Transkript

1

2

3

4

5

6

7 Derleme / Review 141 DO I: /MMJ Diyabet Komplikasyonlarında İleri Glikasyon Son Ürünleri Advanced Glycation End-Products in Complications of Diabetes Mellitus İlker PARMAKSIZ Gaziantep Medical Park, Biyokimya, Gaziantep, Türkiye Özet Diabetes mellitus ileri evrede mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonlarla karşımıza çıkan metabolik bir hastalıktır. Yüksek glukoz konsantrasyonlarında dolaşımdaki veya dokulardaki proteinlerin non-enzimatik glikasyonu ile ileri glikasyon son ürünlerinin oluştuğu bilinmektedir. İleri glikasyon son ürünleri hücrenin yapısını, fonksiyonunu değiştirirler ve sitokinler ile büyüme faktörlerinin sentezine ve salınımına sebep olurlar. Böylece ileri glikasyon son ürünleri diyabetin mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonlarının gelişimine katkı sağlarlar. İleri glikasyon inhibisyonunun nefropati, retinopati ve nöropati gibi diyabet komplikasyonlarını azaltıcı etkileri saptanmıştır. İleri glikasyon son ürünlerinin oluşumunun ve birikiminin tedavisinde kullanılan bazı ajanlar bu derlemede özetlenmiştir. (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2011;24:141-8) Anah tar Ke li me ler: Diabetes Mellitus, İleri glikasyon son ürünleri, Tedavi Abstract Diabetes mellitus is a metabolic disease, which results in microvascular and macrovascular complications in later stages. It has been known that with elevated glucose concentrations, proteins in both the circulation and the tissues are non-enzymatically glycated and this results in the production of advanced glycation end-products. Advanced glycation end-products alter cell structure and function which lead to the synthesis and release of cytokines and growth factors. Therefore, advanced glycation end-products contribute to the microvascular and macrovascular complications of diabetes mellitus. Inhibition of advanced glycation was found to reduce diabetic complications such as nephropathy, retinopathy and neuropathy. Some of the agents that are used for the treatment of advanced glycation end-products formation and accumulation are summarized in this review. (Marmara Medical Journal 2011;24:141-8) Key Words: Diabetes Mellitus, Advanced glycation end products, Treatment Gi riş Diabetes mellitus (DM), insülin sekresyonunda, insülin etkilerinde veya her ikisinde defekt sonucunda oluşan hiperglisemi ile karakterize kronik bir hastalıktır. DM de gözlenen karbohidrat, yağ ve protein metabolizmasındaki anormalliklerin temelinde insülinin hedef dokulardaki etkilerinin eksikliği vardır 1. Diyabetin metabolik sorunlarının yanısıra, bu hastaların uzun dönem hiperglisemiye maruz kalmaları nefropati, nöropati, retinopati ve ateroskleroz gibi mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonların gelişmesine de neden olmaktadır. Komplikasyonlar özellikle glukozun insülinden bağımsız olarak hücre içine girdiği kalp, sinir sistemi, küçük kan damarları gibi dokularda daha sık görülmektedir 2. Kanda yüksek seyreden şeker düzeyleri sonucu oluşan ileri glikasyon son ürünlerinin (advanced glycation end-products, AGE) bu komplikasyonların gelişiminde rol oynadığı düşünülmektedir. AGE, diyabetin kronik komplikasyonlarının dışında, romatoid artrit gibi konnektif doku hastalıklarında, Alzheimer gibi nörolojik hastalıklarda ve son dönem böbrek yetmezliği (end stage renal disease, ESRD) gibi birçok patolojik durumda karşımıza çıkabilmektedir 3. AGE Oluşum Mekanizması AGE ler, proteinler, lipoproteinler ve/veya nükleik asidlerde bulunan azotlu grupların, indirgeyici şekerlerin karbonil grupları ile nonenzimatik glikasyonu sonucu oluşan heterojen bileşiklerdir. AGE ürünleri ilk kez 1912 yılında Louis Camille Maillard tarafından tanımlan- İletişim/Correspondence to: İlker Parmaksız, Gaziantep Medical Park, Biyokimya, Gaziantep, Türkiye E-pos ta: ilkerp76@yahoo.com Başvuru Tarihi/Submitted: Ka bul Ta ri hi/ac cep ted: Marmara Medical Journal, Pub lis hed by Ga le nos Pub lis hing. / Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Der gi si, Ga le nos Ya yı ne vi ta ra fın dan ba sıl mış tır.

8 142 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet Marmara Medical Journal 2011;24:141-8 mıştır. AGE ler ilk kez gıda kimyasında kullanılmış, daha sonraları ise 1968 yılında HbA1c nin diyabetik hastalarda keşfi ile AGE ler araştırılmaya başlanmıştır 4. Protein glikasyonu, şekerin karbonil grubu ile proteinin serbest amino grubunun Schiff bazı oluşturmasıyla başlamaktadır. Schiff bazı oluşumu saatler içerisinde gerçekleşmekte ve sonrasında günler içerisinde Amadori ürünlerine dönüşmektedir. Amadori ürünleri ise daha sonra dikarbonil bileşiklerine ve sonrasında da haftalar içerisinde AGE lere dönüşmektedir (Şekil 1). Amadori ürünlerinin oluşumuna kadar olan bölüm geri dönüşümlü iken, daha sonraki evreler ise geri dönüşümsüzdür. Glikasyon, özellikle erken dönemlerde daha fazla olmak üzere konsantrasyon bağımlıdır, bu sebeple diyabette yapımı artar 3. AGE oluşumunda diğer bir mekanizma ise diyabette artmış olan oksidatif strese bağlı olarak şeker veya lipidlerin oksidasyonu sonucunda, ara ürün olarak reaktivitesi yüksek 3-deoksiglukozon, glyoxal ve metilglyoxal gibi düşük molekül ağırlıklı dikarbonil bileşiklerinin oluşumudur. Dikarbonil bileşikler genel olarak glikoliz ara ürünlerinden, glikasyona uğramış proteinlerin degradasyonundan ve lipidlerin peroksidasyonundan oluşabilmektedir. Bu yollara ilave olarak metilglyoxal, keton cisimlerinin metabolizması ve treonin katabolizması yollarıyla da az miktarda oluşabilmektedir. Dikarbonil bileşikler yüksek kimyasal aktiviteye sahiptir ve çok küçük konsantrasyonlarda bile direkt olarak proteinlerin terminal aminoasit rezidüsüyle reaksiyona girerek AGE oluşumuna yol açabilmektedir. AGE oluşumunda önemli diğer bir mekanizma ise polyol yolağıdır. Diyabete bağlı olarak ortaya çıkan yüksek miktarda glukozun bir kısmı önce sorbitole, sonrasında ise bir AGE ara ürünü olan 3-deoksi- glukozon a dönüşüp AGE oluşumuna katılmaktadır (Şekil 2) 5. Saatler içerisinde Günler içerisinde Haftalar, aylar içerisinde HC=0 HC=N- P H 2C-NH- P HC=O HCOH HCOH C=O C=O HCOH + H 2 N- P HCOH HCOH CH 2 AGE- P HCOH HCOH HCOH HCOH CH 2 OH CH 2OH CH 2OH CH 2OH Glukoz Schiff baz Amadori Ürünleri 3- Deoksiglukazon Şekil 1. Proteinlerin glikasyonu ve AGE oluşumu NH 2 -Protein Glukoz Aldoz Redüktaz Sorbitol Sorbitol Dehidrogenaz Fruktoz 3-Fosfokinaz Fruktoz-3-P Lipidler NADPH NADP + NAD+ NADH Fruktokinaz Glukoz-6-P Fruktoz-1-P Fruktoz-6-P Gliseraldehit Aldolaz Yağ asitleri Fruktoz-1-6-difosfat Gliseraldehit-3-P Dihidroksiaseton-P Gliseraldehit-3-P Dihidroksiaseton-P Proteinler Treonin Piruvat Metilglyoxal (MG) 3-Deoksiglukozon (3-DG) Glyoxal NH 2 -Protein NH 2-Protein NH 2-Protein AGE Şekil 2. Karbonil bileşikler ve AGE nin oluşum mekanizmaları

9 Marmara Medical Journal 2011;24:141-8 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet 143 Ancak bu reaksiyonlar da NADPH ve glutatyonun tüketimine yol açtığından dolayı dolaylı olarak oksidatif stresin artmasına da yol açmaktadır. AGE oluşumunda bu şekilde pek çok mekanizmanın rol oynaması AGE lerin heterojen bir yapıya sahip olmasına yol açmaktadır. Bu yollar dışında diyetle aldığımız gıdalar ve tütün ürünleri reaktif AGE prekürsörlerini içermektedir. Gıdalardaki AGE lere karşılaştırma amacıyla bakıldığında gıdaların yüksek derecede pişirilmesinin (ızgara, kızartma) AGE seviyesini anlamlı olarak arttırdığı, düşük derecede, kısa süreli ve bol su ile pişirmenin ise AGE yi azalttığı gösterilmiştir 6. Heterojen yapıya sahip bu AGE ler kimyasal yapılarına göre 3 e ayrılır 4 ; 1. Floresans çapraz bağlı AGE ler; pentosidine ve crossline 2. Non-floresans çapraz bağlı AGE ler; glucosepane ve MOLD 3. Çapraz bağ yapmayan AGE ler; N- Karboksimetil lizin (CML) ve Pyrraline AGE lerin Genel Özellikleri AGE oluşumunda etkili faktörler; proteinlerin yapım yıkım hızı, hiperglisemi derecesi, ve çevresel oksidan stresin miktarı ve yaygınlığıdır 7. AGE oluşumu haftalar süren bir süreç olduğu için genellikle uzun ömürlü proteinleri etkiler. Proteinlerdeki lizin, histidin, arginin amino asitleri glikasyona daha hassastır. Son dönem böbrek yetmezliği gibi yüksek düzeyde AGE oluşumunun olduğu durumlarda nükleik asit ve lipid bileşenler de AGE oluşumuna katılırlar 3. Glikasyon miktarı hiperglisemi derecesine bağlı olduğundan hem hücre içinde, hem de hücre dışında oluşabilir. İndirgeyici şekerler içerisinde glukoz en düşük glikasyon yapma oranına sahipken fruktoz, treoz, gliseraldehit-3-fosfat ve glukoz-6- fosfat gibi şekerler daha yüksek glikasyona neden olma oranına sahiptir 8. AGE Etki Mekanizmaları ve AGE Reseptörleri AGE ler temelde diyabet komplikasyonlarında iki şekilde rol almaktadır. Bunlardan birincisi; özellikle ekstrasellüler matriksin yapısındaki proteinler arasında çapraz bağlar oluşturarak matriks yapısını ve fonksiyonlarını bozmak, ikincisi ise; AGE lerin birtakım hücrelerde bulunan reseptörlerine bağlanması sonucunda çeşitli sinyal yolaklarını aktive ederek çeşitli transkripsiyon faktörlerinin ve sitokinlerin sentezine ve salınımına yol açılmasıyla pek çok metabolik değişikliklere neden olmasıdır (Şekil 3) 7. AGE ler başlıca; ileri glikasyon son ürünleri için reseptörler (receptor for advanced glycation endproducts, RAGE), çöpçü reseptörler (Class A, CD36, class B tip1, LOX-1, FEEL-1, FEEL-2), AGE-R1 (oligosakkaril transferaz-48), AGE-R2, AGE-R3 (Galektin-3) isimli reseptörlere bağlanmaktadır. Bu reseptörler içerisinde en çok incelenmiş olanı RAGE dir ve IgG süperailesinin bir üyesidir. Başlıca mononükleer fagositler, endotel hücresi, düz kas hücresi ve astrositlerde bulunur, ancak normal damar ve dokularda çok az eksprese edilirler 2. RAGE, AGE ler dışında inflamatuvar sitokinler, amfoterin, amiloid-β ve diğer fibriler proteinler ile uyarılabilir. RAGE ekspresyonu diyabet ve inflamasyonda artar 4. RAGE nin hücre dışı kısmı V tipi bölge ve C tipi bölge olmak üzere 2 bölgeden oluşur. V tipi bölge, ligand bağlanmasından sorumlu iken C tipi bölge, V tipi bölgenin stabilitesini sağlar. Bu kısmı takip eden transmembran bölge ise reseptörün membrana çapalanmasını sağlar. Transmembran bölgenin ucunda ise küçük bir intrasitoplazmik kuyruk bulunur; bu kısım hücre içi sinyalizasyonu sağlayan kısımdır 9. 3 farklı RAGE izoformu mevcuttur. Bunlar; full-length RAGE, solubl RAGE (srage) ve dominant negatif RAGE (DNRAGE) dir. Bu 3 tip reseptörün temel farkı full-length RAGE dışındakilerde intrasitoplazmik kuyruğun olmamasıdır. Dolayısıyla hücre içi sinyalizasyonu sadece full-length RAGE yapabilir. Bu özellik sebebiyle DNRAGE ve srage AGE etkilerini baskılayıcı tarzda etkilidir 10. AGE nin reseptörü olan RAGE ye bağlanması ile NAD(P)H oksidaz, p21ras, mitojen ile aktive edilen protein kinaz (MAPKs), hücre dışı sinyal ile regüle edilen kinaz 1/2, p38, Cdc42 ve Rac gibi GTPazların hücre içi sinyal yolaklarını uyarması NF κb yi aktive eder. NF κb nin aktivasyonu ise inflamatuvar sitokinlerin, adezyon moleküllerinin ve çeşitli mediyatörlerin ekspresyonuna sağlar 11. NF κb nin aktivasyonu ile çöpçü reseptörler, AGE-R1, AGE-R2, AGE-R3 reseptörleri AGE RAGE Oksidatif stres NF-kB aktivasyonu NF-kB kontrolündeki genlerin ekspresyonunda artış Pro-inflamatuvar sitokinlerin yapımı IL-1α IL-6 TNF-α Adezyon moleküllerinin ekspresyonunun artışı VCAM-1 Prokoagulan durumu Doku faktörü Trombomodulin Vazkonstrüksiyon Endotelin-1 Şekil 3. AGE-RAGE etkileşimi ve NF-κB aktivasyonu sonucu oluşan değişiklikler

10 144 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet Marmara Medical Journal 2011;24:141-8 de AGE bağlar ancak RAGE gibi sinyal iletisi başlatmaz ve AGE lerin detoksifikasyon ve klirensini sağlar. Diyabetik Retinopati Diyabetik retinopati körlüğün en yaygın sebebidir. Retinopati, kan damarlarında artmış proliferasyon, mikroanevrizma oluşumu, vasküler oklüzyon, hemoraji ve infarktlarla karakterize bir tablodur 2. Diyabetik retinopatide gözlenen en erken patolojik değişiklik perisit kaybıdır ve AGE ler AGE reseptörüne sahip perisitlere toksiktir 12. Perisit kaybı ile beraber bazal membran kalınlaşması, hiperpermeabilite ve mikroanevrizma oluşumu gibi karakteristik değişiklikler gözlenmektedir. Mikrovasküler homeostazın sağlanmasında perisitler önemli bir rol oynar ve perisit kaybı damarları endotel hücre zedelenmesi, anjiogenez ve trombogeneze eğilimli hale getirir 13. Yapılan çalışmalarda perisit ve vasküler endotel hücrelerinde RAGE mrna düzeylerinin upregüle olduğu görülmektedir 14. Retinal hücrelerin AGE ye maruziyeti potent bir mitojen olan vasküler endoteliyal büyüme faktörün (vascular endothelial growth factor, VEGF) gen ekspresyonunu artırır. Artan VEGF düzeyleri ise anjiogenez ve neovaskülerizasyonu uyarır 2. Yapılan in vitro çalışmalarda AGE nin VEGF aracılığıyla hücre içi hücre adezyon molekülü-1 (intracellular cell adhesion molecule 1, ICAM- 1) in ekspresyonuna sebep olarak retinal mikrovasküler endotel hücrelerine lökosit adezyonunu artırdığı gösterilmiştir 13. Diyabetik Ateroskleroz Ateroskleroz, uzun dönem diyabetin en ciddi sonucudur ve bu hastalarda ölümün major sebebidir. Diyabette LDL nin artmış glikasyonu LDL nin reseptörü tarafından tanınmasını önler ve serum klirensini de azaltır 15. Glikasyona uğramış LDL makrofaj çöpçü reseptörleri tarafından alınır ve köpük hücresi oluşumuna sebep olur. LDL nin aksine HDL nin glikasyonu onun metabolizmasını artırır. Ayrıca HDL nin glikasyona uğraması ters kolesterol taşınımındaki etkinliğini de azaltmaktadır 16. Ayrıca HDL yapısında bulunan paraoksonaz (PON) enziminin glikasyona uğramasına ve onun LDL yi oksidasyondan korumadaki etkinliğinin azalmasına yol açmaktadır 17. Bunlar dışında arter duvarındaki kollajendeki artmış AGE oluşumu damar yapısındaki rijiditeyi artırarak ateroskleroz sürecine katkı sağlamaktadır. Damar yapısında AGE bağlanmış kollajen, LDL yi bağlayarak plak oluşumunu hızlandırır. AGE nin bu etkileri dışında insülin benzeri büyüme faktörü 1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) ve platelet kaynaklı büyüme faktörü (platelet-derived growth factor, PDGF) gibi sitokinlerin salınımını artırır. Bu sitokinler monosit ve makrofajların migrasyonunu artırmak dışında düz kas hücre proliferasyonunu da artırarak plak oluşumunu hızlandırır 2. Bunlar dışında AGE nin T lenfositler üzerindeki RAGE reseptörüne bağlanması γ-interferon yapımını uyararak doku hasarına yol açmaktadır 11. Diyabetik Nefropati Diyabetik nefropati bazal membran kalınlaşması, mezengiumda genişleme, glomerüler filtrasyonda azalma, albuminüri ve en sonunda böbrek yetmezliği ile karakterize bir tablodur 18. Yapılan pek çok çalışmada diyabetik nefropatide VEGF in rolünü destekleyen sonuçlar elde edilmiştir. VEGF böbrekte glomerüler podositlerden eksprese edilir. VEGF reseptörleri özellikle glomerüler endotel hücreleri üzerinde bulunur ve endotel hücrelerinden antiapoptotik proteinlerin salınımına yol açar. Obez tip 2 diyabet modelinde de VEGF inhibisyonu sonucunda glomerüler hipertrofinin de önlendiği görülmüştür 19. Sıçanlarda streptozotosin (STZ) ile oluşturulmuş diyabet modelinde VEGF e karşı antikor miktarının artması durumunda filtrasyonda ve albuminüride düzelme olması da bunu destekler 20. VEGF dışında hiperglisemi ve AGE artışı böbrekte podosit ve proksimal tübüler hücrelerinden transforme edici büyüme faktörü β (transforming growth factor β, TGFβ) salınımını artırmaktadır. TGF-β ise ekstrasellüler matriks bileşenlerinden olan kollajenin sentezini uyarıp bazal membranın kalınlaşmasına yol açmaktadır. Yapısı bozulmuş olan bazal membran aynı zamanda plazma proteinlerinin de bu alanda sıkışmasına yol açarak filtrasyonun bozulmasına yol açmaktadır 2. Diyabetik Nöropati Diyabetik nöropati, sinir iletiminde yavaşlama gibi fonksiyonel anormalliklere eşlik eden periferik sinirlerin segmental demiyelinizasyonu ve aksonal dejenerasyonu ile karakterize bir tablodur 2. Diyabetik hastaların periferik sinirlerinde artmış AGE düzeyleri tesbit edilmiştir. Diyabetin fare modellerinde AGE nin sensorimotor sinir iletim hızını ve periferik sinirlere kan akımını azaltarak diyabetik nöropatiyi artırdığı gösterilmiştir. Diyabette özellikle artmış myelin glikasyonu görülmektedir. Glikasyona uğramış miyelin, makrofajlar tarafından fagositoza duyarlı hale gelir ve makrofajların salgıladığı proteazlar demyelinizasyona yol açar 21. Ayrıca myelin üzerinde biriken AGE, IgG ve IgM gibi plazma proteinlerini tutarak immunolojik reaksiyonlara yol açarak zedelenmeyi artırmaktadır 2. Siyatik sinir ile yapılan çalışmalarda AGE uygulamasını takiben diyabetteki hiperglisemiye benzer değişikliklerin gözlenmesi ve bu değişikliklerin RAGE antikorları verilmek suretiyle baskılanması, AGE nin diyabetik nöropati gelişimindeki rolünü desteklemektedir. İlginç olarak RAGE blokajı ile az miktarda da olsa NF κb aktivasyonunun ve IL-6 ekspresyonunun sürmesi nöropati gelişiminde AGE nin tek başına etkili olmadığını düşündürmektedir 22. AGE Ölçüm Yöntemleri Erken glikasyon ürünlerinin (Amadori ürünleri) ölçümü, diyabetik hastalarda metabolik kontrolü değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu amaçla en çok kullanılan parametrelerden birisi glikozile hemoglobin (HbA1c) düzeylerinin tesbitidir. HbA1c düzeyleri glukoza maruz kalınan son 4-8 haftalık dönemde gerçekleşen glikasyonu temsil etmektedir ve glukoz düzeyleri ile lineer korelasyon göstermektedir. HbA1c ölçümünde çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Glikolize hemoglobin düzeylerinin belirlenmesi için kolorimetrik yöntem, elektroforetik yöntem, izo-elektrofokus yöntemi, immünometrik yöntemlerin kullanılması denenmiştir yılında American Association for Clinical Chemistry (AACC) tarafından

11 Marmara Medical Journal 2011;24:141-8 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet 145 Tablo I. Erken, ara ve ileri glikasyon son ürünlerinin ölçüm yöntemleri Dönem Ölçülen analit Ölçüm yöntemi Erken dönem Fruktozamin Kolorimetri glikasyon ürünleri Amadori ürünleri HbA1c HPLC, kolorimetri, immünometri, kütle spektrometresi (MS) Ara dönem Metil glioksal, HPLC ve gaz glikasyon ürünleri glioksal ve kromotografi/mass 3 deoksiglukozon spektrometri (GC/MS) AGE CML, pentosidin ELISA, HPLC, RIA, kolorimetri, florometri, immunhistokimya, western blot, otofloresans yüksek basınçlı sıvı kromatografisi high performance liquid chromatography (HPLC) referans metod olarak tavsiye edilmiştir. International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) ise kütle spektrometri yöntemi ile referans HbA1c standartları hazırlatılarak rutin HbA1c ölçümünü önermiştir. Daha erken dönemdeki glikasyon ürünlerinin değerlendirilmesinde glikasyona uğramış serum proteinleri de kullanılmaktadır ve son 2 haftalık dönemdeki glisemik kontrolü yansıtmaktadır. Bu amaçla en sık olarak fruktozamin düzeyleri kullanılmaktadır, ancak bu yöntem askorbik asit ve glutatyon gibi serumdaki diğer indirgeyici ajanlar ile interferans verebilmektedir. Bunun dışında aynı dalga boyunda ölçüm yapılan trigliserid ve bilirubin düzeylerinin yüksek olduğu hastalarda hatalı yüksek sonuçlar verebilmektedir. Ara dönem (intermediate) glikasyon ürünlerinin değerlendirilmesinde metil glioksal, glioksal ve 3-deoksiglukozon düzeylerinin ölçümü kullanılmaktadır. Metil glioksal ve glioksal ölçümleri için HPLC ve gaz kromotografi/kütle spektrometri (gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS) yöntemleri kullanılabilmektedir. Ancak reaktivitesinin yüksek olması sebebiyle 3-deoksiglukozonun HPLC yöntemi ile ölçülmesi zordur. AGE düzeylerinin ölçümünde ise, AGE nin yapısı dolayısıyla ilk zamanlarda spektroskopik ve florometrik yöntemler kullanılmaktaydı. Ancak bu yöntemlerin spesifitesinin düşük olması sebebiyle poliklonal antikorlardan yararlanarak RIA ve ELISA gibi immünometrik yöntemler kullanılmaya başlanmıştır. Kimyasal yapısının karmaşıklığı, AGE nin net yapısının ortaya konmasını güçleştirmektedir. Yapısı belirlenmiş olan AGE lerden pentosidinin HPLC ile ölçümü yapılabilmektedir, ancak ticari olarak kullanılabilen bir standartı henüz yoktur. CML düzeylerinin ise ELISA, immunohistokimya, ve kolorimetrik yöntemlerle ölçümü yapılabilmektedir. Pyrralin düzeyleri ise ELISA yöntemi ile, eğer yüksek konsantrasyonlarda ise HPLC yöntemiyle ölçülebilmektedir 11. Günümüzde SRAGE düzeylerinin ölçümünde ELISA, CML düzeylerinin ölçümünde ELISA, kolorimetrik yöntem, immunohistokimya ve Western-blot yöntemlerini kullanarak çalışan ticari kitler mevcuttur. Bunlar dışında cilt otofloresans yöntemi gibi dokudaki CML, pentosidin düzeylerinin değerlendirilmesinde kullanılan, invaziv olmayan ve uzun dönem glisemik düzeyleri yansıtan bir yöntem geliştirilmiştir. Cilt otofloresansı diyabet ve ESRD için kardiyovasküler mortalitenin belirtecidir 23,24. Erken, ara ve ileri glikasyon son ürünlerinin ölçümünde kullanılan yöntemler ve analitler tablo I de özetlenmiştir. Tedavi AGE oluşumunun, çapraz bağ oluşumunun ve AGE nin etkilerinin önlenmesinde çeşitli tedavi seçenekleri denenmiştir. Bunlardan bazıları aşağıda sıralanmıştır: AGE yapımının inhibisyonu (Aminoguanidin, OPB-9195, LR türevleri, pridoksamin) Çapraz bağ kırıcılar (PTB, ALT-711, Pyridinium-3-[[2- (methylsulfonyl) hydrazino] carbonyl]-1-[2-oxo-2-2- thienyl)ethyl]-chloride (TRC4186), 3-benzyloxycarbonylmethyl- 4-methyl-thiazol-3-ium bromide (C36) RAGE blokajı (srage, RAGE antikorları) AGE klirensi (Lizozim) Eksojen AGE maruziyetinin azaltılması (Beslenme alışkanlıklarında değişiklik, AST-120) Antioksidan aktivite ve/veya metal şelasyonu yapanlar (aspirin, ibuprofen, indometazin, D-penisilamin, desferoksamin ve flavonoidler ve piaglitazon) Diğer yöntemler (Aldoz redüktaz inhibitörleri, anjiyotensin reseptör blokerleri, metformin, tiamin ve benfotiamin) Yapılan çalışmalarda ileri glikasyon inhibisyonunun diyabetik nefropati, retinopati ve nöropati komplikasyonlarını azaltıcı etkileri saptanmıştır 25. AGE yapımının inhibisyonu için kullanılan ilaçlar içerisinde ilk denenmeye başlanan bir nükleofilik hidrazin bileşiği olan aminoguanidindir (AG). AG, bir hidrazin (-NHNH2) ve bir guanidin grubundan [-NH-C(=NH)] oluşur ve dikarbonil bileşikleri ve Amadori ürünleri gibi glukozdan türeyen ara ürünlerle reaksiyona girer ve AGE oluşumunu önler. Erken glikasyon ürünlerinin oluşumunu ise engellemez. Bunun yanında başta inos olmak üzere ve konsantrasyon arttıkça diğer NOS türlerini de inhibe etmektedir. Ayrıca yüksek dozlarda antioksidan özellik göstermektedir. Bu etkilerine ilave olarak diyabetik hastalarda 1gr/gün dozda AG kullanımının serum kolesterol, trigliserid ve LDL-kolesterol düzeylerini azalttığı gösterilmiştir 26. Tip 1 diyabetin hayvan modelinde yapılan çalışmalarda AG in mezengial genişleme ve albuminüriyi azalttığı görülmüş. Benzer şekilde tip 2 diyabetin hayvan modellerinde de mezengial genişleme, albuminüri ve bazal membran kalınlaşmasını önlediği gösterilmiştir 27. Sıçanlarda streptozotosin ile oluşturulan diyabet modelinde ise AG kullanımının üriner albumin atılımını azalttığı ve glomerüler bazal membran kalınlaşmasını önlediği gösterilmiştir 28. Yine sıçanlarda streptozotosin ile oluşturulan diyabet modelinde cilt yapısında diyabete bağlı oluşan değişikliklerin AG tedavisiyle önlendiği gözlenmiştir 29. Ayrıca yapılan bazı çalışmalarda diyabetik sıçanların böbrek kortekslerindeki artmış lipid peroksidasyonunun AG kullanımıyla azaldığı rapor edilmiştir 30. Diyabetik sıçanlarda yapılan çalışmalarda, AG kullanımının retinal damarlardaki anormal endotel hücre proliferasyonunu ve perisit kaybını önlediği, bununla beraber sinirlerdeki kan akımındaki azalma ve sinir iletim hızındaki yavaşlamayı önlediği gösterilmiştir. Tip 1 diyabetli 690 kişide yapılan ACTION I çalışmasında

12 146 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet Marmara Medical Journal 2011;24:141-8 ise serum kreatinin düzeylerinde artış gözlenmesi sebebiyle çalışma sonlandırılmıştır. Tip 2 diyabetiklerde yapılan başka bir çalışma da güvenlik endişeleri ve AG in etkinliğinin görülmemesi sebebiyle sonlandırılmıştır. Ancak grip benzeri semptomlar, glomerülonefrit, karaciğer fonksiyon testlerinde anormallikler, B6 vitamin eksikliği, nadiren vaskülit ve anemi gibi yan etkilerin yanı sıra bir kısım hastalarda miyeloperoksidaz ve antinötrofil antikorlarının gözlenmesi sebebiyle çalışmalar sekteye uğramıştır 27,22. OPB-9195, tiyazolidin türevidir. Mekanizması AG ile aynıdır ancak AG den çok daha etkili dikarbonil bileşiklerini tutmaktadır. Yapılan çalışmalarda TGF-β ve VEGF ekspresyonunu azaltarak glomerüler sklerozu, glomerülde AGE birikimini ve albuminüriyi azalttığı gösterilmiştir 22. Yapılan klinik çalışmalar ise OPB nin vitamin B6 eksikliğine yol açması sebebiyle durdurulmuştur 31. TRC4186 ise bir klorid tuzudur. TRC4186 ile yapılan hayvan çalışmalarında kardiyak disfonksiyon gelişimini yavaşlattığı ve ranal disfonksiyonun şiddetini azalttığı gösterilmiştir. TRC4186 ile yapılan çalışmalar faz II aşamasındadır ve umut vericidir 32. Bir tiazolyum bileşiği olan C36 ise etkinliğ ALT-711 ile aynı iken LD50 değeri ise ALT-711 den çok daha düşüktür ve çalışmalar devam etmektedir 33. Yakın zamanda AGE oluşumu ve glikasyonu inhibe eden 3 aromatik bileşik geliştirildi. LR-90, LR-9, LR-74 birden fazla evrede etkili olan glikasyon inhibitörleridir ve AG den daha etkilidirler. Diyabetik sıçanlarda membran kalınlaşmasını ve mezengial genişlemeyi önleyerek diyabetik nefropati gelişimini önlemede umut verici sonuçlar vermişlerdir. Bununla beraber ekstrasellüler dokudaki kollajen içerisindeki protein çapraz bağlarını azalttığı görülmüştür. LR-9 ve LR-74 ün ayrıca cilt kollajenindeki CML miktarlarını azalttığı ve LDL oksidasyonunu azalttığı görülmüştür 27. Pridoksamin bir B6 vitamin türevidir ve Amadori ürünlerinin AGE ürünlerine degradasyonunu inhibe etmektedir. Sıçan modellerinde renal hipertrofiyi ve retinal lezyonları önleyip hiperlipidemiyi azalttığı da görülmüştür 34,35. Çapraz bağ kırıcılar içerisinde ise ilk denenen bileşik Phenyl-thiazolium-bromide (PTB) dir in vitro deneylerde dokularda AGE birikimini azalttığı gözlenirken, proteinüri üzerinde ve ciltteki çapraz bağlı kollajenler üzerinde bir etkisi gözlenmemiştir. Ancak bu etkisizlik fizyolojik sıvılardaki dayanıksızlığından kaynaklanmaktadır 36. ALT-711 hipertansiyon ve kalp yetmezliği gibi kardiyovasküler hastalıklar için geliştirilmiş ve hayvan çalışmalarında büyük arterlerdeki rijiditeyi azalttığı, kardiyak outputu artırdığı, ateroskleroz gelişimini azalttığı gösterilmiştir 27. Bunlara ilave olarak STZ ile diyabet oluşturulmuş farelerde ALT-711 ile tedavi sonucunda RAGE ekspresyonunda, renal CML birikiminde ve TGF-β salınımında azalma tesbit edilmiştir 4. Hayvan modellerinde diyabetik vaskülopatide RAGE nin rolü derinlemesine incelenmekte ve diyabetik vaskülopati gelişiminde AGE-RAGE etkileşiminin önemli bir yeri olduğunu ileri sürülmektedir. srage, RAGE nin ekstrasellüler ligand bağlanma bölgesine sahip formudur ve diyabetik hayvan modellerinde diyabetik aterosklerozda görülen hızlanmış vasküler değişiklikleri baskıladığı görülmüştür. Bununla beraber srage ile yapılan çalışmalarda diyabetteki yara iyileşmesini hızlandırdığı, inflamatuvar hücrelerin migrasyonunu artırırken tümör nekroz faktör-α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α), interlökin -6 (interleukin-6, IL-6), matriks metalloproteinaz (matrix metalloproteinase, MMP) gibi sitokinlerin salınımını azalttığı görülmüştür 37. srage ile yapılan çalışmalara ilave olarak RAGE antikorlarının db/db farelerde uygulanması ile yapılan çalışmalarda 2 hafta sonunda albuminüri, mezengial genişleme, bazal membran kalınlaşmasında azalma ve kreatinin klirensinde düzelme tesbit edilmiştir. Buna benzer sonuçlar Tip 1 diyabet modellerinde de tesbit edilmiştir. Ayrıca diyabetik farelerde srage uygulaması sonucunda VCAM-1, TGF-β, fibronektin ve tip IV kollajen ekspresyonunun azaldığı ve damarda AGE birikiminin önlenerek aterosklerozu baskıladığı gösterilmiştir 4. Diyetle beraber alınan AGE lerin absorbsiyonunun inhibisyonunda oral adsobent olan AST-120 nin kullanılması kronik renal yetmezliğin ilerlemesini azaltmaktadır. Kronik renal yetmezliği olan non-diyabetik bireylerde AST-120 kullanımı AST-120 nin CML ye bağlanmasına ve serum AGE düzeylerinin azalmasına yol açmaktadır 38. Birçok in vitro çalışmada aspirin, ibuprofen, indometazin, D- penisilamin, desferoksamin ve flavonoidlerin kullanımının AGE oluşumunu inhibe ettiği rapor edilmiştir. Bu inhibisyonda olası mekanizma oksidatif stresin bu ajanlar tarafından azaltılmasıdır. Ancak diklofenak aynı zamanda erken glikasyon ürünlerini de inhibe etmektedir. Tiyazolidinedion türevi olan piaglitazon ile yapılan in vitro çalışmalarda ise piaglitazonun dikarbonil bileşikleri tuttuğu ve metal şelasyonu yaptığı görülmüştür. Diyabete bağlı hiperglisemi durumunda fazla glukoz, aldoz redüktaz yolu aracılığı ile fruktoz oluşumu yolağına sapar ve sonrasında glioksal, metilglioksal ve 3-deoksiglukozon türevlerine dönüşür. Diyabetik sıçanlarda epalrestat gibi aldoz redüktaz inhibitörleri (ARI) kullanımı, lenste pentosidin düzeylerini azaltırken ekstrasellüler matrikste çapraz bağlanmış AGE birikimini önlemektedir. Ayrıca diyabetik hemodiyaliz hastalarında lipid peroksidasyonunu azalttığı görülmektedir. Bu hastalarda imidazolon ve CML düzeylerinin azalması hem sorbitol yolunun inhibisyonuna, hem de lipid peroksidasyonunun inhibisyonuna bağlı olabilir çünkü CML nin bir kısmı lipid peroksidasyonu sonucunda oluşmaktadır. Yapılan bir takım çalışmalarda antihipertansif ajan olan olmesartan (Anjiotensin II reseptör blokeri) ve temocaprilat (angiotensine converting enzyme inhibitörü) kullanımının AGE düşürücü etkler gösterdiği görülmüştür. Bu ajanların karbonil bileşikleri tutarak etki yapabileceği düşünülmektedir. Bu ajanların 2 oksidatif basamağı etkileyerek de yapabileceği düşünülmektedir 27. Biguanid bileşiği olan metforminin Tip 2 diyabetlilerde kullanımının kandaki metilglioksal düzeylerini azalttığı tesbit edilmiştir 39. STZ ile diyabet oluşturulmuş sıçan modelinde ise metformin kullanımının lens, siyatik sinir ve renal korteksde artamış AGE düzeylerinin plazma haricinde azaldığı tesbit edilmiştir. Metforminin bu etkiyi metilglioksal ve diğer dikarbonil bileşikleri tutarak yapabileceği düşünülmektedir 27. Benfotiamin B1 vitamini türevi olup kullanımı transketolaz aktivitesini artırarak pentoz fosfat yolunu stimüle eder. Bu yolağın aktivasyonu ise vasküler hasardan sorumlu tutulan hekzosamin yolağı, hücre içi AGE oluşum yolu ve DAG/Protein kinaz C yolaklarının etkilerinin azalmasına yol açar 40. Hayvan deneylerinde yük-

13 Marmara Medical Journal 2011;24:141-8 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet 147 sek doz tiamin ve benfotiamin kullanımının ise transketolaz aktivetisini artırırken albuminüriyi azalttığı gösterilmiştir 41. Sonuç Diyabetin kronik komplikasyonlarının gelişiminde AGE oluşumu ve etkileri önemli bir yer tutmaktadır. Bu heterojen bileşiklerin yapısının net bir şekilde anlaşılması, ölçüm yöntemlerinin standart hale getirilmesi, uzun dönem komplikasyonların patofizyolojisinin net bir şekilde anlaşılması, tedavi seçeneklerinin belirlenmesinde önemli bir basamağın aşılması anlamına gelecek ve diyabetli hastalarda glikasyondan kaynaklanan geç dönem komplikasyonların gelişiminin izlenmesinde yeni bir araç olacaktır. Kaynaklar 1. American Diabetes Association (ADA). Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 2011;34:S62-9. doi: / dc11-s Nessar A. Advanced glycation endproducts-role in pathology of diabetic complications. Diabetes Res Clin Pract 2005;67: doi: /j.diabres Singh R, Barden A, Mori T, et al. Advanced glycation end-products: A review. Diabetologia 2001;44: doi: /s Peyroux J, Sternberg M. Advanced glycation endproducts (AGEs): pharmacological inhibition in diabetes. Pathol Biol (Paris) 2006;54: doi: /j.patbio Turk Z. Glycotoxines, carbonyl stress and relevance to diabetes and its complications. Physiol Res 2010;59: Huebschmann AG, Vlassara H, Regensteıner JG, et al. Diabetes and advanced glycoxidation end products. Diabetes Care 2006;29: doi: /dc Goldin A, Beckman JA, Schmidt AM, et al. Advanced glycation end products: Sparking the development of diabetic vascular injury. Circulation 2006;114: doi: /circulationa- HA Bierhaus A, Hofmann MA, Ziegler R, et al. AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept. Cardiovasc Res 1998; 37: doi: /s (97) Schmidt AM, Yan SD, Yan SF, et al. The multiligand receptor RAGE as a progression factor amplifying immune and inflammatory responses. J Clin Invest 2001;108: doi: /jci Ding Q, Keller JN. Evaluation of RAGE isoforms, ligands and signaling in the brain. Biochim Biophys Acta 2005;1746: doi: / j.bbamcr Lapolla A, Traldi P, Fedele D. Importance of measuring products of non-enzymatic glycation of proteins. Clin Biochem 2005; 38: doi: /j.clinbiochem Chibber R, Molinatti PA, Rosatto N, et al. Toxic action of advanced glycation endproducts on cultured retinal capillary pericytes and endothelial cells: relevance to diabetic retinopathy. Diabetologia 1997; 40: doi: /s Yamagashi S. Role of advanced glycation end products (AGEs) and receptor for AGEs (RAGE) in vascular damage in diabetes. Exp Gerontol 2011;46: doi: /j.exger Tanaka N, Yonekura H, Yamagishi S, et al. The receptor for advanced glycation endproducts is induced by the glycation products themselves and tumour necrosis factor-a through nuclear factor-kb, and by 17 b-estradiol through Sp-1 in human vascular endothelial cells, J. Biol Chem 2000;275: doi: /jbc.m Bucala R, Makita Z, Vega G, et al. Modification of LDL by advanced glycation endproducts contribute to the dyslipidaemia of diabetes and renal insufficiency. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91: doi: /pnas Duell PB, Oram JF, Bierman EL. Nonenzymatic glycosylation of HDL and impaired HDL receptor mediated cholesterol efflux. Diabetes 1991;40: doi: /diabetes Camps J, Marsillach J, Joven J. The paraoxonases: role in human diseases and methodological difficulties in measurement. Crit Rev Clin Lab Sci 2009;46: doi: / Sugiyama S, Miyata T, Horie K, et al. Advanced glycation endproducts in diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 1996;11: Schrijvers BF, Flyvbjerg A, Tilton RG. A neutralizing VEGF antibody prevents glomerular hypertrophy in a model of obese type 2 diabetes, the Zucker diabetic fatty rat. Nephrol Dial Transplant 2005;21: doi: /ndt/gfi De Vriese, AS, Tilton RG, Elger, M, et al. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soc Nephrol 2001;12: Vlassara H, Brownlee M, Cerami A, Recognition and uptake of human diabetic peripheral nerve myelin by macrophages. Diabetes 1985;34: doi: /diabetes Goh SY, Cooper ME. The role of advanced glycation end products in progression and complications of diabetes. J Clin Endocrinol Metab : doi: /jc Ueno H, Koyama H, Tanaka S, et al. Skin autofluorescence, a marker for advanced glycation end product accumulation, is associated with arterial stiffness in patients with end-stage renal disease. Metabolism 2008;57: doi: /j.metabol Chabroux S, Canouï-Poitrine F, Reffet S, et al. Advanced glycation end products assessed by skin autofluorescence in type 1 diabetics are associated with nephropathy, but not retinopathy. Diabetes Metab 2010;36: Wautier JL, Guillausseau PJ. Advanced glycation end products, their receptors and diabetic angiopathy. Diabetes Metab 2001; 27: doi: /j _16.x 26. Thornalley PJ. Use of aminoguanidine (Pimagedine) to prevent the formation of advanced glycation endproducts. Arch Biochem Biophys 2003; 419: doi: /j.abb Schalkwijk CG. Therapeutic interventions in the glyc(oxid)ation pathway. Immunol Endocr Metab Agents Med Chem 2007;7: Gogas Yavuz D, Ersöz HÖ, Tuncel M, et al. Effects of aminoguanidine on glomerular basement membrane thickness and anionic charge in a diabetic rat model. Int J Exp Diabetes Res 2001;2: doi: /EDR Gogas Yavuz D, Bozkurt S, Aydın H, et al. Effects of aminoguanidine on dermal collagen structure and TGF-beta expression in streptozotocin induced diabetic rats. Marmara Med J 2005;18; Gogas Yavuz D, Küçükkaya B, Ersöz HÖ, et al. Effects of aminoguanidine on lipid and protein oxidation in diabetic rat kidneys. Int J Exp Diabetes Res 2002;3: doi: / Daroux M, Prevost G, Maillard-Lefebvre H. Advanced glycation end-products: Implications for diabetic and non-diabetic nephropathies. Diabetes Metab 2010;36:1-10. doi: /j.diabet Kaur H, Prabhakar S. Novel therapies of diabetic nephropathy. Nephrology Reviews 2011; 3:e4: doi: /nr.2011.e4 33. Cheng G, Wang LL, Long L, et al. Beneficial effects of C36, a novel breaker of advanced glycation endproducts cross-links, on the cardiovascular system of diabetic rats. Br J Pharmacol 2007;152: doi: /sj.bjp

14 148 İlker Parmaksız İleri Glikasyon Son Ürünleri ve Diyabet Marmara Medical Journal 2011;24: Degenhardt TP, Alderson NL, Arrington DD, et al. Pyridoxamine inhibits early renal disease and dyslipidemia in the streptozotocindiabetic rat. Kidney Int 2002;61: doi: /j x 35. Stitt A, Gardiner TA, Alderson NL, et al. The AGE inhibitor pyridoxamine inhibits development of retinopathy in experimental diabetes. Diabetes 2002;51: doi: /diabetes Cooper ME, Thallas V, Forbes J, et al. The cross-link breaker, N-phenacylthiazolium bromide prevents vascular advanced glycation end-product accumulation. Diabetologia 2000;43: doi: / s Goova MT, Kislinger JLT, Bucciarelli WLG, et al. Blockade of receptors for advanced glycation endproducts restores effective wound healing in diabetic mice, Am J Pathol 2001;159: doi: /s (10) Yamagishi S, Nakamura K, Matsui T, et al. Oral administration of AST-120 (Kremezin) is a promising therapeutic strategy for advanced glycation end product (AGE)-related disorders. Med Hypotheses 2007;69: doi: /j.mehy Beisswenger PJ, Howell SK, Touchette AD, et al. Metformin Reduces Systemic Methylglyoxal Levels in Type 2 Diabetes. Diabetes 1999;48: doi: /diabetes Hammes HP, Du X, Edelstein D, et al. Benfotiamine blocks three major pathways of hyperglycemic damage and prevents experimental diabetic retinopathy. Nat Med 2003;9: doi: /nm Babaei-Jadidi R, Karachalias N, Ahmed N, et al. Prevention of incipient diabetic nephropathy by high-dose thiamine and benfotiamine. Diabetes 2003;52: doi: /diabetes

15 Derleme / Review 149 DO I: /MMJ Klinik Denemelerde Randomizasyon Randomization in Clinical Trials Emine Arzu KANIK 1, Bahar TAŞDELEN 1, Semra ERDOĞAN 1 1 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bioistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı, Mersin, Türkiye Özet Klinik denemelerde randomizasyonun amacı, hastaların deneme gruplarına tamamen şansa bağlı olarak atanmasını sağlamak ve seçim yanlılığını önlemektir. Bireyler, randomizasyon yöntemleri kullanılarak, çalışmaya katılma kriterleri bakımından birbirine benzer (homojen) olacak şekilde deneme gruplarına dengeli olarak atanabilirler. Ancak küçük örneklemlerde, gruplarda örneklem sayıları dengeli olmayabilir veya gruplardaki bireyler demografik özellikleri ve başlangıç klinik ölçümleri bakımından birbirine tamamen benzer olmayabilir. Bu çalışmada bu kısıtlılıklara çözüm getirebilecek randomizasyon yöntemleri örneklerle açıklanmaya çalışılmıştır. (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2011;24:149-55) Anahtar kelimeler: Randomizasyon, Minimizasyon, Klinik deneme, Seçim yanlılığı, Potansiyel yanlılık Abstract The purpose of randomization in clinical trials is to assign patients into treatment groups randomly and to prevent selection bias. By using randomization methods, the patients can be assigned to groups so that they are similar to each other according to their participation criteria (homogenuous). However, in small samples, sampling distributions in groups may not be balanced or the patients may not be completely similar to each other in their demographical characters and their baseline clinical measurements. In this study, randomization methods which have solutions for this kind of limitations have been explained with some examples. (Marmara Medical Journal 2011;24:149-55) Keywords: Randomization, Minimization, Clinical trial, Selection bias, Potential bias Giriş Randomize kontrollü çalışmalar, klinik kararları doğrudan etkileyen, farklı tedavi denemelerinin etkinliklerini araştıran kanıt değeri yüksek çalışmalardır. Kanıta dayalı tıp kapsamında, randomize kontrollü çalışmalar göz ardı edilemeyecek bir öneme sahiptir. Randomize kontrollü çalışmalar, çalışma tasarımının ileriye yönelik (prospektif) olması, farklılığa neden olabilecek diğer faktörlerin (kovaryatların) ve yanlılığın kontrol edilebilmesi ve en aza indirgenebilmesi açısından önemlidir. Bu nedenle güvenilir ve geçerli karşılaştırmalar yapabilmek için en uygun yöntemlerdir 1. Randomize kontrollü çalışmaların geçerliliği randomizasyon sürecine bağlıdır. Randomizasyon yöntemi ile bireyler çalışmaya katılma kriterleri bakımımdan tamamen birbirine benzer olacak şekilde deney ve kontrol gruplarına dengeli olarak atanabilirler. Ancak, örneklem genişliğine, risk faktörlerinin varlığı gibi bazı kısıtlılıklardan dolayı gruplar dengeli olmayabilir. Bu kısıtlılıklara çözüm getirecek bazı randomizasyon yöntemleri bulunmaktadır. Randomizasyon yönteminin örneklem genişliğine ve çalışmadaki kovaryant ve risk faktörlerinin varlığına ve sayısına uygun olarak bu çalışmada açıklanacak olan yöntemler arasından seçilmesinin randomizasyon başarısını artıracağı düşünülmektedir. Randomizasyon Deneysel çalışmalarda randomizasyon yöntemi ilk olarak 1923 yılında R.A. Fisher tarafından kullanılmıştır. Tıp araştırmalarında randomize klinik denemeler 1990 lı yıllarda ivme kazanmıştır. Randomizasyon, klinik denemede grupların etkinliği incelenecek olan tedavi dışındaki öngörülen ve öngörülmeyen tüm faktörler açısından benzer özelliklere sahip olmasını sağlamak amacıyla yapılır. Deney sonunda ortaya çıkan bulguların araştırılan tedavi şekli ve dozlarının dışında başka bir faktöre bağlı olmadığı sonucuna ancak bu şekilde varılabilir 2. İletişim/Correspondence to: Semra Erdoğan, Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bioistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı, Mersin, Türkiye Tel: E-posta: semraerdogann@gmail.com Başvuru Tarihi/Submitted: Kabul Tarihi/Ac cep ted: Marmara Medical Journal, Pub lis hed by Ga le nos Pub lis hing. / Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Der gi si, Ga le nos Ya yı ne vi ta ra fın dan ba sıl mış tır.

16 150 Kanık ve ark. Klinik Denemelerde Randomizasyon Marmara Medical Journal 2011;24: Randomizasyonun iki temel faydası vardır. Birincisi, nedenselliğin sonuçlanmasına sebep olmak, ikinci temel faydası ise spesifik hastalıkların tedavisi için hastaların seçilmesi aşamasında bilinçli ya da bilinçsiz olarak yapılan seçim yanlılığını ortadan kaldırmaktır. Randomizasyon varsa deney sonucunda tedavi alan ve almayan gruplar arası farklılıklar için sonuç istatistik önemli bulunduğunda nedensellik ilişkisi kurulabilir. Randomizasyonun nedensellik dağılımını sonuçlandırma yeteneği, sadece bilinen prognostik faktörleri değil aynı zamanda bilinmeyen ve ölçülemeyen faktörlere göre de dikkate alarak bireylerin tedavi gruplarına dengeli bir şekilde atanmasını sağlamaktır. Randomizasyon, tedavi yöntemlerinin yansız bir şekilde karşılaştırılması için gerekli ancak yeterli değildir. Tedavi alacak olan bireylerin gruplara atanmaları randomizasyonla sağlansa bile, verilerin analizleri ilgili randomizasyon yöntemine uygun olmadığında deneysel yöntemlerle elde edilen yapısal denge uygun olmayan analiz yöntemiyle bozularak yeni bir yanlılık olan potansiyel yanlılığa sebep olmaktadır 2. Randomizasyon Yöntemleri Örneklem genişliğine grup sayısına, kovaryantların varlığına ve sayısına göre farklı performans gösteren ve literatürde açıklanmış olan randomizasyon yöntemleri aşağıda verilmiştir. 1. Tam (Completed) Randomizasyon 2. Kısıtlı (Restricted) Randomizasyon 2.1.Bloke edilmiş (Permuted Block) Randomizasyon 2.2.Efron Yöntemi (Biased Coin Design, BCD) 2.3.Urn Yöntemi 3. Başlangıç (Baseline) Risk Faktörlerine Göre Randomizasyon 3.1. Tabakalı (Stratified) Randomizasyon 3.2. Kovaryat odaklı (Covariate Adaptive) Randomizasyon Minimizasyon Yöntemi Pocock-Simon Yöntemi 4. Cevap Odaklı (Response Adaptive) Randomizasyon 4.1.Kazanana Oyna (Play-the-winner) Kuralı (KO) 4.2. Randomize KO (RPW) 4.3. Tabakalı ve Randomize KO (SRPW) Tam Randomizasyon Tam randomizasyon, çalışmaya katılma kriterlerine uygun olan bireylerin çalışmaya katıldıktan sonra gruplara tamamen rasgele, eşit şansla ve bir önceki atamadan bağımsız olarak atanmasıdır. Bu yöntemin kullanımı oldukça kolaydır. Yalnız bir dezavantajı vardır ki, örneklem sayısı az olduğunda atama işlemi sonucunda gruplardaki denek sayıları birbirine eşit ya da yakın olmayabilir. Gruplardaki denek sayısının eşitlenebilmesi ya da örneklem büyüklüğü bakımından gruplardaki denge ancak örneklem sayısı artırılarak sağlanabilmektedir. Bu amaçla, farklı örneklem sayılarında, bireylerin deneme gruplarına dağılımındaki dengeyi (n 1 /n 2 1.5) araştırabilmek adına, mini bir simülasyon denemesi yapılmıştır (2). Bu denemede iki gruplu bir araştırmada, örneklem sayısı toplam 10, 20, 30, 50, 100 ve 200 bireyin olduğu durumlar göz önünde bulundurularak, 1000 kez tekrarlanan rasgele atama işlemi sonucunda her iki gruba dağılımın ne kadarının (%) dengeli olduğu saptanıp grafiklerle gösterilmiştir. Grafiklere göre 10 birey iki gruba dengeli bir şekilde dağıtılmak istendiğinde yalnızca %66,2 si, örneklem sayısı 20 olduğunda (n 1 /n 2 1,5) %66, %76,2 (n 1 /n 2 1,5) %33, %23,8 10/0 9/1 8/2 7/3 6/4 5/5 n=10 n=20 17/3 16/4 15/5 14/6 13/7 12/8 11/9 10/10 30 (n 1 /n 2 1,5) %80,9 25 %87,7 (n 1 /n 2 1,5) %19, %12, /4 25/5 24/6 23/7 22/8 21/9 20/10 19/11 18/12 17/13 16/14 15/15 36/14 35/15 34/16 33/17 32/18 31/19 30/20 29/21 28/22 27/23 26/24 25/25 n=30 n=50 Şekil 1: n=10, 20, 30 ve 50 ye ait sonuçlar

17 Marmara Medical Journal 2011;24: Kanık ve ark. Klinik Denemelerde Randomizasyon %2,3 Şekil 2: n=100 ve 200 e ait sonuçlar %97,7 66/34 65/35 64/36 63/37 62/38 61/39 60/40 59/41 58/42 57/43 56/44 55/45 54/46 53/47 52/48 51/49 50/50 Tablo I. Blok içerisinde denek sayısı 2 olduğunda permütasyon yöntemine göre atama (n 1 /n 2 1,5) 14 (n 1 /n 2 1,5) Rasgele sayılar Hasta no Atama A B A B A B B A B A B A A B A B B A B A n=100 n=200 %0,6 %99,4 128/75 124/76 123/77 122/78 121/79 120/80 119/81 118/82 117/83 116/84 115/85 114/86 113/87 112/88 111/89 110/90 109/91 108/92 107/93 106/94 105/95 104/96 103/97 102/98 101/99 100/100 Tablo II. Blok içerisinde denek sayısı 6 olduğunda permütasyon yöntemine göre atama 1 AAABBB 11 ABAABB 2 AABBBA 12 BAABBA 3 ABBBAA 13 ABBABA 4 BBBAAA 14 ABABAB 5 AABBAB 15 BABABA 6 ABBAAB 16 BABAAB 7 BBAAAB 17 BAAABB 8 AABABB 18 BBABAA 9 ABABBA 19 BBAABA 10 BABBAA 20 BAABAB %76,2 si, 30 birey için %80,9 u, 50 olduğunda ise %87,82si dengeli bir şekilde gruplara dağılmaktadır (Şekil 1). Örneklem sayısı 100 e çıkarıldığında %99,7 si dengeli dağılırken 200 örneklem için bu değer %99,4 e çıkmaktadır (Şekil 2). Şekil 1: n=10, 20, 30 ve 50 ye ait sonuçlar Şekil 2: n=100 ve 200 e ait sonuçlar Kısıtlı (Restricted) Randomizasyon Permutasyon Yöntemi (Permuted Block Randomizasyon, Blok Randomizasyon) Küçük örneklemlerden oluşan denemelerde farklı gruplardaki deneme sayılarının eşit ya da yakın olmaması tam randomizasyon yöntemi ile karşılaşılan bir sorun iken bu durum permütasyon yöntemi ile ortadan kaldırılmaktadır. Bu yöntemde, her bir blokta grup sayısı ve olasılıkları eşit olmak zorundadır. İki grup (A ve B) olduğunda blokların büyüklüğü 2, 4, 6, şeklinde, üç grup (A, B ve C) olduğunda ise 3, 6, 9 şeklinde tercih edilmelidir. Pratikte blok içerisindeki denek sayısı 4 oldukça küçük iken, ideal olan bloklar içerisinde 6 ile 12 arasında denek bulunmasıdır 3-6. Blok sayısı 2 olduğunda her blokta bir tane A, bir tane B olmak üzere ( 2 ) 1 = 2! = 2 1!1! tüm olası ihtimaller yazılmakta ve bunlara bir numara verilmektedir (1.AB 2.BA). 20 hastayı A ve B olmak üzere iki farklı tedaviden birine rasgele olarak atayabilmek için çeşitli istatistik programlarından yararlanılabilir. Kullanımının kolay olması ve demo versiyonunun randomizasyonda sorunsuz bir şekilde çalışması nedeniyle uygulamalarda MedCalc paket programı tercih edilmiştir 7. MedCalc paket programında 1 ile 2 arasında rasgele 10 tane sayı üretilerek 1 geldiğinde ilk hastaya A tedavisi, ikinci hastaya B tedavisi, 2 geldiğinde ilk hastaya B ikinci hastaya A tedavisi uygulanmalıdır. Böylece her blokta iki birey olacak şekilde atama işlemi Tablo I deki gibi olmaktadır. Bu işlem rasgele sayılar tablosundan faydalanılarak da yapılabilmektedir. Bloklar rasgele olarak seçilir ve bu işlem çalışmaya alınacak olan tüm denekler gruplara atanıncaya kadar devam edilir ve bu işlemin sonunda gruplardaki denek sayıları eşitlenmiş olur. Denek sayısı 30, A ve B gibi iki muamelenin olduğunu, blokların büyüklüğünün de 3A ve 3B olmak üzere 6 olduğu bir durumu varsayalım. Blok sayısı ( 6 ) 3 = 6! = 20 3!3! olup Tablo II de her bir olası durum bir sayı ile gösterilmiştir. MedCalc paket programında 1 ile 20 arasında rasgele sayı üretilmiştir. Bu sayılar, 6, 3, 1, 9, 6, 5, 18, 15, 4, 4, 19, 15, 5, 1, 10, 2, 16, 8, 11, 1 olsun. İlk olarak 6 numaralı blokla başlanır ve son olarak 1 numaralı blokla atama işlemi sonlandırılır. Buna göre, ABBAAB, ABBBAA, AAABBB, ABABBA,, AAABBB olacak şekilde ilk birey A grubuna 2. ve 3. birey B grubuna, 4 ve 5. birey A grubuna, 6. birey B grubuna vb. şeklinde olmak üzere her bir grupta 15 birey olacak şekilde toplam 30 birey eşit ve homojen olarak yerleştirilmiş olur.

18 152 Kanık ve ark. Klinik Denemelerde Randomizasyon Marmara Medical Journal 2011;24: A, B ve C olmak üzere 3 farklı tedavi yönteminin uygulanacağı ve değerlendirmelerin eşit olasılıklı olduğu bir çalışmayı değerlendirecek olursak; her bir tedavi grubuna 2 şer denek atayacak şekilde her bir bloğa toplam 6 birey atanmış olur. Böylece her altılı atamanın sonunda 3 tedavi grubundaki denek sayısı da eşitlenmiş olur. Bu yöntemde amaç, homojen yapıda çok fazla blok oluşturarak eşit olasılıkla atama işlemlerini gerçekleştirebilmektir. Kısaca permütasyon yöntemi, küçük örneklerden oluşan çalışmalarda gruplar arasındaki denek sayılarının eşitlenmesini sağlamakta olup denek sayısı az olduğunda tercih edilen bir yöntemdir 4-6. Efron Yöntemi (Biased Coin Design, BCD) Efron tarafından 1971 yılında ortaya atılmıştır. Özellikle tedavi odaklı olup, deneklerin ardışık olarak denemeye katıldığı durumlarda uygulanmaktadır 3,5. A ve B gibi iki farklı tedavi yöntemi olduğu bir durumda, A tedavisi alacak olan ya da A grubuna atanacak olan hasta sayısı n A ile B tedavisi uygulanacak ya da B tedavisi alacak olan hasta sayısı ise n B ile gösterilmektedir. Toplam hasta sayısı ise n=n A +n B ile farklılık ise D= n A -n B ile hesaplanmaktadır. D= 0 ise, yani her iki grupta yer alan denek sayısı eşit olduğu durumda sonraki bireyin A veya B grubuna atanma olasılığı ya da A veya B tedavisini alma olasılığı (P A =P B =p) 1/2 ye eşittir. Eğer D< 0 ise, yani A grubunda yer alan hasta sayısı B grubunda yer alan hasta sayısından az ise n A <n B, sonraki bireyin ya da hastanın A grubuna atanma olasılığı ya da A tedavisini alma olasılığı p gibi bir olasılığa eşittir (P A =p). Eğer D> 0 ise, yani A grubunda yer alan hasta sayısı B grubunda yer alan hasta sayısından fazla ise n A >n B, sonraki bireyin ya da hastanın A grubuna atanma olasılığı ya da A tedavisini alma olasılığı ise (1-p) olasılığına eşit (P A =1-p) olacaktır. p olasılığı Efron tarafından 2/3 olarak Pocock ve Simon tarafından ise 3/4 olarak önerilmektedir. Böyle bir durumda Efron a göre, D < 0 ise P A =2/3, D > 0 P A =1/3 olarak hesaplanmaktadır 4, birey kontrol (K) ve tedavi (T) grubu olmak üzere 2 gruba Efron yöntemine göre yerleştirmek istenildiğinde, başlangıçta bütün bireylerin kontrol ya da tedavi gruplarından birine atanma şansı eşittir ve 1/2 dir. Bireyin 0.50 olasılıkla K ya atandığı varsayıldığında, kontrol grubunda 1 birey, tedavi grubunda ise hiç birey olmayacaktır. Böyle bir durumda gruplardaki birey sayıları eşit değildir ve D>0 dır. Bir sonraki bireyin K grubuna atanma olasılığı (1-p), T grubuna atanma olasılığı ise p dir. Efron a göre K grubuna atanma olasılığı 1/3, T grubuna atanma olasılığı ise 2/3 dür. İkinci birey 2/3 olasılığı ile T grubuna atandığında her iki grupta denek sayıları eşitlenmiş olacaktır. Ardından gelen bireyin K veya T grubuna atanma şansı yine eşittir. Üçüncü bireyin T grubuna atandığı varsayılırsa böyle bir durumda 1 birey K grubunda iki birey T grubunda yer alacaktır ve D<0 olacaktır (n C <n T ). Yani K grubunda yer alan birey sayısı T grubunda yer alan birey sayısından az olduğu için sonraki bireyin K grubuna atanma olasılığı 2/3, T grubuna atanma olasılığı ise 1/3 olacaktır. Bu işlem tüm bireyler gruplara atanıncaya devam edecektir ve böylelikle atama işleminin sonunda her iki grupta da eşit sayıda denek yerleştirilmiş olacaktır 4. Bu yöntemin en önemli dezavantajı kullanımının karmaşık ve istatistik analizlerinin de elverişsiz olmasıdır. Urn Yöntemi Efron yönteminin genelleştirilmiş halidir. Efron yönteminde p olasılığı sabit iken, Urn yönteminde dengesizliğin derecesi dikkate alınmaktadır. Küçük boyutlu denemelerde dengeli randomizasyon sağlamakta ve körleme veya maskelemenin mümkün olmadığı durumlarda kullanılmaktadır 4. Bu randomizasyon yöntemi UD (α, β) şelinde gösterilmekte olup α ve β gibi iki parametreden bahsedilmektedir. Bu parametreler kırmızı ve beyaz olmak üzere iki farklı renkteki topları ifade etmektedir. A beyaz da olabilir kırmızı da olabilir. B ise α da seçtiğimiz topun karşıt rengindeki topları göstermektedir. Toplardan biri rasgele olarak seçilmekte ve seçilen top beyaz ise birey A grubuna, kırmızı ise B grubuna atanmaktadır. Bu süreç her bir atama işleminde tekrarlanmaktadır. Bu yöntemin aşamaları aşağıda adımlar halinde verilmektedir 4,9, Adım 0: k beyaz topla ya da kırmızı topla başlanır Adım 1: Rasgele 1 top seçilir Adım 2: Çekilen top kırmızı ise denek B grubuna, beyaz ise A grubuna atanır Adım 3: Çekilen topun zıt renginde bir top atılır (çekilen top beyaz ise β kırmızı olur) Adım 4: Adım 1 e geri dönülür. UD (α,0) ise tam randomizasyon yöntemi ile eşdeğerdir. UD (0,β) durumunda bireyin A ya da B grubuna atanma şansı %50 ye eşittir. (n+1). birey, β nın değeri ne olursa olsun olasılığı ile A grubuna veya P n+1 = n b n 1-P n+1 = n a n olasılığı ile B grubuna atanmaktadır (12,13). Başlangıç (Baseline) Risk Faktörlerine Göre Randomizasyon Bu randomizasyon yönteminde randomizasyon kodları diğer randomizasyon yöntemlerinde olduğu gibi çalışmaya başlamadan önce belirlenmemektedir. Çünkü randomizasyon yöntemi, hastanın çalışmada yer aldığı zamanda uygulanmaktadır. Bu yöntem, her bir gruptaki hastaların sayısını önceden belirlenen prognostik faktörler açısından dengeli bir şekilde tedavi gruplarına dağıtmayı amaçlamaktadır. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında daha dengeli grupların oluşturulduğu bir yöntem olarak görülmektedir. Tabakalı (Stratified) Randomizasyon Çoğu klinik denemelerde tedavi gruplarındaki denek sayılarının eşit veya dengeli olmasının yanı sıra prognostik faktörler (yaş, hastalığın evresi vb.) bakımından da benzer olması istenir. Bu randomizasyon yöntemine göre, tedavi gruplarında ortaya çıkan dengesizlik ihtimali en azından sınırlandırılmış olmaktadır. Bu yöntemin ilk aşaması risk faktörlerine göre tabakalara ayırmak olup her bir tabaka içerisinde tekrar randomizasyon yapılmakta ve randomizasyon yöntemlerinden de dengeyi sağlayabilmek için permütasyon yöntemi kullanılmaktadır. Permütasyon yöntemindeki blok setleri prognostik faktörlerin her bir kombinasyonu için üretilmektedir. Her bir tabakadaki hastalar, özellikleri bakımından homojen olacakları için tabakalara ayırmak denemenin güvenilirliğini artırmaktadır. Çünkü tabakalama bu bilinen prognostik faktörler üzerine tedavinin dengesini sağlamakta ve sonuçların yorumlanmasını kolaylaştırmaktadır 4,5. Sınırlandırılmış blok randomizasyon yönteminde 2 ve daha fazla tabaka oluşturulabilmektedir. Her bir tabaka içerisindeki risk faktörü sayısı ve her bir risk faktörünün kategori sayısı arttıkça her bir tabaka içerisinde daha az sayıda denek olacak hatta bazı taba-

19 Marmara Medical Journal 2011;24: Kanık ve ark. Klinik Denemelerde Randomizasyon 153 Tablo III. Minimizasyon yöntemine göre randomizasyon Plasebo grubu İlaç grubu Cinsiyet E K Yaş ve üzeri 9 7 Hipertansiyon şiddeti Hafif 7 5 Orta Ağır 8 9 Toplam Tablo IV. Minimizasyon yöntemine göre atama Plasebo İlaç Farkın işareti E ve üzeri Orta Toplam (+) ve 0(-) kalar da hiç denek olmayacaktır. Böylece gruplar arası dengenin tam olarak sağlanamaması gibi sakıncalar ortaya çıkabilir. Böyle bir durumda, prognostik etkisi belirgin olmayan değişkenlere göre tabakalandırma yapılmasından kaçınılması gerekmektedir. Kovaryat Odaklı (Covariate Adaptive) Randomizasyon Minimizasyon Yöntemi Küçük örneklerde bile pek çok prognostik faktörler için gruplar arasında mükemmel bir denge sağlamada oldukça etkili bir yöntemdir. İlk olarak Taves tarafından 1974 yılında öne sürülmüş ve ardından da 1975 yılında Pocock ve Simon tarafından geliştirilmiştir. Örnek genişliği küçük olduğunda basit randomizasyon ve kısıtlı randomizasyon yöntemlerine göre bazı avantajlara sahiptir. Minimizasyon yöntemi randomizasyondan tamamıyla farklı bir prensibe dayanmaktadır. Bu yöntem basit randomizasyon yöntemi ile karşılaştırıldığında karmaşık gibi görünse de bilgisayar programı mevcut olup (Minim) elle hesaplaması da zor değildir 14,15. Cinsiyet, yaş ve hipertansiyon şiddeti gibi üç faktöre göre tabakalara ayrılan, plasebo ve ilaç olmak üzere iki farklı grupta yer alan 50 hastaya ait denek sayıları Tablo III de verilmektedir. Hastaneye gelen bir sonraki hastanın (51. hastanın) erkek, 63 yaşında ve hastalık şiddetinde de orta evrede olduğu varsayıldığında bu hastanın plasebo veya ilaç grubundan hangisine atanacağını belirlemek için iki olası kriter önerilmektedir. Birincisi, farkın işaretinden yola çıkarak, ikincisi ise plasebo ve ilaç grubundaki hasta sayısından yola çıkarak atama işlemini gerçekleştirmektir 6,16. Bunlara ait sonuçlar Tablo IV de verilmektedir. Farkın işaretine göre atama yapıldığında, 3 pozitif 0 negatif değer olduğuna göre plasebo grubundaki hasta sayısı ilaç grubundaki hasta sayısından fazladır. Dolayısıyla yeni hasta ilaç grubuna atanmalıdır. Toplamlar üzerinden atama işlemi gerçekleştirildiğinde, plasebo grubunda toplam 35, ilaç grubunda ise toplam 31 hasta vardır. Plasebo grubundaki hasta sayısı ilaç grubundakinden fazla olduğu için yeni hasta ilaç grubuna atanmalıdır. Gruplardaki denek sayıları birbirine eşit olduğunda tam randomizasyon yöntemi kullanılmaktadır. Pocock-Simon Yöntemi Pocock ve Simon yöntemi yalnızca iki grup için uygulanmakta ve denek sayısı az olduğunda faktör sayısı üzerinden grupları dengelemektedir. Bu yöntem pek çok prognostik veya risk faktörü göz önünde bulundurularak bir sonraki hastayı gruplardan birine (A veya B) atayabilmek için bir B(t) fonksiyon değeri hesaplamaktadır. Aşağıdaki gibi formüle edilen fonksiyon değeri, dengesizliğin derecesini vermekte olup dengesizlik ölçümü olarak adlandırılmaktadır. B(t) = Σ 2 i=1 w i Range i Formülde w i, her bir faktör için ağırlık olarak ifade edilmekte ve w 1 /w 2 =1.5 olacak şekilde w 1 =3 ve w 2 =2 ile ağırlıklandırılır. Hesaplanan B(t) değerinden küçük olanı tercih edilir ve en küçük B(t) değeri için olasılık değeri ise p=2/3 olarak önerilmektedir. Böyle bir durumda P i = (2/3, 1/3) olmaktadır. Yukarıdaki örnekten yalnızca iki prognostik faktör olan cinsiyet ve yaş faktörleri alındığında, 51. Hastanın erkek ve 63 yaşında olduğu bir durumda bu hastanın hangi gruba atanacağı bu yönteme göre aşağıdaki biçimde belirlenmektedir (Tablo V). Tablo V e göre 51. birey plasebo grubuna atandığında elde edilen B(t) değeri; B(t) = w 1 Range (A) 1 +w 2 Range (A) 2 = 3*2+2*3=12 ve ilaç grubuna atandığında elde edilecek olan B(t) değeri aşağıdaki gibi hesaplanır. B(t) = w 1 Range (B) 1 +w 2 Range (B) 2 =3*0+2*1=2 ilaç grubuna atandığında elde edilen B(t) değeri plasebo grubuna atandığında hesaplanan B(t) değerinden küçük olduğu ve küçük olan tercih edildiği için hastanın ilaç grubuna atanma olasılığı 2/3 dür 4,12,16. Tablo V. Pocock-Simon yöntemine göre randomizasyon Cinsiyet E Hasta Range A Hasta Range B Plasebo grubuna İlaç grubuna verilirse verilirse Plasebo grubu = =0 İlaç grubu Yaş 60 ve üzeri Plasebo grubu = =1 İlaç grubu 7 7 8

20 154 Kanık ve ark. Klinik Denemelerde Randomizasyon Marmara Medical Journal 2011;24: Tablo VI. KO kuralına göre randomizasyon Hasta No: Tedavi A: S S F F F Tedavi B: S F S S S Cevap Odaklı (Response Adaptive) Randomizasyon Kazanana Oyna (Play the Winner) Kuralı (KO) Bu yöntem 1969 yılında Zelen tarafından ortaya atılmış ve sonrasında da geliştirilmiştir. Bu kural sadece 0 ve 1 lerden oluşan ikili yapıda sonuç değişkeni (başarılı, başarısız) ve iki tedavi (A ve B) yönteminin bulunduğu klinik denemelerde uygulanmaktadır. Bu yönteme göre, ilk hasta basit randomizasyon yöntemi ile A veya B tedavisinden herhangi birine rasgele olarak atanır. Eğer ilk hastaya verilen tedavi başarılı olursa bir sonraki hastaya aynı tedavi uygulanmalı, ancak tedavi başarısız olursa bir sonraki hastaya diğer tedavi uygulanmalıdır. 10 hastaya uygulanacak tedavi yöntemi için KO kuralına göre atama yapılırsa Tablo VI daki gibi bir yol izlenir (başarılı ise S; başarısız ise F ile gösterilsin). Bu yönteme göre bir sonraki hasta alınmadan mutlaka bir önceki hastanın cevap değişkeninin sonucunun bilindiği varsayılmaktadır. Böylece çok sayıda hastaya en iyi tedavi yöntemi uygulanmış olacaktır. Bu etik açıdan olumlu bir durumdur. Ancak, araştırıcı bir sonraki hastanın hangi tedaviyi alacağını önceden bildiği için çalışmada yanlılık söz konusu olmaktadır ki bu da yöntemin dezavantajıdır Son 30 yıldan beri pek çok bilim adamı tarafından farklı KO kuralları önerilmiştir. Mesela, 1971 yılında Döngüsel KO (Cyclic play the winner) kuralı ve 1978 yılında Wei ve Durham tarafından Zelen in KO kuralının bir modifikasyonu olarak randomize KO kuralı (RPWR) geliştirilmiştir ki bu yöntem Efron tarafından geliştirilen Urn yöntemine benzemektedir. Ardından 1979 yılında Poyla tarafından Urn dizaynı (GUPD) önerilmiştir. Bu kural 2 den fazla deneme olduğunda randomize KO kuralının bir uzantısıdır. 2 den fazla deneme olduğunda ve prognostik faktörlerin bulunduğu çalışmalarda Tabakalı ve Randomize KO (SRPWR) yöntemi geliştirilmiştir Randomize KO Kuralı 1978 yılında Zelen in PW kuralının bir modifikasyonu olarak Wei ve Durham tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem Urn yöntemine benzemektedir. Bir kutuda c sayıda A ve c sayıda B gibi belirlenmiş iki farklı tipte top olsun. Tedavi A ve tedavi B olmak üzere iki farklı grubumuz olsun. Bir hasta rasgele olarak seçilir ve bu rasgele seçilen bireyin de kutudan yerine koyma yöntemine göre bir top seçmesi istenir. Rasgele seçilen top A tipi bir top olduğunda hastaya tedavi A uygulanacak, B tipinde bir top gelirse hastaya tedavi B uygulanacak. Bir önceki tedaviyi alan hastanın A tedavisini alıp, bu tedavi sonucu başarılı olursa kutuya A tipinde bir top eklenir, eğer alınan tedavi başarısız olursa kutuya bu sefer B tipinde bir top eklenir. Bir önceki tedaviyi alan hastanın B tedavisini alıp, bu tedavi sonucu başarılı olursa kutuya B tipinde bir top eklenir, eğer alınan tedavi başarısız olursa kutuya bu sefer A tipinde bir top eklenir. Bu süreç her bir atama işleminde tekrarlanır 17,21,23. Tabakalı ve Randomize KO (SRPWR) Bir tedavinin başarı olasılığı, hem tedavinin etkinliğine hem de prognostik faktörlerin (yaş, hastalık durumu, cinsiyet gibi) bilinmesine bağlı olabilir. Bu yönteme tedavi sayısı 2 ve daha fazla olduğu ve prognostik faktörlerin yer aldığı durumlarda başvurulmaktadır. Bu kurala göre randomizasyon yapabilmek için aşağıdaki adımlar izlenmektedir. Adım 1: Her bir prognostik faktöre göre s tabaka tanımlanır. Adım 2: Her bir tabaka için s tane kutu hazırlanır. Her bir kutuda i=1,,t (t muamele) olacak şekilde numaralı toplar oluşturulur. Adım 3: k. (k=1,2,.,s) tabakaya ait bir hasta için atama işlemi yapılırken k.kutudan bir top çekilir. Top i numaralı ise hastaya i. tedavi uygulanır. Eğer kutu boş ise 0 ile 1 arasında Uniform dağılımdan rasgele veri üretilir ve atama işlemi bu şekilde gerçekleştirilir. Eğer sayı i/t değerinden küçük ve (i-1)/t değerine eşit ya da büyük ise hastaya i. tedavi uygulanır. Adım 4: Bir önceki i tedavisini alan hastanın cevabı başarılı ise k. kutuya her bir tip için b (b>a) adet i tipinde top a adet diğer tipte top eklenir. Eğer cevap başarısız ise k. kutuya her bir tip için a adet i tipinde b adet diğer tipte top eklenir. Adım 5: Tüm hastaların yerleştirme işlemi tamamlanıncaya kadar 3. ve 4. adımlar tekrar edilir 20. Sonuç ve Öneriler Tam randomizasyon, en kolay randomizasyon yöntemi olarak bilinmektedir. Ancak, örneklem sayısı fazla olduğunda gruplarda dengeli bir atama yapılırken küçük örneklemlerde gruplar arasındaki dengesizlik oluşmakta ve bu dengesizlik permütasyon yöntemi ile ortadan kaldırılmaktadır. Çalışma gruplarının sadece denekler bakımından dengeli olması değil, prognostik faktörler açısından da dengeli olması istenmektedir. Böyle bir durumda tabakalı randomizasyon yöntemi ile risk faktörlerini tabakalara ayırıp her bir tabaka içerisinde de dengeyi sağlayabilmek için permütasyon yöntemi kullanılmalıdır. Bu yöntemin tek sakıncası tabaka içerisinde bazen denek sayılarının az olacağı hatta hiç olmayacağı durumla karşılaşılabilmesidir ki böyle bir durumda çalışmanın gücü azalmaktadır. Küçük örneklemlerde bile pek çok prognostik faktör için gruplar arasında mükemmel bir denge sağlamada en etkili yöntem minimizasyon yöntemidir. 0 ve 1 lerden oluşan ikili yapıda sonuç değişkeni olduğunda, iki ve daha fazla tedavi yönteminin bulunduğu ve prognostik faktörlerin yer aldığı klinik denemelerde ise en çok tercih edilecek randomizasyon yöntemi ise tabakalı ve randomize kazanana oyna kuralıdır. Kaynaklar 1. Xiao L, Lavori PW, Wilson SR, Ma J. Comparison of dynamic block randomization and minimization in randomized trials: A simulation study. Clin Trials 2011;8: doi: / Armitage P, Colton T, (editors). Encyclopedia of Biostatistics. New York: John Wiley & Sons Ltd, Stevens J. Applied multivariate statistics for the social sciences. London: Lawrence Erlbaum Associates Inc., Beller EM, Gebski V, Keech AC. Randomization in clinical trials. MJA 2002; 177:565-7.doi: /j.nuclcard Alpar R, Uludağ AK. Reducing the bias in clinical trials (Randomization&Blinding). FABAD J Pharm Sci 2003;28: Machin D, Fayers PM. Randomized clinical trials: Design, Practice and Reporting. Oxford: John Wiley & Sons Ltd, Kanık EA, (çeviri editör). Adım Adım MedCalc. Ankara: Ümit Ofset, Melfi VF. Randomized adaptive designs. Adaptive Designs IMS Lecture Notes - Monograph Series 1995;25: Eisele RJ. Biased coin designs: Some properties and applications. Adaptive Designs IMS Lecture Notes - Monograph Series 1995;25:48-64.