Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý

Transkript

1 Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý Mahmut KÖMÜRCÜ*, Hüseyin ÖZKAN** * GATA Ortopedi ve Travmatoloji AD / Ankara, Doç. Dr. ** GATA Ortopedi ve Travmatoloji AD / Ankara, Yrd. Doç. Dr. Canlýlarda kendilerini yenileme ve farklýlaþma (plastisite) kabiliyeti bulunan hücrelere kök hücre denir. Bu konuda ilk önemli öngörü Alman bilim adamý Carl Rudolph Wirchow'un 1800'lü yýllarýn baþýndaki "Omnis cellula e cellula = tüm hücreler baþka hücrelerden geliþir" yaklaþýmýdýr (1). Ülkemizde bu konuda öncü sayýlayabilecek ilk hücre kültürü çalýþmalarý sýðýr vebasý ve þarbona karþý yeni aþý metotlarý da geliþtirmiþ olan Ord. Prof. Dr. Süreyya Tahsin Aygün'e aittir. Aygün 1971 yýlýnda "örneðin kalp kültür hücresi enjekte edilen bir organizmada, kalbe yerleþiyor. Hücreler 2-7 ay içinde geliþiyor, gün içinde de hasta organý yeniliyor" diyerek zamanýnýn ötesinde bir yaklaþýmla hücrenin gücünü vurgulamýþtýr(1). Bu günkü manada ilk mezenkimal kök hücre (MKH) tanýmlamasý ise 1999 yýlýnda Pittenger ve arkadaþlarý tarafýndan yapýlan: "Kemik iliðinden köken alan ve uygun uyaranlarla üç temel seri; osteoblastik, adipositik ve kondrositik seriye farklýlaþabilen fibroblastoid hücrelerdir" tanýmýdýr (2). Kök hücreler çoðalabilen ve ihtiyaç duyulduðunda görev yapacak olan hücrelere farklýlaþarak olgunlaþmasýný saðlayabilen hücrelerdir. Bunun en iyi örneði döllenmiþ yumurtadýr ki vücuttaki tüm hücrelere dönüþebilme potansiyeli olan bu ilk embriyonel hücreye "totipotent" hücre denmektedir. Fertilizasyonun yaklaþýk beþinci gününde bu hücreler mezoderm endoderm ve ektodermden köken alan çok farklý hücre çeþidine dönüþebilme yeteneði olan "blastosist"e dönüþürler. Bu özelliðe sahip hücrelere de "pluripotent" hücreler denir. Hayatýn ilerleyen dönemlerinde yerleþtikleri dokunun hücre tipini üreten daha özelleþmiþ eriþkin tip kök hücreler ortaya çýkar. Kemik iliði kök hücreleri gibi olan bu hücrelere de "multipotent" hücreler denir (2,3,4). Kemik iliði kök hücreleri elde edilmesinin kolay olmasý, neoplastik diferansiyasyonun düþük olmasý, etik sorunlarýn olmamasý nedeniyle en fazla araþtýrma yapýlan ve klinik kullanýmý olan kök hücrelerdir. Kemik iliðinde hematopoetik kök hücreler, hemanjioblastlar, multipotent eriþkin progenitör hücreler ve mezenkimal kök hücreler (MKH) þimdiye kadar izole edilen kök hücrelerdir. Bunlar içinde MKH'ler mezodermal kaynaklý adipositler, osteoblastlar, kondrositler, tenositler, iskelet kas hücreleri ve visseral stromal hücrelere differansiye olabilmektedirler. Ancak MKH'ler bunun yanýnda ektodermal kaynaklý (nöronlar gibi) ve endodermal kaynaklý (hepatositler gibi) dokulara da diferansiye olabilmektedir. Biz bu yazýmýzda MKH'lerin, yapýlan çalýþmalar ýþýðýnda, kemik, kýkýrdak, tendon ve kas gibi dokularýn hastalýklarýnda kullanýlma potansiyelini deðerlendireceðiz.. Literatürde 2000 yýlý sonrasý döneme baktýðýmýzda mezankimal kök hücre biyolojisi, farklýlaþmasý ve tedavide kullaným çabalarýna ait çok sayýda yayýnla karþýlaþýyoruz. MKH'nin izolasyonu: MKH insanda genellikle süperior iliak kanattan alýnan kemik iliði aspiratýndan elde edilir (2,5,6). Ancak femoral ve tibial medullar kýsýmlarýndan (7,8) ve torasik ve lomber vertebralardan da elde edilebilirler (9). Büyük hayvanlarda benzer bölgelerden alýnýrken kemirgenlerde daha çok tibia ve femur mid-diafizinden alýnýr (10, 11). Kemik iliðinden elde edilen çekirdekli hücrelerin genç eriþkin dönemde 1/10.000, eriþkinde 1/ 'i ve 80 yaþýndan sonrada 1/ 'i ancak MKH'dir (12,13). Heparinize edilmiþ enjektöre alýnan kemik iliði aspiratý serum fizyolojik veya PBS ( Phosphate Buffered Saline) ile seyreltilerek fikol dansite gradiyent yöntemi ile mononüklear hücre ayrýmý yapýlýr. Fikol süpernatantýndan ayrýlan hücre çökeltisi %20-30 FBS (Fetal Bovine Serum) içeren DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) besiyerinde süspanse edilir. Hücre kültür flasklarýnda saat 37 C sýcaklýkta, %5 CO2 içeren humidifiye inkübitörlerde inkübe edilir. Bu süre sonunda süpernatant ve plastiðe yapýþmayan hücreler aspire edilerek uzaklaþtýrýlýr. Geriye kalan plastiðe yapýþmýþ hücreler kültüre edilmeye devam 130 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4

2 M. KÖMÜRCÜ, H. ÖZKAN edilir. Hücreler flask tabanýnýn %75'ini kaplayýnca tripsinasyon iþlemi yapýlarak yapýþan hücrelerin tabandan ayrýlmasý saðlanýr. Daha sonra hücreler bölünerek taze besiyerlerine ekilir. Ortalama 2-6 pasaj sonra yeterli sayýda hücre elde edilmiþ olur. Kullanýma hazýr hale gelen hücreler daha sonra çalýþýlmak üzere dondurularak -80 C ile -196 C de saklanýr (6, 14,15). MKH'nin Tanýmlanmasý: Elde edilen hücrelerin MKH olduklarýný gösterecek bir belirteç henüz ortaya konulamamýþtýr. Ancak bu iþlemlerin 7. günü sonunda oluþan fibroblast kolonileri sayýlýr, buna CFU-F (Coloni Forming Unit Fibroblast) ölçümü denir mononüklear hücre için 1 adet MKH olduðu kabul edilir. Flowsitometrik olarak MKH'ler hematopoetik hücrelerin en önemli belirteci olan CD45 ve CD34+'ü taþýmazlar (6, 15, 16). Fakat bu hücreler Thy-1 (CD90), CD106 (VCAM), ß-1 integrin CD29/CD49, CD10 ve CD13 gibi markerlarý ve PDGF, EGF, NGF ve IGF1 gibi reseptörleri taþýrlar (13). Ýmmun fenotipik karekteristikler ise primer hücrelerde deðil kültüre hücrelerde görünür olur. Bildirilen karakteristik markerlar SH-2, SH-3 ve SH-4 dür. Ancak bu markerlarýndan hiçbiri MKH'ler için spesifik deðilidir. Ek olarak MKH'ler HLA class-1'leride taþýrlar. MKH'lerin "lineage" (dizi) deðiþtirmesi - kemik, kýkýrdak ve yað doku- kullanýlan diðer bir fonksiyonel ayýrýcý yöntemdir. MKH'lerin bu özelliði bir çok laboratuar yöntemle gösterilmiþtir (6, 17,18). Kültüre edilmiþ MKH'ler ið þeklinde fibroblastik bir görünüme sahiptirler. Bunlarýn osteogenik aktivasyonu için ß-glycerol-phosphate, ascorbic acid-2- phosphate, dexamethasone ve fetal bovine serum içeren osteojenik diferansiasyon besiyeri kullanýlýr. Yaklaþýk üç haftalýk kültür sonucunda osteoblastik hücre görünümleri, kalsiyum birikimi ve alkalen fosfataz ekspresyonu göstermesi osteoblastik farklýlaþma olarak deðerlendirilir (19). Kondrojenik farklýlaþmayý göstermek içinde hücreler ilk pasaj sonunda polipropilen tüp içinde pellet oluþturacak þekilde santrifüje edilir, üzerine 10ng/ml TGF ß3 içeren kondrojenik besiyeri eklenerek dört hafta kültüre edilir. Bu durumda hücreler fibroblastik yapýlarýný hýzla kaybederler ve kartilaj spesifik ekstra sellüler matriks özelliði gösterirler. Hücre morfolojileri hýzlý þekilde deðiþiklik gösterir. Kültür sonunda Safranin-O boyasý ile diferansiyasyon deðerlendirilir (14,19). Adipojenik farklýlaþmayý ortaya koymak için ise hücreler 0.1µM deksametazon, 0.5 mm 3-izobutil - 1-metilksantin, 10 µg/ml rekombinant insan (rh) insülini, 0.2 mm indometazin ve serum içeren besi yeri ile kültüre edilir. Yaklaþýk 3-4 siklus sonunda Oil- Red O boyasý ile lipidden zengin vakuollerin intrasellüler birkiminin ortaya konmasý adipojenik diferansiasyonun gerçekleþtiðini gösterir. Ek olarak bu invitro farklýlaþmalar ciltaltýna yapýlan implantasyonlar ile invivo olarak da gösterilebilir (14,19). Görüldüðü gibi MKH'lerin tanýmlanmasýnda teknik sorunlar halen aþýlamamýþtýr. MKH plastisitesini göstermede bu teknik sorunlarý aþmak için bu gün çoðunlukla donör hücre markerlarý kullanýlmaktadýr (Y koromozom, GFP+ ve ß-gal + hücreler gibi). Ancak yalancý pozitif sonuçlar halen ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. MKH'lerin Ortopedide kullanýmý: Ýnvitro ve invivo diferansiasyon özellikleri olan bu hücreler için elbetteki tedavi edici bir bakýþ da oluþacaktýr. Özellikle ve öncelikle tedavisinde güçlük çekilen konular, dejeneratif ve progressif hastalýklarda kullanýmý akla gelmektedir. Bu amaçla otojenik yada allojenik kök hücreler lokal yada sistemik infüzyon tarzýnda uygulanmaktadýr. Özellikle MKH ile ilgili çeþitli alanlarda oldukça çok tedavi uygulamalarý görülmektedir. Bu geniþ uygulama alanlarý içerisinde kardiovasküler sistem hastalýlarý, miyokart infarktý (20,21), periferik arter hastalýlarý (22), akciðer fibrozisi (23), sipinal kord yaralanmalrý (24,25), dermatolojik hastalýlar, kas iskelet sistemi ve periferik sinirlerle ilgili çalýþmalar yapýlmaktadýr. MKH ve Kemik Tamiri: Kemik rejenerasyonu þu basamaklarla oluþur: 1.Osteogenezis; kemik iyileþmesinin tüm aþamalarýna katýlýr ve hücre transferi ile kemik oluþturma kapasitesini ifade eder. 2. Osteoindüksiyon; Kemik formasyonun indükleme kapasitesinde olan materyallerdir. En iyi bilineni DBM (demineralized bone matrix)'dir. Ancak DBM yalnýz baþýna deðil biyolojik aktif sitokinlerinlerle birlikte MKH'leri osteoblastik ve kondroblastik farklýlaþmaya veya MKH'leri çoðalmaya stimüle eder. 3. Osteokondüksiyon; kemik yapýcý hücreler (MKH ve onlarýn ürünleri) için skafold (destek yapý) saðlanmasýdýr. 4. Osteopromosyon; biyolojik ve mekanik 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 131

3 Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý Resim 1. A. Tavþan tibiasýna eksternal fiksatörün uygulanmasý. B ve C. Tibianýn ortaya konulmasý. D. Tibianýn osteotomize edilmesi. kolaylaþtýrýcý faktörlerin etkisi ile kemik iyileþmesi ve rejenerasyonunun saðlanmasýdýr. Bunun en güzel örneði PRP (platalet-rich plasma)'dýr. Plataletlerdeki? garanüller zengin TGF-ß (trans-forming growth faktör), PDGF (platalet-derived growth faktör), VEGF (vasküler endotelial growth faktör) ve IGF (insulin-like growth faktör) içermektedir (26, 27,28,29). MKH'lerin osteoblastik aktivitesini ve kemik formasyonuna katkýsýný gösteren çok sayýda yayýn vardýr. Çalýþmalar MKH'lerin invitro osteogenik potansiyelleri ortaya konulduktan sonra, invivo potansiyellerini ortaya koyan çalýþmalarda yapýlmaktadýr ( 30,31). Kültüre edilmiþ MKH veya yoðunlaþtýrýlmýþ kemik iliði aspiratlarý kullanarak yapýlan bu çalýþmalardan olumlu sonuçlar alýnmaktadýr. Taguchi ve arkadaþlarýnýn yapmýþ olduklarý çalýþmada kemik iliði hücrelerinin invivo migrasyonu ve kemik tamirine olan katkýsýný deðerlendirilmiþtir (32). Bu çalýþmada GFP-þimerik farelerin femurlarýnda oluþturulan kýrýklardan sonra kuyruk veninden kemik iliði hücreleri verilerek incelenmiþtir. Kýrýk bölgesindeki kallus dokusu içinde ve kemiðin çeperindeki hücrelerin hepsinin GFP pozitif olduðu yani osteoblastlara dönüþtüðü ve MKH'lerin kemik iyileþmesiyle kesin olarak ilgili olduðu gösterilmiþtir (32,33). Ural ve arkadaþlarýnýn GATA'da (Gülhane Askeri Týp Akademisi) yaptýklarý çalýþmada da tavþanlarýn her iki tibialarýnda defekt oluþturularak eksternal fiksatör uygulanmýþtýr (34) (Resim1). Tibialardan birinde defekt bölgesine MKH lokal olarak verilmiþ diðer tibia kontrol grubu olarak kullanýlmýþ ve hiçbirþey verilmemiþtir (Resim2). Uygulamanýn 15. günü ve bir ay sonra radyolojik olarak (Resim3, 4) ve birinci ay sonunda histokimyasal olarak (Resim5, 6) MKH uygulanan tarafta daha hýzlý iyileþme saðlandýðý ve eksternal fiksatörün tutulma süresinin kýsaldýðý gösterilmiþtir (34). Bu gün için kemik iyileþmesinde ve defektlerin kapatýlmasýnda osteoindüktif ve osteopromotif materyallerin gen ekspresyonu ile MKH'lerle kombine kullanýmlarý ve defektlerin kapatýlmasýnda skafoldlar ile MKH'lerin kombine edildiði çalýþmalar yapýlmaktadýr (35,36,37). Hideka ve arkadaþlarýnýn yapmýþ olduklarý bir dizi çalýþmada spinal füzyon oluþturulmak istenen ratlarda adenovirus vektör-bmp 7 ve adenovirus vektör-bmp 2 ile BMP 7 homodimerlerinin transfer edildikleri kemikiliði hücrelerinin uygulandýðý vertebral kýrýk bölgesinde %80 daha iyi Resim 2- A ve B. Osteotomi hattýna mezenkimal kök hücrelerin lokal olarak uygulanmasý. 132 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4

4 M. KÖMÜRCÜ, H. ÖZKAN Resim 3. MKH uygulanan grupta A. Radyolojik olarak osteotomi hattýnýn gösterilmesi. B. 15. gün radyolojik görünüm C. 1. ay radyolojik görünüm D. 1. ay sonunda makroskopik görünüm füzyon elde ettiklerini bildirmiþlerdir (38,39). Cunninghan ve arkadaþlarýnýn adenovirus vektör- BMP2-BMP7 heterodimerleri ile karþýlaþmýþ kemik iliði hücreleri uyguladýklarý ratlarda ise çok daha yüksek oranda füzyon saðladýklarýný bildirmiþlerdir (40). MKH'ler onlarý hedef bölgede tutan ve kemik defektlerinde osteokonduktif olarak kullanýlan doðal veya sentetik biomateryaller ile birlikte kullanýlmaktadýrlar (36,41). Kon ve arkadaþlarý defektif kýrýk oluþturulan koyun tibialarýna hidroksiapatit seramik taþýyýcýlar ile (HAC)+ kemik iliði derive osteoprogenitör hücreler uygulanmýþlardýr. Ýki ay sonra HAC verilenlerde dýþ yüzeyde minimal kemik formasyonu olurken, HAC + kemik iliði derive osteoprogenitör hücreler verilen defektlerde çok daha fazla kemik formasyonu olduðu gözlenmiþtir (42). Çalýþmalar kemik defektlerinin MKH ve skafoldlar ile tamir edilebileceðini göstermektedir ki bu da klinik olarak zaman içinde bu uygulamalarýn kansellöz otogreftlere alternatif olabileceðini göstermektedir (26,43). Ahn ve arkadaþlarý ise tavþanlarda proksimal tibiada fizis defekti oluþturmuþlar. Defekt bölgelerine TGF ß3 ile kültüre edilmiþ MKH implante etmiþler (44). Altý hafta sonra kontrol gruplarýnda 28-30º angulasyon gözlenirken MKH verilen tavþanlarda önemli bir angulasyon oluþmadýðý gözlenmiþtir. Fizis yaralanmalarýnýn tedavisinde MKH uygulamalarý yapýlacak yeni çalýþmalar ýþýðýnda alternatif bir tedavi olarak görünmektedir. Kýrýk kemik onarýmý ve rejenerasyonu yanýnda sistemik kemik hastalýklarýnda MKH kullanýmý ile ilgili çalýþmalardan da ümit verici sonuçlar alýnmaktadýr. Pereira ve arkadaþlarýnýn yapmýþ olduklarý çalýþmada osteogenezis imperfektelý farelere saðlýklý farelerden alýnan kemik iliði kök hücreleri infüze Resim 4. MKH uygulanmayan grupta A. Radyolojik olarak osteotomi hattýnýn gösterilmesi. B. 15. gün radyolojik görünüm C. 1. ay radyolojik görünüm D. 1. ay sonunda makroskopik görünüm 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 133

5 Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý Resim 5. Kontrol grubu 1. ay sonunda osteotomi bölgesinde yeni kemik formastonu izlenmemektedir ( H-E ).. Resim 6. MKH uygulanan grup 1. ay sonunda osteotomi bölgesinde yeni üretilmiþ kemik dokusu görülmektedir ( H-E ). edilmiþtir (45). Bu hücrelerin kemikte kollojen-1 üretimi ile kýsmen iyileþme saðladýklarý gösterilmiþtir. Horwitz ve arkadaþlarý da benzer bir çalýþmayý osteogenezis imperfektalý çocuklarda yapmýþlardýr. Bu çocuklara MKH verilmesini müteakip osteoblastik farklýlaþma ve kemik mineral dansitesinde artma olduðu gösterilmiþtir(46, 47). Tüm bu çalýþmalar MKH'ler ile kemik hastalýklarý ve kemik iyileþmesinde yeni tedavi ufuklarý açýlmakta olduðu görülmektedir. otogreftleme ve perikondral artroplastiler ideal tedavi yöntemleri deðildir(48). Bu nedenle kondral rejenerasyonu saðlayabilmek için kondrosit kültürleri yapýlarak eklem içine süspansiyonlarý enjekte edilmiþ veya çeþitli matrikslerde kondrositler uygulanmýþtýr(49). Ancak MKH'lerin kondrojenik diferansiyasyonlarýnýn gösterilmesi ile(2,16,17) kök hücreler hayvan modellerinde kondral lezyonlarýn tamiri için denenmeye baþlanmýþtýr(10, 45). GATA'da Ural ve arkadaþlarýnýn yapmýþ olduklarý çalýþmada invitro koþullarda farklýlaþtýrýlan MKH'ler ve oksidize selüloz tavþan kulaklarýnda oluþturulan defektlere implante edilerek günlerde tam kat biyopsilelerle deðerlendirilmiþtir. MKH verilen tavþan kulaklarýnda kondrosit ve kondroblast adacýklarý oluþmuþtur (Resim7). Böylece MKH implantasyonunun kýkýrdak defektlerinin onarýmýnda önemli yeri olabileceði gösterilmiþtir(50). Tatebe ve arkadaþlarý tam kat kondral defekt oluþturduklarý tavþan dizlerine emilebilir poly-glycolic-acid skafold (PGA) ile MKH uygulayarak ve 42. haftalarda deðerlendirmeler yapmýþlar. Makroskopik histolojik ve immünfloresan incelemeler ile MKH'lerin hem kondrojenik hemde osteojenik differansiasyonunu göstermiþlerdir. Ayný zamanda tam kat kartilaj oluþumunun da saðlandýðýný gözlemlemiþlerdir(51). Murfy ve arkadaþlarý da kondral defekt oluþturduklarý keçilerin dizlerine MKH enjekte ederek yaptýklarý deðerlendirmelerinde, MKH'lerin kondral bozulmada ilerlemeyi durduðunu bildirmiþlerdir(10). MKH'ler ile kýkýrdak tamirlerinde baþarýlý insan çalýþmalarý da bildirilmiþtir. Wakitani ve arkadaþlarý yüksek tibial osteotomi yapýlan osteoartritli 24 hastanýn 12'sinin dizine otolog MKH enjekte etmiþlerdir. MKH ve kartilaj tamiri: Kondral hasar daha çok spor yapan ve daha hareketli bir yaþam tarzýnýn oluþmasý, travmalar, sistemik hastalýlar ve yaþam süresinin uzamasý ile artan senil osteoartritler nedeniyle günümüzde adeta salgýn halini almýþtýr. Bu nedenle kartilaj tamiri ve rejenerasyonuna da ilgi artmýþtýr. Konvansiyonel yöntemler diyebileceðimiz artroskopik cerrahi giriþimleri (lavaj, dirilleme, mikrokýrýk), osteokondral 134 Resim 7. Oksidize selüloz ve MKH verilen tavþan kulaðýnda bir ay sonra oluþan kondroblastlar (H-E). TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4

6 M. KÖMÜRCÜ, H. ÖZKAN Resim 8. A. Tavþan menisküsünde tam kat vertikal defekt oluþturulmasý. B. Diz eklemi içine MKH verilmesi. Diðer 12 hastaya ise MKH uygulanmamýþtýr. Hastalar 42 hafta sonra artroskopik olarak deðerlendirildiklerinde enjeksiyon yapýlan hastalarda tüm defektleri kaplayan daha iyi sonuç gözlenmiþtir. Ancak klinik skorlar arasýnda fark gözlenmemiþtir(52). Kýkýrdak lezyonlarýn tedavisinde bu gün kullanmakta olduðumuz cerrahi yöntemlerin yetersiz sonuçlarý ve morbitidesi göz önüne alýnýrsa, kök hücre kullanýmýyla elde edilen sonuçlar gelecekte MKH'lerin iyi bir alternatif oluþturabileceðini göstermektedir(53,54). MKH ve menisküs tamiri: Menisküs diz eklemi biyomekaniðinde stabilizasyon, þok absorbsiyonu ve yük daðýlýmýnda ki etkisi nedeniyle önemli bir role sahiptir(55). Ancak semptomatik menisküs yýrtýklarýnda, özellikle avasküler olan iç 1/3 lük kýsýmda, halen tedavi cerrahi rezeksiyondur. Son zamanlarda MKH ile yapýlan çalýþmalar menisküs tamirinde de ümit verici sonuçlar bildirmektedir. Izuta ve arkadaþlarý çýkardýklarý tavþan menisküslerinde avasküler zonda tam kat defekt oluþturarak invitro þartlarda fibrin yapýþtýrýcý ile MKH uygulamýþlar, haftalarda yaptýklarý deðerlendirmeler ile kontrol gruplarýna göre MKH verilen menisküslerin tamir edildildiðini göstermiþlerdir. Böylece MKH'nin avasküler zonda oluþan lezyonlarý tamir edebildiðini ortaya koymuþlardýr56). Biz de GATA'da devam etmekte olan çalýþmamýzda tavþanlarýn her iki dizinde menisküs avasküler zonda 1.2 mm lik tam kat vertikal defekt oluþturduk. Dizlerden birine MKH enjekte ettik diðer dizi kontrol diz olarak kullandýk (Resim8). 3 hafta sonra çýkarttýðýmýz menisküslerin incelemesi sonucu MKH verdiðimiz tarafta defektlerin kontrol gruba göre makroskopik ve histolojik olarak daha fazla iyileþme gösterdiðini ön sonuçlar olarak gözlemledik (Resim9). Abdel-Hamid ve arkadaþlarýda menisküslerini çýkardýklarý köpeklerin dizlerine kemikiliði aspiratý vermiþler ve 3 ay sonra klinik ve histokimyasal olarak iyileþme bulduklarýný rapor etmiþlerdir(11). Murphy ve arkadaþlarý ise medial menisküsleri cerrahi olarak çýkarýlmýþ, ön çapraz baðlarý koparýlmýþ ve kýkýrdak lezyonu oluþturulmuþ keçilerin dizlerine mezenkimal kök hücre enjeksiyonu yapýlmýþlar. 12 ve 24 hafta sonra menisküslerin rejenere olduðu, kýkýrdak bozulmasýnýn durduðu, ön çapraz baðda ise iyileþme olmadýðýný gözlemlemiþlerdir(10). MKH'ler menisküs tedavisinde de önemli bir alternatif olarak görünmektedir. MKH ve tendon-kas tamiri: MKH'lerin kas ve tendonlar gibi diðer konnektif doku elemanlarýna diferensiasyonu ile ilgili çalýþmalar da yapýlmaktadýr. Tendon içi enjeksiyonlar bir çok hayvan çalýþmasýnda denenmiþ, olumlu Resim 9. A. Kontrol grubu tam kat menisküs defektinde iyileþme izlenmiyor. B. MKH verilen grup belirgin iyileþme mevcut Cilt: 5 Sayý: 3-4 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 135

7 Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý sonuçlar bildirilmiþtir. Chong ve arkadaþlarý tavþan aþil tendonlarýný tam kat keserek oluþturduklarý lezyonlarýn tamirinde intralezyonel MKH kullanmýþlardýr. Tendonlarýn iyileþmesinde MKH verilen grubun kontrol grubuna göre erken dönem daha hýzlý iyileþtiðini göstermiþlerdir (57). Dresler ve arkadaþlarýnýn yapmýþ olduklarý çalýþmada genç (1 yaþýnda) ve yaþlý (4 yaþýnda) tavþanlarýnýn aþil tendonlarýnda defekt oluþturulup MKH enjeksiyonu yapýlarak deðerlendirilmiþtir. Sonuç olarak enjeksiyondan 12 hafta sonra hayvanlarýn yaþ farkýndan baðýmsýz olarak her iki grupta da tendon iyileþmesinin saðlandýðý, tendon güçleri arasýnda fark olmadýðý ve tendon çevresinde oluþan ossifikasyonun hareketlere mani olmadýðý gösterilmiþtir (58). Bu gün için çalýþmalar tendon-tendon iyileþmesi kadar tendon- kemik iyileþmesiyle ilgilide yapýlmaktadýr. Lim ve arkadaþlarýnýn yapmýþ olduklarý çalýþmada tavþanlarda önçapraz baðýn tamirinde tibial yüzeyde tendon-kemik iyileþmesinde MKH uygulanmasýnýn iyileþmeye katkýda bulunduðu gösterilmþtir (59). Tüm benzer olumlu sonuçlara raðmen bu gün tendon dokusunun tamir kabiliyetinin sýnýrlý olmasý ve tendonlarda kemik dokulardaki gibi doku spesifik diferansiasyon faktörlerinin ortaya konulamamýþ olmasý çalýþmalarýn önünde aþýlmasý gereken zorluklardýr. Bu gün için MKH'lerin kas hücrelerine farklýlaþmasý ile ilgili çalýþmalar daha çok kardimyopatiler ve infarkt sonrasý miyokardýn rejenerasyonu ile ilgili yoðunlaþmýþtýr (20, 60,61). Bunlar yanýnda konjenital iskelet kasý defektleri ve myopatilerde de teorik olarak kullanýlabilmesi gerekmektedir. De Bari ve arkadaþlarý ilk çalýþmalarýnda invitro olarak MKH'lerin myojenik diferansiasyon kabiliyetlerini ve bunlarýn myopatilerde kullanýlma potansiyellerini göstermiþlerdi (62). Sonraki çalýþmalarýnda da Duchenne musküler distrofi oluþturulmuþ fýndýk farelerine MKH uygulamýþlar ve kas liflerini restore ettiðini göstermiþlerdir (63). Ramirez ve arkadaþlarý da çalýþmalarýnda MKH'lerin hangi hasarlanmalardan sonra dolaþýmda ölçülebilir miktarda arttýklarýný gönüllülerde araþtýrmýþlardýr. Ramirez kronik kas hastalýðý olanlarda ve atletlerde yarýþ sonrasý (iki saat içinde) erken dönemde kanda MKH'lerde saðlýklý kontrol gruplarýna göre anlamlý oranda artýþ olduðunu göstermiþlerdir (64). Biz bu gün için kas dokusunun kök hücrelerle tamir edilebildiðini biliyoruz. Bundan sonraki çalýþmalar kas dokusu tamirinde kök hücrelerin regülasyonunun ve düzenleyici diðer mekanizmalarla koordinasyonunun ortaya konulmasý ile ilgili olacaktýr (65). MKH ve Sinir Tamiri: Kök hücrelerden merkezi sinir sistemi ve periferik sinir sistemi üzerinde rejeneratif etkisini gösteren çalýþmalardan da ümit verici sonuçlar alýnmaktadýr. Gao ve arkadaþlarý siyatik sinirlerini hasarlandýrarak motor fonksiyon kayýplarýný gösterdikleri ratlara nöral kök hücre transplante etmiþler. Üç ay sonra bu ratlarda hedef kaslara uzanan aksonal yapýlarý göstermiþlerdir. Ancak bu yeni kolinerjik inervasyonun saðladýðý motor fonksiyon dönüþü parsiyel olmuþtur (66). Hofstetter ve arkadaþalarý spinal kord hasarý oluþturduklarý ratlarda yedi gün sonra intralezyonel ve lezyon çevresine MKH vermiþler. Yaptýklarý deðerlendirmede spinal kord hasarý sonrasý oluþan tamir dokusunda verilen MKH'nin engrafmanýný göstermiþlerdir (67). Park ve arkadaþlarý da komplet spinal kord hasarý olan altý hastada hasarlý bölgeye kemik iliði hücre nakli yapýlmýþtýr. Ameliyattan hemen sonra duyu almada iyileþmeler gözlenmiþ, önemli derecede motor iyileþmeler 3-7 ay sonra gözlenmiþtir. Spinal kord yaralanmalarýnda kemik iliði hücrelerinin tedaviyi yönetmekte güvenli bir yöntem olduðu sonucuna varýlmýþtýr (68). Deda ise yapmýþ olduðu çalýþmada 17 ve 2 yýl önce komplet spinal kord hasarý olmuþ iki hastaya lokal, intratekal ve intravenöz kemik iliði hücresi enjekte etmiþtir. 72 saat sonra duyuda dönüþ ve üç hafta sonra da motor fonksiyonlarda iyileþmeler bildirmiþtir (69). Park ve arkadaþlarý yapmýþ olduklarý çalýþmada hipoksik iskemiye cevap olarak ilk olarak dolaþýmda nöral kök hücrelerin arttýðýný ve iskemik bölgeye yerleþerek nöron ve oligodendrositlere dönüþtüklerini bildirmiþlerdir (70). Bu son çalýþmalarda göstermektedir ki kültür ortamýnda veya yaralanma bölgesinde progenitör hücreler nöral hücrelere farklýlaþmaktadýrlar. Sonuç: Son yýllarda MKH'lerin potansiyel klinik kullanýmlarý ile ilgili çok sayýda çalýþma yapýlmýþtýr. Ýnvitro olarak gösterilen, MKH'lerin farklýlaþma potansiyellerine dayanan bu çalýþmalar, büyük defektlerin kapatýlmasýndaki sorunlarýn aþýlmasý için doku mühendisliði çalýþmalarý ile kombine edilmiþtir. Bu konuda son yýllarda geliþtirilen bioreaktör uygula- 136 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4

8 M. KÖMÜRCÜ, H. ÖZKAN malarý ile hücreler scafoldlar içine sürekli olarak doldurulmakta, besin destekleri saðlanmakta ve spesifik fiziksel uyaranlarýn verilmesi ile doku büyüme ve geliþmesi elde edilmektedir (71). Ayrýca doku iyileþmesinin mekanizmalarý daha iyi anlaþýldýkça indüktif bir kýsým materyaller ile yapýlan kültürlerle veya gen transferi yöntemlerinin eklenmesi ile daha iyi sonuçlar bildirilmektedir. Bu gün gelinen noktada kök hücre uygulamalarý gelecekteki tedavi modalitelerini etkileyecek gibi görünmektedir. Ancak bu heyecan verici noktada MKH'lerin tedavide kullanýlabilmesi için henüz cevaplanmasý gereken çok sayýda soru ve yapýlmasý gereken uzun takipli klinik çalýþma sonuçlarýnýn görülmesi gerekmektedir. Bu ümit verici ve bakir alanda çalýþacak araþtýrmacýlarýn bu gün tedavisinde yetersiz kalýnan birçok soruna çözüm bulacaklarýný ümit etmekteyiz. Yazýþma Adresi: Yrd.Doç.Dr. Hüseyin Özkan GATA Ort. Ve Trav. AD Etlik / Ankara Eposta: heorto@yahoo.com Kaynaklar 1. Çetiner M: Hücresel Tedaviler Tarihi ve Süreyya Tahsin Aygün. 2. Ulusal Kök Hücre Kongresi Program ve Özet Kitabý, Trabzon, 2006, s: Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284(5411): Ural AU: Hematopoetik Kök Hücre. 2. Ulusal Kök Hücre Kongresi Proðram ve Özet Kitabý, Trabzon, 2006, s: Herzog EL, Chai L, Krause DS: Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood 2003, 102(10): Digirolamo CM, Stokes D, Colter D, Phinney DG, Class R, Prockop D J: Propagation and senescence of human marrow stromal cells in culture: a simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate. Br J Haematol 1999, 107: Deans RJ, Moseley AB: Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol 2000, 28: Murphy JM, Dixon K, Beck S, Fabian D, Feldman A, Barry F: Reduced chondrogenic and adipogenicactivity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis. Arthritis Rheumatism 2002, 46: Oreffo RO, Bord S, Triffitt JT: Skeletal progenitor cells and ageing human populations. Clinical Science 1998, 94: D'Ippolito G, Schiller PC, Ricordi C, Roos BA, Howard GA: Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research 1999, 14: Murphy M, Fink DJ, Hunziker EB, Barry FP: Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis. Arthritis Rheumatism 2003, 48: Abdel-Hamid M, Hussein MR, Ahmad AF, Elgezawi EM: Enhancement of the repair of meniscal wounds in the redwhite zone (middle third) by the injection of bone marrow cells in canine animal model. Int J Exp Pathol. 2005, 86(2): Caplan AI : The mesengenic process. Clin Plast Surg. 1994, 21(3): Fibbe WE: Mesenchymal stem cells. A potential source for skeletal repair. Ann Rheum Dis. 2002, 61 Suppl 2:ii Lodie TA, Blickarz CE, Devarakonda TJ, He C, Dash AB, Clarke J, Gleneck K, Shihabuddin L, Tubo R: Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow-derived stem cells reveals a lack of distinction. Tissue Engineering 2002, 8: Þahin F: Hematopoetik Kök Hücre. 2. Ulusal Kök Hücre Kongresi Proðram ve Özet Kitabý, Trabzon, 2006, s: Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM: Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002, 418: Muraglia, A., Cancedda, R., & Quarto, R.: Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. Journal of Cell Science 2000, 113: Barry F, Boynton R, Murphy M, Haynesworth S, Zaia J: The SH-3 and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2001, 289: Barry FP, Murphy JM: Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol. 2004, 36(4): Ozbaran M, Omay SB, Nalbantgil S, Kultursay H, Kumanlioglu K, Nart D, Pektok E.: Autologous peripheral stem cell transplantation in patients with congestive heart failure due to ischemic heart disease. Eur J Cardiothorac Surg. 2004, 25(3):342-50; discussion Stamm, C, Westphal B, Kleine HD, Petzsch M, Kittner C, Klinge H, Schumichen C, Nienaber CA, Freund M, Steinhoff G: Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003, 361: Durdu S, Akar AR, Arat M, Sancak T, Eren NT, Ozyurda U.: Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation for patients with Rutherford grade II-III thromboangiitis obliterans. J Vasc Surg. 2006, 44(4): Epub 2006 Aug Ortiz LA, Gambelli F, McBride C, Gaupp D, Baddoo M, Kaminski N, Phinney DG.: Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2003, 100: Deda H. Stem cell therapy in ALS patients: early results with a new technique Cell(y) News. September 2006 s:3 25. Attar A, Kaptanoglu E, Aydin Z, Ayten M, Sargon MF. Electron microscopic study of the progeny of ependymal stem cells in the normal and injured spinal cord.surg Neurol. 2005;64 Suppl 2:S Kraus KH, Kirker-Head C.:Mesenchymal stem cells and bone regeneration. Vet Surg. 2006, 35(3): Review 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 137

9 Mezenkimal Kök Hücre Ve Ortopedide Kullanýmý 27. Kerimoðlu S: Hematopoetik Kök Hücre. 2. Ulusal Kök Hücre Kongresi Proðram ve Özet Kitabý, Trabzon, 2006, s: A.M. Phillips: Overview of the fracture healing cascade. Injury, Int. J. Care Injured 2005, 36S; Wýlson EMK, Barbieri CH, Mazzer N: Bone healýng stýmulatýon by platelet-rých autogenous plasma. An experýmental study ýn rabbýts. Acta Ortop Bras 2006, 14(4): Otto W. R., J. Rao: Tomorrow's skeleton staff: mesenchymal stem cells and the repair of bone and cartilage.cell Prolif. 2004, 37: Javazon E. H., K. J. Beggs, A. W. Flake: Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging. Exp. Hematol. 2004, 32: Taguchi K, Ogawa R, Migita M, Hanawa H, Ito H, Orimo H: The role of bone marrow-derived cells in bone fracture repair in a green fluorescent protein chimeric mouse model. Biochem Biophys Res Commun. 2005, 27;331(1): Denise Shirley A, David Marsh A, Grant Jordan A, Stephen Mcquaid B, Gang Li: Systemic Recruitment Of Osteoblastic Cells Ýn Fracture Healing Journal Of Orthopaedic Research 2005, 23: Ural AU, Demiralp B, Avcu F, Yurttaþ Y, Canpolat E, Can B, Serdar M, Sarper M. : Allojenik mezenkimal kök hücrelerin tavþan tibial segmentel kemik defekti tamirinde kullanýmý. Turkish Journal of Hematology. Supplament 2004 ;Vol:21 (3): Logeart-Avramoglou D, Anagnostou F, Bizios R, Petite H: Engineering bone: challenges and obstacles.j. Cell. Mol. Med ;Vol 9, No 1: Montufar-Solýs D, Nguyen HC, Nguyen HD, Horn WN, Cody DD, Duke PJ: Using Cartilage To Repair Bone: An Alternative Approach Ýn Tissue Engineering annals Of Biomedical Engineering 2004,Vol. 32, No.3: Kadowaki A, Tsukazaki T, Hirata K, Shibata Y, Okubo Y, Bessho K, Komori T, Yoshida N, Yamaguchi: A Isolation and characterization of a mesenchymal cell line that differentiates into osteoblasts in response to BMP-2 from calvariae of GFP transgenic mice. Bone 2004, 34(6): Hidaka C, Goshi K, Rawlins B, Boachie-Adjei O, Crystal RG: Enhancement of spine fusion using combined gene therapy and tissue engineering BMP-7-expressing bone marrow cells and allograft bone. Spine 2003, 28(18): Zhu W, Rawlins BA, Boachie-Adjei O, Myers ER, Arimizu J, Choi E, Lieberman JR, Crystal RG, Hidaka C: Combined bone morphogenetic protein-2 and -7 gene transfer enhances osteoblastic differentiation and spine fusion in a rodent model. J Bone Miner Res. 2004, 19(12): Cunninghan ME, Bilgic S, Lawhorne T, RawlinsB, Crystal R, Boachie A O, Hidaka C.:Gene Mediated Anterior Spinal Fusion in the Rat. 53rd Annual Meeting of The Orthopaedic Research Society, San Diego CA USA 2007, PNo: Marion NW, Mao JJ: Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 2006, 420: Kon E, Muraglia A, Corsi A, Bianco P, Marcacci M, Martin I, Boyde A, Ruspantini I, Chistolini P, Rocca M, Giardino R, Cancedda R, Quarto R.: Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. J Biomed Mater Res. 2000, 49(3): Meinel L, Betz O, Fajardo R, Hofmann S, Nazarian A, Cory E, Hilbe M, McCool J, Langer R, Vunjak-Novakovic G, Merkle HP, Rechenberg B, Kaplan DL, Kirker-Head C.: Silk based biomaterials to heal critical sized femur defects. Bone 2006, 39(4): Ahn JI, Terry Canale S, Butler SD, Hasty KA.: Stem cell repair of physeal cartilage. J Orthop Res. 2004, 22(6): Pereira RF, O'Hara MD, Laptev AV, et al.: Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta. PNAS USA 1998, 95: Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, et al.: Transplantability and therapeutic effects of bone marrowderived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med. 1999, 5: Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WW, Fitzpatrick LA, Neel MD, McCarville ME, Orchard PJ, Pyeritz RE, Brenner MK.: Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta. Blood 2001, 97(5): Atik OS, Korkusuz F: Surgical repair of cartilage defects of the patella. Clin Orthop Relat Res 2001, (389): Krampera M, Pizzolo G, Aprili G, Franchini M.: Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone 2006, 39(4): Ural AU, Saray A, Can B, Avcu F, Çavuþoðlu T, Canpolat E.: Repair of cartilage defects by using in vitro differantiated mesenchymal stem cell in vivo: Experimental study in rabbits. Blood 2005,106 (11): 482a. 51. Tatebe M, Nakamura R, Kagami H, Okada K, Ueda M. :Differentiation of transplanted mesenchymal stem cells in a large osteochondral defect in rabbit. Cytotherapy 2005, 7(6): Wakitani S, Imoto K, Yamamoto T, Saito M, Murata N, Yoneda M.: Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. Osteoarthritis Cartilage 2002, 10(3): Mizuta H, Kudo S, Nakamura E, Otsuka Y, Takagi K, Hiraki Y.: Active proliferation of mesenchymal cells prior to the chondrogenic repair response in rabbit full-thickness defects of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage 2004, 12(7): Redman SN, Oldfield SF, Archer CW.: Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cell Mater 2005, 9: Kurzweil PR, Friedman MJ. : Meniscus: Resection, repair, and replacement. Arthroscopy 2002, (2 Suppl 1): Izuta Y, Ochi M, Adachi N, Deie M, Yamasaki T, Shinomiya R.: Meniscal repair using bone marrow-derived mesenchymal stem cells: experimental study using green fluorescent protein transgenic rats. Knee 2005 Jun, 12(3): Chong AK, Ang AD, Goh JC, Hui JH, Lim AY, Lee EH, Lim BH.: Bone marrow-derived mesenchymal stem cells influence early tendon-healing in a rabbit achilles tendon model. J Bone Joint Surg Am Jan, 89(1): Dressler MR, Butler DL, Boivin GP.: Effects of age on the repair ability of mesenchymal stem cells in rabbit tendon. J Orthop Res Mar, 23(2): Lim JK, Hui JH, Li L, Thambyah A, Goh J, Lee EH.: Enhancement of tendon graft osteointegration using mesenchymal stem cells in a rabbit model of anterior cruciate ligament reconstruction. Arthroscopy 2004, 20: TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 2006 Cilt: 5 Sayý: 3-4

10 M. KÖMÜRCÜ, H. ÖZKAN 60. Haudek SB, Xia Y, Huebener P, Lee JM, Carlson S, Crawford JR, Pilling D, Gomer RH, Trial J, Frangogiannis NG, Entman ML.: Bone marrow-derived fibroblast precursors mediate ischemic cardiomyopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A Nov 28, 103(48): Arguero R, Careaga-Reyna G, Castano-Guerra R, Garrido- Garduno MH, Magana-Serrano JA, de Jesus Nambo-Lucio M.: Cellular autotransplantation for ischemic and idiopathic dilated cardiomyopathy. Preliminary report.arch Med Res Nov, 37(8): De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P, Luyten FP. :Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane.arthritis Rheum Aug, 44(8): De Bari C, Dell'Accio F, Vandenabeele F, Vermeesch JR, Raymackers JM, Luyten FP: Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from synovial membrane. J Cell Biol 2003,160: Ramirez M, Lucia A, Gomez-Gallego F, Esteve-Lanao J, Perez-Martinez A, Foster C, Andreu AL, Martin MA, Madero L, Arenas J, Garcia-Castro J.:Mobilisation of mesenchymal cells into blood in response to skeletal muscle injury.br J Sports Med Aug, 40(8): Shi X, Garry DJ.: Muscle stem cells in development, regeneration, and disease. Genes Dev Jul 1, 20(13): Gao J, Coggeshall RE, Tarasenko YI, Wu P.: Human neural stem cell-derived cholinergic neurons innervate muscle in motoneuron deficient adult rats. Neuroscience 2005, 131(2): Hofstetter CP, Schwarz EJ, Hess D, Widenfalk J, El Manira A, Prockop DJ, Olson L.: Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.proc Natl Acad Sci U S A Feb 19, 99(4): Park HC, Shim YS, Ha Y, Yoon SH, Park SR, Choi BH, Park HS.: Treatment of complete spinal cord injury patients by autologous bone marrow cell transplantation and administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor.tissue Eng May-Jun, 11(5-6): Deda H. :Stem cell therapy in spinal cord injury: early good result of a new technique in 2 patients. Cell(y) News. September 2006, s:1 70. Park KI, Hack MA, Ourednik J, Yandava B, Flax JD, Stieg PE, Gullans S, Jensen FE, Sidman RL, Ourednik V, Snyder EY.: Acute injury directs the migration, proliferation, and differentiation of solid organ stem cells: evidence from the effect of hypoxia-ischemia in the CNS on clonal "reporter" neural stem cells.exp Neurol May, 199(1): Vunjak-Novakovic G, Martin I, Obradovic B, Treppo S, Grodzinsky AJ,Langer R, et al.: Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res 1999,17: Cilt: 5 Sayý: 3-4 TOTBÝD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliði Derneði) Dergisi 139