Transkript

1 1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ PROPOLİSİN U-937 İNSAN MAKROFAJ HÜCRELERİ ÜZERİNE SİTOTOKSİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Hazırlayan Ayşe SERT Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2011 KAYSERİ

2 2

3 3 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ PROPOLİSİN U-937 İNSAN MAKROFAJ HÜCRELERİ ÜZERİNE SİTOTOKSİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Hazırlayan Ayşe SERT Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2011 KAYSERİ

4 i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Ayşe SERT

5 ii PROPOLİSİN U-937 İNSAN MAKROFAJLARI ÜZERİNE SİTOTOKSİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI adlı Bitirme Ödevi, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı nda BİTİRME ÖDEVİ olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Danışman Ayşe SERT Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı Doç. Dr. Hatice Özbilge ONAY : Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

6 iii TEŞEKKÜR Bitirme ödevimin yürütülmesi süresince değerli emeklerini ve katkılarını esirgemeyen Danışman Hocam Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA ve Anabilim Dalı Başkanım Doç. Dr. Hatice ÖZBİLGE ye teşekkürlerimi sunarım. Ayşe SERT Kayseri, Mayıs 2011

7 iv PROPOLİSİN U-937 İNSAN MAKROFAJ HÜCRELERİ ÜZERİNE SİTOTOKSİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Ayşe SERT Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Mayıs 2011 Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA ÖZET Bu çalışmada, insan makrofaj hücreleri kullanılarak hücrelerin çoğaltılması, pasajlanması, dondurularak saklanması, hücre sayımı, canlılık kontrolü gibi hücre kültürünün temel aşamaları ile hücre kültür laboratuarı genel kurallarının öğrenilmesi amacıyla, sahip olduğu biyolojik aktivitelerden dolayı popüler bir araştırma konusu olan propolisin, makrofaj hücreleri üzerine sitotoksik etkisi araştırıldı. Bu amaçla, ATCC U- 937 insan makrofaj hücreleri kullanıldı. -80 C soğutucudan çıkarılan hücreler hızla çözdürülerek, % 10 fetal bovine serum ve % 2 penisilin-streptomisin ilaveli RPMI-1640 besiyerinde pasajlandı. Hücreler 37 C ve % 5 CO 2 li ortamda inkübe edildi ve düzenli aralıklarla pasajlandı. Her pasaj işleminde hücreler invert mikroskopta morfolojisi ve sayısı yönünden incelendi ve canlılığı tripan blue ile kontrol edildi. Deney için pasaj sayısı aralığındaki hücreler kullanıldı. 24 kuyucuklu hücre kültür plaklarında son hücre konsantrasyonu hücre/ml olacak şekilde, propolisin etanolik ekstresinin konsantrasyonları µg/ml arasında ikişer kat olacak şekilde ayarlandı. Hazırlanan plak 37 C de % 5 CO 2 li inkübatörde 24 saat inkübe edildi. Hücreler inkübasyonun 0., 6. ve 24. saatlerinde, trypan blue ile boyanarak ışık mikroskobunda canlılık oranı ve morfoloji yönünden değerlendirildi. İnkübasyonun 6. saatinde propolisin 128 µg/ml, 24. saatinde 64 µg/ml konsantrasyonundan itibaren hücrelerin canlılık oranında azalma, hücre zarında düzensizleşme ve sitoplazmada granülizasyon görülmeye başlandı. Bu çalışmada U-937 insan makrofaj hücrelerine propolisin doz ve zamana bağlı olarak toksik etkileri araştırılmış ve sonuçların propolisin makrofaj hücreleri üzerine etkileri ile ilgili çalışmalara yön vereceği düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Propolis, U-937 makrofaj hücreleri, sitotoksisite

8 v INVESTIGATION OF CYTOTOXIC EFFECTS OF PROPOLIS ON U-937 HUMAN MACROPHAGE CELLS Ayse SERT Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, June 2011 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA ABSTRACT In this study, basic stages of cell culture such as replicating, passaging and freezing the cells, cell count and control of viability by using human macrophage cells, and the cytotoxic effects on macrophages of propolis which is a popular research topic because of its biological activities were investigated in order to learn the general rules of cell culture laboratory. For this purpose, ATCC U-937 human macrophage cells were used. The cells which were taken out from -80 o C cooler and rapidly thawed were passaged at RPMI-1640 with 10 % foetal bovine serum and 2 % penicillin-streptomycin. The cells were incubated at 37 o C and in 5 % CO 2 atmosphere and were passaged at regular intervals. In each passage process the cells were examined in terms of morphology and numbers under the inverted microscope and viability was checked with trypan blue. For the experiment, the cells between 4th and 10th passages were used. That final cell concentration of 24-well cell culture plates is cells/ml, ethanolic extract concentrations of propolis is µg/ml and two layers were set up. The prepared plates were incubated at 37 o C and in 5 % CO 2 incubator for 24 hours. 0th, 6th and 24th hours of incubation, cells were stained with trypan blue and evaluated for viability and morphology under light microscope. In the 6th hour of incubation, concentration of propolis is 128 mg/ml, in the 24th hour of incubation it is 64 mg/ml. Beginning from these concentration rates reduction of the vitality of cells, disorders in cell membranes and granulisation in stoplasm were detected. In this study, the toxic effects of propolis depending on dose and time on the U-937 human macrophage cells were investigated and it was thought that the results will lead the studies related to the effects of propolis on macrophage cells. Key Words: Propolis, U-937 human macrophage cells, cytotoxicity

9 vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK...i KABUL ONAY...ii TEŞEKKÜR...iii ÖZET...iv ABSTRACT...v İÇİNDEKİLER...vi KISALTMALAR...viii ŞEKİLLER LİSTESİ...x 2. GENEL BİLGİLER PROPOLİS Propolis Hakkında Genel Bilgiler Propolisin Fiziksel Özellikleri Propolisin Kimyasal İçeriği Propolisin Bitkisel Kaynakları Propolisin Arılar ve İnsanlar Tarafından Kullanımı Propolisin Biyolojik Etkileri MAKROFAJ HÜCRELERİ Makrofaj Hücreleri Hakkında Genel Bilgiler Makrofaj Hücrelerinin İmmün Sistemdeki Yeri GEREÇ ve YÖNTEM DENEYDE KULLANILAN BESİYERİ VE SOLÜSYONLARIN HAZIRLANMASI Fetal Bovine Serum Penisilin Streptomisin Solüsyonu RPMI-1640 Besiyeri Hücre Dondurma Solüsyonu...19

10 vii Hücre Yıkama Solüsyonu U-937 MAKROFAJ HÜCRELERİNİN ÜRETİLMESİ Hücrelerin Çözdürülmesi Hücrelerin Pasajlanması Hücrelerin Canlılık Kontrolü Hücrelerin Dondurulması Hücrelerin Sayımı PROPOLİSİN HAZIRLANMASI Propolis Konsantrasyonlarının Hazırlanması DENEYİN YAPILIŞI BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR...35 ÖZGEÇMİŞ...42

11 viii KISALTMALAR GC-MS HPLC : Kütle spektrumlu gaz kromatografisi : Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ºC : Santigrat derece DMSO gr MİK L mg : Dimetil sülfoksit : Gram : Minimal inhibitör konsantrasyon : Litre : Miligram µm : Mikrometre µl : Mikrolitre ml : Mililitre µg : Mikrogram kg Ig TNF-α IL-1β C3b CD MHC NO : Kilogram : Immünglobülin : Tümör nekroz faktör-alfa : İnterlökin 1-beta : Kompleman 3b : Cluster of differentiation : Major histocompatibility complex : Nitrik oksit H 2 O 2 : Hidrojen peroksit PBS HIV ATCC CO 2 : Phosphate buffer saline : Human immunodeficiency virus : American type culture collection : Karbondioksit

12 ix FBS U mm UV dk mm mm 3 cm 3 : Fetal bovine serum : Ünite : Milimolar : Ultraviolet : Dakika : Milimetre : Milimetre küp : Santimetre küp DNA : Deoksiribonükleikasit nm Th : Nanometre : T helper TGF-β1 : Tümör growth faktör beta 1 spp : Alt türler IC50 : En yüksek inhibe edici konsantrasyonun yarısı MTT : 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide XTT OD C V :2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5- carboxanilide : Optik dansite : Konsantrasyon : Volüm

13 x ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1. Bal arısı Apis mellifera... 2 Şekil 2.2. Propolis... 3 Şekil 2.3. Kara kavak (Populus nigra) bitkisi... 7 Şekil 2.4. Arılar tarafından propolis üretimi için tercih edilen bitki örnekleri... 8 Şekil 2.5. Propolisin preparat örnekleri Şekil 2.6. Bağışık yanıtta yer alan hücrelerin morfolojisi, kökeni ve makrofajların bu sistemdeki yeri Şekil 3.1. Thoma lamı üstten görünüş Şekil 3.2. Thoma lamı sayım alanı Şekil 3.3. Deneyin yapılış şeması Şekil 4.1. Kontrol grubu hücrelerin invert mikroskobik görüntüleri Şekil 4.2. Propolisin 64 µg/ml konsantrasyonuna maruz kalan hücrelerin invert mikroskobik görüntüsü (6. saat) Şekil 4.3. Propolisin 64 µg/ml konsantrasyonuna maruz kalan hücrelerin invert mikroskobik görüntüsü (24. saat) Şekil 4.4. Propolisin 128 µg/ml konsantrasyonuna maruz kalan hücrelerin invert mikroskobik görüntüsü (6. saat) Şekil 4.5. Propolisin 256 µg/ml konsantrasyonuna maruz kalan hücrelerin invert mikroskobik görüntüsü (6. saat) Şekil 4.6. Propolisin 256 µg/ml konsantrasyonuna maruz kalan hücrelerin invert mikroskobik görüntüsü (24. saat) Şekil 4.7. Propolisin 512 µg/ml konsantrasyonuna maruz kalan hücrelerin invert mikroskobik görüntüsü (24. saat) Şekil 4.8. Trypan blue ile boyanan hücrelerin ışık mikroskobik görüntüleri Tablo 4.1. Propolisin makrofaj hücreleri üzerine etkilerinin mikroskobik değerlendirmesi... 26

14 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Doğal ürünler binlerce yıldır insanlar arasında birçok hastalığın tedavisinde kullanılagelmiştir. Propolis de bu doğal kaynaklı ürünler arasında yerini almaktadır. Sağlıklı bir yaşam için alınması gereken birçok besin kaynağını bünyesinde bulundurması, kolaylıkla elde edilebilir olması ve toksik etkisinin olmaması bakımından mükemmel bir doğal ilaç olma özelliğini kazanmıştır. Buradan yola çıkılarak insanlar propolisi öncelikle, arıların kullanım amaçlarına benzer ihtiyaçlarla kullanmaya çalışmış, zamanla propolisin sahip olduğu zengin bileşik içeriğinin spesifik etkilerinin araştırılmasına yönelmişlerdir. Günümüzde propolisin antimikrobiyal, antioksidan, antitümöral, antiinflamatuar gibi biyolojik aktivitelere sahip olduğu bilimsel çalışmalarla gösterilmiştir (1). Hücre ve doku kültürü çalışmaları, aşı üretimi, çeşitli ilaçların hücre siklusuna etkisi, enfeksiyon ve kanser araştırmaları, sitotoksisite çalışmaları, çeşitli enzim ve hormonların üretimi, ilaç hammaddesi olarak bitkilerden etken madde eldesi gibi konularda kullanılmaktadır ve günümüzde popüler araştırma tekniklerinin önemli bir kısmını oluşturmaktadır (2). Bu çalışmalarda rol alması kaçınılmaz olan eczacıların eğitiminde hücre kültür tekniklerinin öğrenilmesi önem arz etmektedir. Bu çalışmada, insan makrofaj hücreleri kullanılarak hücrelerin çoğaltılması, pasajlanması, dondurularak saklanması, hücre sayımı, canlılık kontrolü gibi hücre kültürünün temel aşamaları ile hücre kültür laboratuarı genel kurallarının öğrenilmesi amacıyla, bal arıları tarafından bitkilerden toplanan ve sahip olduğu biyolojik aktivitelerden dolayı popüler bir araştırma konusu olan propolisin, makrofaj hücreleri üzerine sitotoksik etkisi araştırılmıştır.

15 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. PROPOLİS Propolis Hakkında Genel Bilgiler Propolis, bal arıları tarafından ağaçların kozalak ve kabuklarından, bitkilerin tomurcuk ve filizlerinden toplanan çeşitli yağlar, polenler, özel reçine ve mumsu maddelerin karışımından oluşan yapışkan bir maddedir (3). Propolis ilk kez Yunanlılar tarafından keşfedilerek doğal bir antibiyotik olarak kullanılmıştır. Pro eki ön, giriş; polis ise şehir anlamına gelmektedir. Kalıp olarak ise şehrin defansı, kovanın defansı anlamına gelmektedir (4). Propolis toplama işlemi Apis mellifera olarak isimlendirilen işçi bal arıları tarafından gerçekleştirilmektedir. Bal arıları, ağaç kabuklarından, bitkilerin dal ve tomurcuklarından toplayarak arka bacaklarındaki polen sepetçiklerinde biriktirdiği reçinemsi maddeleri ve bitki öz sularını, baş kısımlarında bulunan salgı bezlerinden salgılanan birtakım enzimlerle biyokimyasal değişikliğe uğratır ve balmumu ile karıştırarak kovan içerisinde kullanacağı bir ürün haline getirir (Şekil 2.1) (5, 6). Şekil 2.1. Bal arısı Apis mellifera

16 3 Propolis, arıların patojenik mikroorganizmalara karşı en önemli kimyasal silahı olup, çok eski zamanlardan beri halk sağlığında kullanılmaktadır (7, 8). Avrupa da, halk arasında uzun yıllar boyunca tedavi amaçlı kullanılan işlenmemiş bitkisel ilaçlardan biridir (9). Günümüze kadar propolisin terapötik kullanımı, farmokolojisi, biyolojik aktiviteleri ve kimyasal yapısı üzerine pek çok araştırma yapılmıştır. Propolisin, enflamasyonda, kalp hastalıklarında, hatta kanserde terapötik ve koruyucu etki mekanizmasına sahip olduğu yapılan bilimsel çalışmalarla gösterilmiştir (10). Ayrıca çalışmalar antibakteriyal, antifungal, antiviral, antiülser, anestezik, antioksidan, antihepatotoksik, immünstimülan etkilerini ortaya koymuştur (3, 11) Propolisin Fiziksel Özellikleri Propolis, zamk gibi yapışkan, reçinemsi kokulu, suda erimeyen, acımsı tada sahip sakıza benzeyen bir maddedir (Şekil 2.2) (9, 12). Arılar propolisi balmumu ile karıştırırlar. Propolisin, bazı bitkilere özgü proteinleri de yapısında bulundurması, propolisin mumsu kısmının bitkisel mum yapısında olduğunu göstermektedir. Propolis C arasında elastik bir yapı göstermekte, soğukta katı kırılgan bir şekle dönüşmektedir. Depolama esnasında kararmakta, güneş ışınlarının etkisiyle elastikiyetini kaybetmektedir. Yüksek sıcaklıklarda (30-40 C) yumuşayıp yapışkan bir durum almakta, 80 C da kısmen erimektedir (3,13). Şekil 2.2. Propolis Propolisin rengi; bitki türüne, kaynağına, yaşına bağlı olarak sarıdan koyu kahverengiye kadar değişmektedir. Propolisin rengi, kokusu ve tıbbi karakteri bitkiye, bölgeye,

17 4 mevsime ve koloniye bağlı olarak değişir. Şeffaf propolisin varlığı da kaydedilmiştir (14). Propolis, eter, kloroform, aseton ve diğer organik çözücülerde kısmen, % 95 lik alkolde büyük ölçüde çözünmekte, suda çok az çözünmekte veya hiç çözünmemektedir. Propolis, tıpta % 70 lik alkolde çözünmüş çözelti olarak kullanılmaktadır (3, 13). Propolisin ticari ekstraksiyonları için çözücü olarak genellikle etanol, glikol ve su kullanılır (15) Propolisin Kimyasal İçeriği Coğrafi ve botanik orijin farklılıklarından dolayı, çok karışık bir kompozisyona sahip olan ham propolis ekstraktları, 300 den fazla farklı yapı içermektedir. Sıcak bölgelerde flavonoidler ve sinnamik asit türevleri gibi temel fenolik bileşenler içerirken, tropikal bölgelerde propolisin daha çok diterpenler ve prenilat bileşenlerini içerdiği bildirilmiştir. Propolisin en önemli aktif bileşenleri arasında aromatik asitler, fenolik maddeler, özellikle flavonoidler (flavonlar, flavonoller, flavononlar) ve fenolik asit gibi bileşenler bulunmaktadır (16, 17). Ham propolisin yapısı, kaynağına bağlı olarak değişkenlik göstermekle birlikte; % 2-5 polen, % 5-10 uçucu yağlar (bunun % 0.5'i esansiyel yağlar), % 5-15 organik bileşikler, % bitkisel kaynaklı balmumu ve % reçine ve balsamdan oluşur. Reçine ve balsam içeren kısım, terpenler, polisakkaritler gibi maddeler içerir. Balmumu ise yağ asitleri, B vitaminleri, C ve E vitaminleri içerir. Organik kısmın en önemli bölümü olan ve biyolojik aktivitesinin önemli bir kısmından sorumlu olan flavonoidler (polifenolik içerik), üzerinde en fazla çalışma yapılmış maddelerdir (13, 18). Propolis, farklı mineral ve oligo elemanlar da içerir. Flavon ve flavonoidler propolise antiviral ve antibakteriyal özellikler kazandıran maddelerdir (19, 20). Propolisin kimyasal yapısındaki değişkenlik propolisin kalitesinin belirlenmesinde ve tıpta kullanımında önemli bir sorun haline gelmiştir. Bu konuda propolis toplanılan kaynağın net olarak takip edilememesi kimyasal yapısının belirlenmesinde zorluklar yaratmıştır. Bununla birlikte propolisin biyolojik aktivitesi belirlenirken propolisten izole edilen aktif bileşenlerin belirlenmesi, söz konusu aktivitenin hangi bileşik ya da

18 5 bileşik gruplarından kaynaklanabileceği konusunda yorum yapma açısından kolaylık sağlamaktadır. Özellikle botanik orijini farklı olan yani farklı coğrafik bölgelerden elde edilen propolis örneklerinin kimyasal yapısının aydınlatılmasında fayda vardır. Nitekim son yıllarda propolisin standardizasyonunu kolaylaştırmak için dünyanın farklı coğrafik bölgelerinden toplanan propolislerin tiplendirilmesi için birçok çalışma yapılmaktadır (12). Propolisin kimyasal kompozisyonunun toplama tekniklerine bağlı olarak örnekten örneğe farklılık göstereceği bildirilmektedir. Plastik ızgaralı yöntem ile toplanan propolis örneklerinde biyolojik olarak aktif maddeleri içeren reçine miktarının düşük olması nedeniyle, bu yöntemle elde edilen propolis örnekleri kimyasal içerik yönünden düşük kalitededirler. Daha saf propolis üretimi için ise önden veya yandan ahşap tuzaklı yöntemlerin kullanılması önerilmekte ve daha yaygın olarak kullanılmaktadır (21). Propolis üzerinde yapılan çalışmalar, insan sağlığı açısından da oldukça önemli ve gerekli olan vitaminler, mineral ve elementler de içerdiğini göstermiştir. İhtiva ettiği vitaminler B1, B2, C ve E vitaminleri iken, bakır, kalsiyum, alüminyum, stronsiyum ve vanadium gibi elementleri de içerdiği bildirilmiştir (22). Ayrıca, miristik asit, benzoik asit, benzil alkol, kafeik asit, vanilin ve izovanilin gibi kimyasal bileşiklerin de bulunduğu tespit edilmiştir (18, 23). Propolisin kimyasal bileşimi, biyolojik ve farmakolojik özelliklerini belirler. Bu nedenle dünyanın farklı coğrafik bölgelerinden temin edilen propolis örneklerinin kimyasal yapısının incelenerek belirlenmesi gerekmektedir. Propolisin yapısında bulunan aktif bileşenlerin belirlenmesi için farklı analitik yaklaşımlar kullanılmıştır. Propolisin kimyasal kompozisyonunun belirlenmesinde en geçerli metot kütle spektrumlu gaz kromatografik (GC-MS) metottur, ayrıca yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) metodu da kullanılır (12). Bu incelemeler sonucunda propoliste toplam 100 den fazla aktif bileşen olduğu tespit edilmiştir (24). Propolisin içerdiği maddeler ve bunların etkileri aşağıda özetlenmiştir: Flavonoidler: Antimikrobiyal özellikler, ateş düşürücü, kılcal damarların geçirgenliğini azaltıcı, hemostatik etki

19 6 Krizin: Anti-Helicobacter pylori Apigenin: Gastrik ülserin iyileştirilmesi Acacetin: Ateş düsürücü Kuersetin: Antiviral, antitümöral aktivite, spazmolitik Kaempferid: Anti-Mycobacterium phlei, mikroorganizmaların asit direncine karşı etki Kaemperol-7,4 -dimetil eter: Antifungal Ermanin: Antifungal Galanjin: Bakteriyostatik aktivite, antibakteriyal, anti-h. pylori Pinosembrin: Lokal anestetik, anti-h. pylori aktivitesi Pinobanksin: Antibakteriyal Pinostrobin: Lokal anestetik 3,4 -dihidroksiflavonidler: Kılcal damarların güçlendirilmesi Flavan-3-ols: Kılcal damarların güçlendirilmesi Pektolinarinjenin: Spazmolitik Luteolin: Gastrik ülserin iyileştirilmesi Luteolinin 3,4 -dimetil eteri: Spazmolitik ve hipokoleretik Artepillin C: Antitümoral etki Eriodiktiol: Kalp yetmezliğini iyileştirici etki, akut kalp yetmezliğini önleyici etki Pinosilvin (3,5-dihidroksistilben): Bacillus subtilis ve Bacillus cereus u inhibe edici özelliği, M. phlei ve Mycobacterium semegmatis e karşı etkinlik Ferulik asit: Antibakteriyal etki, kollojenik etki Isoferulik asit: Staphylococcus aureus a karşı etkinlik Benzoik asit: Balsamik ve antiseptik aktivite Sinnamik asit: S. aureus a karşı etkinlik Isopentil ferulat: İnfluenza virüse karşı etkinlik

20 7 p-kumarik asit benzil ester: Antimikrobiyal ve antifungal etkinlik Kafeik asit: Antiviral, bazı Gram-pozitif ve Gram-negatif mikroorganizmalar üzerine antibakteriyal aktivite Prenil kafeat: Gizli kontakt alerjen 3-metil-2-enil kafeat: Antiviral aktivite Kafeik asit fenetil ester: Antitümoral aktivite Metil kafeat: Tümör sitotoksisitesi Diterpenoid clerodan: Antitümöral aktivite, antibakteriyal özellik Eterik yaglar: Antimikrobiyal aktivite Bisabolol: Ateş düşürücü özellik (10) Propolisin Bitkisel Kaynakları Propolisin içeriği, toplandığı bitkilerin tür ve çeşitlerine göre değişmektedir. Pek çok farklı bitkiden arılar tarafından toplanan propolis için en önemli kaynağın kara kavak (Populus nigra) bitkisi olduğu bilinmektedir (Şekil 2.3) (25). Şekil 2.3. Kara kavak (Populus nigra) bitkisi

21 8 Bunun yanı sıra, çam (Pinus), huş (Betula alba), kavağın diğer türleri (Populus spp), at kestanesi (Alnus glutinosa), karaağaç (Ulmus), meşe (Quercus), erik (Prunus), akçaağaç (Acer), fındık (Corylus), kestane (Castaneae sativa), ıhlamur (Tilia), akasya (Acacia), köknar (Abies), söğüt (Salix) ağaç türlerinin de arılar tarafından propolis üretimi için en çok tercih edilen bitkiler olduğu bildirilmektedir (Şekil 2.4) (25). Meşe Ağacı (Quercus) Akasya Ağacı (Acacia) Ihlamur Ağacı (Tilia) Şekil 2.4. Arılar tarafından propolis üretimi için tercih edilen bitki örnekleri Propolisin yoğun olarak toplandığı bitki çeşitleri, coğrafik bölgeye ve mevsime göre değişmektedir. Propolisin Avrupa'da ana kaynağı olarak kavak (Populus) türleri gösterilmektedir. Propolisin yoğun olarak toplandığı kavak türleri Avrupa, Kuzey Amerika ve Kuzey Afrika ile sınırlıdır. Afrika da propolisin kaynağı akasya (Acacia) dır. Avusturalya da Avrupa da olduğu gibi kavağın çok sınırlı olması nedeniyle, ökaliptusun (Eucalyptus) en önemli propolis kaynağı olduğu bildirilmektedir (13).

22 9 Propolis polen içeriği bakımından zengin olduğu için polen analizi yapılarak bitkisel kökeni bulunabilmektedir. Bu sayede propolisin kökenini oluşturan bitkiler tespit edilmektedir. Propolisin toplandığı bitki kaynaklarının bilinmesi kimyasal standardizasyonu açısından önemlidir. Yapılan bir çalışmada çeşitli bölgelerden gelen 56 propolis örneğinin polen analizi yapılarak propolis kaynağı olan bitkiler belirlenmiştir. Örneğin Avustralya da propolis kaynağı bitki olarak Eucalyptus türleri belirlenirken, İtalya da Castaneae sativa önemli bir propolis kaynağı bitki olarak bildirilmiştir (26). Arılar propolisi, bitkilerden topladığı kimyasal bitki özlerini kullanarak üretmektedir. Yaprak ve goncalar üzerindeki lipofilik maddeler, sepal, sakız, reçine gibi bitki kaynaklı maddelerin oranı arı reçinesinin kimyasal oluşumunu belirlemektedir (27) Propolisin Arılar ve İnsanlar Tarafından Kullanımı Propolis arılar tarafından kovan içerisinde, duvarları tıkamak ya da güçlendirmek, kovanda bulunan petekleri tamir etmek, ince bir tabaka halinde petekleri cilalamak, kovan içinde ölen ancak kovan dışına taşınamayan arı ve diğer canlıların vücutlarının mumyalamasını sağlamak, bunların çürüyüp mikroorganizma üretmelerini engellemek, yavru yetiştirme dönemlerinde yarık ve çatlaklardan suyun buharlaşıp kaybolmasını engelleyerek kovan içi olması gereken nem oranını koruyabilmek, kovanı olumsuz çevre koşullarından korumak, kovan giriş deliğini küçültmek, kovanın dezenfekte edilmesini sağlamak amaçlarıyla kullanılır (21). İnsanoğlu propolisi çok eski çağlardan beri farklı amaçlar için kullanagelmiştir. Günümüze kadar gelen eski Yunan yazıtları, propolisin iltihaplanan yaralar ve diş çürükleri için tedavi amacıyla kullanıldığını tanımlar. Ayrıca propolis, Romalılar döneminde yara üzerine konulan lapa benzeri karışımın içerisine katılarak kullanılmıştır. İbranice eski vasiyetnamelerde Tzori olarak geçen propolisin tedavi edici özelliklerinden bahsedilmektedir. Avrupa daki onikinci yüzyıl kayıtları propolisin medikal preparatlarının ağız ve yara enfeksiyonlarının tedavisi ve diş sağlığı için kullanımından bahsetmektedir (15, 28).

23 10 Propolis günümüzde antibakteriyal, antifungal, antiviral, antiinflamatuar, antiülseratif, lokal anestezik, antitümöral özellikleri gibi biyolojik aktivitesinden dolayı apiterapide, biyokozmetikte, sağlıklı beslenmede, halk sağlığında geniş bir kullanıma sahiptir (10, 29). Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda propolis ekstraktının herhangi bir toksinojenitesinin bulunmadığı tespit edilmiştir. Ayrıca propolisin % lik sulu çözeltilerdeki konsantrasyonunun akut ve kronik solunum hastalıklarında aerosol olarak başarılı şekilde kullanıldığı bildirilmiştir (30). Propolisin kullanıldığı yerler şöyle özetlenebilir: 1. Propolis, antimikrobiyal etkileri nedeniyle bazı bakteriyel ve fungal hastalıkların tedavisinde, içerisindeki esansiyel yağ asitleri nedeniyle lokal anestezide, grip, uçuk gibi viral enfeksiyonların iyileştirilmesinde, antitümör etkisi nedeniyle özellikle akciğer kanserlerinde, romatizmal hastalıkların tedavisinde, bağışıklık sistemini düzenlemesinden dolayı hastalıklara karşı vücut direncini arttırmakta kullanılır. Ayrıca propolis, kardiovasküler hastalıklar, solunum yolları enfeksiyonları, diş sağlığı, deri hastalıklarının tedavisi ve özellikle yanıklar olmak üzere yara tedavilerinde de kullanılmaktadır (15). 2. Yapılan çalışmalarda doku yenileme ve onarma özelliği gösterildiğinden, dermatolojik ve kozmetik uygulamalarda geniş kullanım alanı bulmuştur. Propolis bitki ekstraktları, arı sütü ve E vitamini ile birlikte cildi besleyici, temizleyici ve onarıcı ürünlerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Propolisin etanolik solüsyonları, ağızdaki minör ülserlerin, ağrılı yaraların, ciltteki enfeksiyonların tedavisi için sıklıkla satılan bir üründür. En yaygın karşılaşılan yan etkileri, ciltte ve mukoz membranlarda irritasyonlara neden olan alerjik durumlardır. Astımlı hastalarda, egzemalı ve ısırgan otuna hassas kişilerin tedavisinde kullanılırken çok dikkatli olunmalıdır (31). 3. Çürümeyi ve bozulmayı engelleyici özelliği ile gıda sanayinde kullanılmaktadır (15). Propolis gıda ürünleri paketleme materyallerinde kullanımı konusunda patent almıştır. Propolisin dondurulmuş balık stoklarının saklama süresini uzattığı bildirilmiştir (32).

24 11 4. Evcil hayvanların ayak ve deri problemlerinin çözümünde, endometritisin tedavisinde başarılı sonuçlar vermiştir (33). Sonuç olarak, günümüzde propolis ilaçlarda, kişisel ürünlerde ve birçok preparatta kullanılmaktadır (Şekil 2.5). Şekil 2.5. Propolisin preparat örnekleri Propolisin Biyolojik Etkileri Son yıllarda, propolisin faydalı biyolojik aktiviteleri nedeniyle değişik alanlarda kullanımı konusuna duyulan ilgi artmıştır. Propolisin tıbbi özellikleri tarihsel olarak çok eski zamanlardan beri bilinmektedir ve yıllar boyunca propolis insanlar tarafından değişik hastalıkların tedavisinde kullanılmıştır. Birçok araştırma propolisin biyolojik aktivitesi, farmakolojik ve tedavi edici özellikleri ve kimyasal bileşimi üzerine odaklanmıştır. Bu çalışmalarda propolisin antibakteriyal, antifungal, antiviral, antiinflamatuar, antitümoral, antioksidan, immünomodülatör etkilere sahip olduğu ortaya konmuştur (17, 27). Farklı orijine sahip propolis örneklerinin biyolojik aktiviteleri ile ilgili yapılan çalışmalarda Brezilya propolisinin antibakteriyal, sitostatik, serbest radikal koruyucu aktivitesi belirlenirken Bulgar propolisinin bakterisidal, antifungal ve antiparaziter aktivitesi belirlenmiştir. Türk propolisinin de antibakteriyal, antifungal, antioksidan, antikarsinojenik, yara iyileştirici gibi bazı biyolojik aktiviteleri incelenmiştir (18). Propolisin yapısında bulunan flavanoid ve fenolik türevleri olan doğal ürünlerin, vazodilatör ve antihipertansif etkilere sahip olduğu bilinmektedir. Flavanoidler ayrıca antioksidanları ve metal şelatörleri içerirler. Flavanoidlerin antioksidan ve vazodilatör etkilerine ilave olarak antialerjik, antiviral ve immünostimülan fonksiyonları da gösterilmiştir (34).

25 12 Propolisin en karakteristik özelliği mikroorganizmalara karşı gösterdiği antimikrobiyal etkinliği olup, bu farmakolojik özelliklerinden dolayı insanoğlu tarafından kullanılagelmiştir. (35). Örneğin ayak ve cilt yaralarının iyileştirilmesinde, ölülerin mumyalanmasında kullanılmakta olduğunu bildiren kayıtlar mevcuttur (36). Propolis, arıların bir numaralı düşmanı olan Bacillus larvae bakterisine karşı öldürücü özelliktedir. Propolisin bu kullanımı, kovanın yapımı aşamasında oluşabilecek herhangi bir enfeksiyonu önler ve ölü hayvan dokusunda büyüyebilecek bakterileri engeller (37). Çeşitli çalışmalarda propolisin B. subtilis, S. aureus, Candida albicans ve Trchophyton mentagrophytes türlerine karşı antimikrobiyal etkisinin olduğu bildirilmiştir (38). Bankova ve arkadaşları, Brezilya propolisinin değişik fraksiyonlarının S. aureus a karşı antibakteriyal etki gösterdiği ve bu etkinin ana kaynağının polar fenolik bileşimler olduğu sonucuna varmışlardır (39). Bir başka çalışmada çeşitli propolis örneklerinin antibakteriyal etkileri araştırılmış, B. subtilis ve S. aureus için minimal inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri µg/ml, Escherichia coli için µg/ml olarak bulunmuştur. Bu nedenle propolisin gram pozitif mikroorganizmalara, gram negatif mikroorganizmalara göre daha etkili olduğu rapor edilmiştir. Ayrıca bu etkiden propolis örneklerinin fenolik içeriğinin ve flavonoid bileşiklerinin sorumlu olduğu bildirilmiştir (40). Propolisin 25 H. pylori klinik izolatı üzerine etkisinin araştırıldığı bir çalışmada, klaritromisin ile kombine kullanıldığında H. pylori inhibisyonunda sinerjik ya da additif aktivite gösterdiği bildirilmiş ve bu veriye dayanarak propolis ve klaritromisin kombinasyonunun, H. pylori ye bağlı gastroduodenal hastalıkların kontrolüne yardımcı olabileceği vurgulanmıştır (41). Propolisin H. pylori suşu üzerinde antibakteriyal etkisinin araştırıldığı bir başka çalışmada da, etanolik ekstraktının oldukça etkili olduğu (MİK: 75 µg/ml) bildirilmiştir (42). Değişik propolis formülasyonlarının Trypanosoma cruzi ile enfekte edilmiş fareler üzerinde denendiği bir çalışmada, bu parazitin parazitik etkisi üzerine ve farelerin hayatta kalma sürelerine bir etkisi olmadığı bildirilirken, bir başka çalışmada propolisin çeşitli ekstrelerinin T. cruzi amastigotlarına karşı etkili olduğu gösterilmiştir (43, 44).

26 13 Çeşitli Avrupa ülkelerinden elde edilen propolisin antimikrobiyal aktivitesinin araştırıldığı bir çalışmada, Alman propolisinin S. aureus ve E. coli ye karşı en etkili propolis türü olduğu, ana kaynağını pinosembrinin oluşturduğu Avusturya propolisinin ise C. albicans a karşı en etkili propolis türü olduğu bildirilmiştir (45). Türkiye de de değişik bölgelerden elde edilen propolisin antimikrobiyal etkilerinin araştırıldığı çalışmalar mevcuttur. Kartal ve arkadaşları, Türkiye den Kazan ve Marmaris bölgelerinden toplanan propolis örneklerinin etanolik ekstrelerinin antimikrobiyal aktivitesini araştırmışlar ve Kazan yöresi örneklerinin daha güçlü antimikrobiyal aktivite gösterdiğini bildirmişlerdir (46). Uzel ve arkadaşları, Anadolu nun dört farklı bölgesinden (Bursa-Orhangazi, Bartın, Ankara-Mamak, Trabzon) toplanan propolisin etanollü ekstrelerinin, Gram pozitif bakteri ve mayalara karşı oldukça etkili olduklarını bildirmişlerdir (47). Silici ve arkadaşları ise, Artvin, Kayseri ve Adana dan toplanan propolis örneklerinin C. albicans, Candida glabrata, Trichosporon sp. ve Rhodotorula sp. ye karşı düşük dozlarda bile etkili olduğunu göstermişlerdir (48). Propolisin antimikrobik etkinliğinin esas olarak pinosembrin, galangin, pinosilvin ve pinobanksin gibi flavonoidler, sinnamik asit, benzil pkumarat ve kafeik asit esterlerine bağlı olduğu bildirilmiştir (49). Propolisin antibakteriyal aktivitesinden sorumlu bileşik grupları toplandığı bitki türüne göre değişmektedir; kavak tipi propoliste flavonlar, flavononlar, fenolik asitler ve onların esterleri iken, Baccharis tipi (Brezilya) propoliste prenillenmiş p-kumarik asitler, diterpenler ve Kırmızı Küba propolisinde prenillenmiş benzofenonlardır (12). Propolisin güçlü dezenfektan etkisi bulunur ve bu etki sayesinde kovan ile petek gözlerinin dezenfeksiyonu sağlanır (3). Farelerde yapılan araştırmalarda propolisin sitokin üreten immün sistem hücrelerini aktive ettiği ve bu etkilerle propolisin aynı zamanda antitümör etkiye de sahip olduğunu ortaya konmuştur (50). Kafeik asit fenil etil ester, propolisin içeriğinde bulunan ve çok geniş etkilerden sorumlu bir maddedir. En önemli özelliklerinden biri tümör hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisidir (51).

27 14 Son yıllarda propolisin önemli biyolojik etkilerinden birinin de karsinostatik etki olduğu fark edilmiştir. Propolis bileşiminde bulunan organik maddelerden flavonoidler, serbest radikal temizleyicisi, metabolik enzim düzenleyici, detoksifiye edici ve immünomodülasyonu sağlayıcı etkileri ile ileri aşamalarda antikanserojenik etki göstermektedirler (17). Propolis, yapısındaki sinnamik asit ve terpenoidlerin sitotoksik aktivitesi nedeniyle bazı kanser türlerinde kullanılmaktadır. Bu yönüyle propolis barsak, böbrek, meme, burun ve farenks kanserinde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Yapılan araştırma sonuçlarında düşük dozdaki propolisin meme karsinomlarını önleyici olarak uygulanabileceği bildirilmiştir (6). Brezilya propolisinden izole edilen yeni bir clerodane diterpenoidinin tümör hücrelerini S fazında yakalayarak hepatoma hücrelerinin büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Aynı çalışmada, suda çözünmüş propolis ekstraktlarından, antioksidan aktivite gösteren ve hepatosellüler karsinoma ve insan akciğer karsinoma hücrelerine karşı sitotoksik etki gösteren bir propolis etken maddesi izole edilmiştir (52). Farelerde oluşturulan Ehrlich karsinomasına karşı propolisin antitümoral aktivitesinin araştırıldığı bir çalışmada, propolis antitümoral ilaçlarla kombine edilerek tedavide kullanılmış ve tümör hücrelerinde önemli düzeyde inhibisyon oluştuğu, hatta bazı deneklerde tümör hücrelerinin yok olduğu kaydedilmiştir (53). Son yıllarda propolis, immün sistem üzerine etkileri araştırılmaya başlanan önemli bir doğal kaynaktır (53). Propolis, trombosit agregasyonunu ve eikosanoid sentezini inhibe ederek immün sistem üzerine düzenleyici etki gösterir. Ayrıca bakteriyal enfeksiyon durumunda fagositik hücreleri uyarır (54). HIV-1 enfekte hastalarda lenfositlerin immün yanıtını geliştirir (55). Propolisin immün sistem üzerine etkisini doğrudan makrofajlardan oksijen ve nitrojen metabolitleri gibi fungusid maddeleri serbest bırakarak ve aynı zamanda bazı proenflamatuar sitokinlerin üretimini indükleyerek gösterdiği iddia edilmektedir. Yapılan bir çalışmada propolisin, fare peritoneal makrofajlarından IL-1β ve TNF-α gibi sitokin üretimini uyardığı gösterilmiş, böylece makrofaj aktivasyonunu arttırarak immün yanıtı güçlendirdiği ortaya konmuştur. Bu etkiden özellikle içerdiği kaffeoligunic asitin

28 15 sorumlu olduğu bildirilmiştir (53, 56). Ayrıca propolisin, kompleman sistemini de doğrudan ya da makrofajlardan sitokin salınımı yoluyla etkilediği rapor edilmiştir (57). Propolisin BALB/c farelerde makrofajlar üzerine etkisinin incelendiği bir çalışmada, farelere 200 mg/kg propolis uygulanmış ve bu farelerin peritoneal makrofajlarından kontrole göre daha çok H2O2 üretildiği ve NO üretiminin inhibe olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada farelerin timus, kemik iliği, dalak ve adrenal bezleri histopatolojik olarak incelenmiş, stres altındaki farelerin timusunda, kemik iliğinde ve adrenal bezlerinde bir değişiklik görülmezken, dalaktaki germinal merkezlerde büyüme olduğu tespit edilmiş ancak propolis uygulanan farelerde dalaktaki bu değişimin olmadığı bildirilmiştir (53). Propolisin bu etkilerinin yanında toksik ve alerjik özellikleri de araştırılmıştır. Propolis kullanan kişilerde zehirlenme belirtisine rastlanmamıştır. Günümüzde kişilerin propolise mi, onu kontamine eden diğer arı ürünlerine mi reaksiyon verdikleri tam olarak bilinmemektedir. Bu nedenle arı ve arı ürünlerine alerjisi olanlarda, astım, ekzema ve ürtiker gibi alerjik reaksiyonları olan kişilerde dikkatli olunması gerekmektedir. Propolisin normalden daha yüksek alımlarda insan ve hayvanlar için tehlikeli olabileceği vurgulanmaktadır. Balıklarda yapılan bir çalışmada, yüksek oranda ( g propolis/l) uyguladıkları propolisin eritropoezisi inhibe ederek eritrosit, hemoglobin ve hematokrit değerlerinde azalmaya neden olduğu belirtilmiştir. Ancak propolisin belirtilen bu toksik etkilerini destekleyen fazla literatür veriye rastlanmamıştır (58) MAKROFAJ HÜCRELERİ Makrofaj Hücreleri Hakkında Genel Bilgiler Pluripotent kök hücre denilen ortak bir progenitör hücrenin farklılaşması ile bütün kan hücreleri oluşur. Bu hücrelerin farklılaşması, fetüsün gelişmesi esnasında başlar ve hayat boyu devam eder. Pluripotent kök hücre, lenfoid (T ve B hücreleri), myeloid, eritrositik ve megakaryoblastik (plateletlerin kaynağı) kökenleri içeren kan hücrelerinin farklı kökenlerini oluşturmak üzere kök hücrelere farklılaşır (Şekil 2.6). Hematopoetik hücre gelişimini ve son farklılaşmayı düzenleyen özgül sitokinler, esas olarak enfeksiyonlara yanıtta ve aktivasyonda yardımcı T hücreleri, dendritik hücreler ve makrofajlar tarafından salgılanır (59).

29 16 Şekil 2.6. Bağışık yanıtta yer alan hücrelerin morfolojisi, kökeni ve makrofajların bu sistemdeki yeri Mononükleer fagosit sistemi, myeloid hücrelerdir; kandaki monositlerden oluşur ve monositlerden türemiş hücrelerdir. Farklı sitokinler veya doku ortamı, monosit ve myeloid kök hücrelerin çeşitli makrofaj ve dendritik hücrelere farklılaşmasını teşvik eder. Bu hücreler, makrofajları, akciğerlerdeki alveoler makrofajları, karaciğerdeki Kupffer hücrelerini, böbrekteki intraglomerüler mezenşimal hücreleri, bağ dokusundaki histiositleri, osteoklastları, sinovial hücreleri ve beyindeki mikroglial hücreleri içermektedir. Alveolar ve serozal (örneğin peritoneal) makrofajlar gezgin makrofajlara örnektir. Beyin mikroglial hücreleri, beyine doğum sırasında giren ve sabit hücrelere farklılaşan hücrelerdir. Bazı dendritik hücreler, myeloid hücrelerdir ve monositlerden köken almış olabilirler. Bu olgun formlar, en uzak doku lokalizasyonlarda ve fonksiyonlarına göre değişik morfolojilerde olabilirler; makrofaj aktivitelerinin veya hücre yüzey belirteçlerinin bir kısmını eksprese edebilirler (59). Monositler, tek parçalı ve fasulye şeklinde çekirdeği olan, µm çapında hücrelerdir. Periferal kan lökositlerinin % 3-8 ini temsil ederler. Monositler,

30 17 enflamasyonun erken hücresel komponenti olarak nötrofilleri takip ederler. Kana karışan monositler, özel dokuların kapiller bölgelerinde farklılaşırlar ve makrofaj olarak anılırlar. Geniş lökositler olan makrofajlar, normalde omurgalıların hücre yüzeyinde bulunmayan, mannoz gibi moleküllere karşı reseptörler taşırlar. Sonuçta, yabancı olanı olmayandan ayırma özelliğine kısmen de olsa sahiptirler. Makrofajlar, ayrıca dışarıdan akciğerlere ulaşan toz, polen gibi yabancı maddeleri; ya da vücudun yıkıma uğramış kendi hücrelerini içine alıp, parçalara ayırarak, onları yok etme işlemini üstlenmiş temizlikçi hücreler olarak da tanımlanırlar. Monositlerden türeyen makrofajlar, bağ dokularında yerleşip farklılaşır ve çoğalırlar; eskiden retiküloendotelyal sisitem olarak adlandırılırken, günümüzde monosit/makrofaj sistemi olarak tanımlanan bu hücreler grubu, kısa ömürlü (1-2 gün) nötrofillerin aksine, varlıklarını aylarla ifade edilen uzun sürelerle korurlar (60) Makrofaj Hücrelerinin İmmün Sistemdeki Yeri Makrofajlar,lizozomlar içeren, nötrofillerin aksine mitokondrileri olan uzun ömürlü fagositik hücrelerdir. Maofajların şu temel fonksiyonları vardır: 1-Fagositoz 2-Özgül bağışık yanıtları başlatmak için T hücrelerine antijen sunumu 3-Doğal ve bağışık yanıtları aktive etmek ve düzenlemek için sitokinlerin sekresyonu. Makrofajlar, immünoglobulin (Ig) G nin Fc parçası (Fc-δ R I, Fc- δ R II, Fc- δ R III ) ve kompleman basamağının C3b ürünü (CR1, CR3) için hücre yüzey reseptörlerini eksprese ederler. Bu reseptörler, bu proteinlerle kaplanmış antijen, bakteriler veya virüslerin fagositozunu kolaylaştırırlar. Toll-benzeri ve diğer patern tanıma reseptörleri, patojen ile ilişkili moleküler yapıları tanırlar ve savunma yanıtını aktive ederler. Makrofajlar, aynı zamanda bağışık yanıtı genişletmek için CD4 yardımcı T hücrelerine antijen sunmayı sağlayan sınıf II MHC antijenlerini eksprese ederler. Makrofajlar, bakteriyi algıladığında ateş dahil olmak üzere bağışık ve enflamatuar yanıtları arttıran interlökin-1, interlökin-6, tümör nekrozis faktör, interlökin-12 ve diğer molekülleri salgılarlar. Bir T-hücre-kaynaklı lenfokin olan interferon- δ, makrofajları aktive eder. Aktive makrofajlar, artmış fagositik, öldürme ve antijen sunma yeteneklerine sahip olurlar (59).

31 18 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. DENEYDE KULLANILAN BESİYERİ VE SOLÜSYONLARIN HAZIRLANMASI Fetal Bovine Serum Farmasötik Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda mevcut bulunan fetal bovine serum (FBS) (Biological, İsrail), 56 o C ye ayarlı su banyosunda (Nüve, Türkiye) 30 dk tutularak inaktive edildi. Biyolojik güvenlik kabininde (MN120, Nüve, Türkiye) streril falcon tüplere 10 ar ml dağıtılarak kullanılıncaya kadar -20 o C de saklandı Penisilin Streptomisin Solüsyonu Penisilin (10000 U/ml) streptomisin (10 mg/ml) solüsyonu (Gibco, Almanya), biyolojik güvenlik kabininde steril eppendorf tüplere 2 şer ml dağıtılarak kullanılıncaya kadar -20 o C de saklandı RPMI-1640 Besiyeri Hücre mediumu olarak 25mM HEPES ve L- Glutamin içeren RPMI-1640 besiyeri (Sigma, USA) kullanıldı. Bu besiyeri üzerine % 10 oranında inaktive edilmiş steril FBS ve % 2 oranında penisilin- streptomisin solüsyonu ilave edildi. Hazırlanan besiyeri miktarı 1 haftalık ihtiyaca göre ayarlandı ve kullanılıncaya kadar +4 o C de saklandı.

32 Hücre Dondurma Solüsyonu Hücreleri dondurarak saklamak amacıyla % 90 oranında FBS ve % 10 oranında DMSO içeren solüsyon kullanıldı. Steril falcon tüpte hazırlanan solüsyon, 0,22 m lik filtreden geçirilerek steril edildi Hücre Yıkama Solüsyonu Hücreleri yıkama işleminde % 3 oranında penisilin- streptomisin içeren fosfat buffer saline (PBS), 0,22 m lik filtreden geçirmek suretiyle steril edilerek kullanıldı U-937 MAKROFAJ HÜCRELERİNİN ÜRETİLMESİ Çalışmada LGC Promochem den elde edilen ATCC U-937 insan makrofaj hücreleri kullanıldı Hücrelerin Çözdürülmesi Hücre içeren krio tüp -80 o C soğutucudan (Operon, Kore) çıkarıldı, sıcaklığı 37 o C ye ayarlı su banyosunda hızla çözdürüldü. Çözdürülen hücre çözeltisinden 1 ml, 9 ml taze hazırlanmış % 10 FBS ve % 2 penisilin-streptomisin ilaveli RPMI-1640 besiyeri içine eklenip pipetaj yapıldı. Santrifüj cihazında (Nüve, Türkiye) 1500 devirde 5 dk santrifüj edildikten sonra süpernatan çekilip uzaklaştırıldı. Pellet üzerine 4 ml kadar hücre mediumu eklenip süspansiyon haline gelene kadar pipetaj yapıldı. Bu süspansiyondan 1 er ml, 9 ar ml hücre mediumu içeren hücre kültür flasklarına eklendi. Flasklar % 5 CO 2 li inkübatöre (Sanyo, Japonya) 37 o C ye kaldırıldı Hücrelerin Pasajlanması Hücre kültür flaskları % 5 CO 2 li inkübatörden çıkarılarak biyolojik güvenlik kabinine alındı. Hücreler düzenli olarak invert mikroskopta (Leica, Almanya) hücrenin morfolojisi ve sayısı yönünden incelendi ve ortalama 2 günlük aralıklarla pasajı yapıldı. Bu amaçla hücre kültür flasklarındaki medium tek kullanımlık steril pipet yardımı ile pipetaj yapılarak konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarıldı devirde 5 dk oda sıcaklığında santrifüj edildikten sonra süpernatan atılıp pellet hücre yıkama çözeltisi ile

33 20 yıkandı. Tekrar santrifüj edildikten sonra elde edilen pellet, oda sıcaklığına getirilen 4 ml hücre mediumu ile süspanse edildi. Bu süspansiyondan 1 er ml; 9 ar ml taze besiyeri içeren hücre kültür flasklarına eklendi ve hücreler invert mikroskopta edildi. Hücre kültür flaskları, üzerine pasaj sayısı ve tarih yazılarak 37 o C de % 5 CO 2 li inkübatöre kaldırıldı Hücrelerin Canlılık Kontrolü Her pasaj işleminde hücrelerin canlılığı trypan blue (Biological, İsrail) ile kontrol edildi. Bu amaçla temiz bir lam üzerine eşit miktarlarda hücre süspansiyonu ve trypan blue boyası koyularak karıştırıldı. Bunun üzerine lamel kapatarak hazırlanan preparat ışık mikroskobunda (Leica, Almanya) hücrelerin canlılığı ve morfolojisi yönünden incelendi. Boya almayan hücreler canlı, mavi boyanan hücreler ölü olarak değerlendirildi. 100 hücre sayılarak boya almayan hücrelerin yüzde oranı hesaplandı Hücrelerin Dondurulması Bu aşamada hücrelerin bir kısmı ileri çalışmalarda tekrar kullanılabilmesi amacıyla dondurularak saklandı. Bu amaçla, hücre kültür flasklarındaki medium, tek kullanımlık steril pipet yardımı ile pipetaj yapılarak konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarıldı. Tüpler 1500 devirde 5 dk oda sıcaklığında santrifüj edildi. Süpernatan atılıp pellet hücre yıkama çözeltisi ile yıkandı ve tekrar santrifüj edildi. Oluşan pellet, dondurma çözeltisinde süspanse edildi ve bu süspansiyondan bir miktar alınarak hücrelerin trypan blue ile canlılık kontrolü yapıldı. Bir kısım hücrenin dondurulma ve çözdürülme aşamalarında kaybedileceği göz önüne alınarak, son hacim yaklaşık 5 x x 10 7 hücre / ml olacak şekilde ayarlandı. Bu karışımdan 2 şer ml krio tüplerine aktarıldı. Krio tüpleri üzerine tarih, pasaj sayısı ve canlılık oranı not edildikten sonra dakikada 1 o C soğutan izopropil alkollü özel kontainer içinde -80 o C soğutucuya kaldırıldı Hücrelerin Sayımı Hücre sayımında thoma lamı kullanıldı. Thoma lamının üstten görünüşü Şekil 3.1 de sunulmuştur.

34 21 Şekil 3.1. Thoma lamı üstten görünüş Thoma lamında sayım yapılacak alan cam yüzeyindeki çizgilerle belirlenmiştir (Şekil 3.2). Thoma lamının çukur bir kısmı vardır, lamel kapatıldığında bu çukurun yüksekliği 0,1 mm dir. İncelenecek materyal, bu kısım üzerine aktarılır. Thoma lamında 1 büyük kare, 16 orta boy kare ve her orta boy karede 25 küçük kare olmak üzere toplam 400 küçük kare vardır. Sayım bu karelerde yapılır. Küçük kare olarak belirtilen, gerçekte bir kare prizmadır. Derinlik boyutu, çukurun derinliğini göstermekte olup 0,1 mm dir. 1 küçük kare olarak belirtilen kare prizmanın hacmi = 0,05 mm x 0,05 mm x 0,1 mm = 0,00025 mm 3 = 1/4.000 mm 3 'dür. Bir sayım alanında 16 x 25 = 400 küçük kare olduğundan toplam sayım hacmi = 0,00025 mm 3 x 400 = 0,1 mm 3 'dür. Şekil 3.2. Thoma lamı sayım alanı Thoma lamında, hücre süspansiyonunun 1 ml sindeki hücre sayısını bulmak için; bir orta boy karede sayılan hücre adedi seyreltme faktörü ile çarpıldı, tüm kare sonucuna erişmek

35 22 için bu sayı 16 ile çarpıldı. 0,1 mm 3 ' deki hücre sayısını veren bu sonuç, matematik hesap gereği 10 4 ile çarpılarak 1 ml deki hücre sayısı hesaplandı (1ml = 1 cm 3 ) PROPOLİSİN HAZIRLANMASI Çalışmada, Kayseri bölgesinden toplanan propolisin etanol ile hazırlanan ektresi kullanıldı Propolis Konsantrasyonlarının Hazırlanması Propolisin etanollü ekstresinden 820 mg tartılarak 1 ml absolü etanolde çözüldü. Etanolde çözünmüş olan bu propolis çözeltisi, çapı 0,2 µm olan steril membran filtreden süzülerek steril hale getirildi. Bu ana stok solüsyonundan aşağıdaki formül kullanılarak % 10 etanol içeren distile suda 1024 µg/ml propolis konsantrasyonu elde edildi. C 1 x V 1 = C 2 x V 2 Propolisin 1024 µg/ml konsantrasyonundan aynı formül yardımı ile µg/ml arasında ikişer kat propolis konsantrasyonları hazırlandı. Böylece elde edilen konsantrasyonlardaki etanol içeriği % arasına düşürülmüş oldu.

36 DENEYİN YAPILIŞI Deneyin yapılış sırası Şekil 3.3 te gösterilmiştir. Çalışmanın tüm aşamaları biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirildi. Çözdürülecek hücreler için RPMI-1640 besiyeri oda ısısına getirilerek % 10 Fetal Bovine Serum ve % 2 penisilin-streptomisin ilave edildi. ATCC U-937 insan makrofaj hücreleri -80 C soğutucudan çıkarıldı, sıcaklığı 37 C ye ayarlı su banyosunda hızla çözdürüldü. Hücre çözeltisi taze besiyerinde santrifüj edildi, pellet besiyerine eklenerek pipetaj yapıldı.

37 24 Hücre kültür flaskları 37 C ye ayarlı % 5 CO 2 li inkübatöre kaldırıldı. Hücreler düzenli olarak invert mikroskopta morfolojisi ve sayısı yönünden incelendi. Hücreler, hücre yıkama çözeltisi ile yıkanarak ortalama 2 günlük aralıklarla pasajlandı. Her pasaj işleminde hücrelerin canlılığı trypan blue ile kontrol edildi. Hücreler pasajlanırken, pasaj sayısı aralığında bazı hücrelerin pasajı devam ettirilirken, bir kısım hücre ileri çalışmalarda tekrar kullanılabilmesi amacıyla dondurularak saklandı.

38 25 24 kuyucuklu hücre kültür plaklarında son hücre konsantrasyonu 1x10 6 hücre/ml olacak şekilde thoma lamında hücre sayımı yapıldı Propolisin etanolik ekstresinin konsantrasyonları, µg/ml arasında ikişer kat olacak şekilde ayarlandı ve çalışma kuyucuklarına hücrelerle birlikte dağıtıldı. Hazırlanan plak 37 C de % 5 CO 2 li inkübatörde 24 saat inkübe edildi. İnkübasyonun 0., 6. ve 24. saatlerinde, hücreler trypan blue ile boyanarak ışık mikroskobunda canlılık oranı ve morfoloji yönünden değerlendirildi. Şekil 3.3. Deneyin yapılış şeması

39 26 4. BULGULAR Propolisin µg/ml arasında ikişer kat artan konsantrasyonlarına maruz bırakılan makrofaj hücrelerinin, canlılık, hücre zarında düzensizleşme, sitoplazmada granülizasyon yönünden yapılan mikroskobik değerlendirme sonuçları Tablo 4.1 de sunulmuştur. Bu verilere göre inkübasyonun 6. saatinde propolisin 128 µg/ml, 24. saatinde 64 µg/ml konsantrasyonundan itibaren hücrelerin canlılık oranında azalma, hücre zarında düzensizleşme ve sitoplazmada granülizasyon görülmeye başlandı. Tablo 4.1. Propolisin makrofaj hücreleri üzerine etkilerinin mikroskobik değerlendirmesi Propolis konsantrasyonları Hücrelerin Mikroskobik Değerlendirmesi 0.saat 6.saat 24.saat 512 µg/ml Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %70 i canlı Hücre zarında düzensizleşme (++) Sitoplazmada granülizasyon (++) Hücrelerin %40 ı canlı Hücre zarında düzensizleşme (++++) Sitoplazmada granülizasyon (++++) 256 µg/ml Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %80 i canlı Hücre zarında düzensizleşme (++) Sitoplazmada granülizasyon (++) Hücrelerin %50 si canlı Hücre zarında düzensizleşme (+++) Sitoplazmada granülizasyon (+++) 128 µg/ml Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %85 i canlı Hücre zarında düzensizleşme (+) Sitoplazmada granülizasyon (+) Hücrelerin %60 ı canlı Hücre zarında düzensizleşme (++) Sitoplazmada granülizasyon (++) 64 µg/ml Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %85 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %80 i canlı Hücre zarında düzensizleşme (+) Sitoplazmada granülizasyon (+) 32 µg/ml Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %88 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %85 i canlı 16 µg/ml Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %90 ı canlı Morfoloji normal Hücrelerin %88 i canlı 0 µg/ml (Kontrol grubu) Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %95 i canlı Morfoloji normal Hücrelerin %90 ı canlı Morfoloji normal