PAXgene Kan RNA Seti El kitabı

Transkript

1 PAXgene Kan RNA Seti El kitabı Sürüm 2 PAXgene Kan RNA sistemi kan toplama tüpü (PAXgene Kan RNA Tube) ve nükleik asit saflaştırma (PAXgene Kan RNA Kit)kitinden oluşmaktadır. Kan toplaması, saklanması ve taşınması ile hücre içi RNA nın kapalı tüp içerisinde dengelemesi ve moleküler tanımlayıcı testlerinde kullanılan RT-PCR için tam kandan hücre içi RNA nın izolasyonu ve saflaştırılması için amaçlanmıştır. PAXgene Kan RNA Sisteminin performans özellikleri yalnızca FOS ve IL1B gen dizinleri ile sağlanmıştır. Kullanıcı diğer hedef dizinler (kodlar) için uygun PAXgene Kan RNA sistem performans özelliklerinin sağlanmasından sorumludur. Laboratuarda tanı amaçlı kullanım içindir TR PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Produced by QIAGEN GmbH for PreAnalytiX R TR Nisan 2008

2 Ticari markalar : PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group); BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA); Eppendorf (Eppendorf- Netheler-Hinz GmbH). PAXgene Kan RNA setleri tüm ülkelerde bulunmaz, lütfen soruşturun. Sınırlı lisans anlaşması Bu ürünün kullanılması PAXgene Kan RNA setinin herhangi bir alıcısı yada kullanıcısının aşağıdaki şartları Kabul ettiği anlamına gelir: 1 The PAXgene Kan RNA seti sadece PAXgene kan RNA seti el kitabına göre kullanılabilir ve sadece set içinde kapsanan elemanlarla kullanım için uygundur. PreAnalytiX PAXgene kan RNA seti el kitabında açıklanan ve adresinde verilen protokollerde kapsananlar haricinde içerilmeyen herhangi bir bileşen (eleman) ile fikir eserleri sahipliği altındaki mülkiyetlerinden herhangi birisi altında içerilen elemanlardan herhangi birisini kullanma yada dahil etmek için herhangi bir lisans vermez. 2 Açıkça ifade edilen lisansların haricinde, PreAnalytiX bu setin ve/veya kullanımlarının üçüncü tarafların haklarını ihlal etmediğine ilişkin herhangi bir garanti vermez. 3 Bu set ve setin elemanlarına bir kerelik kullanım için lisans verilmiştir ve yeniden kullanılamazlar, yenilenemezler veya yeniden satılamazlar.. 4 PreAnalytiX özellikle açıkça ifade edilenlerin haricinde açık ifade edilen yada ima edilen diğer lisansları kabul etmez. 5 Setin (kitin) alıcı ve kullanıcısı yukarıda yasaklanan herhangi bir eylemin yapılmasına yol açacak yada kolaylaştıracak herhangi bir eylemi yapmamayı yada yapılmasına izin vermemeyi kabul eder. PreAnalytix herhangi bir mahkemede bu sınırlı lisans anlaşmasının yasaklamalarını uygulattırabilir ve bu sınırlı lisans anlaşmasını veya set veya elemanlarına ilişkin fikir eserleri mülkiyet haklarından herhangi birisini uygulamak için herhangi bir davada avukatlık ücretleri dahil araştırma ve mahkeme bedellerini geri alacaktır.. Güncelleştirilen lisans şartları için, adresine bakın PreAnalytiX GmbH, Tüm hakları saklıdır. PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Switzerland PreAnalytiX Distribütörleri PreAnalytiX ürünleri PreAnalytiX için QIAGEN veya BD tarafından üretilir ve PreAnalytiX için QIAGEN veya BD tarafından dağıtılır. Ürünler PreAnalytiX GmbH dan sipariş edilemez. Lütfen yerel PreAnalytiX dağıtıcısına ilişkin irtibat bilgileri konusunda son sayfaya bakın.

3 Muhteva Sembollerin açıklamaları 4 Takım muhtevası 5 Saklama Koşulları 6 Amaçlanan Kullanım 6 Ürün Kullanım Kısıtlamaları 7 Kalite Kontrol 7 Teknik Yardım 7 Emniyet bilgileri 7 Giriş 10 İlke ve İşlem 10 Örnek Toplama ve Dengeleme 10 Elle RNA arıtma 18 Otomatik RNA arıtma işlemi 26 Kullanıcı Tarafından Tedarik Edilecek Ekipman ve Ayıraçlar 30 Önemli notlar 31 QIAcube kullanılması 31 QIAcube cihazının çalıştırılması 31 QIAcube cihazı üzerine protokollerin yüklenmesi 31 QIAcube cihazının yüklenmesi 33 Protokol: PAXgene Kan RNA Tüplerinde (BRT) Toplanan İnsan Tam Kanından Toplam RNA nın Saflaştırılması 41 Protokol: PAXgene kan RNA tüpleri (BRT) içinde toplanmış insan tam kanından toplam RNA nın otomatik olarak arıtılması 47 Hata Giderme Kılavuzu 53 EK A: RNA işleme hakkında genel açıklamalar 55 EK B: Toplam RNA nın miktarı ve Kalitesinin belirlenmesi 56 Ek C: PAXgene Kan RNA Tüplerinin Kullanımı 58 Sipariş bilgileri 59 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008 3

4 Sembollerin açıklamaları i <N> <N> testleri için yeterli içerik Kullanım talimatlarına bakın İle Kullanım Yeniden kullanmayın Laboratuarda tanımlayıcı tıbbi cihaz Katalog numarası Parti kodu Malzeme numarası Bileşenler Sayı Işıklandırma kullanılarak sterilizasyon yöntemi Kunitz birimleri Sıcaklık sınırlamaları Üst sıcaklık sınırı İmalatçı Önemli not? EtOH Şişeye etanol kattıktan sonra geçerli tarihi yazın. Gelince Ekleme İçerir. Yeniden oluşturulmuş Deoksiribonükleraze I Etanol Guanidine isothiocyanate RNase-içermeyen DNase Seti Yol açar 4 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

5 Takım muhtevası PAXgene Kan RNA Takımı (50) Catalog no Seyrelti(Hazırlama) sayısı 50 BR 1 Yeniden karıştırma ayıraç tamponu 20 ml BR 2 Bağlayıcı solüsyonu * 18 ml BR 3 Yıkama tampon solüsyonu 1* 45 ml BR 4 Yıkama tampon solüsyonu 2 (konsantre) 11 ml BR5 Çıkarma tampon solüsyonu 6 ml RNFW RNase-içermeyen Su (Şişe) 2 x 125 ml PK Proteinase K (Yeşil kapak) 2 x 1.4 ml PRC PAXgene RNA döndürme kolonları (Kırmızı) 5 x 10 PT İşlem tüpleri (2 ml) 6 x 50 Hemogard İkinci BD Hemogard kapakları 50 MCT RNFD Mikrosantrifüj Tüpleri (1.5 ml) DNase I, RNase-içermez (dondurulmuş-kurutulmuş) 3 x 50 1 x Kunitz birimleri Tablo izleyen sayfada devam etmektedir. * Çamaşır suyu içeren dezenfektan maddeler ile uyumlu değildir. Guanidin tuzu içerir. Emniyet bilgileri için bkz sayfa 8. Yukama Tamponu 2 (BR4) konsantre olarak tedarik edilir. İlk kez kullanmadan önce, şişe üzerinde gösterildiği gibi işlem solüsyonu elde etmek için belirtildiği şekilde 4 hacim etanol ilave edin (96 100%, saflık sınıfı p.a.). Kunitz birimleri DNase I ölçümü için yayın olarak kullanılan birimlerdir; tanımı için bkz sayfa 3 veya 3 e bakın. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008 5

6 PAXgene Kan RNA seti (50) katalog no Terkip sayısı 50 RDD DNA Sindirim tamponu (Beyaz kapak) 2 x 2 ml DRB PSC DNase yeniden karıştırma tampon solüsyonu (Tüp, lilac kapak) PAXgene Ufalayıcı döndürme kolonları (lilac) PAXgene Kan RNA Seti El kitabı (Sürüm 2) 2 ml 5 x 10 1 Saklama Koşulları PAXgene RNA döndürme kolonları (PRC), PAXgene ufalayıcı döndürme kolonları (PSC), proteinaz K (PK), ve tamponları (BR1, BR2, BR3, BR4, ve BR5) set (kit) etiketinde belirtilen sıcaklıkta kuru olarak saklanabilir. DNase I (RNFD) içeren RNase-sız DNase Seti, DNA parçalama tamponu (RDD), ve DNase yeniden karıştırma alma tamponu (DRB), ortam sıcaklığında sevk edilmektedir. Teslimat üzerine RNase-sız DNase Setinin tüm bileşenlerini derhal etiket üzerinde belirtilen sıcaklıkta saklayınız. Amaçlanan Kullanım PAXgene Kan RNA sistemi kan toplama tüpü (PAXgene Kan RNA Tube) ve nükleik asit saflaştırma (PAXgene Kan RNA Kit) setinden oluşmaktadır. Kan toplaması, saklanması ve taşınması ile hücre içi RNA nın kapalı tüp içerisinde dengelenmesi ve moleküler tanılayıcı testlerinde kullanılan RT-PCR için tam kandan hücre içi RNA nın izolasyonu ve saflaştırılması için amaçlanmıştır. PAXgene kan RNA tüplerinin (BRT).kullanımı hakkında bilgi için PAXgene Kan RNA tüpü ürün sirkülerine bakın. PAXgene Kan RNA Sisteminin performans özellikleri yalnızca FOS ve IL1B gen dizilişleri (transkripleri) ile belirlenmiştir. Kullanıcı diğer hedef dizilişler için uygun PAXgene Kan RNA sistem performans özelliklerinin sağlanmasından sorumludur. 6 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

7 Ürün Kullanım Kısıtlamaları PAXgene Kan RNA setleri laboratuarda tanımlayıcı uygulamalar için insan tam kanından (4.8 x x 10 7 lökositler/ml) hücre içi RNA nın saflaştırılması için amaçlanmıştır. İnsan tam kanındaki genomik DNA nın veya viral nükleik asitlerin saflaştırılması için kullanılmamaktadır. Stabilizasyon spesifikasyonları için sınırlı sayıda onaylanan diziliş (transcription) nedeniyle (FOS ve IL1B gen dizilişleri), performans özellikleri tüm dizilişler için tesis edilmemiştir. Diğer dizilişler için onaylamanın gerekli olup olmadığını tespit etmek amacı ile laboratuar personeli üretici verilerini ve kendi verilerini incelemelidir. Kalite Kontrol QIAGEN in ISO-sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi ne uygun olarak, her bir PAXgene Kan RNA seti partisi tutarlı ürün kalitesinin temin edilmesi için önceden belirlenmiş özelliklere göre test edilmiştir. Teknik Yardım QIAGEN olarak teknik desteğimizin kalitesi ve erişilebilirliği ile gurur duymaktayız. Teknik Hizmet Bölümlerimiz moleküler biyoloji ve PreAnalytiX ürünlerinin kullanımı ile ilgili geniş pratik ve teorik uzmanlığa sahip deneyimli bilim adamlarından oluşmaktadır. PAXgene Kan RNA Kiti ile ilgili sorularınız için lütfen bizimle irtibata geçmekten çekinmeyiniz Teknik yardım ve daha fazla bilgi için lütfen QIAGEN Teknik Servisini arayınız (bkz sayfa 59). Emniyet bilgileri Kimyasallar ile çalışırken daima uygun laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanınız. Biyolojik veya kimyasal materyaller ile çalışırken enfeksiyon (Örn. HIV veya hepatit B virüsleri) veya kişisel yaralanma risklerinden kaçınmak için, her zaman uygun bir laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanınız. Daha fazla bilgi için lütfen uygun malzeme emniyeti bilgi sayfalarına (MSDS) bakınız. Bunlara adresinde her bir QIAGEN kiti ve kit bileşeni ile ilgili bilgileri bulabileceğiniz, görüntüleyebileceğiniz ve çıktılarını alabileceğiniz kolay ve kompakt PDF formatında on line olarak erişilebilmektedir. Bağlama tamponu (BR2) ve yıkama tamponu 1 (BR3) çamaşır suyu ile birleştiğinde yüksek reaktif bileşikler oluşturabilen guanidin tiyosiyanat içermektedir. Eğer Bağlama Tamponu (BR2) veya yıkama tamponu 1 (BR3) dökülürse, dökülen bölgeyi öncelikle uygun bir laboratuar deterjanı ve su ile ve daha sonra 1% PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008 7

8 (v/v) sodyum hipoklorit ile temizleyiniz. DİKKAT: Numune- hazırlama atık maddesine doğrudan çamaşır suyu yada asit solüsyonları katmayın. 9 hacim RNA dengeleme solüsyonu ve kan karışımı başına 1 hacim ticari çamaşır suyu solüsyonu (%5 sodyum hipoklorit) kullanılarak PAXgene Kan RNA Tüpündeki (BRT) RNA dengeleme solüsyonu ve kan karışımı dezenfekte edilebilir. RNA saflaştırma işlemindeki santrifüj aşamalarından meydana gelen üstte kalan kısımlar gibi örnek-hazırlama atıkları potansiyel olarak bulaşıcı kabul edilmektedir. Bunları imha etmeden önce atıklar, bulaşıcı malzemelerin ortadan kaldırılması için yüksek sıcaklıkta buharla steril edilmeli veya yakılmalıdır. İmha işlemi resmi yönetmeliklere göre gerçekleştirilmelidir. Aşağıdaki risk ve güvenlik ibareleri PAXgene Kan RNA seti bileşenleri için geçerlidir. PAXgene Kan RNA Tüpleri (BRT) ile ilgili emniyet bilgileri için PAXgene Kan RNA Tüp Ürün Sirküleri ne bakınız. Bağlayıcı tampon solüsyonu (BR2) Xn Guanidine thiocyanate içerir: zararlı (Xn). Risk ve emniyet maddeleri:* R20/21/22-32, S Yıkama tampon solüsyonu 1 (BR3) Etanol içerir: yanıcıdır. Risk ibaresi:* R10 * R10: Yanıcı; R20/21/22: Solunması, deri ile teması veya yutulması halinde zararlıdır; R32: Asitler ile teması çok zehirli gazlar meydana getirir; R36/37/38: Gözleri, solunum sistemini ve deriyi tahriş eder; R42/43: Solunması veya deri ile teması halinde hassasiyet meydana getirebilir. ; S13: Yiyecek, içecek ve hayvan yemlerinden uzak tutunuz; S22: Tozunu solumayınız; S23: Spreyini solumayınız; S24: Deri ile temasından kaçınınız; S26: Gözler ile temas halinde derhal bol su ile durulayın ve tıbbi yardım alın; S36: Uygun koruyucu kıyafetler giyin; S36/37: Koruyucu kıyafetler ve eldivenler kullanın; S46: Yutulması halinde derhal tıbbi yardım alın ve şişe üzerindeki etiketi gösterin. 8 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

9 Proteinase K (PK) Xn Proteinaz içerir K (Tritirachium album): hassaslaştırıcı, tahriş edicidir. Risk ve güvenlik ibareleri:* R36/37/38-42/43, S /37 DNase I (RNFD) DNase I Xn Deoksiribonükleaz içerir (sığır): hassaslaştırıcıdır. Risk ve güvenlik ibareleri:* R42/43, S /37 24-saatlik acil durum bilgileri : İngilizce, Fransızca ve Almanca acil durum tıbbi bilgiler günün 24 saati aşağıdaki numaradan elde edilebilir: (Zehir Bilgi Merkezi Mainz, Almanya) Tel: * R10: Yanıcı; R20/21/22: Solunması, deri ile teması veya yutulması halinde zararlıdır; R32: Asitler ile teması çok zehirli gazlar meydana getirir; R36/37/38: Gözleri, solunum sistemini ve deriyi tahriş eder; R42/43: Solunması veya deri ile teması halinde hassaslaştırabilir.; S13: Yiyecek, içecek ve hayvan yemlerinden uzak tutunuz; S22: Tozunu solunmayınız; S23: Spreyini solumayınız; S24: Deri ile temasından kaçınınız; S26: Gözler ile temas halinde derhal bol su ile durulayın ve tıbbi yardım alın; S36: Uygun koruyucu kıyafetler giyin; S36/37: Koruyucu kıyafetler ve eldivenler kullanın; S46: Yutulması halinde derhal tıbbi yardım alın ve şişe üzerindeki etiketi gösterin. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008 9

10 Giriş Hücresel RNA nın incelenmesi için tam kan alımı bir çok moleküler analizde ilk adımdır. Ancak, söz konusu deneylerdeki büyük bir problem laboratuarda hücresel RNA profilinin istikrarlı olmayışıdır. PreAnalytiX araştırmaları tam kandaki ayrı mrna türlerinin oda sıcaklığında saklanması veya nakliyesi sırasında 1000-kattan fazla sayıda değişebildiğini göstermiştir.* Bunun nedeni hem RNA bozunumu hem de kanın alınmasından sonra belirli genlerin dizilişindeki azalmadır. RNA diziliş profilindeki söz konusu değişimler gen dizilişinin güvenilir olarak çalışılmasını imkansız hale getirmektedir. RNA diziliş profilini flebotomi sonrasında koruyan bir metot bu nedenle insan tam kanındaki gen dizilişinin doğru olarak analizi için çok önemlidir. İlke ve İşlem PreAnalytiX, hücre içi RNA nın saflaştırılması için hızlı ve etkili bir protokol ile birlikte insan tam kan örneklerinin alımı (toplanması), dengelenmesi, saklanması ve taşınması için yeni bir sistem geliştirmiştir. Sistem PAXgene Kan RNA seti kullanılarak elle yada otomatik RNS arıtmasının izlediği PAXgene Kan RNA Kit kullanımı ile RNA saflaştırılması için PAXgene Kan RNA Tüplerinin (BRT; ABD Patentleri 6,602,718 ve 6,617,170) kullanılmasını gerektirmektedir. Hem elle yapılan hem de otomatik protokoller RNA kalitesi ve verimine (sonucuna) ilişkin temel olarak eş değerde performans sağlarlar. Elle uygulanan protokolün elle veya (sayfa 3-26) ve otomatik protokolün (sayfa 3-30) performans verileri bu el kitabı içinde kapsanmıştır. Örnek Toplama ve Dengeleme PAXgene Kan RNA Tüpleri (BRT) patentli RNA dengeleme (stabilizasyon) teknolojisine sahip bir özel ayıraç bileşimi içermektedir. Bu ayıraç bileşimi RNA moleküllerinin RNase tarafından bozunumundan korumakta ve gen dizilişindeki ex vivo değişimleri minimize etmektedir. PAX- gene Kan RNA Tüpleri (BRT) insan tam kanının toplanması ve C de 3 güne kadar veya 2 8 C de 5 güne kadar hücresel RNA nın dengelenmesi için amaçlanmıştır. (şekiller 1.2 sayfa 12 ve 13). Halihazırda mevcut veriler hücresel RNA nın en az 24 ay 20 C veya 70 C de dengelenmesine işaret etmektedir. Daha uzun sürelerde denge (istikrar) üzerine devam eden çalışmalar hakkında daha fazla bilgi almak için lütfen QIAGEN Teknik Servisi ile irtibata geçiniz. RNA stabilizasyonunun gerçek dayanımı hücresel RNA nın türüne göre ve kullanılan ilave uygulamalara göre değişiklik gösterebilmektedir. Dengeleme özellikleri için sınırlı sayıda onaylanan transkript nedeniyle (FOS ve IL1B gen transkriptleri), performans özellikleri tüm transkriptler için tesis edilmemiştir. Laboratuar personeli üretici verilerini ve kendi verilerini diğer transkriptler için onaylamanın gerekli olup olmadığının tespiti için incelenmelidir. * Rainen, L. et al. (2002) Tam kan örneklerinde mrna diziliş (expression) dengesi. Clin. Chem. 48, PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

11 18 25 C deki kan numunelerinde RNA istikrarı: FOS Saklama (günler) Saklama (günler) Şekil 1 Kan iki örnek halinde 10 donörden toplanmış ve belirtilen gün sayısı kadar C de saklanmış ve toplam RNA saflaştırması bunu takip etmiştir. A Kan PAXgene Kan RNA Tüplerine (BRT) toplanmış ve bunlarda saklanmış, ve toplam RNA RNA the PAXgene Kan RNA Kiti kullanılarak saflaştırılmıştır. B kan pıhtılaşma önleyici olarak EDTA içeren standart kan toplama tüplerine toplanmış ve toplam RNA silika-diyafram tabanlı RNA temizliği ile standart organik çıkarma metodu kullanılarak saflaştırılmıştır. FOS göreceli transkript düzeyleri gerçek zamanlı, dubleks RT-PCR ile, dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart saplamaları ile çizilmiştir. Kesikli çizgiler analizin ±3x toplam duyarlılığına işaret etmektedir (2.34 CT). PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

12 18 25 C deki kan numunelerinde RNA istikrarı: IL1B Saklama (günler) Saklama (günler) Şekil 2 Kan, Şekil 1 de belirtildiği şekilde toplanmış ve RNA saflaştırılmış ve bunun üzerine C de saflaştırılmıştır. IL1B nin göreceli transkript düzeyleri gerçek zamanlı, dubleks RT-PCR ile, dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak belirlenmiştir Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart saplamaları ile çizilmiştir. Kesikli çizgiler analizin ±3x toplam duyarlılığına işaret etmektedir (1.93 CT). 12 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

13 2 8 C deki kan numunelerinde RNA istikrarı(dengesi) : FOS saklama (günler) Saklama (Günler) Şekil 3 Kan iki örnek halinde 10 donörden toplanmış ve belirtilen gün sayısı kadar 2 8 C de saklanmış ve toplam RNA saflaştırması bunu takip etmiştir. A Kan PAXgene Kan RNA Tüplerine (BRT) toplanmış ve bunlarda saklanmış, ve toplam RNA RNA the PAXgene Kan RNA Kiti kullanılarak saflaştırılmıştır. B kan pıhtılaşma önleyici olarak EDTA içeren standart kan toplama tüplerine toplanmış ve toplam RNA silika-diysafram tabanlı RNA temizliği ile standart organik çıkarma metodu kullanılarak saflaştırılmıştır. FOS göreceli transkript düzeyleri gerçek zamanlı, dubleks RT- PCR ile, dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart saplamaları ile çizilmiştir. Kesikli çizgiler analizin ±3x toplam duyarlılığına işaret etmektedir (2.34 CT). PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

14 2 8 C deki kan numunelerinde RNA istikrarı: IL1B Depolama (Günler) saklama (Günler) Şekil 4 Kan, Şekil 3 de belirtildiği şekilde toplanmış ve RNA saflaştırılmış ve bunun üzerine 2 8 C de saflaştırılmıştır. IL1B nin göreceli transkript düzeyleri gerçek zamanlı, dubleks RT-PCR ile, dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak belirlenmiştir Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart saplamaları ile çizilmiştir. Kesikli çizgiler analizin ±3x toplam duyarlılığına işaret etmektedir (1.93 CT). 14 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

15 RNA konsantrasyonu ve saflaştırılması PAXgene Kan RNA Kiti PAXgene Kan RNA Tüpüne (BRT) toplanan 2.5 ml insan tam kanından toplam RNA nın saflaştırılması içindir. Bu prosedür basittir (bkz. Aşağıdaki akış şeması) ve elle yada otomatik usullerle yapılabilir.(akış çizelgesine bakın). Her iki protokolde saflaştırma (arıtma) nükleik asidi PAX gene kan RNA tüpü içinde topak oluşturacak şekilde bir santrifüj işlemi ile başlar. İlke olarak, her iki protokol aynı set elemanları ile aynı protokol kademelerini izler. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

16 Elle PAXgene kan RNA İşlemi Kan proteinase K (PK) ve Bağlama tamponunu(br2) ekleyin Bekletin PAXgene ufalayıcı döndürme kolonuna aktarın. Shredder Döndürme Column (PSC) Karışım Üstte kalan yada akanı mikro santrifüj tüpüne aktarın ve etanol ekleyin. PAXgene RNA döndürme kolonu (PRC) üzerine yükleyin Yıkama topağı Toplam RNA bağlantısı Yıkama Özümseme DNA Tekrar karıştırma Mikro santrifüj tüpüne (MCT) aktarma Yıkama Yıkama(çıkarma) 65 C ye Isıtma Kullanıma hazır RNA 16 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

17 Otomatik PAXgene Kan RNA işlemi Kan PAXgene RNA döndürme kolonu (PRC) üzerine yükleyin Bekletin Karışım PAXgene ufalayıcı döndürme kolonuna (PSC) aktarın Sıvıya etanol ekleyin Yıkama topağı İşlem tüpüne (PT) aktarma ve QIA küp karıştırıcıya yükleme Yeniden karıştırma PAXgene RNA döndürme kolonuna (PRC) yükleyin Toplam RNA bağlama Yıkama Sindirim DNA QIAcube üzerinde tam otomatik Yıkama PAXgene RNA döndürme kolonuna (PRC) aktarma Çıkarma Mikro santrifüj tüplerinin (MCT) kapağını kapatın ve QIA tüp karıştırıcısını 95 C ye ısıtın Kullanıma hazır RNA PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

18 Elle RNA arıtma Protein sindirimini meydana getirmek için yeniden karıştırılan topak proeinase K(PK) ile birlikte en uygun hale getirilmiş tamponlar içinde bekletilir. Hücrede lisate işlemini homojen hale getirmek ve kalan hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için PAXgene ufalayıcı döndürme kolonu vasıtası ile ilave bir santrifüj işlemi yapılır ve akan kısmın üstte kalanları yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır. Bağlantı şartlarını ayarlamak için etanol eklenir ve bir PAxGENE RNA döndürme kolonuna (PRC) Lisat (ayrıştırma ürünü) eklenir. Kısa bir santrifüj işlemi sırasında RNA seçmeli olarak geçen kirleticiler şeklinde PAXgene silis zarına bağlanır. Kalan kirleticiler birkaç yıkama kademesinde temizlenir. İlk ve ikinci yıkama adımları arasında diyafram (membrane), bağlı DNA ların iz miktarlarını ortadan kaldırmak için DNase I (RNFD) ile işlenmektedir. Yıkama adımından sonra, çıkarma tamponunda (BR5) ayrıştırılmakta ve ısı ile doğal yapııs değiştirilmektedir. paxgene kan RNA sistemi kullanılarak saflaştırılan toplam RNA oldukça saftır. elle uygulanan protokol A 260 /A 280 i kullanıldığında değerler 1.8 ve 2.2 arasında ve betaactin geninin miktarsal, gerçek zamanlı, bir PCR işlemi ile ölçüldüğünde örneklerin en az %95 inde 1.0% genomik DNA (w/w) mevcuttur. numunelerin en azından % 95 i % 30 a kadar eluat(yıkama ürünü) kullanıldığında PT-PCR de engelleme göstermez. Elle hazırlama protokolü (işlemi) ortalamaları kullanıldığında numune hazırlama süresi (12 örnek terkibinden alınan verilere göre) yaklaşık 90 dakika olup bunun yalnızca 40 dakikası uygulama süresidir. 2.5 ml sağlıklı insan tam kanından alınan RNA ürünleri işlenen örneklerin >95% i için 3 μg dir.ürünler donöre bağlı olduğu için münferit ürünler değişebilmektedir. Münferit donörler için PAXgene Kan RNA sistemi yüksek üretebilirliğe ve tekrarlanabilirliğe sahip ürünler (şekiller 5 ve 6, sayfalar 19 ve 20 ) and tekrarlanabilir ve yeniden üretilebilir RT-PCR (şekiller 7 ve 8, sayfalar 23 ve 24) ile klinik Tanımlama testleri için yüksek dayanıklılık sağlamaktadır. Şekil 5 PAXgene Kan RNA sisteminin genel tekrarlanabilirliğini ve tekrar üretilebilirliğini göstermektedir. İlave çalışmalar farklı PAXgene Kan RNA kit partilerinin ve farklı operatörlerin RNA ürünü ve gerçek zamanlı RT-PCR üzerindeki etkisini analiz etmektedir. Ayrı PAXgene kan RNA Tüpleri yerine havuza toplanan kan örnekleri (BRT) bu araştırmalar için kullanılmış olup sonuçlar sistem tekrarlanabilirliğini, kan alımları arasındaki dalgalanmayı yansıtmamakta ancak yalnızca örnek hazırlamanın tekrarlanabilirliğini yansıtmaktadır. (bkz Şekil 6). 18 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

19 Tekrarlanabilen ve yenilenebilen RNA arıtması Verici RNA verim ortalaması (μg/2.5 ml Kan) RNA verimi (μg/2.5 ml kan) Donör Şekil 5 14 donörden alınan dörtlü kan örneklerinin her biri 3 teknisyen tarafından işlenmiştir. (A, B, C). Üç set ekipman kullanılmış ve tek bir teknisyen tarafından hazırlanan tüm örnekler aynı ekipman kullanılarak işlenmiştir. A aynı donörden ve farklı teknisyenlerden kopya örneği başına RNA ürün ortalaması ve standart sapması gösterilmiştir. B14 donörden her birinden alınan 12 kopya kan örneği 3 farklı teknisyen tarafından elle işlenmiştir. Aynı donörden ve tüm teknisyenlerden örnek başına RNA ürünü ortalaması ve standart sapmaları gösterilmiştir., A260/A280 oranları arasında değişmektedir. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

20 Farklı Operatörler ve PAXgene Kan RNA Kiti lotları Kullanılarak Toplanan Kan Örnekleri için RNA Tekrar Üretilebilirliği ve Tekrarlanabilirliği Verici grubu RNA verimi CV sapma katsayısı (%) RNA verimi (μg/2.5 ml kan) Verici Şekil 6 30 farklı donörden alınan kan örnekleri PAXgene Kan RNA tüplerine toplanmıştır (BRT; donör başına 12 tüp, toplamda 360 tüp). 3 donörden tüp içerikleri havuza toplanmış ve 36 örneğe yeniden ayrılmıştır. Bu 3 donör havuzu başına 36 örnek 3 farklı operatör tarafından işlenmektedir. Her bir operatör 10 donör havuzundan işlenen dörtlü örneklerden çıkarma için 3 farklı PAXgene kan RNA set partisi kullanmıştır. A Her bir operatör parti kombinasyonu için RNA ürünü ve standart sapma. 10 donör havuzundan dörtlü kan örnekleri 3 farklı operatör (Kull. A, Kullan B. Kull. C) tarafından her biri 3 kit partilerinden (1,2,3) elle işlenmiştir. Aynı donör havuzundan farklı operatör ve farklı set, set partisi dörtlü örnek başına ortalama ürünler (kolonlar) ve standart sapmalar verilmiştir. B Donör havuzu başına tüm operatör lot kombinasyonu için RNA ürün CV si (Kull. A,B,C, 1,.2, l.3); ortalama ürünü ve standart sapması Şekil 6A da gösterilmiştir. 20 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

21 Tablo 1A her bir kullanıcı ile her bir parti içindeki yenilenebilirlik Tablo 1A. Her bir parti ve her bir kullanıcı içinde yenilenebilirlik Veri kombinezonu Parti 1, Kull A Verici grubu x 10 6 hücre/ml Ort sonuç (μg) 8.03 SD (μg) 0.42 CV (%) 5 Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort. verim (μg) 9.55 SD (μg) 0.99 CV (%) 10 Parti 1, Kull B Parti 1, Kull C Parti 2, Kull A Parti 2, Kull B Parti 2, Kull C Parti 3, Kull A Parti 3, Kull B Parti 3, Kull C Tablo 1B. Her bir parti ve her bir kullanıcı içinde yenilenebilirlik Verilerin kombinezonu Kul A, tüm partiler Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort sonuç (μg) 7.46 SD (μg) 0.85 CV (%) 11 Verici grubu6 6.5 x 10 6 cells/ml Ort. sonuç(μg ) 9.43 SD (μg) 1.22 Kul. B, Tüm partiler Kul. C, Tüm partiler CV (%) Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 7.52 SD (μg) 0.41 CV (%) Verici grubu x 10 6 cells/ml ort sonuç (μg) 7.54 SD (μg) 0.72 CV (%) Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 7.96 SD (μg) 0.49 CV (%) Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 7.81 SD (μg) 0.82 CV (%) PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

22 Tablo 1C. Her bir parti içinde ve tüm kullanıcılar arasında yenilenebilirlik Veri kombinezonu Parti1 1, Tüm kullanıcılar Verici grubu x 10 6 hücre/ml Ort sonuç (μg) 7.96 SD (μg) 0.69 CV (%) 9 Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort. verim (μg) 9.88 SD (μg) 1.34 CV (%) 14 Donor pool x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 8.83 SD (μg) 1.63 CV (%) 19 Donor pool x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 9.02 SD (μg) 1.27 CV (%) 14 Parti 2, Tüm kullanıcılar Parti 3, Tüm kullanıcılar Tablo 1D. Tüm partiler ve tüm kullanıcılar arasında yenilenebilirlik Veri kombinezonu All lots and all users Verici grubu x 10 6 hücre/ml Ort sonuç (μg) 7.44 SD (μg) 1.09 CV (%) 15 Verici grubu x 10 6 cells/ml Ort. verim (μg) 9.66 SD (μg) 1.65 CV (%) 17 Donor pool x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 8.35 SD (μg) 1.70 CV (%) 20 Donor pool x 10 6 cells/ml Ort. sonuç (μg) 8.99 SD (μg) 1.80 CV (%) 20 4 temsili donör havuzu detaylı analizi. havuzlar beyaz kan hücre sayısına göre seçilmiş olup beyaz kan hücresi sayımlarının alt üst ve orta düzeylerini temsil etmektedir. (4.8 x x 10 7 lökosit/ml). Beyaz kan hücre sayımı donör havuzu başına 3 donörden 3 beyaz kan hücresi sayımının ortalama değerini ifade etmektedir. 22 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

23 Kullanıcılar arasında RT-PCR çoğalması (yenilebilirliği) Kullanıcı Kullanıcı Şekil 7 Şekil 6 da açıklanan deneyde saflaştırılan RNA gerçek zamanlı PT-PCR de kullanılmaktadır. A FOS ve B IL1B nispi diziliş( transkript) değerleri gerçek zamanlı, dupleks RT-PCR kullanılarak belirlenmiş ve 18S rrna dahili standart olarak kullanılmıştır. Tüm örnekler için değerler kullanıcı 1 e göreceli olarak arıtılmış (10 donör havuzu x 3 set partisi x 4 kopya = her gen için 120 veri seti), ortalama (kırmızı çizgiler) ve standart sapmalar (siyah çubuklar) tüm örnekler için gösterilmiştir. Kesikli çizgiler analizlerin ±3x toplam duyarlılığını ifade etmektedir. (FOS: 2.34 CT; IL1B, 1.93 CT). PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

24 Setteki partiler arasında RT-PCR yenilenebilirliği Parti Parti Şekil 8 Şekil 6 da açıklanan deneyde saflaştırılan RNA gerçek zamanlı PT-PCR de kullanılmaktadır. A FOS ve B IL1B nispi diziliş ( transkript) değerleri gerçek zamanlı, çifte RT-PCR kullanılarak belirlenmiş ve 18S rrna dahili standart olarak kullanılmıştır. Tüm örnekler için değerler set partisi 1 e göreceli olarak arıtılmış (10 donör havuzu x 3 set partisi x 4 kopya = her gen için 120 veri seti), ortalama (kırmızı çizgiler) ve standart sapmalar (siyah çubuklar) tüm örnekler için gösterilmiştir. Kesikli çizgiler analizlerin ±3x toplam duyarlılığını ifade etmektedir. (FOS: 2.34 CT; IL1B, 1.93 CT). 24 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

25 Tablo 2. Şekil 7 ve 8 den RT-PCR Verilerinin Özeti Test Sistemi Verilerin kıyaslanması FOS/18S rrna analizi Orta. ( C T ) ±SD ( C T ) IL1B/18S rrna analizi Ortal. ( C T ) ±SD ( C T ) Her bir kullanıcı içinde ve tüm partiler arasında yenilebilirlik Tüm kullanıcılar- Parti 1 Parti 1 Tüm kullanıcılar- Parti 2 Parti 2 Tüm kullanıcılar- Parti 3 Parti Her bir parti ve tüm kullanıcılar arasındaki yenilenebilirlik Tüm partiler,kullanıcı A-Kullanıcı A Tüm partiler,kullanıcı A-Kullanıcı B Tüm partiler,kullanıcı A-Kullanıcı C Kull.: araştırmayı gerçekleştiren teknisyen. Parti: Araştırmada kullanılan set parti sayısı SD: Standart sapma. Ortalama DDCT değerleri (N = 120) ve standart sapmalar Şekil 7 ve 8 de sunulan veriler için gösterilmektedir. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

26 Otomatik RNA arıtma işlemi QIAcube kullanılarak numune hazırlanması yüksek kalitede RNA arıtma için PAXgene kan RNA setini kullanmanıza olanak sağlayan, elle yapılan işlemle aynı kademeleri izler. QIAcube hakkında daha fazla bilgi için kullanıcı el kitabına bakın ve User adrssine bakın. Otomatik RNA arıtma (saflaştırma) protokolü 2 kısımdan (veya protokolden) meydana gelir,bunlar PAXgene kan RNA kısım A ve PAXgene kan RNA kısım B dir ve iki kısım arasında kısa elle bir müdahale vardır. Santrifüje tabi tutulmuş, yıkanmış ve yeniden karıştırılmış nükleik asit topağı (bakınız RNA konsantrasyonu ve arıtılması sayfa ) PAXgene kan RNA tüpünden (BRT) işlem tüplerine aktarılır ve işlem tüpleri QIA çalışma tezgahı üzerindeki bir termo-karıştırıcı ünitesi içine yerleştirilir. Operatör menüden PAXgene kan RNA kısım A protokolünü seçer. QIAcube cihazının çıkarma tampon solüsyonunda (BR5). RNA çıkarılmasına kadar protokolün (programın) aşamalarını icra eder. Operatör arıtılmış RNA içeren mikro santrifüj tüplerini (MCT) QIAcube cihazının termo karıştırıcı ünitesi içine aktarır. Operatör menüden PAXgene kan bölüm 2 protokolünü seçer ve QIAcube tarafından ısıl değişiklik gerçekleştirilir. Ortalama numune hazırlama zamanı (12 numune hazırlama terkibinden alınan verilere dayalı olarak) 125 dakikadır ve sadece 20 dakika sure ile elle işlem vardır. 2.5 ml sağlıklı insan tam kanından RNA verimleri işlenen numunelerin %95 inde 3 μg dir. 3 operatör tarafından 3 set partisi ile otomatik protokol kullanılarak elde edilen toplam 288 numunenin sonuçlarını gösteriyor. Bu araştırmalarda bireysel PAXgene kan RNA tüpleri (BRT) yerine gruplandırılmış kan numuneleri kullanıldığı için, bu sonuçlar bireysel olarak çekilen kan numunelerinden beklenen RNA sonucunu yansıtmaz. Sonuçlar yüksek oranda vericiye (donöre) dayalı) olduğundan bireysel sonuçlar değişiklik gösterebilir. 26 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

27 RNA verimi (sonucu) otomatik işlem RNA sonucu (μg/2.5 ml Kan) Şekil 9 PAXgene kan RNA tüplerinde (BRT) 48 farklı vericiden alınan kan numuneleri toplandı; (Donör başına 6 tüp ile toplam 288 tüp vardı. 6 vericiden alınan tüplerin muhtevası grup olarak toplandı ve yeniden 36 paya ayrıldı. 6 vericili gruptaki bu bu 36 numune 3 farklı operatör (A,B,C) tarafından işlendi. Her bir operatör otomatik çıkarma işlemi için PAXgene kan RNA setinin 3 farklı setini (1,23) kullandı ve 8 verici grubundan her birisi için dörtlü kopya numunelerini kullandı. Her bir operatör-parti kombinezonu için tüm bireysel numunelerin RNA verimleri gösterilmiştir.. Numunelerin en azından %95 I çıkarılan ürünün % 30 una kadar kullanıldığında RT-PCR engellemesi göstermemiştir. Aynı işlemde RNA-pozitif numunelerle (İnsan tam kanı) ile çiftlenen RNA-negatif numunelerde (su) betaglobin ve FOS dizilişlerinin(transcript) sıralarının miktarsal RT-PCR ile ölçülen şekilde numuneler arasındaki karşılıklı bulaştırma otomatik protokol kullanılarak tespit edilemez. PAXgene Kan RNA Sistemi ve otomatik protokol ile arıtılan RNA RT-PCR engellenmemesinin olmayışı ile gösterildiği gibi (yukarı bakın) oldukça saftır ve A 260 /A 280 değerleri 1.8 ve 2.2 arasında olup beta-actin geninin bir sırasının miktarsal, gerçek zamanlı PCR işlemi ile ölçüldüğü gibi tüm numunelerin 95% inde 1% genomik DNA vardır. 3 operatör tarafından 3 set partisi ile otomatik program (protokol) kullanılarak toplam 288 numunenin DNA sı hazırlandı. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

28 RNA saflığı (A 260 /A 280 değerleri) otomatik işlem Şekil 10. Şekil 9 da açıklanan deneydeki PAXgene kan RNA setinin 3 farklı partisi (1,23) kullanılarak 3 farklı operatör (A, B, C tarafından arıtılmış RNA. Her bir operatör parti kombinezonu için tüm bireysel numunelerin A 260 /A 280 değerleri gösterilmiştir.. RNA saflığı (% genomik DNA bulaşması) Otomatik işlem Genomic DNA (w/w) (%) RNA saflığı (A 260 /A 280 ) Şekil 11: Şekil 9 da açıklanan deneydeki PAXgene kan RNA setinin 3 farklı partisi (1,2,3) kullanılarak 3 farklı operatör (A, B, C tarafından RNA arıtıldı. Her operatör parti kombinezonu için tüm numunelerde Genomik DNA miktarları (w/w) gösterilmiştir. 28 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

29 PAXgene kan RNA sistemini kullanan otomatik RNA arıtma (saflaştırma) protokolü şekil 12 de gösterildiği gibi oldukça yüksek yenilenebilir ve tekrarlanabilir RT-PCR sonuçları sağlamaktadır ve bu özellik onu klinik tanı testleri için güvenilir yapmaktadır. Otomatik ve elle yapılan protokoller arasında RT-PCR yenilenebilirliği Şekil 12: şekil 9 da açıklanmış olan deneyde otomatik protokol kullanılarak PAX gene RNA kan setinin 3 farklı partisini (1,2,3) kullanan 3 farklı operatör (A,B,C) tarafında RNA saflaştırıldı. Dahili bir standart olarak 18S rrna kullanılması ile göreceli diziliş seviyeleri (Rel.Trans..levels) FOS ve IL1B gerçek zamanlı, çifte RT-PCR ile tespit edildi. C T yöntemi ile her iki çıkarma protokolünün (hem elle hem de otomatik) kullanıldığı çiftlenmiş kan numunelerinden hazırlanan RNA seviyeleri arasındaki muhtemel dizilişi farklılıkları hesaplandı. Tüm numune çiftleri için (4 kopya x 8 verici grubu x 3 takım=288 çift) bireysel C T değerleri grafikle tek noktalar şeklinde gösterildi ve(büyük noktalar) ve tüm numuneler için standart sapmalar (siyah çizgiler) gösterildi. Aralıklı çizgiler analizlerin ±3x toplam hassasiyetlerini gösteriyor. (FOS: 2.34 C T ; IL1B, 1.93 C T ). PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

30 Kullanıcı Tarafından Tedarik Edilecek Ekipman ve Ayıraçlar Kimyasallar ile çalışırken her zaman uygun laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanınız. Daha fazla bilgi için ürün tedarikçilerinden edinilebilen uygun materyal güvenlik veri sayfalarına (MSDS) başvurunuz. Tüm protokollar için PAXgene Kan RNA tüpleri (BRT; kat. no ) Etanol (96 100%, saflık sınıfı p.a.) Pipetler* (10 μl 4 ml) Steril, aerosol-bariyerli, RNase-sız pipet uçları Kademeli silindir x g değere erişebilen ve sallanmalı bir rotor ile PAXgene kan RNA tüplerini (BRT) tutacak bir kova ile santrifüj* Girdaplı karıştırıcı (vortex)* Kırılmış buz Etiketleme için silinmez kalem Elle yapılan protokol için x g hıza erişebilen ve 2 ml mikro santrifüj tüpleri için bir döner eleman ile donanımlı değişik hızda mikro santrifüj tertibatı 55 C ve 65 C e bekletebilen ve 1400 rpm hızı aşmayan ancak 400 rpm değerde karıştırma yapabilen karıştırıcı tutucu (Örneğin., Eppendorf Thermomixer Compact, veya muadili) Elle yapılan protokol için QIAcube* (QIAGEN, kat. no [110 V], kat. no [230 V]) QIAcube sarf malzemeleri Filtre uçları, 1000 μl (1024) (QIAGEN, kat. no ) Ayıraç tüpleri, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. no ) Döner eleman adaptörleri (10 x 24) (QIAGEN, kat. no ) * Aygıtların imalatçıların tavsiyelerine göre düzenli şekilde kontrol edilmesini, bakılmasını ve kalibre edilmesini sağlayın. RNA tutulması hakkındaki kılavuzları bildiğinizden emin olun RNA (Ek A, sayfa 55). Tampon solüsyonu BR4 konsantrasyonuna etanol ekleme için. Başlatma paketi içinde de kapsanmıştır; QIAcube (QIAGEN, kat. no ). 30 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

31 QIAcube aksesuarları Ayıraç şişesi tablası (QIAGEN, Kat. no ) Döner eleman adaptör tutucusu (QIAGEN, cat. no ) Makas Önemli notlar QIAcube kullanılması QIA küpü çalıştırmayı bildiğinizden emin olun. Lütfen PAXgene Kan RNA ürünlerinin otomatik protokollerini başlatmadan önce emniyet bilgilerine özenle dikkat göstererek QIAküp kullanıcı el kitabını okuyun. QIAcube cihazının çalıştırılması QIAcube kapağını kapatın ve güç anahtarı ile QIAcube cihazını açın (Şekil 13 e bakın). Bir biip sesi veren alarm tertibatı sesi çıkar ve başlama ekranı görünür. Augıt başlatma testlerini otomatik olarak icra eder. QIAcube cihazı üzerine protokollerin yüklenmesi QIAcube üzerinde ilk RNA çalışması yapılmadan önce bir ilk protokol yüklemesi gereklidir. PAXgene kan RNA kısım A ve PAXgene Kan RNA kısım B protokollerinin her ikisini de yükleyin. Protokoller adresinde sağlanır ve QIAcube ile sağlanan USB belleği ile indirilmesi ve USB terminali üzerinden QIAcube cihazına aktarılması gereklidir. Koruyucu pano arkasında bulunan USB terminali (şekil 13 e bakın ), QIAcube cihazının bir USB çubuğuna bağlanmasına izin verir. (QIAcube ile birlikte sağlanır). Kayıt dosyaları yada rapor dosyaları benzeri veri dosyaları da terminal üzerinden QIAcube cihazından USB belleğine (çubuğuna) aktarılabilir. USB terminali sadece QIAGEN ile birlikte sağlanan USB ubuğu ile kullanım içindir. Bu terminale (porta) başka cihazlar bağlamayın. Protokolleri indirirken veya veri dosyalarını aktarırken yada bir protokolü çalıştırırken USB çubuğunu çıkarmayın. Başlatma paketi içinde de kapsanmıştır; QIAcube (QIAGEN, kat. no ). PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

32 QIAcube ön görünüşü Şekil 13 tuş ekranı kapı Koruyucu pano arkasındaki RS232 seri bağlantı noktası (QIAGEN cihazı servis uzmanları tarafından kullanılmak içindir) Koruyucu pano arkasındaki USB bağlantı noktası Güç anahtarı Atık çekmecesi 32 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

33 QIAcube cihazının yüklenmesi Zaman tasarufu amacı ile yükleme protokolde 10 dakikalık bir veya iki santrifüj işlemi sırasında yapılabilir (3 ve 5 numaralı kademeler) PAXgene kan RNA tüpleri (BRT) içinde toplanan İnsan tam kanından toplam RNA nın otomatik olarak saflaştırılması, sayfa 47. Ayıraç şişeleri (tüpleri) 4 QIAcube ayıraç tüpünü tablo 3 de sıralanan ayıraçlarla dikkatle doldurun (tüpleri ayıraç şişeleri üzerindeki gösterge seviyesine kadar doldurun). Şişeleri(tüpleri) ve kapakları tampon solüsyon isimleri ile açık olarak etiketleyin ve ayıraç tüp çekmecesi içinde uygun konumda yerleştirin (Şekil 14 ve 15 e bakın). QİAcube üzerinde her bir işlem öncesinde, ayıraç şişelerinin gösterge seviyelerine kadar doldurulduklarından emin olun (orijinal set tampon şişelerinde kalan hacimler) ayıraç şişelerini doldurmak için kullanılmalıdır). Doldurulmuş ayıraç şişeleri (tüpleri) ile birlikte ayıraç tablasını gösterildiği gibi QIAcube çalışma tezgahı üzerine ayarlayın (Şekil 14 ve 15). Çalışma tezgahı (masası) üzerine yerleştirmeden önce şişelerin kapaklarını çıkarın. PAXgene kan RNA seti (50) içinde sağlanan tampon solüsyon hacimleri QIAcube üzerinde azami 7 RNA hazırlama işlemi için yeterlidir. 50 numunenin hepsini işleme amacı ile yeterli tampon solüsyon hacimlerine izin vermek amacı ile daha az sayıda çoklu işlemden kaçınılmalıdır. Tablo 3. Ayıraç şişeleri tablasındaki konumlar Pozisyon Ayıraç 1 Bağlayıcı tampon (BR2) % etanol 3 Yıkama tampon solüsyonu 1 (BR3) 4 Yıkama tampon solüsyonu 2 (BR4)* 5 (Boş bırakın) 6 (Boş bırakın) * Yıkama tampon solüsyonu 2 (BR4) bir konsantre şeklinde sağlanır. İlk kez kullanmadan önce, bir çalışma solüsyonu elde etmek için şişe(tüp) üzerinde gösterildiği gibi 4 hacim etanol (% , saflık derecesinde) katın. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

34 Ayıraç şişe tablasının (rafının) yüklenmesi Pozisyon 1 Bağlama tamponu (BR2) Pozisyon 2 % etanol Etiket şeridi Pozisyon 3 Yıkama tamponu 1 (BR3) Pozisyon 4 Yıkama tamponu 2 (BR4) Etiket şeridi Pozisyon 5 Pozisyon 6 Boş Boş Şekil 14 ayıraç şişesi çerçevesinde (tablasında) konumlar ve muhtevaların şeması. QIAcube üzerine tabla (rack) yüklenmesi. 34 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

35 QIAcube iç görüntüsü Şekil 15 Santrifüj kapağı Santrifüj Karıştırıcı Ayıraç şişesi çekmecesi Uç sensörü Mikro santrifüj tüp yuvaları Uç tablaları (çekmeceleri) Uçlar ve kolonlar için düzenleme yuvaları Robot kolu PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

36 Döndürme kolonları (PRC, PSC), mikro santrifüj tüpleri (MCT), ve QIAcube plastik kısımları μl Filtre uçları ile 1000 doldurulmuş 2 uç çerçevesini QIAcube üzerine koyun(şekil 15 e bakın). Gerekirse uçlarla çekmeceleri yeniden doldurun. Sadece QIAcube ile kullanılmak için amaçlanmış 1000 μl filtre uçlarını kullanın. Bir silinmez kalem kullanarak döner eleman (rotor) adaptörleri ve mikro santrifüj tüplerini (MCT) işaretleyin. Kullanılacak PAXgene ufalayıcı döner kolonlarını (PSC) açın ve makas ile kapakları tamamen kesip ayırın (Şekil 16 ya bakın 16). QIAcube robot tutma kolunun uygun çalışması için kapakları ve kapağı PAXgene ufalayıcı döndürme kolonlarına (PSC; için şekil 16 ya bakın) bağlayan plastik kısımları tamamen kaldırın. Aksi halde robot tutma kolu döndürme kolonlarını uygun şekilde tutmayabilir. (PSC, PRC). Şekil 17 de (Sayfa 17) gösterildiği gibi PAXgene RNA döndürme kolonu (PRC), PAXgene ufalayıcı döndürme kolonu (PSC, kapaksız), ve etiketlenmiş mikro santrifüj tüpünü (MCT) her bir etiketlenmiş rotor adaptörün içinde uygun konumlara yükleyin. Döner kolon (PRC) ve mikro santrifüj tüpünün (MCT) kapaklarının Rotor (döner eleman) adaptörü kenarındaki yuvaların tabanına kadar tamamen itildiğinden emin olun aksi halde santrifüj işlemi sırasında kapaklar kopacaktır. Bir PAXgene ufalayıcı döndürme kolonunun (PSC) yüklenmesi Çıkarılmış Kolon (PSC) kapağı Yanlış çıkarılmış kolon (PSC) kapağı; kapağın bir kısmı kalır Şekil 16 PAXgene ufalayıcı döndürme kolonu (PSC) orta konuma yüklenir. Kolonu (PSC) yüklemeden önce kapağı kesin 36 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

37 Tablo 4. Rotor adaptöründeki laboratuar aygıtları Konum Lab.aygıtı Kapak konumu 1 PAXgene RNA döndürme kolonu (kırmızı, PRC) 2 PAXgene ufalayıcı döndürme kolonu (leylak, PSC) ( rotor adaptörü içine yerleştirmeden önce kapağı kesin) 3 Mikro santrifüj tüpü (MCT)* L3 L1 * PAXgene kan RNA seti içinde içerilen mikro santrifüj tüplerini kullanın (1.5 ml, MCT). Şekil 17 Rotor adaptörü üç tüp pozisyonuna (1 3) ve üç kapak (L1 L3) pozisyonuna sahiptir. Santrifüj yükleme Toplanmış olan rotor adaptörlerini şekil 18 de gösterildiği gibi santrifüj kovaları içine yükleyin. Eğer 12 den qaz sayıda numune işleniyorsa, radyal olarak dengelenmiş santrifüj rotorunu yüklediğinizden emin olun (Şekil 19 a bakın). 12 den az sayıda numune işlenecek olsa bile bir rotokol işleminden önce tüm santrifüj koyaları monte edilmiş olmalıdır. Tek bir numune veya 11 numune işlenemez. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

38 Santrifüj yüklemesi Şekil 18 : Monte edilen rotor adaptörlerini santrifüj kovaları içine yükleyin. 38 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

39 Santrifüj ve karıştırıcının yüklenmesi 2 numune 3 numune 4 numune 5 numune 6 numune 7 numune 8 numune 9 numune 10 numune Şekil 19: 2 ile on (2-10) arasındaki numunenin işlenmesi için santrifüj ve karıştırıcı konumları gösterilmiştir. Bir veya 11 numune işlenemez. PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

40 İşlem tüpleri (PT) Önceki işlemlerden mikro santrifüj yuvasında bırakılmış herhangi bir işlem tüpleri (PT) varsa çıkarın (Şekil 15 e bakın, sayfa 37). 3 işlem tüpünü Tablo 5 de verilen ayıraç miktarı ile doldurun. Tüpleri ayıraç isimleri ile açıkça etiketleyin ve bunları tablo 6 da gösterildiği gibi mikro santrifüj tüp yuvaları içinde uygun konumlara yerleştirin. Gösterilen hacimde DNA özümseme tamponunu (RDD) işlem tüpü (PT) içine pipetle aktarın ve gösterilen RNase 1 (RNFD stok solüsyonu hacmini ekleyin μl pipet ucu kullanarak bütün karışımı aşağı yukarı üç kez pipetle aktarma yaparak hafifçe karıştırın. PAXgene RNA seti içinde kapsanan 2 ml işlem tüplerini (PT) kullanın. Tablo 5 de gösterildiği gibi sadece gerekli hacmi pipetle aktarın. Tablo 5. Mikro santrifüj tüp yuvaları için işlem tüplerinde gereken ayıraçların hacmi Numune sayısı Proteinase (PK) Gösterilen numune sayısı için gerekli ayıraç hacmi (μl) DNase I bekletme karışımı Çıkarma (elüsyon) tamponu (BR5) (23 DNase I [RNFD] RDD) (33 DNase I [RNFD] RDD) (42 DNase I [RNFD] RDD) (51 DNase I [RNFD] RDD) (60 DNase I [RNFD] RDD) (69 DNase I [RNFD] RDD) (78 DNase I [RNFD] RDD) (88 DNase I [RNFD] RDD) (97 DNase I [RNFD] RDD) (115 DNase I [RNFD] RDD) 1177 Tablo 6. Mikro santrifüj tüpü yuvaları Muhteva Konum A B C Proteinase K (PK) DNase I bekletme(kuluçka) karışımı Çıkarma tampon solüsyonu (BR5) Kap İşlem tüpü (PT)* İşlem tüpü (PT)* İşlem tüpü (PT)* * PAXgene Kan RNA seti içinde gösterilen 2 ml işlem tüplerini (PT ) kullanın. 40 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008

41 Protokol: PAXgene Kan RNA Tüplerinde (BRT) Toplanan İnsan Tam Kanından Toplam RNA nın Saflaştırılması Başlama öncesinde önemli noktalar Kit kutusunun intakt ve hasarsız olduğundan ve tamponların sızıntısızlığından emin olunuz. Zarar görmüş kitleri kullanmayın Pipet kullanırken doğru hacme ayarlandığından ve sıvının dikkatli biçimde ve tamamen emildiğinden (içe çekildiğinden) ve dağıtıldığından emin olun Örneklerin yanlış tüp veya dönüş kolonuna transferini önlemek için tüm tüplerin ve döndürme kolonlarının uygun biçimde etiketlendiğinden emin olun. Her bir tüpün kapağını ve gövdesini etiketleyin. döndürme kolonları için işleme tüpünün gövdesini etiketleyin. Her bir tüp ve döndürme kolonunu içerisine sıvı transfer edildikten sonra kapatın. Örnek ve tamponların prosedür sırasında dökülmesi RNA ürününü ve saflığını azaltabilir. Aksi belirtilmediği sürece bu protokolün tüm adımları santrifüj adımları dahil olmak üzere oda sıcaklığında (15 25 C) gerçekleştirilmelidir. Nükleik asit büyütmenin hassasiyeti nedeniyle aşağıdaki önlemler çapraz kirlenmenin önlenmesi için örneklere müdahale edilirken izlenmelidir. Örneği kolon kenarını ıslatmadan dikkatlice döndürme kolonuna (PRC, PSC) pipetleyin. Sıvı transferleri arasında her zaman pipet uçlarını değiştirin. Aerosol bariyerli uçlar kullanın Döndürme kolonu (PRC, PSC) zarına (diyaframına) pipet ucu ile dokunmayınız. Girdap (Vorteks) oluşturarak karıştırma veya mikro santrifüj tüpünün ısıtılmasından sonra kapağın içerisindeki damlalardan kurtulmak için hafifçe santrifüj edin. Tüm prosedür boyunca eldiven kullanınız. Örnek ve eldivenler arasında temas olması halinde derhal eldivenleri değiştiriniz. Mikro santrifüje yerleştirmeden önce döndürme kolonunu (PRC, PSC) kapatın. Prosedürde açıklandığı şekilde santrifüj edin. Bir seferde yalnızca bir döndürme kolonu açın (PRC, PSC), ve aerosol oluşmasını önlemek için dikkat gösterin Çoklu örneklerin etkili paralel işlemesi için santrifüjden sonra döndürme kolonlarının transfer edileceği rafı doldurun. Çoklu numunelerin etkili, paralel işlenmesi için döndürme kolonlarının (PRC,PSC) santrifüj işleminden sonra aktarılabileceği işlem tüpleri ile bir PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/

42 çekmeceyi doldurun kullanılmış tüpleri imha edin ve döndürme kolonları (PRC, PSC) içeren yeni işleme tüplerini doğrudan mikro santrifüje yerleştirin. Başlamadan önce yapılacak şeyler : PAXgene Kan RNA Tüp Ürünü Sirküleri nde yer alan talimatlara uygun olarak kan PAXgene Kan RNA Tüplerine (BRT) toplanmalıdır. Gerekli ise, PAXgene Kan RNA Tüplerinin (BRT) kullanılması ile ilgili tavsiyeler için bkz Ek C (sayfa 37) Kan hücrelerinin tamamen eridiğinden emin olmak için PAXgene Kan RNA Tüplerinin (BRT) oda sıcaklığında en az 2 saat bekletildiğinden (uygun şartlar altında) emin olun. PAXgene Kan RNA Tüplerinin (BRT) geceden bekletilmesi ürünü artırabilir. Kan toplanmasından sonra PAXgene Kan RNA Tüpleri (BRT) 2 8 C veya 20 C veya 70 C de saklanmışsa öncelikle oda sıcaklığına dengeleyin ve daha sonra prosedüre başlamadan önce 2 saat boyunca oda sıcaklığında saklayın Sayfa 8 deki güvenlik bilgilerini okuyun. RNA nın işlenmesi ile ilgili talimatları okuyunuz (Ek A, sayfa 34). Pipetler ve sallayıcı inkübatör (küvez)gibi enstrümanların üretici tavsiyelerine uygun olarak kontrol ve kalibre edildiğini temin ediniz. ve 20 no lu adımlarda sallayıcı-inkübatör (küvez ) gerekmektedir. Sallayıcı inkübatör sıcaklığını 55 C ye ayarlayın. Bağlama tamponu (BR2) saklama halinde tortu oluşturabilir. Gerekli ise bunu çözmek için 37 C de ısıtın. Yıkama tamponu 2 (BR4) konsantre olarak sağlanmaktadır. İlk defa kullanmadan önce, çalışma solüsyonu oluşturmak için şişede belirtildiği üzere 4 hacim etanol ilave edin (96 100%, saflık sınıfı p.a.) RNase-sız DNase Setini ilk kez kullanacaksanız, DNase I stok solüsyonu hazırlayınız. Katı DNase I (RNFD; 1500 Kunitz birimleri)* set bile birlikte verilen 550 μl DNase yeniden askıya alma tamponunda (DRB) çözünüz. Viyalin açılması sırasında hiçbir DNase I (RNFD) in kaybının yaşanmadığından emin olun. Sulandırılmış DNase I (RNFD) i vortekslemeyin. DNase I özellikle fiziksel yapı değişikliği için hassastır. Karıştırma yalnızca tüpün nazikçe alt üst edilmesi ile gerçekleştirilmelidir. Güncel veriler sulandırılmış DNase I (RNFD) in 6 haftaya kadar 2 8 C de saklanabildiğini göstermektedir. DNase I (RNFD) in daha üzün süreli saklanması için cam tüpten stok solüsyonunu çıkarın ve tek kullanımlık paylara ayırın (kit ile birlikte verilen 1.5 ml mikro santrifüj tüplerini [MCT] kullanın; 5 pay için yetecek kadar bulunmaktadır.), ve 6 aya kadar 20 C de saklayın. Çözünmüş paylar 6 haftaya kadar 2 8 C de saklanabilir. Çözdükten sonra payları tekrar dondurmayınız. Devam eden 42 PAXgene Kan RNA Kit Handbook 04/2008