Yeni Nesil Dizileme Prensipleri

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Yeni Nesil Dizileme Prensipleri"

Tunç Ayhan
7 yıl önce
İzleme sayısı:

2 Yeni Nesil Dizileme Prensipleri Doç.Dr.Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

3 NGS Yeni Nesil Dizi Analizi Next Generation Sequencing Massively Parallel Sequencing Second Generation Sequencing Paired End Sequencing

Tarihçe En yaygın sekanslama teknolojisi Sanger sekanslama 1000-1200 bç HGP

ayrılıp sekanslama vektörlerine klonlanması Bireysel olarak okunan overlap

4 Tarihçe En yaygın sekanslama teknolojisi Sanger sekanslama bç HGP Shotgun sekanslama DNA nın enzimatik ya da mekanik olarak fragmanlara ayrılıp sekanslama vektörlerine klonlanması Bireysel olarak okunan overlap diziler sayesinde insanın tüm genomu dizilendi Massively Parallel Sequencing in temeli

Tarihçe 1977- Sanger sekanslama 1990- HPRT geni klonlandı 1996- ABI 310 piyasaya çıktı 1998-ABI 3700 piyasaya çıktı HGP çoğunlukla bu cihaz ile gerçekleştirildi 2001- ilk insan DNA sı konsensus

5 Tarihçe Sanger sekanslama HPRT geni klonlandı ABI 310 piyasaya çıktı 1998-ABI 3700 piyasaya çıktı HGP çoğunlukla bu cihaz ile gerçekleştirildi ilk insan DNA sı konsensus dizisi Sanger Lander et al., 2001; Venter et al., Roche İlk diploid insan genomu Craig Venter whole-genome shotgun sequencing Levy et al., İkinci diploid insan genomu James D Watson Roche 454 Wheeler et al., ,5 milyon $

6 Shendure J et al. Nature Biotechnology, 2008

7 NGS-2015 Steinbock LJ et al., Nanotechnology, 2015

8 NGS

9 İkinci Nesil Sekanslama Teknolojileri Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer 454 sequencing ABI SOLiD analyzer Illumina Genome Analyzer Solexa technology

10 Bench-top Sequencers

11 İllumina Solexa Teknolojisi

12 İllumina Solexa Teknolojisi

13 İllumina Solexa Teknolojisi

14 Sequencing By Synthesis (SBS) 3 5 Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases A T C A G T C T G C T A C G A Detect signal Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat G T C A G T A C C C G A T C G A All four labelled nucleotides in one reaction High accuracy Base-by-base sequencing No problems with homopolymer repeats T 5

15 Clonal Single Molecule Array Technology 40 MILLION CLUSTERS PER FLOW CELL 20 MICRONS 100 MICRONS

16 Base Calling T G C T A C G A T T T T T T T T G T

17 İllumina SBS Teknolojisi

18 MiSeq

19 Uygulamalar DNA Targeted Resequencing De Novo Sequencing Whole Exome Sequencing (WES) Whole Genome Sequencing (WGS) RNA Targeted Resequencing mrna Sequencing Small RNA Sequencing Total RNA Sequencing Methylation Sequencing

20 Hedef Zenginleştirme Metodları Meldrum C et al. Clin Biochem Rev 2011

21 MiSeq

22 MiSeq Örnek Hazırlama

23 Indeksleme

24 PCR-Sample Pooling Havuz 1 Havuz 2 Havuz 3 Havuz 4 Havuz

25 Pool 1 P o o l 1 Pool 2 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 HBB 3 PTPN11 4 MEFV 5 SRD5A2 6 OXT 7 OXT 8 OXTR 9 NPC1 10 GCK 11 MC4R 12 NPC2 13 CFTR 14 VHL 15 LOXL1 16 HNF1A 17 BCKDHB 18 SLC6A8 19 CD40 20 CD40L 21 BRCA1 22 BRCA2 23 EPM2A 24 RET 25 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 HBB 3 PTPN11 4 MEFV 5 SRD5A2 Pool 2 P o o l 2 Pool 3 22 BRCA2 23 EPM2A 24 RET 25 Grup No GEN ADI 1 BTD 2 HBB 3 PTPN11 4 MEFV 5 SRD5A2 6 OXT 7 OXT 8 OXTR 9 NPC1 10 GCK 11 MC4R 12 NPC2 13 GBA 14 GDF6 15 LOXL1 16 HNF1A 17 GCDH 18 SLC6A8 19 CD40 20 CD40L 21 BRCA1 22 BRCA2 23 LPL 24 RET 25 WFS Grup No GEN ADI 1 BTD 2 AR 3 FGFR2 Pool 3 P o o l 3 24 RET 25 WFS Grup No GEN ADI 1 BTD 2 AR 3 FGFR2 4 MEFV 5 WFS1 6 OXT 7 OXT 8 OXTR 9 NPC1 10 GCK 11 MC4R 12 NPC2 13 CAV3 14 SF1 15 LOXL1 16 HNF1A 17 RMRP 18 TACİ 19 CTSK 20 BRCA1 21 BRCA2 22 SERPİNA1 23 EPM2A 24 ELA2 25 RET

26 MiSeq Örnek Yükleme

27 NGS Akış Şeması Sekanslama Görüntü işleme Okuma Alingment Varyant deteksiyonu Filtreleme

28 Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013

30 NGS Dosya Türleri Wangs S et al. Genomics and Informatics, 2013

31 NGS Dosya Türleri FASTAQ NGS raw datası FASTA sekans+kalite datası Wellcome Trust Sanger tarafından bulundu SAM/BAM Sequence Alignment/Map FASTAQ nun align edilmiş hali Varyant saptama algoritmalarına hazır format Kodlama şekilleri farklı

32 NGS Dosya Türleri VCF Variant Calling Format Align edilmiş dizideki varyantları gösterir Manifest dosyaya göre

33 MiSeq Kalite Kontrol

34 MiSeq Kalite Kontrol

35 MiSeq Kalite Kontrol

38 MiSeq Analiz

39 MiSeq Analiz

40 MiSeq Analiz

41 BRCA2 Geni K2729N

42 BTD Geni c.617_619delttg

43 Sistemik Artefakt

44 NGS ve Nadir Hastalıklar Booycott et al. Nat Rev Genet, 2013

45 Varyant Saptama Oranı WES Ortalama varyant WGS %90 veritabanlarında kayıtlı Ortalama 5 milyon varyant yeni Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013

46 Kalıtılan Mutasyon Algoritması Boycott et al. Nat Rev Genet, 2013

65 Üçüncü Nesil Sekanslama Helicos HeliScope Dünyadaki ilk DNA mikroskobu Pacific Biosciences SMRT (Single Molecule Real Time) sequencer DNA polimeraz flow cell e bağlı Her nükleotid eklenmesinde ışıma

66 Dördüncü Nesil Sekanslama Nanopore DNA sequencer Nükleotid etiketleme ve tespiti yok Ekzonükleazla kesilen baz nanopordan geçer Polimerizasyon yok 15 dakikada WGS Çok düşük maliyet Ku CS et al. Expert Rev. Med. Devices, 2013

67 Oxford Nanopore Technologies

Benzer belgeler

Sekansın Temelleri ve Sekans Bazlı Çalışma Doç. Dr. Fatih Özaltın Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Nefroloji Ünitesi Nefrogenetik Laboratuvarı TİGED-24 Nisan 2011 Dalaman Çekirdekte DNA kromatin