GENETİK K TANI YÖNTEMLERİ

Transkript

1 GENETİK K TANI YÖNTEMLERİ Yrd.Do Doç.Dr.Ayşe e Gül G l ZAMANİ Selçuk Üniversitesi Meram Tıp T p Fakültesi Tıbbi Genetik AD, KONYA 1

2 GENETİK K TANI YÖNTEMLERY NTEMLERİ 1- Sitogenetik ve Moleküler ler Sitogenetik Tanı Yöntemleri I. Sitogenetik Tanı Yöntemleri 1. Klasik Sitogenetik Tanı Yöntemleri 2. Özelleşmiş Sitogenetik Tanı yöntemleri a. Kardeş kromatid değişimi imi (Sister( Chromatid Exchange= SCE) b. Mikronükleus kleus (MN) c. Frajil bölge tayini II. Moleküler ler Sitogenetik Tanı Yöntemleri 1.Akış karyotiplemesi(flow karyotyping) 2. Floresans in situ hibridizasyon (FISH) 3. Fiber FISH 4. Multicolor-FISH a. Spectral karyotyping (SKY) b. Multiplex-FISH (M-FISH) c. R-FISHR d. Cobra-FISH e.komparatif genomik hibridizasyon(cgh) 2. Moleküler ler Genetik Tanı Yöntemleri I. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) II. Allel-özg zgü oligonükleotid analizi (Allele( Allele-specific oligonucleotid= = ASO) III. DNA dizi Analizi IV. Mikroarray Analizi 2

3 Kromozomlar mitotik/mayotik metafaz Spontan olarak bölünen dokularda Kültürde bölünmeleri için uyarılan hücrelerde 3

4 Spontan olarak bölünen hücreler: Kemik iliği Lenf nodülleri Solid tumorler Bazı plevral ya da asidik sıvılar Fetal asitler Kistik higroma Fetus ya da yeni doğan kanı 4

5 Spontan olarak bölünme hızı düşük olan hücreler: Kan lenfositleri Amniyon sıvısı Koryonik villuslar Deri ve fibroblast içeren diğer dokular 5

6 HÜCRE (DOKU) KÜLTÜRÜ Kısa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat) Örn: Kemik iliği, kan Uzun süreli kültür (1-3 hafta) Örn: Amniyon sıvısı, deri ve diğer dokular... 6

7 Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkı maddeleri (Kültür Ortamı): 1. Besi Yerleri (=Vasat) Dengelenmiş tuz solüsyonu ile hazırlanırlar Hanks ya da HBSS ozmotik basınç ve ph kontrolü Glukoz hücreler için enerji Medyumlar TC Medium 199 Minimal Esential Medium (MEM) McCoy s 5A Nutrient Ham s F-10 RPMI-1640 gibi Daha spesifik besi yerleri. Örn: Chang Leibovitz L15 7

8 Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkı maddeleri (Kültür Ortamı): 2. Antibiyotik Penicillin amphotericin streptomycin BAKTERİ nystatin MANTAR 3. Serum Dana serumu (FBS) Sığır fetusu serumu (FCS) Hücre büyüme faktörleri, adhezyon faktörleri, iz elementler, hormonlar,vitaminler 4. L-Glutamin Çoğunlukla besi yerinin içinde hazır 8

9 5. Mitoz uyaranı =Mitojen: EBV(Epstein Bar Virus), Pokeweed mitojen (PWM), Phorbol ester (TPA) En çok kullanılan mitojen : Phytohemagglutinin insan periferik kan kültüründeki olgun lenfositleri uyararak onları bölünmeye teşvik eder. 9

10 KROMOZOM ELDESİ ve PREPARATLARIN HAZIRLANMASI (HARVESTING) * 2 saat önce Kolşisin ya da Demekolsin (mitozu durdurmak için) sıvı faz * Santrifüj hücre fazı * Hipotonik Muamelesi M KCl, % 0.95 lik Na Sitrat * Fiksatif Muamelesi: (3 Metanol : 1 Asetik Asit) X 3 kere * Lamlara yayma ve kurutma 10

11 G-Bandlama Most common method used Chromosomes treated with trypsin denatures protein Giemsa stain each chromosome characteristic light and dark bands 400 bands per haploid genome Each band corresponds to 5-10 megabases Dark bands are gene poor 11

12 İdiyogram 12

13 ISCN International System for Human Cytogenetic Nomenclature Kromozomların herbir bölgesinin numaralandırılmas lması Sentromere (proximal) en yakın n bölgeler b için i in en küçük üçük Sentromere (distal) en uzak bölgeler için i in en büyük b numaralar 13

14 HRB-Bandlama Bandlama Yüksek çözünme 800 band prometafaz kromozom Metotreksat ve Kolşisin kullanılır 14

15 Q-Bandlama Özellikle Y kromozomu anomalilerinde ve mozaisizim tanısında nda kullanılır G-band benzeri bandlar elde edilir.fakat polimorfizmler saptanamaz Floresans mikroskop gereklidir. 15

16 R-Bandlama X kromozom anomalilerini tanımlamak için i in kullanılır Kromozomlar giemsa ile bandlanmadan önce ısıya tabii tutulur Açık k ve karanlık renkteki bandlar terstir. 16

17 C-Bandlama Sentromerleri ve heterokrometini tanımlamak için i in kullanılır. Heterokromatik bölgeler Tekrarlayan diziler içerir Oldukça kondanse kromatin fiberleridir. 17

18 NOR-Bandlama Gümüş (NOR)boyama: Nukleolar organizasyon bölgeleri b ve akrosentrik kromozomların n ikincil boğumlar umları boyanır. 18

19 Kardeş kromatid değişimi imi İki hücre h döngd ngüsü boyunca kromatidleri ayırma fırsatf rsatı veren BrdU (bromo-deoxy- uridine) ) kültk ltür r ortamına eklenir. Sadece bir zincirde DNA BrdU almış ışsa normal karanlık Giemsa boyaması olur, diğer er zincir daha açık a renkle boyanır. Eğer er değişim im gerçekle ekleştiyse, kromatid parça a parça a açık a k ve koyu renklerde görülür: g r: "harlequin kromozomları. 19

20 Kardeş kromatid değişimi imi 20

21 Mikronükleus kleus tekniği 21

22 Frajil bölge tesbiti 22

23 Akış Karyotiplemesi Ultrasonik titreşim başlığı Hücre süspansiyonu Koruma sıvısı dedektörler ANALİZÖR pozitif yüklü tek floresan hücre içeren damlalar Nonfloresan negatif yüklü tek hücre içeren damlalar Hücre toplayıcı Hücre toplayıcı 23

24 Akış Karyotiplemesi Kromozom sayısı Floresan oranı 24

25 Floresans In Situ Hibridizasyon FISH Hedefin hazırlanması Probun hazırlanması Denaturasyon Hibridizasyon Hibridizasyon sonrası yıkama Kromozomların boyanması Floresans mikroskobi 25

26 Tüm m Kromozom Boyama Probları (Kromozom Painting Prob ) Chromosome 8 painting probe 26

27 Sentromer Spesifik Problar kromozom 7 sentromer spesifik signal kromozom 8 sentromer spesifik signal 27

28 Lokus Spesifik Problar Tek Gen Probları DiGeorge Sendromu (22 de mikrodelesyon) 22q13 e özgü kontrol sinyali 22q11.2 ye özgü DiGeorge probu SRY lokus spesifik prob kullanılarak yapılmış FISH örneği. SRY/X probu kullanıldı. X kromozomu SRY 28

29 Telomerik Problar: 29

30 Fiber FISH 30

31 Spektral Karyotipleme (SKY) 31

32 Multiplex FISH Akciğer kanseri hücre h dizilerinde 5-florokrom5 M-FISH karışı ışımı ile hibridizasyon sonrası A)gerçek ek renk metafazı,, B) sınıflands flandırılmış renk sunumu 32

33 Multiplex FISH C). Karyotip 33

34 Cobra FISH İnsan nsan COBRA FISH prob seti ile elde edilen 12-renk imajı. Sadece üç adet florokrom kullanılarak larak yapılan oranlı işaretleme(deac, Cy3 and Cy5 ). Beyaz ok klasik sitogenetik yöntemlerle tesbit edilemeyen bir translokasyonu göstermektedir

35 R x FISH=Cross Cross-speciesspecies colour FISH

36 Karşı şılaştırmalı genomik hibridizasyon= comparative genomic hybridization (CGH): 36

37 Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon(cgh): Hasta dokunun DNA sı (TEST) İşaretleme (Kırmızı Floresan) Normal doku DNA sı (KONTROL) İşaretleme (Yeşil floresan) Normal metafaz kromozomu ile hibridizasyon (log2 ratio) Amplifikasyon Delesyon 37

38 Karşı şılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH): CGH-metafaz plağı Test DNA sı ile hibridizasyon *Test DNA FITC/yeşil *Referans DNA Rhodamine/kırmızı 38

39 Karşı şılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH): CGH- karyotip Aynı metafazın CGH karyogramı(bir önceki slayt 39

40 Karşı şılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH): CGH idiyogramları 40

41 Karşı şılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH): normal kazanım kayıp 41

42 Polimeraz zincir reaksiyonu(pzr) Çift zincir DNA Isıyla zincirlerin Primerlerin ayrılması hibridizasyonu DNA polimeraz +datp, +dgtp, +TTP, +dctp Primerlerden DNA sentezi 1.basamak 2.basamak 3.basamak Birinci siklus Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer DNA sentezi DNA sentezi Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer DNA sentezi DNA oligonükleotid primerler Amplifiye edilecek olan cift zincirli kromozomal DNA bölgesi (hedef bölge) Birinci siklus İki adet cift sarmal DNA molekülü sentezlenir İkinci siklus Dört adet cift sarmal DNA molekülü sentezlenir Üçüncü siklus Sekiz adet cift sarmal DNA molekülü sentezlenir 42

43 PZR'nin genetikte kullanım alanları: Onkogenezis araştırmalar rmaları, Kalıtsal tsal hastalıklarda taşı şıyıcının n ve hastanın n tanısı (mutasyon analizi), Prenatal tanı, Klinik örneklerde patojen organizmaların n saptanması, Adli tıp t p (DNA parmak izi araştırmas rması,vb), Prob oluşturulmas turulması/klonlama/gen ekspresyon arastırmalar rmaları, DNA dizi analizinde, büyük b k miktarda DNA örneklerinin oluşturulmas turulmasında, Bilinmeyen dizilerin tayininde, Geçmi miş DNA'nın n incelenmesinde, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analizinde, Invitro fertilizasyon yapılan lan tek hücrede, h implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmas lması, DNA protein interaksiyonunun araştırılmas lmasında (footprinting( footprinting) kullanılabilir. labilir. 43

44 Allel-özg zgü oligonükleotid (ASO) Hibridizasyon Hatalı eşleşme Hibridizasyon yok Genotip Hatalı eşleşme Hibridizasyon yok Hibridizasyon Genotip 44

45 45 Allel-özg zgü oligonükleotid (ASO) hastalar heterozigot Homozigot Homozigot Homozigot Homozigot heterozigot heterozigot heterozigot

46 DNA Dizi Analizi: 46

47 DNA Dizi Analizi: 47

48 Mikroarray Analizi Hedef mrna hazırlanması RT/PCR Floresan boyalarla işaretleme Microarray oluşturulması Eşit oranda birleştirme Hedef karışım mikroarray ile hibridize edilir tarama Verinin analizi 48

49 Mikroarray analizi 49

50 Mikroarray analizi 50