MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME"

Su Özhan
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME Can AYDOĞAN Klinik Pazarlama Müdürü Kasım 2011, Antalya 1

2 İÇERİK Mikrobiyal Genotiplendirme Diversilab çalışma adımları Sonuç değerlendirmesi Kütle Spektrometresi VITEK MS Sistem tanıtımı (demo) 2

3 Moleküler Tiplendirme Bir çok farklı yöntem mevcut Tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajları var Yöntem Yöntemseçimi seçimi Ayırım gücü ve tekrarlanabilirlik Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi Kurulum ve çalışma maliyetleri İhtiyaç ve gerekli olan beceri seviyesi Klinik laboratuarında kullanım için uygunluk ve otomasyon 3

Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi Kurulum ve çalışma

4 Bacterial Barcodes Bacterial Barcodes - Athens, Georgia / ABD Ekim 2006 da biomérieux tarafından satın alındı Nisan 2007 ECCMID / Munih te Diversilab lansmanı yapıldı Komple Enfeksiyon Kontrol Çözümü 4

5 Diversilab Ne işe yarar? Bakteri, küf ve mayaların genotiplendirmesini yapar - Köken tayini - Parmakizi tayini Neden suş genotiplendirmesi yapılır? Organizmaların gelişim ve yayılımlarının takibi amacı ile organizmaların genetik benzerliklerini ve değişimlerini ortaya koymak için 5 5

Parmakizi tayini Neden suş genotiplendirmesi yapılır?

6 Moleküler Tiplendirme Yöntemleri Kromo romoz zomal DNA Anal nalizi izi PCR REA PFGE REA-Prob RAPD AP-PCR DAF ERIC-PCR BOX-PCR RFLP Ribotyping AFLP Dizi Analizi MLST SLST REP REP--PCR (GTG)5 MLVA & VNTR ARDRA ITS (trna-pcr) SSCP TGGE & DGGE 6 DiversiLab 6

BOX-PCR RFLP Ribotyping AFLP Dizi Analizi MLST SLST REP

7 Filogenetik Sınıflandırma Vitek, API MicroSeq Riboprinting Riboprinter PFGE AFLP DiversiLab Genetik Farklılıklar: FAZLA AZ Teknik Ayırım: YÜKSEK DÜŞÜK 7

8 Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar Bilgi Yönetimi Sürveyans Önlem Müdahale HAI Tarama Çevre Kontrolü HAI Tanı Yapı, Organizasyon, süreç Salgın Yönetimi İletişim Eğitimi Düzenleyici Eylem Planı 8 8

9 Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar Bilgi Yönetimi Myla DiversiLab Sürveyans Önlem Müdahale HKE chromid MRSA, ESBL,VRE Hasta Tarama Hava: air IDEAL+ media Çevre Kontrolü HKE Tanı Yüzey: Count-tact Su: GVPC, BCYE, Slidex Legionella DiversiLab VITEK MS, VT2 (ID/AST), API, Media, Slidex, Etest BacT-Alert Vidas CDAB, Rota Yapı, Organizasyon, süreç Salgın Yönetimi İletişim Eğitim Eylem Planları Vikia Rota Adeno Nuclisens MRSA, KPC, RSV, bionexia, RSV Direct IF identification DiversiLab 9 9

VITEK MS, VT2 (ID/AST), API, Media, Slidex, Etest BacT-Alert Vidas CDAB, Rota Yapı, Organizasyon, süreç Salgın Yönetimi

10 DiversiLab bu adımları otomatize eder Bean, P., et al J Clin Micro 1999 Vol

11 Çalışma Prensibi Tekrarlayan diziler : Organizmaların DNA sında fonksiyonları bilinmeyen kısa DNA dizileri (35-40 bp) belirli bir düzende tekrarlanır. 1. rep-pcr primerleri genom boyunca aralara yayılmış olan spesifik tekrarlayan dizilere bağlanırlar. Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiye edilir. 2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler. Çeşitli boyutlarda bir çok banttan oluşan rep-pcr parmakizi profili oluşturulur. 3. Mikrobiyal klonların profilleri suşlara spesifiktir. Bu parmakizleri daha sonra mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri göstermede kullanılabilir

Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiye edilir. 2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler.

12 Çalışma Adımları II. I. İzole kültürden manuel DNA ekstraksiyonu yapılır. III. Thermalcycler da DiversiLab Parmakizi kitleri kullanılarak rep-pcr yapılır. IV. Biyoanalizör kullanılarak otomatik microfluidic elektroforez yapılır. İnternet tabanlı yorumlama yazılım programı ile kolay ve hızlı değerlendirme yapılır. Sonuç süresi = izole organizmadan ~4 saat 12 12

Biyoanalizör kullanılarak otomatik microfluidic elektroforez yapılır.

13 DiversiLab LabChip LabChip microfluidic elektroforez Elektroferogram Jel 13 13

14 Standardizasyon Standardize Parmakizi Kitleri Valide test protokolleri Kitlerde + / - kontrol lik ambalaj Uzun son kullanım tarihi Dondurma/çözme imkanı Teknik destek 14 14

15 Test Menüsü DiversiLab Acinetobacter Kit DiversiLab Listeria Kit DiversiLab Archaebacteria Kit DiversiLab Mycobacterium Kit DiversiLab Aspergillus Kit DiversiLab Mycoplasma Kit DiversiLab Bacillus Kit DiversiLab M. tuberculosis Kit DiversiLab Bifidobacterium Kit DiversiLab Propionibacterium Kit DiversiLab Campylobacter Kit DiversiLab Pseudomonas Kit DiversiLab Candida Kit DiversiLab Salmonella Kit DiversiLab Clostridium Kit DiversiLab Staphylococcus Kit DiversiLab C. perfringens Kit DiversiLab Streptococcus Kit DiversiLab Enterobacter Kit DiversiLab Bacterial Kit DiversiLab Enterococcus Kit DiversiLab Fungal Kit DiversiLab Escherichia Kit DiversiLab Serratia Kit DiversiLab Klebsiella Kit DiversiLab Francisella Kit DiversiLab Lactobacillus Kit DiversiLab Saccharomyces Kit 15 15

tuberculosis Kit 410963 DiversiLab Bifidobacterium Kit 410987 DiversiLab Propionibacterium Kit 410964 DiversiLab Campylobacter Kit 410988 DiversiLab Pseudomonas Kit 410965 DiversiLab Candida Kit

16 Yazılım Web tabanlı kullanıcı yazılımı Otomatik değerlendirme Kullanıcılara özel şifre Her an verilere erişim imkanı Veri kaybetme riski yok İstendiğinde farklı üniteler ile veri paylaşma imkanı Standart bmx kütüphaneleri ile hızlı identifikasyon imkanı Her zaman en güncel sürüm kullanımı Ücretsiz yazılım güncellemeleri 16 16

üniteler ile veri paylaşma imkanı Standart bmx kütüphaneleri ile hızlı

17 17 17

18 Sonuçlar 18 18

19 Sonuçlar 19 19

20 Sonuçlar Liste Dağılım 20 20

21 Standardize Kütüphaneler Mevcut kütüphaneler MRSA C. difficile Mycobacterium Küf Maya Candida Francisella E.coli Salmonella Gram + Gram - Geliştirilen kütüphaneler Acinetobacter VRE Non-Fermenter Coag-Neg Staph M. chelonae M. abscessus, M. avium M. intercellulare, tuberculosis M. Bovis, M. peregrinum M. septicum Candida glabrata Candida albicans Salmonella typhimurium Salmonella enterditis E. coli O157 O155 M

22 Mycobacterium Mycobacterium 22 22

23 Maya Maya 23 23

24 Escherichia coli 24 24

25 Yüksek tekrarlanabilirlik 30 günde 10 defa 2 E.coli O157H7 suşunun subkültürü yapıldı 70 C de 5 defa donduruldu Petriler 4 C de 7 ve 14 gün bekletildi Toplam 100 DNA ekstraksiyonu Altı farklı Biyoanalizör Üç farklı teknisyen Üç gün %1 den az varyasyon %99 200bp 4Kb Healy, et al. JCM Jan

26 Yüksek tekrarlanabilirlik %98 Üç farklı mikroorganizma Üç farklı teknisyen tarafından Üçer farklı DiversiLab Parmakizi kiti lotu ile çalışıldı ve < %2 varyasyon bulundu Healy, et al. JCM Jan

27 Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesi MRSA kronik otitli sağlık çalışanı 27 27

28 Erciyes Üniversitesi Moleküler Kongresi,

29 Erciyes Üniversitesi XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi,

30 GATA 30 30

31 GATA 31 31

32 Erciyes Üniversitesi XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi,

33 DiversiLab PFGE 24 Numune: 6 saat 33 33

34 Diversilab İzole kültürden ~4 saatte hızlı sonuç Web tabanlı arayüzü ile kolay kullanım Standardizasyon & Yüksek Tekrarlanabilirlik Otomatik Değerlendirme & Yorumlama Teknik Destek 34 34

35 Klinik Laboratuarı nda Genotiplendirme Türkiye de Diversilab Erciyes Üniversitesi Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Marmara Üni. Pendik Eği. Ve Araş. Hastanesi Çukurova Ü. Veterinerlik Fakültesi Mersin Üniversitesi Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Gaziantep Üniversitesi Koç Üniversitesi / Amerikan Hastanesi Hacettepe Ü., Süleyman Demirel Ü. (proje bazında) 35 35

36 FMLA ( Full Microbiology Lab Automation) Hastane Kaynaklı Enfeksiyonların Yönetimi Diversilab Numunenin Ekimi Kültür İdentifikasyon Antibiyogram Gram Boyama 36 36

37 KÜTLE SPEKTROMETRE 37

38 Kütle Spektrometresi Nedir? Kütle Spektrometresi numunenin temel içeriğinin belirlenmesinde kullanılan analitik bir tekniktir. MS prensibi yüklü moleküller oluşturup onların kütle yük oranını ölçerek kimyasal bileşiğin iyonizasyonu esasına dayanır. Doğrudan koloniden MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması. MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi 38

39 Modern Mikrobiyal Taksonomi: Proteomikler & Genomikler protein bacterial cell DNA genome proteome Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = , 2117] mass fingerprint DNA fingerprint % Intensity species definition & determination Mass (m/z) 39

40 Günümüzde Kullanım 24 saatlik kültür Manuel Ön-seçim VITEK 2 Sistemi API - Sistemi Manuel Ön-seçim yok Direnç Testleri Serolojik Testler Görsel Metodlar PCR MALDI-TOF MS SARAMIS Sadece 2 dakika 4 72 saat Mikroorganizma tanımlaması 40

41 biomérieux Kütle Spektrometre Tarihçesi Mayıs 2010: biomérieux tarafından satın alındı * SARAMIS: Mikrobiyal ID veritabanı (patentli SuperSpectra ) ve algoritmaları Haziran 2010: ile anlaşma yapıldı Mikrobiyoloji laboratuvarları için ortak kütle spektrometre geliştirilmesi MALDI-TOF teknolojisi Shimadzu tarafından bulunmuştur *SARAMIS = Spectral ARchive And Microbial Identification System 41

42 MALDI-TOF MS: Temel Prensip tespit ayırım İyon dedektörü Hareket alanı + elektrot hızlanma Hızlanma alanı iyonizasyon + + desorpsiyon matriks / analit kristallerii kuyucuk 42

43 İş akışı: Numune Hazırlığı (Adım 1) 48 pozisyonlu plak 0.3 µl Matriks solüsyonu eklenmesi Tek koloni veya süspansiyondan seçim ve transfer 43

44 İş akışı: Ölçüm (Adım 2) Otomatik spektrum eldesi ~60 sn. Sağlam protein iyonizasyonu ve moleküler ağırlık ölçümü P ow er % Intensity N egative V acuum <<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = Ionising Mass (m/z) 44

45 İş akışı: Analiz (Adım 3) Mikroorganizma tanımlaması Algoritma hesaplaması Veritabanı ile karşılaştırma 45

46 Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı peak paternlerinin oluşması Pantoea agglomerans Acinetobacter lwoffi Burkholderia cepacia Raoultella ornithinolytica Staphylococcus aureus Escherichia coli 4000 m/z

47 Sonuç Süresi İş akışı adımları Süre (dakika) n=5 n = 24 n = 96 izolat izolat izolat Plak Matriks Kurutma Okuma Sonuç süresi Toplam

48 Myla : Kullanım arayüzü MS-ID sonuç görüntülenmesi VITEK MS sonuçları 48

49 Çok hızlı tanımlama Kolay kullanım Maliyet etkin Kullanıcı dostu Sürekli genişleyen veritabanı ve geliştirmeler ile mükemmel performans LIS ve diğer laboratuvar sistemleri ile entegrasyon P ow er Ionising V acuum N egative 49

50 Türkiye de VITEK MS Marmara Ü. Pendik Eğit. ve Araş. Hastanesi 50

51 Sorularınız? 51

52 52

Benzer belgeler

Dilara YILDIRAN. Candida İzolatlarının Tür Düzeyinde. ve MALDI-TOF MS Sistemlerinin Karşılaştırılması. Mikr. Uzm.

Dilara YILDIRAN. Candida İzolatlarının Tür Düzeyinde. ve MALDI-TOF MS Sistemlerinin Karşılaştırılması. Mikr. Uzm. Candida İzolatlarının Tür Düzeyinde Tanımlanmasında Altın Standart Yöntem Olan rdna ITS1/2 Dizi Analizi ile VITEK 2 YEAST ID, API ID 32C ve MALDI-TOF MS Sistemlerinin Karşılaştırılması D i l a r a Y ı