BACTEC PZA Test Medium Culture Vials

Transkript

1 BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook 7H12 Ortamı ph 6,0 PP071JAA MA /06 Türkçe KULLANIM AMACI BACTEC PZA Testi Ortamı (Middlebrook 7H12 Broth, ph 6,0) Mycobacterium tuberculosis in pirazinamide (PZA) duyarlılığını test etmek için özel olarak geliştirilmiştir. Temel olarak, BACTEC 460TB cihazıyla birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. ÖZET VE AÇIKLAMA BACTEC Radyometrik Tekniği birincil anti mikobakteriyel ilaçların (streptomisin, isoniazid, rifampin ve etambutol) antimikrobiyal duyarlılık testleri için kullanılır. 1-4 Bu teknikte, mikobakter tarafından BACTEC 12B Ortamında bulunan 14 C-işaretli substratın metabolize edilmesi sonucu üretilen 14 CO 2 kantitatif olarak ölçülür. Ortama bir antimikrobiyal madde eklenirse, bu antimikrobiyal maddeye duyarlı mikobakter izolatları inhibe olur ve üretilen 14 CO 2 miktarı azalır. Butler ve ark., 5 PZA nın duyarlılık testi için ph ı 5,5 olan özel bir 7H10 Agar Ortamı gerektiren geleneksel yöntemi geliştirmişlerdir. Bu yöntemin kısıtlı olduğu noktalardan birisi, ph 5,5 te çoğu M. tuberculosis izolatının gelişememesi veya çok az gelişmesidir. İlaç ancak düşük ph değerlerinde aktif olduğundan BACTEC 12B Ortamı PZA duyarlılık testleri için kullanılamaz. 5 Heifets ve ark. PZA duyarlılığının ph 5,5 te BACTEC 12B Ortamı kullanılarak test edilmesi için radyometrik bir yöntem önermiştir. Bu yöntem, her bir şişe ph ının, flakonda gelişme başladığında 6,8 den 5,5 e düşürülmesini gerektirmektedir. 6 ph 5,5 te 12B Ortamından alınan genel sonuçlar 7H10 ph 5,5 te elde edilenlerden daha iyi olsa da, ph 5,5 te, çoğu izolat 12B Ortamında üreyememiştir Daha sonra yumurta sarısı eklenmesinin mikobakter gelişimini artıracağı öne sürülmüştür. 7 Bu şekilde daha fazla raporlanabilir sonuç elde edilmiştir ancak, taze yumurta sarısı eklenmesi işleminin zahmetli olduğu ve rutin klinik laboratuvar uygulamaları açısından pratik olmadığı görülmüştür. Salfinger ve Heifets ileri çalışmalar yaparak PZA nın MIC sinin ortam ph ının 5,5 ten 6,8 e yükselmesi sonucunda arttığını raporlamıştır. 8 Salfinger ve ark. yukarıda açıklanan radyometrik duyarlılık prosedürlerini modifiye ederek, ph ı 5,9 ila 6,0 (BACTEC PZA Testi Ortamı) olan BACTEC 12B Ortamıyla geleneksel katı besiyerinde (ph 5,5) kullanılan PZA konsantrasyonundan daha yüksek bir konsantrasyon kullanımını önermiştir. 9 PROSEDÜR İLKELERİ BACTEC PZA Testi Ortamı, ph ı 6,0 a indirgenmiş modifiye bir 7H12 Ortamıdır. Bu ph ta, PZA nın mikobakterler üzerindeki aktivitesi çoğu M. tuberculosis izolatının gelişimi inhibe edilmeksizin belirlenebilir. ph taki artışı dengelemek için, BACTEC testinde geleneksel test yönteminde kullanılan konsantrasyona (25 50 µg/ml) kıyasla daha yüksek bir PZA konsantrasyonu (100 µg/ml) kullanılır. PZA Testi Ortamı 14 C-işaretli bir substrat içerir. Mikobakter bu ortamda geliştiğinde işaretli substratı metabolize eder ve 14 CO 2 ortamın üst kısmından kapalı flakonun içindeki atmosfere karışır. BACTEC 460TB cihazı, flakondaki gazı serbest bırakarak ve bu gazı iyonizasyon miktarının Gelişme Endeksi (GI) olarak adlandırılan bir sayıya çevrildiği bir elektrometreye aktararak 14 CO 2 varlığını test eder. Ortamda üretilen 14 CO 2 hızı ve miktarı ortamdaki gelişme hızı ve miktarıyla doğru orantılıdır. Anti mikobakteriyel ilaç PZA ortama eklendiğinde, duyarlı mikobakterlerin gelişimi inhibe olur. Bu durum, kontroldeki= 14 CO 2 üretiminde gerçekleşen artış eğilimiyle karşılaştırıldığında gözlenen azalmayla belirlenir. Organizmalar dirençliyse, test flakonundaki gelişim çok az baskılanır veya hiç baskılanmaz. REAKTİFLER Her bir PZA Testi Ortamı (Son ph 6,0 ± 0,2) flakonunun (4 ml) içeriği*: 7H9 Broth... %0,47 w/v Kazein Hidrolizat... %0,10 w/v Bovin Serum Albumin... %0,50 w/v Katalaz ünite 14 C substratı... 4 µci Deiyonize su (ml)... 4 q.s. *Performans kriterlerini sağlamak üzere gereken şekilde zenginleştirilmiştir. = 1

2 Uyarılar ve Önlemler: In vitro Diyagnostik Kullanım içindir. Bu ürün kuru doğal kauçuk içerir. Klinik örneklerde hepatit virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Kan veya diğer vücut sıvılarıyla kontamine olan tüm öğelerle çalışılırken, Standard Precautions (Standart Önlemler) ve kurumsal düzenlemeler takip edilmelidir. Prosedürler uygun bir güvenlik kabininde ve gerektiği gibi havalandırılan bir alanda gerçekleştirilmelidir. İnoküle edilen flakonlar, cihaz test alanında HEPA filtreli hava ve negatif basınç sağlayan bir BACTEC 460TB aspiratörü bulunan bir BACTEC 460TB cihazında test edilmelidir. Kullanımdan önce her flakon; bulanıklık, kapağın kabarması / içe göçmesi gibi hasar, bozulma veya kontaminasyon belirtileri açısından incelenmelidir. Kontaminasyon belirtisi gösteren flakonları KULLANMAYIN. Kontamine flakonda pozitif basınç bulunabilir. Flakon kontaminasyonu gözle görülür olmayabilir. Hasar belirtisi gösteren flakonlar inokülasyon öncesinde atılmalıdır. Bazı durumlarda cam şişe çatlamış olabilir ve çevir-aç kapak çıkarılırken veya kullanım sırasında kırılabilir. Yine bazı durumlarda, flakon uygun şekilde kapatılmamış olabilir. Her iki durumda da, flakon içeriği özellikle flakonun ters çevrilmesi sırasında kaçak yapabilir veya dökülebilir Flakonlar inoküle edildiyse, sızıntı veya dökülmeye, patojen organizmaların/ajanların mevcut olabileceğini göz önünde bulundurarak, dikkatle müdahale edin. Atmadan önce inoküle edilen tüm flakonları otoklavlayarak sterilize edin. Örneğin kültür flakonlarına inokülasyonu sırasında gerçekleşebilecek sızıntıları en aza indirgemek için, kalıcı iğneleri bulunan şırıngalar veya Luer-Lok Marka Uç kullanın. Kontaminasyon Örnek alımı ve BACTEC flakonuna inokülasyonu sırasında örneğin kontamine olmasını önlemek için özen gösterilmelidir. Kontamine olan bir örnek pozitif okuma sonucu verir, ancak geçerli bir klinik sonuç değildir. Bu tür bir kontaminasyon, BACTEC iğneleri ve tüplerine uygun olmayan şekilde bakım yapılmasından, septumun yetersiz şekilde temizlenmesinden veya BACTEC iğne ısıtma birimindeki bir arızadan kaynaklanabilir (Cihaz Çalıştırma ve Bakım Kılavuzu na bakın). Bu tür bir değerlendirme, kullanıcı tarafından, geri kazanılan organizma türü, aynı organizmanın çoklu kültürlerde gözlenmesi, hastanın klinik geçmişi, uygun ekipman kontrolleri gibi faktörlere dayanarak gerçekleştirilmelidir. Saklama Talimatları BACTEC PZA Testi Ortamı flakonları, soğuk (2 25 ºC) ve kuru bir yerde saklanmalıdır. Her ambalajın dış yüzeyinde bulunan Son Kullanma Tarihi ni yazın ve ilk olarak en eski stoğu kullanın. Radyoaktif materyallerin saklama sırasında, sadece yetkili personelin erişebileceği kabinlerde depolanması iyi bir uygulamadır. Kabin, Dikkat: Radyoaktif Materyal uyarısı ile etiketlenmelidir. Materyali doğrudan parlak güneş ışığına maruz bırakmayın. Başlangıçta her flakonu mutlaka BACTEC 460TB cihazında test ederek flakon içinde %5 10 luk CO 2 atmosferi elde edin ve yüksek arkaplan okuma sonucu veren flakonları ayırın. İlk okuma sırasında flakon okuma sonucu GI 20 veya daha yüksekse bu flakonu atın. ÖRNEK HAZIRLAMA İzole, saf M. tuberculosis kültürleri BACTEC 12B Ortamında taze olarak çoğaltılmalı ve bu test için aktif gelişme fazındayken kullanılmalıdır. Eski, buzdolabında saklanan veya bir günden fazla tepe GI okuma sonucu veren kültürleri kullanmayın. PROSEDÜR Sağlanan Malzemeler BACTEC PZA Testi Ortamı Gerekli Fakat Sağlanmamış Malzemeler BACTEC PZA İlacı/Sulandırma Sıvısı Kiti (50 test) BACTEC 12B Ortamı= = = Bkz. "Ticari Takdim Şekli" BACTEC 460TB Cihazı Kalıcı iğne takılı tüberkülin şırınga 5 ml lik şırınga Dezenfektan çözeltisi %70 İzopropil alkol = 2

3 İlaç Ortamının Hazırlanması a. Liyofilize PZA ilacı özel bir PZA Sulandırma Sıvısıyla (RF) birlikte, ayrı olarak temin edilir. b. Flakon kapağını alkol swabıyla temizleyin. Liyofilize PZA flakonuna 5 ml RF yi şırınga kullanarak aseptik olarak ekleyin. İyice karıştırın. Tamamen çözüldüğünde, bu çözelti 4000 µg PZA/mL lik bir stok çözeltisi olacaktır. c. İnokülasyon öncesinde, flakon kapağını alkol swabıyla temizledikten sonra, 0,1 ml stok PZA çözeltisini her bir PZA ortamı flakonuna 1 ml lik şırınga kullanarak ekleyin. Son PZA konsantrasyonu 100 µg PZA/mL ortamdır. Önlemler: PZA yı su veya RF dışında herhangi bir seyreltim sıvısı kullanarak hazırlamayın. Flakon içindeki RF hacmi değişebilir. PZA tozunu sulandırırken elinizdeki flakondan tam olarak 5 ml alın. Duyarlılık testinin performansı açısından, ortama doğru miktarda test ilacının eklenmesi son derece önemlidir. 1 ml lik tüberkülin şırınga kullanarak tam olarak 0,1 ml stok çözelti ekleyin. Kontrolün Hazırlanması Herhangi bir ilaç içermeyen bir PZA Testi Ortamı kontrol olarak kullanılır. Kültürü inoküle etmeden önce kontrol flakonuna 0,1 ml RF ekleyin. RF, gelişim destekleyici bir madde olan polioksietilen stearat (POES) içermektedir. İnoküle edilen tüm flakonlarda RF bulunmalıdır. İnokülumun Hazırlanması Bu testi gerçekleştirirken sadece aktif olarak gelişmekte olan kültürler kullanılmalıdır. Aşırı çoğalmış, bekletilmiş veya başka bir ortamda geliştirilmiş kültürleri kullanmayın. a. Test kültürünün, her flakon için 0,1 ml RF ile zenginleştirilmiş bir BACTEC 12B Ortam flakonunda (Katalog No ) alt kültürü hazırlanmalıdır. b. Flakonu 37 C ± 1 C de inkübe edin ve her gün BACTEC 460TB cihazında test edin. c. Günlük GI a ulaştığında, bu flakonu duyarlılık testi için inokülasyonda kullanabilirsiniz. d. GI, dan yüksekse, taze 12B Ortamını başlangıç gelişme flakonuna aşağıdaki tabloya uygun şekilde ekleyin. Seyreltilmişse, seyreltim oranını daha sonra kullanmak üzere kaydedin. GI : Seyreltim yok GI : 1,0 ml 12B Ortamı ekleyin GI : 1,5 ml 12B Ortamı ekleyin GI : 2,0 ml 12B Ortamı ekleyin GI : 2,5 ml 12B Ortamı ekleyin GI : 3,5 ml 12B Ortamı ekleyin Kullanmadan önce iyice karıştırın. Tepe GI yı geçen, okuma sonucu 999 olan flakonları dikkate almayın. Testin İnokülasyonu a. Şırıngayı yerleştirmeden önce tüm kültür flakonlarının kapaklarını %70 alkol swabıyla temizleyin. b. 12B Ortamındaki test kültürünü kalıcı iğne takılı 1,0 ml lik tüberkülin şırınga kullanarak tamamen karıştırın. c. Kontrol ve PZA flakonlarına bu inokulumdan 0,1 er ml ekleyin. KÜLTÜRÜ KONTROL İÇİN diğer ilaçlarda (örn., isoniazid, streptomisin, etambutol, rifampin vs.) önerilen şekilde SEYRELTMEYİN. d. Kauçuk septumun kapağını uygun bir dezenfektanla dezenfekte edin ve daha sonra %70 alkol swabıyla temizleyin. NOT: Testi gerçekleştirirken flakonların işlenmesi sırasında dikkatli olunmalıdır. Flakon septumları kültür organizmalarıyla kontamine olmuş olabilir. İnkübasyon ve Test a. İnoküle edilen tüm flakonların (kontrol flakonları da dahil olmak üzere) %5 CO 2 atmosferine sahip oldukları inkübasyondan önce BACTEC 460TB cihazıyla test edilmelidir. Daha önce yapılmadıysa, flakonlar inokülasyondan hemen sonra test edilebilir. b. Flakonları 37 C ± 1 C de inkübe edin. c. PZA ve kontrol flakonlarını, kontrol flakonunun GI sı 200 veya daha fazla olana kadar her gün BACTEC 460TB cihazıyla test edin. Kalite Kontrolü Son kullanma tarihi geçen flakonları KULLANMAYIN. Çatlak veya hasar gözlenen flakonları kullanmayın. Flakonları uygun şekilde atın. = 3

4 BACTEC 460TB cihazının kalite kontrolüne ilişkin bilgi için BACTEC 460TB ve 460 ın Çalıştırma ve Bakım Kılavuzuna bakın. Diğer ilaç duyarlılık testlerinde olduğu gibi, inokulum kalitesi bu test için de son derece önemlidir. 12B Ortamında aktif olarak gelişmekte olan kültürlerin uygun seyreltimlerini kullanın. İdeal koşullarda, kontrol okuma sonucu 4 ila 7 gün içinde GI 200 olmalıdır. Kontrolde 4 günden kısa sürede 200 lük bir GI elde edilmesi, inokulumun çok yoğun olduğunu gösterir. Sonuçlar net değilse, test tekrarlanmalıdır. 200 lük GI sonucunun 7 10 günden daha uzun sürede elde edilmesi, inokulumun düşük kaliteye (yani düşük canlılık oranı, inokulumun düşük başlangıç GI okuma sonucu veya yetersiz seyreltim) sahip olduğunu gösterir ve sonuçlar hatalı olabilir. Kontrol ve ilaç flakonlarındaki GI, net sonuçlar elde edilene kadar dikkatle izlenmelidir. Şüpheli sonuç elde ettiğinizde testi tekrarlayın. İlaç flakonundaki GI, kontrolün %10 una çok yakınsa, flakonları 1 3 gün daha test edin. Bu şekilde test kültürünün duyarlılık özelliğine ilişkin bir değerlendirme yapmanız kolaylaşır. Sonuçlar yorumlanamıyorsa, testi BACTEC 12B Ortamında (Katalog No ) gelişen taze izolatla tekrarlayın. Duyarlılık kontrolü olarak daima H37Rv (ATCC 27294) ve direnç kontrolü olarak daima H37Rv PZA-R (ATCC 35828) kullanın. Gerekli kalite kontroller ilgili yerel, devlet ve/veya federal düzenlemeler veya akreditasyon gerekliliklerine veya laboratuvarınızın standart Kalite Kontrol prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kullanıcının, uygun Kalite Kontrol uygulamaları için ilgili NCCLS yönergelerine ve CLIA düzenlemelerine uyması önerilir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Cihaz, okumaları luk bir Gelişme Endeksi ölçeğine bağlı olarak doğrudan gerçekleştirir. Gelişme Endeksi ortamdaki organizmaların metabolik aktivitesinin bir ölçüsüdür. Kontrol flakonunun GI sı 200 veya daha fazla olduğunda, sonuçları aşağıdaki şekilde yorumlayın: ilaç flakonundaki GI kontrol flakonu GI sının < %9 u = Duyarlı ilaç flakonundaki GI kontrol flakonu GI sının > %11 i = Dirençli ilaç flakonundaki GI, kontrol flakonu GI sının %9 u ile %11 i (dahil) arasında = Sınır PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR Gelişme Endeksi sayısı ortamda gerçekleşen gelişme hızı ve miktarını yansıtır fakat koloni oluşturma birimi/ml yi kantitatif olarak belirlemek için kullanılmaz. Koloniyel morfoloji ve pigmentasyon özellikleri yalnızca katı besiyerinde belirlenebilir. GI çıktısına bağlı olarak yaklaşık %10 luk bir eşik değeri direnç veya duyarlılığın yaklaşık olarak tahminlenmesi için kullanılabilir. BACTEC PZA duyarlılık testi, sadece M. tuberculosis kompleksi izolatları için önerilmektedir. PZA veya duyarlılık testi yönteminin, tüberküloz (MOTT) dışındaki mikobakterler için kullanılabilirliği bilinmemektedir. BEKLENEN DEĞERLER Kontrol flakonunun GI değerinde kademeli bir artış gözlenmesi gerekir. Test flakonundaki GI aynı kalabilir veya test organizmalarının duyarlılığına bağlı olarak artabilir veya azalabilir (bkz. örnek 1 ve 2). Genellikle BACTEC sonuçları 4 ila 7 gün içinde alınabilir. Zaman zaman yavaş gelişen kültürlerin sonuç vermesi daha uzun sürebilir. 4 günden kısa veya 21 günden uzun sürede elde edilen sonuçları yorumlamayın. Örnek 1: PZA Duyarlılığı Günlük GI Okuma Sonuçları GI İlacı GI Kontrolü % Sonuçlar: Kontrol x 100 = %0,8 Duyarlı İlaç < %9 475 Örnek 2: PZA Direnci Günlük GI Okuma Sonuçları Günlük GI Okuma Sonuçları GI İlacı GI Kontrolü % Sonuçlar: Kontrol x 100 = %86,5 Dirençli İlaç > % PERFORMANS ÖZELLİKLERİ ph ı 6,0 olan modifiye 7H12 ortamını temel alan radyometrik BACTEC 460TB tekniği, şu ana kadar National Committee for Clinical Laboratory Standards tarafından önerilen tek kültür bazlı PZA duyarlılığı testi yöntemidir. 14,15 Pfyffer ve ark. tarafından M. tuberculosis in PZA ya duyarlılığının test edildiği bir çalışmada, BACTEC 460TB PZA Ortamı ve İlacı, BACTEC MGIT 960 PZA Ortamı ve İlacıyla karşılaştırıldığında sonuçlar %96 dan daha fazla benzerlik = 4

5 göstermiştir. BACTEC 460TB PZA testi için gelişme endeksi (GI) 200 olan radyometrik alt kültür elde etmek için gerekli süre hariç ortalama sonuç alma süresi 5,4 gündür. 14 TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ Kat. No. Açıklama BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 ml, 10 luk kutu BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 test) BACTEC 12B Medium BACTEC 460TB Instrument REFERANSLAR NK= dêçëëi=tk=jk=~åç=gkik=e~ïâáåëi=nvurk= o~çáçãéíêáå=ëéäéåíáîé=áåüáäáíáçå=íéëí=ñçê=çáññéêéåíá~íáçå=çñ= jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáëi=jóåçä~åíéêá~=äçîáëi=~åç=çíüéê=ãóåçä~åíéêá~k =gk=`äáåk=jáåêçäáçäki=onwrsrjrsuk= OK= jáççäéäêççâi=dk=éí=~äk=nvtt= ^ìíçã~í~ääé=ê~çáçãéíêáå=çéíéåíáçå=çñ=öêçïíü=çñ=jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáë=áå= ëéäéåíáîé=ãéçá~k =^ãéêk=oéîk=oéëék=aáëk=nnrwnmssjnmsvk= PK= oçäéêíëi=dkak=éí=~äk= bî~äì~íáçå=çñ=íüé=_^`qb`=ê~çáçãéíêáå=ãéíüçç=ñçê=êéåçîéêó=çñ=ãóåçä~åíéêá~=~åç=çêìö= ëìëåééíáäáäáíó=íéëíáåö=çñ=jk=íìäéêåìäçëáë=ñêçã=~åáçjñ~ëí=ëãé~ê=éçëáíáîé=ëééåáãéåëk =gk=`äáåk=jáåêçäáçäk=nuwsuvjsvsk= QK= páççáèái=pkek=éí=~äk=nvunk= bî~äì~íáçå=çñ=~=ê~éáç=ê~çáçãéíêáå=ãéíüçç=ñçê=çêìö=ëìëåééíáäáäáíó=íéëíáåö=çñ= jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáëkò=gk=`äáåk=jáåêçäáçäk=npwvmujvnok= RK= _ìíäéêi=tkok=~åç=gklk=háäìêåk=nvuo= fãéêçîéç=ãéíüçç=ñçê=íéëíáåö=ëìëåééíáäáäáíó=çñ=jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáë= íç=éóê~òáå~ãáçékò=gk=`äáåk=jáåêçäáçäk=nswnnmsjnnmvk= SK= eéáñéíëi=ik_k=~åç=jk=ak=fëéã~åi=nvurk= o~çáçãéíêáå=ãéíüçç=ñçê=íéëíáåö=ëìëåééíáäáäáíó=çñ=ãóåçä~åíéêá~=íç= éóê~òáå~ãáçé=áå=teno=äêçíükò=gk=`äáåk=jáåêçäáçäk=onwommjomqk= TK= tçççäéói=`kik=~åç=ok=tk=pãáíüïáåâi=nvuuk= o~çáçãéíêáå=ãéíüçç=ñçê=éóê~òáå~ãáçé=ëìëåééíáäáäáíó=íéëíáåö=çñ= jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáë=áå=éöö=óçäâ=éåêáåüéç=_^`qb`=no_=ãéçáìãk =^åíáãáåêçäk=^öéåíë=`üéãçíüéêk= POWNORJNOTK= UK= p~äñáåöéêi=jk=~åç=ik=eéáñéíëi=nvuuk= aéíéêãáå~íáçå=çñ=éóê~òáå~ãáçé=jf`ë=ñçê=jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáë=~í= ÇáÑÑÉêÉåí=éeÛë=Äó=íÜÉ=ê~ÇáçãÉíêáÅ=ãÉíÜçÇK =^åíáãáåêçäk=^öéåíë=`üéãçíüéêk=pownmmojnmmqk= VK= p~äñáåöéêi=jk=éí=~äk=nvuvk= o~éáç=ê~çáçãéíêáå=ãéíüçç=ñçê=éóê~òáå~ãáçé=ëìëåééíáäáäáíó=íéëíáåö=çñ=jóåçä~åíéêáìã= íìäéêåìäçëáëk =oéëk=jáåêçäáçäk=nqmwpmnjpmvk= NMK= k~íáçå~ä=`çããáííéé=ñçê=`äáåáå~ä=i~äçê~íçêó=pí~åç~êçëk=ommnk=^ééêçîéç=dìáçéäáåé=jovj^ok=mêçíéåíáçå=çñ= ä~äçê~íçêó=ïçêâéêë=ñêçã=çååìé~íáçå~ääó=~åèìáêéç=áåñéåíáçåëi=oåç=éçk=k``ipi=t~óåéi=m^k= NNK= d~êåéêi=gkpk=nvvsk=eçëéáí~ä=fåñéåíáçå=åçåíêçä=mê~åíáåéë=^çîáëçêó=`çããáííééi=rkpk=aéé~êíãéåí=çñ=eé~äíü=~åç= eìã~å=péêîáåéëi=`éåíéêë=ñçê=aáëé~ëé=`çåíêçä=~åç=mêéîéåíáçåk=dìáçéäáåé=ñçê=áëçä~íáçå=éêéå~ìíáçåë=áå=üçëéáí~äëk= fåñéåík=`çåíêçä=eçëéáí~ä=béáçéãáçäk=ntwrpjum= NOK=rKpK=aÉé~êíãÉåí=çÑ=eÉ~äíÜ=~åÇ=eìã~å=pÉêîáÅÉëK=NVVVK=_áçë~ÑÉíó=áå=ãáÅêçÄáçäçÖáÅ~ä=~åÇ=ÄáçãÉÇáÅ~ä=ä~Äçê~íçêáÉëI= eep=mìääáå~íáçå=e`a`fi=qíü=éçk=rkpk=dçîéêåãéåí=mêáåíáåö=lññáåéi=t~ëüáåöíçåi=ak`k= NPK= aáêéåíáîé=ommmlrqlb`=çñ=íüé=bìêçéé~å=m~êäá~ãéåí=~åç=çñ=íüé=`çìååáä=çñ=nu=pééíéãäéê=ommm=çå=íüé=éêçíéåíáçå= çñ=ïçêâéêë=ñêçã=êáëâë=êéä~íéç=íç=éñéçëìêé=íç=äáçäçöáå~ä=~öéåíë=~í=ïçêâ=eëéîéåíü=áåçáîáçì~ä=çáêéåíáîé=ïáíüáå=íüé= ãé~åáåö=çñ=^êíáåäé=nsenf=çñ=aáêéåíáîé=uvlpvnlbb`fk=lññáåá~ä=gçìêå~ä=iosoi=ntlnmlommmi=ék=mmonjmmqrk= = NQK= mñóññéêi=dkbki=ck=m~äáåçî~=~åç=pk=oωëåüjdéêçéëk=ommok=qéëíáåö=ëìëåééíáäáäáíó=çñ=jóåçä~åíéêáìã=íìäéêåìäçëáë=íç= éóê~òáå~ãáçé=ïáíü=íüé=åçåê~çáçãéíêáå=_^`qb`=jdfq=vsm=póëíéãk=gk=`äáåk=jáåêçäáçäk=qmwnstmjnstqk= NRK= k~íáçå~ä=`çããáííéé=ñçê=`äáåáå~ä=i~äçê~íçêó=pí~åç~êçëk=ommmk=qéåí~íáîé=ëí~åç~êç=joqjqok=pìëåééíáäáäáíó=íéëíáåö= çñ=ãóåçä~åíéêá~i=åçå~êçá~=~åç=çíüéê=~éêçäáå=~åíáåçãóåéíéëi=oåç=éçk=k``ipi=t~óåéi=m^k= = 5

6 = = 6