bu tarihten itibaren bu yu k DNA moleku llerini ayırmak ic in c oklu elektrik alanlarını kullanan c es itli aygıtlar gelisţirilmisţir. Tu m sistemler DNA moleku llerini aynı boyutta ayırır, ancak ayırma hızı ve netlig inde farklılıklar vardır.

38 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Sistemin dog ru s ekilde anlas ılması ic in bazı terimlerin bilinmesinde yarar vardır ki bunlar s u s ekilde sıralanabilir; Darbeli Alan (Pulsed Field): Alternatif olarak birden fazla elektrik alanı kullanan herhangi elektroforez isļemi Degĭs im Aralıg ı (Switch Interval): Alternatif alanların etkin oldugŭ zaman Yeniden Yo nlendirme Ac ısı (Reorientation Angle): I ki alternatif elektrik alanı arasındakidar ac ı Alan Do nu s u mu (Field Inversion): I ki alternatif alanın birbirinin kars ısında yo nlendirildigĭ PFGE sistemleri Voltaj Farkı (Voltage Gradient): Jele uygulanan elektrik potansiyeli Homojen Alan (Homogenous Field): Tu m alan boyunca tekdu zepotansiyelfarkıolan elektrik alanı

39 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Buÿu k DNA c ok kırılgandır ve yu ksek viskozitesinden dolayı genellikle pipetlenmesi zordur. Bu nedenle DNA nın PFGE ic in hazırlanması, standart DNA hazırlama yo ntemlerine go re biraz daha farklıdır. Kromozomal DNA o nce agaroz dolguların ic ine go mu lu r ve bu dolgular proteinlerin sindirilip geriye yalın DNA'nın kalması ic in enzimler ile muamele edilir. Bu dolgular daha sonra belli boyutlarda kesilip restriksiyon enzimleri ile muamele edildikten sonra jeldeki ku c u k kuyulara aktarılır ve agaroz ile oldukları konuma sabitlenir. Kosţurulan jelde voltaj farkı elektroforezlenen o rneg in boyutuna go re du zenlenmis olmalıdır. Daha buÿu k DNA o rnekleri jel u zerinde du zgu n ilerleyebilmek ic in daha du s u k voltaj farkına ihtiyac duyar. Agaroz secȩrken de o rnek boyutunun unutulmaması gerekir. EEO (elektroendoozmoz) agaroz, moleku ler biyolojide 2,5 Mbc 'den buÿu k moleku llerin ayrılabilmesi ic in sertifikalandırılmıs tır. Digĕr yandan, darbeli alan agarozlarının kosţurma su resi daha az oldug undan buÿu k moleku ller ic in daha uygundur. Jelde DNA'nın hareketliligĭni etkileyen bir parametre de sıcaklıktır. Sıcaklıgĭ arttırmak daha fazla harekete yol ac ar. Bu nedenle C en c ok kullanılan sıcaklık aralıgĭdır. Buna ilaveten DNA'nın, iyonik gu cu du s u k tampon c o zeltiler ic inde daha hızlı yol aldıg ı da go z o nu ndebulundurulmalıdır.

40

41

42 Sinyal Dizileri, Filogenetik Problar ve Mikrobiyal Topluluk Analizleri Ribozomal RNA dizilerinin bilgisayar analizleri, belirli grup organizmalara özgü kısa oligonükleotitler olarak bilinen sinyal dizilerini ortaya çıkarmıştır. Hücresel yaşamın her bir domaini için spesifik sinyal dizileri vardır. Bir domain içerisindeki spesifik bir grubu veya bazı durumlarda belirli bir cinsi ve hatta tek bir türü tanımlayan sinyaller olduğu bilinmekte olup, bu sinyaller sıralanmış dizileri bilgisayarda denetleyerek de belirlenebilir.

43 Yaşamın 3 domainini tanımlayan 16S veya 18S rrna daki sinyal dizileri.

44 Sinyal Dizileri ve Filogenetik Problar Prob, bir karışımdaki nükleik asit dizisine komplementer dizi taşıyan, etiketlenebilen ve hibridize olabilen bir nükleik asit zinciridir. Problar genel veya spesifik olabilir. Domaini ne olursa olsun tüm organizmalardaki ribozomal RNA'ların korunmuş dizilerine bağlanan evrensel ribozomal RNA probları sentezlenebilir. Bunun aksine sadece Bacteria domainine ait türlerin hücrelerinde bulunan RNA'lara özgü sinyallerle reaksiyona girebilecek özel problar da dizayn edilebilir. Benzer şekilde archaealara ve eukaryatlara özgü problar da sadece Archaea ve Eukarya türleri ile reaksiyona girecektir.

45 Filogenetik Problar ve FISH Cins veya familya gibi bir domain içerisindeki belirli temel gruplar bile özel problar ile hedeflenebilmektedir. Prob floresan bir boya ile işaretlendiğinde, probun hücresel ribozomlara bağlandığı mikroskobik olarak görülebilir. Hücreleri uygun reaktiflerle muamele ettiğimizde, membran geçirgen hale gelir ve prob/boya karışımının hücre içine girişine izin verir. Probun direk olarak ribozomlardaki ribozomal RNA ile hibridizasyonundan sonra, hücreler benzer şekilde floresan özellik kazanır ve bir floresan mikroskobu altında incelenebilir.

46 Filogenetik Problar ve FISH Kısa adı FISH olarak bilinen bu tekniğe floresan in- situ hibridizasyon denilip, kültüre edilmiş veya doğal ortamlarındaki hücrelere direk olarak uygulanabilir ("in situ" terimi "ortamın içerisinde" anlamına gelir). Kısacası FISH filogenetik bir boyadır. FISH ekolojide mikroskobik teşhiste ve organizmaları yaşam ortamlarında direk olarak izlemek amacıyla kullanılabilir. FISH aynı zamanda mikrobiyal toplulukların komposizyonunu direk olarak mikroskop ta belirlemede kullanılan bir yöntemdir Klinik tanıda, hasta numunelerinden spesifik patojenlerin hızlı teşhisi amacıyla kullanılmaktadır. Bu teknik, kültüre edilmiş bir organizmaya ihtiyaç duyar.

47 Floresan etiketli ribozomal RNA probları: Filogenetik boyalar, (a) Bacillus megaterium hücreleri ile Saccharomyces cerevisiae nın faz- kontrast fotomikrografı (prob kullanılmamıştır). (b) Aynı alanda hücreler san- yeşil bir evrensel rrna probu ile boyanmıştır (bu prob herhangi bir domaindeki bir türle reaksiyona girer), (c) Aynı alan eukaryatik bir prob ile boyanmıştır (sadece S. cerevisiae hücreleri reaksiyona girer). B. megaterium hücreleri yaklaşık 1.5 mikrometre ve S. cerevisiae hücreleri ise yaklaşık 6 mikrometreçapındadır. Aktive edilmiş bir atık su granülünde, nitrifikasyon yapan bacterileri görünür hale getirmek için filogenetik boyaların kullanımı.

48 MLST (Multi Locus Sequence Typing) Birinci kuşak yöntemler q Plazmid analizi q Restriksiyon enzim analizi İkinci kuşak yöntemler q Genomik DNA izolasyonu, restriksiyon ve Southern Blotting Üçüncü kuşak yöntemler q RAPD q PFGE HÜCRE Dördüncü kuşak yöntemler q MLST q Mikro satellit analizi q Mantar hücresi

49 MLST (Multi Locus Sequence Typing) Her yapısal (housekeeping) gen için bakteri türlerindeki farklı diziler farklı alellerde bulunmaktadır. Her izolat için lokuslardaki aleller, alellik profili ve sekans tipini belirler. Birçok lokusun tiplendirilmesi Çeşitli yapısal (housekeeping) genlerin internal parçalarının DNA dizileri Her genin bp internal parçaları

50 MLST (Multi Locus Sequence Typing) Hem ribozomal RNA dizilemesi hem de ribotiplendirmedeki kısıtlamalardan biri de, analizlerin sadece tek bir gen üzerine odaklanmasıdır. Çok lokuslu dizi tiplendirmesi (MLST), bu sorunun üstesinden gelir ve bir tür içerisindeki suşların karakterizasyonunda kullanılan yararlı bir tekniktir. MLTS, bir organizmadaki "yaşamsal faaliyetleri kodlayan" (housekeeping) altı yedi adet gene ait parçaların dizilimleri ile aynı organizmanın farklı suşlarındaki özdeş gen gruplarını karşılaştırılmasını içerir. Bu genler, hücrenin temel fonksiyonlarını kodlamakta ve plazmitlerden ziyade kromozomlar üzerinde yerleşmektedir. Her bir gen için yaklaşık olarak 450- bç'lik dizi PCR ile çoğaltılır ve dizilenir. Daha sonra karşılaştırmalı dizileme verileri bir dendogram ile ifade edilir.

51 MLST (Multi Locus Sequence Typing) MLST çok yakın akraba suşları bile ayırt edebilme gücüne sahiptir. Bu nedenle organizmaları tür seviyesine kadar tanımlamada, rrna dizilemesine göre çok daha iyi bir yöntemdir. MLST organizmaları tür seviyesinin üzerinde karşılaştırmak için uygun değildir. MLST şimdiye kadar belirli bir patojenin suşlarını ayırt etmek için klinik mikrobiyolojiye önemli bir katkıda bulunmuştur. MLST aynı zamanda epidemiyolojik çalışmalarda da oldukça yararlıdır.

52 Ribotiplendirme ve çok lokuslu dizi tiplendirmesi (MLST). (a) Dört farklı laktik asit bakterisinin ribotiplendirme sonucu. Her bir bakterinin tek kolonisinden izole edilen DNA'ya ait restriksiyon enzim kesimlerinin bir türe hatta bir tür içerisindeki suşlara özgü 16S rrna genleri ile problanması sonucu oluşan DNA fragmetlerinin deseni. Bilinen organizmalarla beraber jelde görüntülenen desenler numaralandırılır ve çevresel veya klinik izolatlann teşhisinde karşılaştırmak amacıyla bir veri tabannda saklanır. Bantların yerlerindeki değişiklikler ve bant yoğunluğu teşhiste önemlidir. (b) Çok lokuslu dizi tiplemesindeki (MLST) basamakları.

53 MLST (Multi Locus Sequence Typing) MLST yaklaşımı, korunan çoklu gen lokuslarındaki farklılıkları hedeflemede MLEE(Multi locus enzyme electrophoresis) nin gösterdiği başarıya dayanmaktadır. Bununla beraber bu farkın MLST ile kesin olarak tanımlanması, gen kesitlerindeki nükleotit dizilimlerinin saptanmasıyla mümkün kılınmıştır. Nükleotit diziliminin avantajı, sonuçlarının kolayca onaylanabilmesi, saklanabilmesi ve elektronik olarak paylaşılabilmesidir. MLST için gerek duyulan örnekler, uygun ambalaj içinde olması koşuluyla taşınmasında herhangi bir problem ortaya çıkarmayan DNA dizileri veya ölü hücre süspansiyonudur. Ayrıca hazırlanan örnekler, posta yoluyla bir laboratuvardan diğerine kolaylıkla gönderilebilir. Bu durum, MLST nin diğer bir avantajıdır.

54 MLST (Multi Locus Sequence Typing) Protokoller ve primer dizilimleri elektronik olarak dağıtılabilir ve tercih edilen MLST parametreleri kolaylıkla otomatize edilebilir. MLST; korunan 7 temel gen (housekeeping gene) içindeki belirli kısımlar kullanılarak, bakteri izolatlarının tanımlandığı güvenilir bir yöntemdir. Her bir genin iç kısmında yaklaşık baz çifti (bç) büyüklüğündeki parçalar, otomatik DNA dizilimleyicisi aracılığıyla iki iplikçik yönünden de doğru bir şekilde dizilimlenerek kullanılır. Bakteri türündeki farklı dizilimler, her bir korunan temel gen için farklı alleller olarak atanır ve her bir izolat için 7 lokustaki alleller, allellik profili ya da dizilim analizini tanımlar. MLST de alleller arasındaki nükleotit farklılıklarının sayısı gözardı edilerek, bu farklılıkların tek bir nükleotid alanında mı yoksa birkaç alanda mı meydana geldiği göz önünde bulundurulur ve farklı allel numaraları verilir. Buradaki mantık, yeni bir allel oluşumuna neden olan tek bir genetik olayın nokta mutasyonu ya da sonradan meydana gelecek olan allelden çok orjinal allelle ilişkili olan yeniden birleşim anındaki yer değişimi ile meydana gelmesidir.

55 MLST (Multi Locus Sequence Typing) İzolatların bu yöntemle incelenmesi için önce polimeraz zincir reaksiyonundan faydalanılır. Sonuç, elde edilen PCR ürünlerinin çoklu lokus dizilim analiziyle elde edilir. Tüm potansiyel lokuslar için çeşitli kriterler kullanılmaktadır. Bunları içeren genler, DNA onarımı, replikasyonu ve amino asit sentezi için önemli olan temel ürünleri kapsamaktadır.

56 Yeni bir MLST sisteminin düzenlenmesinin üç yolu vardır: Ø Başlangıç değerlendirmesinde kullanılacak izolatların seçimi, Ø Karakterize edilecek genetik lokusların seçimi, Ø Gen yükseltilmesi ve nükleotit dizilim tespiti için primerlerin dizaynıdır.

57 MALDI- TOF (Matriks Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Matriks Destekli Lazer Desorpsiyonu/Iẏonizasyonu - Uc us Su resi) Matriks destekli lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu (MALDI); proteinler, peptitler ve sȩkerler gibi biyomoleku llerin ve eski iyonizasyon yo ntemleriyle iyonize edildig inde kırılıp parc alanmaya eg ilimli olan polimerler, dendrimerler gibi buÿu k organik moleku llerin analizine olanak sag layan, ku tle spektromektresinde kullanılan hassas bir tekniktir. Bu yo ntem her ne kadar daha az yu klu iyonların meydana gelmesine neden olsa da hem hassasiyet hem de u retilen iyonlar ac ısından en c ok elektrosprey iyonizasyonuna benzemektedir. Lazer ıs ımasıyla iyonizasyonun sag lanması ic in genellikle nitrojen lazer kullanılır. Dog rudan lazer ıs ımasının biyomoleku le verecegĭ zararın engellenmesi, buharlas ma ve iyonlas ma, matriksle sag lanır.

58 Kuẗle Spektrometresi ile Tür Tayini Ku tle Spektrometresi numunenin temel icȩrigĭnin belirlenmesinde kullanılan analitik bir tekniktir. MS prensibi yu klu moleku ller olusţurup onların ku tle yu k oranını o lcȩrek kimyasal biles igĭn iyonizasyonu esasına dayanır. Dog rudan koloniden MALDI- TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması. Ku tle Spektrometresi VITEK MS ile tanılama GC- MS (MIDI) ile tanılama

59

60

61 MALDI- TOF Spektrumlar mikroorganizmaların tanımlanmasında kullanılmaktadır. Iṅcelenmek istenen mikroorganizmaya ait koloni dog rudan hedef noktasının u zerine yayılır ve matriksle kaplanır. Meydana gelen ku tle spektrumları, ilgili yazılımla incelendikten sonra kayıtlı profillerle kars ılasţırılır. Tu rlerin bu teknik ile tanımlanması, gu nu mu z standart immu nolojik ve biyokimyasal yo ntemlerden daha gu venilir ve ucuz olmasından kaynaklanmaktadır (Seng vd. 2009).

62

63

64

65

66

67 MALDI- TOF

68 16S ve 18S rrna

69 RNA NIN ÖZELLİKLERİ RNA genellikle tek zincirlidir, daha esnek bir yapıya sahiptir ve daha kompleks ve çeşitlilik gösteren 3 boyutlu yapılar oluşturur. Bir RNA zinciri kıvrılabilir ve kendi bazlarıyla çift oluşturabilir. Bu molekül içi baz eşleşmesi RNA nın biçimini ve şeklini belirler. RNA nükleotidlerinde riboz şekeri taşır. Adından da anlaşılacağı gibi iki şeker arasındaki tek fark 2. C atomuna bağlı oksijenin olup olmamasıdır. Tek bir DNA zinciri gibi RNA zinciri de şeker- P omurgasından oluşur ve bazlar kovalent olarak ribozun 1 C atomuna bağlıdır. DNA da olduğu gibi şekerin 3-5 fosfodiester bağıyla nükleotidlereklenir. RNA, DNA dan farklı ama proteinlere benzer biçimde önemli biyolojik reaksiyonları katalizler. Enzim gibi çalışan bu RNA moleküllerine ribozimadı verilir.

70 Hücresel yaşam formlarının RNA yaşam formlarından evrimleştiğini gösteren muhtemel senaryo. Kendini eşleyen RNA'lar, lipoprotein kesecikleri içerisine daimi olarak yerleşip hücresel yapılar haline gelebilirler. Zamanla RNA'nın katalitik işlevini proteinler devralmış ve RNA'nınkodlama fonksiyonudna ile yer değiştirmiştir.

71 rrna rrna'ları kodlayan genler, translasyonel sistemdeki temel bileşenler, ATPaz proteinleri, ATP sentezleyen veya hidrolizini yapan enzim kompleksleri, genetik rekombinasyona yardımcı olan RecA enzimi ve belirli translasyonel proteinler mikroorganizmalar hakkında en çok kabul edilebilir filogenetik bilgiyi edinmemizi sağlamışlardır. Ribozomal RNA'lar, onların mükemmel evrimsel kronometreler olmasını sağlayacak çeşitli özellikleresahiptirler. Ribozomal RNA'lar, oldukça büyük, işlevsel olarak sabit, evrensel olarak yaygın moleküller olup, tüm hücrelerde nükleotid dizisinin korunduğu çok sayıda bölge içerirler. ProkaryotIarda büyüklükleri 5S, 16Sve 23S ("S", "Svedberg'i simgeler ve bir partikülün santrifüj edildiğinde çökmesini esas alan bir kütie ölçüsüdür) olan üç çeşit ribozomalrna molekülü vardır.

72 Ökaryot Hücrelerde Bulunan RNA Polimerazlar Polimerazın Tipi Transkribe ettiği genler RNA polimeraz I 5.8S, 18S ve 28S rrna genleri RNA pol II RNA poliii Tüm protein kodlayan genler, snorna genleri ve bazı snrna genleri trna genleri, 5S rrna genleri, bazı snrna genleri ve diğer küçük RNA genlerinin sentezi

73 Prokaryothücrelerde mrna sentezi. Ökaryot hücrelerde mrna sentezi.

74 Neden 16S rrna Geni? Fonksiyonel olarak korunmuştur ve tüm bakterilerde bulunur. Uygun büyüklüktedir (~1550 bç). Üzerinde iyi korunmuş ve heterojen bölgeler içerir. PCR primerleri oluşturulabilir. Cins/tür düzeyinde ayrım sağlar. Yeterli veri tabanı vardır.

75 16S ve 18S rrna 16S rrna prokaryotlarda ribozomların küçük alt birimi olarak görev yapan büyük polinükleotidler (yaklaşık 1550 baz) olup, dizilimi evrimsel bilgi edinilmesinde kullanılır. Ökaryotik karşılığı 18S rdna dır.

76 Thermus thermophilus 30S alt birimi atomik yapısı. Proteinler, mavi ve turuncu tek RNA sarmalı gösterilmiştir.

77 (a) Escherichia coii'nin 70S ribozomunu gösteren elektron mikrograf (b) Ribozomun kısımları; 5S, 16S ve 23S ribozomun küçük alt birimindeki farklı RNA formlarını ifade eder. (c) 16S ribozomal RNA'nın (rrna) primer ve sekonder yapısı. Bu Escherichia coli'ye (Bacteria) ait 16S rrna'dır; Archaea nın 16S rrna'lan bütün sekonder yapıya (katlanma) benzerlik gösterir, ama primer yapılarında (dizi) çok sayıda farklılık vardır. 16S rrna nın eukaryatlardaki benzeri sitoplazmadabulunan 18S rrna'dır. Ribozomal RNA elektron mikrogrofu.

78 16S rrna siteleri ve rrna fonksiyonları

79 18S Ribozomal rrna'lardan 28S, 5.8S ve 18S rrna'lar, tek bir RNA molekülünün işlemden geçmesi sonucu oluşur. Memelilerde bu öncül rrna (pre- rrna) 45S büyüklüğündedir, bunun başından ve sonundan birer parça, iç kısmından da iki parça çıkınca kalan parçalar 28S, 5.8S ve 18S büyüklüğünde olur. Bu işlemden sonra 5.8S rrna ve 28S rrna birbirlerine hidrojen bağlarıyla bağlanırlar.

80 18S Büyümekte olan hücreler pek çok ribozoma gerek duyduklarından çok sayıda rrna sentezlemek durumundadırlar. Bu yüzden genomda çok sayıda rrna geni bulunur. 45S rdna geni, her biri tekrardan oluşan (kromozom 13, 14, 15, 21 ve 22'de) beş küme halindedir. Bunların transkripsiyonu RNA polimeraz I tarafından yapılır. 5S rrna'nın transkripsiyonu ise RNA polimeraz III tarafından yapılır. 5S rrna, gen tarafından kodlanır, bunlar da art arda dizilmiş tekrarlardan oluşur. Bu tekrar kümelerinden en büyüğü kromozom 1q (41-42)'dedir. 28S, 5.8S ve 18S rrna'ları çekirdekçikte sentezlenir, 5S rrna'sı ise çekirdeğin farklı bir bölgesinde sentezlenir.

81 YENİ TÜR TEŞHİSİ 16S rrna dizisinde, diğer tüm organizmalardan %3 ten fazla farklılık gösteren bir prokaryotun (veri tabanındaki diğer tüm dizilere %97 den daha az benzerlik gösteren) yeni bir tür olduğu düşünülmektedir. Bu öneriyi destekleyen en önemli gözlem, 16S rrna dizisinde %97 den daha az benzerlik gösteren iki prokaryotun genomik DNA larının genel olarak %70 ten daha az hibridize olmasıdır. Minimal bir değer bulunduğunda ise iki mikroorganizmanın aynı tür oldukları düşünülür. 16S dizisi diğer tüm organizmalardan %3 ten fazla farklılık gösteren bir organizma, DNA hibridizasyon kriterine göre yeni bir olarak kabul edilse de, rrna dizisi çok benzediği hatta bire bir olduğu bazı organizmalarda da oldukça farklı bir genoma sahip olabilirler. Bu nedenle, SSU dizilemesi sonunda %97 den fazla dizi benzerliği görülen durumlarda, genomik hibridizasyon yeni türlerin tanımlanması için önemli bir taksonomik araçtır.

82 (a) Test edilen organizmanın DNA'sı izole edilir. DNA'lardan biri etiketlenmiştir (Organizma l'in DNA'sında radyoaktif fosfat olarak gösterilmiştir), (b) Hibridizasyon deneyi. Etiketlenmiş DNA nın kendi kendine tekrar birleşmemesi için ortama fazla miktarda etiketlenmemiş DNA eklenir. Hibridizasyonu takiben, sadece hibridize olmuş DNA'daki radyoaktiviteyi ölçmek için, hibridize olmamış DNA ortamdan uzaklaştırılır, (c) Sonuçlar. Kontroldeki radyoaktivite (Organizma 1 'in DNA'sı kendisi ile hibridize edilir) %100 hibridizasyon değeri olarak kabul edilir. Taksonomik bir araç olarak genomik hibridizasyon.

83 rrna Dizileri rrna dizilerine ait çok geniş bir veri tabanı mevcuttur. Örneğin Ribozomal Veri Tabanı Projesi (RDP) şu an sayısı 'i aşan bu tür dizilere ait çok büyük bir kolleksiyona sahiptir. SSU rrna'ların filogenetik bir araç olarak kullanımına, 1970'lerde Illinois Üniversitesinden CarI Woese öncülük etmiştir. EukaryatIarda ise dizileme çalışmaları, işlevsel olarak benzer fakat biraz daha büyük olan 18S molekülü üzerine odaklanmıştır. 16Sve 18S rrna'ları ribozomun küçük alt biriminin (30S veya 40S) bir parçası olduklarından, SSU (küçük alt birim) dizilemesi, 16S veya 18S dizilemesi ile eş anlama gelmektedir. Ribozomal RNA dizilerinin karşılaştırılması, organizmalar arasındaki evrimsel ilişkinin belirlenmesinde kullanılabilir.

84 rrna Dizileri Ribozomal RNA dizilerinin elde edilmesi ve filogenetik ağaçların oluşturulması, moleküler biyoloji ve bilgisayar analizlerinin beraber yürütülmesi sonucu şu an oldukça rutin hale gelmiştir. Yeni bulunan diziler, RDP'deki veya GenBank (Amerika), DDBS (Japonya) ve EMBL (Almanya) gibi diğer genetik veri tabanlarındaki mevcut dizilerle karşılaştırılabilir. SSU rrna dizilerinin karşılaştırılmasında, saf bir mikroorganizma kültürü ile çalışılabileceği gibi mutlaka saf kültürle çalışmak da şart değildir. İşleme başlamak için PCR kullanılarak genomik DNA'dan 16S ribozomal RNA'yı kodlayan gen çoğaltılır. Daha sonra PCR ürünü ddna dizileme metodu (Sanger dizilemesi) ile dizilenir. Ham dizi verileri, daha önce sıralanmış dizilerle bir dizi editörü yardımı ile sıralanır. rrna'ların hepsi tamamen aynı uzunlukta değildir. Bu sebeple sıralama esnasında bir dizinin diğerinden daha kısa olduğu bölgelerdeki gerekli boşluklar doldurulmalıdır.

85 rrna Dizileri Sıralanmış diziler daha sonra bir ağaç oluşturma programına taşınarak karşılaştırmalı analizleri yapılır. En çok kullanılan ağaç oluşturma algoritmaları uzaklık ve parsinomidir. Uzaklık metodu kullanıldığında, diziler sıralanır ve sonra bilgisayar kayıtlarında dizi verilerinin her bir pozisyonundaki farklılıklar belirlenerek evrimsel uzaklık (E D ) hesaplanır. Filogenetik analizlerde kullanılan diğer popüler yöntem ise parsinomidir. Parsinomi, evrimsel yayılış esnasında ortak bir atadan iki farklı nesile ayrılmak için meydana gelmesi gereken minimum miktardaki dizi değişikliklerinin hesaplanması temeline dayanan evrimsel ağaçlar oluşturur.

86 16S rrna dizileri kullanılarak filogenetik uzaklık ağaçlarının hazırlanışı. Örneklemek amacıyla sadece kısa diziler gösterilmiştir. Evrimsel uzaklık ED (b) herhangi iki organizmadaki benzer olmayan dizilerin yüzdesi şeklinde hesaplanır. Düzeltilmiş ED, orjinal genotipte oluşabilecek geri mutasyonlar veya aynı bölgede oluşabilecek ileri mutasyonlar hesaba katmak için gerekli istatistiksel bir düzeltmedir. Ağaç (c) veriye en çok uygunluk gösteren bilgisayar analizi ile oluşturulmuştur, (d) Yelpaze şeklinde veya iki parçaya ayrılmış şekilde olan farklı biçimdeki filogenetik ağaçlar. Her iki biçimde de herhangi iki organizmayı ayıran dalların toplam uzunluğu, evrimsel uzaklık ile doğru orantılıdır.

87 rrna ların Uygulanma Aşamaları 1.DNA Ekstraksiyonu 2.16S rrna PCR 3.Pürifikasyon 4.Sekans döngüsü 5.Pürifikasyon 6.Sekans analizi 7.Elektroferogramların değerlendirilmesi 8.Verilerin yorumlanması

88 1. DNA Ekstraksiyonu Klinik örnekten Kültür kolonisinden Basit yöntemler tercih edilmeli

89 2. 16S rrna PCR Yaklaşık 500 bç Sıklıkla yeterli yaklaşık 1500 bç Birden fazla sekans analizi < 500 bç DNA nın hasarlı olma ihtimali varsa

90 Kullanılan Primerler Dizi (5-3 ) Lokalizasyon 27f AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG f ACT CCT ACG GGA GGC AGC r GCT GCC TCC CGT AGG AGT f GTG CCA GCM GCC GCG GTA A r TTA CCG CGG CKG CTG GCA C r CTT TAC GCC CAR TRA WTC CG f ATT AGA TAC CCT GGT AGT CC r GGA GTA CCA GGG TAT CTA AT f AAA CTY AAA KGA ATT GAC CG r CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT f AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG r CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT f GAG GAA GGT TGG GGA TGA CGT r ACG TCA TCC CCA ACC TTC CTC r AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC r TGA CGG GCG GTG WGT RCA r GGT TAC CTT GTT ACG ACT T r AAG GAG GTG WTC CAR CC

91 3. Pürifikasyon Standart yöntemler Ticari kitler Jelden PCR ürününden

92 4. Sekanslama Döngüsü ( Cyclesequencing ) Yaklaşık 25 döngü Yeni PCR ürünü oluşmaz. Farklı uzunluklarda ürünler oluşur. Tek primer dntp Sonlandırıcı boyalar (Farklı dalga boyunda floresans veren boyalarla işaretli ddntp)

93 5. Sekans Analizi Kapiller elektroforez sistemli otomatik sekans cihazları Sanger yöntemiyle çalışır. Sonlandırıcı boyaları okur. Elektroferogram oluşturur.

94 ddntp Dalga boyu Floresans Pik rengi G 540 nm yeşil siyah A 570 nm yeşil/sarı yeşil T 595 nm kırmızı kırmızı C 620 nm turuncu/kırmızı mavi

95 6.Elektroferogramların Değerlendirilmesi Otomatik raporlanır. Gözle değerlendirilir!!! Karşılaştırılır.

96 16S rrna SEKANSLAMA

97 rrna ların Kullanım Alanları Yeni patojenlerin keşfi Bartonellahenselae Tropherymawhipplei Mycobacterium genavanse Moleküler Koch Postülatları! Taksonomik güncellemeler, yeni cins ve türlerin belirlenmesi Kültürde üretilemeyen/ zor üreyen mikroorganizmalarıntanısı Klinik önemi olan patojenlerin tanımlanması Antibiyotik tedavisi altında etken belirlenmesi Steril örneklerde etkenin hızlı belirlenmesi