Kullanılan Semboller In vitro diagnostik medikal gereç. Lot numarası. Katalog numarası. İle Kullanım. Kullanım bilgileri.

Transkript

1

2 İçerik Tablosu Türkçe Kullanılan Semboller... 5 Kullanım Amacı... 6 Test Prensibi... 6 Reaktifler... 6 Tanımlama,kullanım için hazırlama ve saklama koşulları 6 Kit içeriğinde olmayan gerekli materyaller... 8 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 9 Örnekler Beyanat ve Önlemler Test Prosedürü Yıkama Talimatı Sonuçlar Validasyon Test sonuçları Sınırlamalar Test performansı Özgünlük Duyarlılık Kesinlik Kullanılan Semboller In vitro diagnostik medikal gereç Lot numarası Katalog numarası İle Kullanım Kullanım bilgileri Biyolojik riskler Sıcaklık sınırlamaları < X > testi için yeterli miktarı içerir Negatif Kontrol Pozitif Kontrol Plate Örnek Diluent Yıkama Solusyonu 25x

3 Konjugat Diluent 1 Konjugat 1 100x Substrat Buffer Substrat TMB 100x Stop Solusyonu Kullanım Amacı INNOTEST HCV Ab IV insan plazma ve serumunda insan Hepatit C virus (HCV) antikorlarının belirlenmesi için 4. jenerasyon enzim immunotesttir. Test Prensibi Polistren mikroplate striplerinin kuyucukları HCV antijenlerinin karışımı ile kaplıdır: CORE, NS3, NS4 ve NS5. Her bir test örneği bu kuyucuklardan birinde inkübe edilir. Eğer örnek içinde virus-spesifik HCV antikorları var ise solid-faz antijenlere bağlanacaklardır. Daha sonra, horseradish peroxidase (HRP) enzimi ile işaretli purifiye edilmiş rabbit anti-human IgG (h zinciri spesifik) eklenir. Bu işaretli antikorların pozitif reaksiyonu üzerine ön formda bir solid-faz antijen/antikor kompleksi bağlanır. Enzim substratı ile inkübasyon test kuyucuklarında mavi renk oluşumuna neden olur ve reaksiyonu durdurmak için sülfirik asit eklenmesi ile renk sarıya döner. Eğer örnekler HCV antikoru içermiyorsa işaretli antikor spesifik olarak bağlanmaz ve sadece düşük backgroundlu bir renk gelişimi gözlenir. Reaktifler Tanımlama,kullanım için hazırlama ve saklama koşulları - Kaplı test kuyucukları da dahil tüm test reaktifleri 2-8 C de saklanırsa son kullanma tarihine kadar bozulmaz. Herbir paket içeriği: 1. 1 şişe 1.5 ml (192T) ya da 3 ml (480T) Negatif Kontrol (0.01% methylisothiazolone (MIT) içeren insan serumu ve koruyucu olarak 0.1% chloroacetamide (CAA)) şişe 1.5 ml (192T) ya da 3 ml (480T) of Pozitif Kontrol (HCV antikorları içeren phosphate buffer, protein stabilizörleri ve koruyucu olarak Proclin 300). Pozitif Kontrolde presipitasyon görülebilir. Bu presipitasyon test performası ve sonuçlarını etkilememektedir poşet (192T) ya da 5 poşet (480T) strip-holder ile 12 x 8 HCV antijen-kaplı test kuyucuğu (Plate). İçine kurutucu madde olarak silikajel torba eklenmiştir. Stripleri içeren alüminyum folyo poşet açıldıktan sonra, kullanılmayan herbir test kuyucuğu, silikajel torba ile birlikte kapalı plastic minigrip poşette 2-8 C de 8 hafta saklanabilir şişe 60 ml (192T) ya da 150 ml (480T) Örnek Diluent (sodium chloride içeren phosphate buffer, Triton, protein stabilizörleri ve koruyucu olarak Proclin 300 mor renkli buffer solusyonu) şişe 150 ml (192T) ya da 200 ml (480T) konsantre Yıkama Solusyonu (0.01% MIT içeren phosphate buffer ve koruyucu olarak 0.1% CAA), kullanımdan önce distile ya da deiyonize su ile 1:25 seyreltilmelidir. Test Sayısı Yıkama Solusyonu (ml)h 2 O (ml)

4 1 x x Yıkama Solusyonda 2-8 C de bekledikten sonra tuz kristalleri oluşabilir. Bu kristaller, seyreltme yapmadan önce 37 C de dağıtılmalıdırlar. Seyreltilmiş yıkama solusyonu 2-8 C de 4 hafta saklanabilir şişe 60 ml (192T) ya da 150 ml (480T) Konjugat Diluent (protein içeren phosphate buffer ve enzim stabilizörü ve koruyucu olarak 0.05% Proclin 300 yeşil renkli buffer solusyonu) şişe 0.60 ml (192T) ya da 1.5 ml (480T) konsatre Konjugat 100x (horseradish peroxidase işaretli rabbit anti-human IgG (H chain)), kullanmadan önce Konjugat Diluent ile 1:100 seyreltilmelidir. Test x 96 5 x 96 Sayısı Konjugat (ml) Konjugat dilüent (ml) Konjugat çalışma solusyonu oda sıcaklığında 8 saat saklanabilir şişe 60 ml (192T) ya da 150 ml (480T) Substrat Buffer (0.006% hydrogen peroxide içeren phosphate citrate buffer) şişe 1 ml (192T) ya da 1.5 ml (480T) konsantre Substrat TMB 100x (dimethylsulfoxide (DMSO) içinde çözülmüş tetramethylbenzidine (TMB)), kullanımdan önce Substrat Buffer ile 1:100 seyreltilmelidir. Test x 96 5 x 96 Sayısı Substrat (ml) Substrat Buffer (ml) Konsantre Substrat TMB tamamen erimelidir. (erime noktası 18 C). Substrat solusyonu karanlıkta ve oda sıcaklığında (18 to 30 C) 1 saat saklanabilir şişe 30 ml (192T) ya da 45 ml (480T) Stop Solusyonu (0.9 N sulfuric acid) (192T) ya da 15 (480T) yapışkan plate kaplayıcı (192T) ya da 2 (480T) plastik minigrip poşetleri, kullanılmamış striplerin konulması için. Kit içeriğinde bulunmayan gerekli materyaller - Distile ya da deiyonize su µl ve µl pipetler ve tek kullanımlık pipet uçları µl ye kadar çekebilen, Konjugat, Substrat Solusyonu ve Stop Solusyonu eklenecek tek kullanımlık V- şeklinde oluk ile kullanılabilen opsiyonel olarak multikanal pipet. - Microplate shaker C İnkübatör. - Microplate yıkayıcı (400 µl volümlü tekrar şırıngası ve aspirator kullanılarak alternatif olarak yıkama el ile yapılabilir). - Emici dokular. - Fotometrik Okuyucu: 450 nm ve opsiyonel olarak 620 nmde okuma yapaliben mikroplate okuyucu.

5 Güvenlik ve Çevre Koşulları - Lütfen Material Safety Data Sheet (MSDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son güncellenen MSDS versiyonu websitesinde yer almaktadır. - Koroziv! (C) Yanmaya sebep olur. Deri ile temas etmesi halinde bol miktarda su ve sabunla yıkayınız. Koruyucu giysiler, göz/yüz koruyucu giyiniz ve eldiven kullanınız. Bir kaza olduğunda ya da kendinizi kötü hissettiğinizde derhal doktorunuza başvurunuz (üzerindeki etiketi gösteriniz). STOP SOLUSYONU H2SO4 içermektedir. - Örnekler ve Negatif Kontrol ün potansiyel enfeksiyon ajanı olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. - Pozitif Kontrol, anti-hiv-1/hiv-2 ve HBsAg için negatif olarak test edilmiştir. Negatif Kontrol, anti-hiv- 1/HIV-2, anti-hcv ve HBsAg için negatif olarak test edilmiştir. Test metodu kan örneklerinin enfeksiyon ajanlarını geçirmeyeceğine dair garanti vermemektedir. Bu nedenle, tüm kan komponentleri ve biyolojik materyallerinin potansiyel enfeksiyon ajanı olduğu göz önüne alınarak kullanılmalıdır. Sadece yeterince tecrübesi olan personel bu testi çalışmalıdır. Tüm kan örnekleri ve biyolojik materyaller güvenlik koşullarına uygun olarak atılmalıdır. 121 C de 15 dakika otklavlanmalıdır. Tek kullanımlık materyaller yakılmalıdır. Sodyum hipokloritli miks likit atıkların son konsantrasyonu ± 1% sodyum hipoklorit olmalıdır. Atmadan önce bir gece bekletiniz. ÖNLEM: asit içeren likitlere sodium hipoklorit eklemeden önce nötralize ediniz. - TMB substrat solusyonu ile temas etmekten ve inhalasyonundan sakınınız. Bu solusyon deri, gözler ve solunum sistemi için tahriş edicidir. TMB Substrat Solusyonu içindeki DMSO deri tarafından oldukça hızlı emilime neden olur, - Negatif Kontrol ve Yıkama Solusyonu koruyucu olarak MIT/CAA içerir. Bu solusyon deride hassasiyete neden olabilir. Eldiven ve koruyucu gözlük takınız. - Konjugat Diluent, Pozitif Kontrol ve Örnek Diluent koruyucu olarak Proclin 300 içerir. - Bu kit Stop Solusyonu olarak 0,9N sülfirik asit içerir. - Tehlikeli ya da enfeksiyonlu ajanlar ile çalışılırken koruyucu giysiler; eldiven ve koruyucu gözlük kullanılması gereklidir. - Atıklar hastanelerin atılım talimatlarına göre yok edilmelidir. Kamusal ve çevresel düzenlemelere uyulmalıdır. Örnekler - EDTA lı, heparinli ve sitratlı kandan alınan serum veya plazma örnekleri kullanılabilir. EDTA-plazma örnekleri kullanılırken SAM (Örnek ekleme kontrolu) Örnek Diluent renk değişimi olmayacağını dikkate alınız. - Kullanılacak örneklerin mikrobiyal kontaminasyonu olmamalıdır. - Katkı maddeleri hatalı sonuçlara neden olabilir. - Test yapılmadan önce örneklerin çözülmemiş kısımları santrifüj ile ortadan kaldırılmalıdır. - Saklanmadan önce plazma ve serum santrifüj ile kan pıhtısı ve kan hücrelerinden ayrılmalıdır. - Örnekleri 2-8 C de saklayınız. Bir haftadan daha uzun saklamak için -20 C de küçük hacimlere ayırarak dondurunuz. - Isıya maruz kalmış örnekler ile çalışmayınız. Beyanat ve Önlemler : - Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayınız. - Kit içeriğindeki reaktifleri birbirine karıştırmayınız, farklı lot numarasındaki komponentleri kullanmayınız. - Donmuş reaktifler hatalı sonuçlara neden olabilir! - Tüm kanallar Konjugat Çalışma Solusyonu ve Substrat Solusyonu hazırlanmasından sonra distile su ile iyice temizlenmelidir. - Kontaminasyonu önlemek için plate kenarlarına dokunmayınız. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçınınız. - Kullanmadan önce örnekler ve kontrollerin homojen olduğundan emin olun. - Herbir örneği alikuotlarken yeni bir pipet ucu kullanın.

6 - Örneklerin kuyucuklara eklendiğinden emin olun. Örneklerin tam eklenmemesi hatalı nonreaktif sonuçlara nedn olabilir. Kuyucuklara kontrol ve örneklerin eklendiği görerek ya da fotometrik okuma ile teyit edilmelidir. - EDTA-plazma örnekleri kullanılırken SAM (Örnek ekleme kontrolu) Örnek Diluent renk değişimi olmamasına dikkat ediniz. - Kontaminasyonu önlemek için örnek ya da konjugat yüklerken kuyucukların kenarlarına pipet ucu ile değmeyiniz. - İnkübasyon ya da saklama sırasında Substrat Solusyonunu güçlü ışık altında açıkta bırakmayın. Substrat ile inkübasyon sırasında plate karanlıkta bekletilmelidir. Substrat Solusyonu kullanılırken renksiz olmalıdır. Eğer solusyon maviye dönerse değiştirilmelidir. - Tekrar kullanılan kaplı test kuyucukları hatalı sonuçlara neden olur. - Pozitif Kontrolde presipitasyon görülebilir. Bu presipitasyon test performansı ve sonuçlarını etkilemez. - Bu test sadece klinik laboratuvar tecrübesi olan personel tarafından kullanılmalıdır. - Reaktif çalışma solusyonlarını hazırlarken kan toplama tüplerini kullanmayınız. Test Prosedürü Lütfen teste başlamadan önce Beyanat ve Önlemler kısmını okuyunuz. Tüm test materyalleri kullanımdan yaklaşık 30 dakika önce oda sıcaklığına (18 to 30 C) getirilmiş olmalı ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına (2 to 8 C) kaldırılmalıdır. Kuyucuklarda su yoğunlaşmasından kaçının, alüminyum folyo oda ısısında bekletilirken sıkıca kapatılmış olmalıdır. Teste başlamadan önce inkübator sıcaklığını 37 ± 1 C ye ayarlayın. 1. Gerekli sayıda stribi alın; bir strip için, bir SAM kontrol kuyucuğu, bir negatif ve bir pozitif kontrol herbir strip tutacağına konmalıdır. Daha fazla sayıda strip için en az bir SAM kontrol kuyucuğu, iki negatif ve iki pozitif kontrol herbir strip tutacağına konmalıdır. Test çalışması sırasında, strip, strip tutacağı içinde olmalı ve bir köşeye tutturulmalıdır. 2. SAM kontrol kuyucuğu dahil herbir kuyucuğa 200 µl Örnek Diluent ekleyin. 3. SAM kontrol kuyucuğu hariç uygun test kuyucuklarına 20 µl örnek ya da kontrol ekleyiniz. Rengin mordan koyu maviye dönmesi, örnek ya da kontrolün kuyucuğa eklendiğini gösterir. SAM renk değişimi 620 nm dalga boyunda fotometrik olarak okunabilir: - Cihaz üreticisi bilgilerine göre SAM kontrol kuyucuğu üzerinde Blank okutunuz. - Herbir kontrol ve örnek e eşit ya da daha fazla değerde olmalıdır.. 5 kez pipetleme ile ya da 1000 rpmde 1 dakika plate shakerda sallayarak örneklerin ve kontrollerin Örnek Diluent ile tamamen karıştığından emin olun. 4. Stripleri yapışkan kaplayıcı ile kapatınız. 37 ± 1 C de 60 ± 3 dakika inkübe ediniz. İnkübasyon sırasında Konjugat Çalışma Solusyonunu hazırlayınız, Reaktiflere bakınız. 5. Herbir kuyucuğu 6 kez yıkayınız. (Yıkama Talimatlarına bakınız). 6. SAM kontrol kuyucuğu dahil herbir kuyucuğa 200 µl hazırlanmış Konjugate Çalışma Solusyonu ekleyiniz. Mikrokuyucuk striplerine Konjugat Çalışma Solusyonu eklendikten sonra 450nm dalga boyunda fotometrik olarak okunur: - Sam kontrol kuyucuğu üzerinde blank okutmayınız. - Herbir kontrol ve örnek ye eşit ya da daha fazla değerde olmalıdır. 7. Stripleri yeni yapışkan kaplayıcı ile kapatınız. 37 ± 1 C de 60 ± 3 dakika inkübe ediniz. İnkübasyon sırasında Substrat Solusyonunu hazırlayınız, Reaktiflere bakınız. 8. Herbir kuyucuğu 6 kez yıkayınız. (Yıkama Talimatlarına bakınız). 9. Herbir kuyucuğa hazırlanmış 200 µl Substrat Solusyonu ekleyiniz. 10. Oda sıcaklığında ve karanlıkta 30 ± 1 dakika inkübe ediniz. 11. Reaksiyonu durdurmak için, Substrat Solusyonu ile aynı sekansta ve aynı zaman aralığında 50 µl Stop Solusyonu ekleyiniz. Plağı dikkatlice tutarak uygun şekilde çalkalayın. c adımdan sonra 15 dakika içinde kuyucuklardaki solusyonların absorbanslarını 450 nmde mikroplate okuyucu da okutunuz. SAM kontrol kuyucuğunu blank olarak okutmayınız.

7 Yıkama Talimatı Seyreltilmiş yıkama solusyonu ile yıkayıcıya önyıkama yaptırınız. Aşağıda manual yıkama adımları bulunmaktadır: - Tüm kuyucuklardaki sıvıyı tamamen aspire edin, aspiratörün ucu ile kuyucukların dibinde kalanları da çekin. - Kuyucuk yüzeyine zarar vermemeye dikkat edin. - Herbir aspirasyondan sonra pleyti ters çevirin ve emici dokular üzerinde sertçe vurun. - Kuyucukları 400 µl Yıkama Solusyonu ile doldurun. - En az 30 saniye ıslanması için bekleyin ve sıvıyı aspire edin. - Bu adımları 6 kez tekrarlayın. Önerilen yıkama ya da protokol yokluğunda, aşağıdaki otomatik yıkama adımlarını uygulayınız: 6 yıkama siklüsüne ayarlanmalıdır: µl/kuyucuk miktarında yükleyin. - Doldurma yüksekliğini kuyucuğun tamamı olarak ayarlayınız. - Bir aspirasyon/yıkama/ıslanma siklüsü yaklaşık 30 saniye sürmelidir. Tamamlanmamış yıkama, sonuçları olumsuz etkileyecektir. Yıkama solusyonunun ve yıkayıcının kontamine olması kapsamlı problemlere neden olabilir. Bir problem oluştuğunda, yıkama şişesi ve yıkayıcıyı 4% formaldehid solusyonu ile overnight dezenfekte ediniz. Sonuçlar Kısaltmalar: P = ortalama pozitif kontrol absorbansı S =test örneklerinin ortalama absorbansı Validasyon Kişisel negatif ve pozitif kontrollerin doğruluğunu denetleyin (450 nm de absorbans). - Herbir negatif kontrol den düşük olmalıdır. - Herbir pozitif kontrol den yüksek olmalıdır. - P eliminasyon kontrolleri den düşük olmalıdır. Eğer kontrollerin yarısından fazlası elimine olursa, hatanın kaynağı dikkatlice araştırıldıktan sonra test tekrar çalışmalıdır. Test sonuçları Cut-off değeri hesaplaması: (P/2.75). S < (P/2.75) ise örnek NON-REAKTİF tir. S (P/2.75) ise örnek REAKTİF tir. ÖNEMLİ: - blank üzerinde düzeltme yapılması önerilmez. Çünkü sınır çizgisinde pozitif çıkan örnekler düzeltme sonrasında sınır çizgisi negatife dönüşebilir. Bu durumda, blank OD-değeri ile birlikte tüm OD değerleri düşer, balnk değerinin 2.75 ile bölünmesi durumunda cut-off değeri düşer. İlk testte Pozitif çıkan örnek tekrar test edilmelidir. Tekrar Pozitif çıkan örnek ilave konfirmasyon testleri ile teyit edilmelidir. Sınırlamalar INNOTEST HCV Ab IV test prosedürü, insan serum ve plazmasında HCV antikorlarını belirlemek için dizayn edilmiştir. Diğer vucüt sıvıları ile test performansı hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu örneklerin çalışılması önerilmez.

8 INNOTEST HCV Ab IV testi ile negative bulunan bir sonuç Hepatit C virus enfeksiyonundan korunduğuna dair kanıt olarak kullanılamaz. Erken enfeksiyonlarda HCV için antikor seviyesi belirlenemeyebilir. HCV antikorlarının bulunmuş olması hepatit C tanısı için kesin değildir fakat; olası ya da geçmiş hepatit C virus enfeksiyonunu gösterebilir. Test Performansı Fransa (bir çalışma, 5 bölgede, The Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (AFSSAPS) Paris tarafından), Almanya (2 çalışma, Blood Bank Ulm ve Max von Pettenkofer-Institut München de) ve Belçika (3 çalışma, Blood Transfusion Center Antwerp, AZ-VUB Brussels ve CRI Ghent de) da 6 çalışma yapılmıştır. Ek olarak iç kaynaklı testler yapılmıştır. Bütün testler insane serumu ile yapılmıştır.aşağıda verilen duyarlılık ve özgüllük değerleri referans test baz alınarak değerlendirilmiştir. Özgüllük A. Dört kan transfüzyon merkezinde ve Innogetics te toplamda 8076 seçilmemiş donor örneği INNOTEST HCV Ab IV testi ile çalışılmıştır. Bilgileri Tablo1 de gösterilmiştir. Tablo 1. Seçilmemiş kan donorlerinin serum örneklerinde HCV antikoru belirlenmesi Study No. Repeatedly Repeatedly Repeatedly Specificity samples reactive on IT reactive on IT reactive on IT (%) tested HCV Ab IV HCV Ab IV HCV Ab IV negative on other reactive on other indeterminate screening and screening and on other confirmation test confirmation test confirmation test France % (2 sites) (2005/2009) Belgium % (2035/2039) Germany % (2020/2024) Innogenetics % (1998/2002) Total % (8058/8074) Seçilmemiş kan donorlerinden alınan örneklerin bu testteki duyarlılığı 99.80% (8058/8074). B. HBV-, RF-, HTLV-, EBV-, syphilis- ve Toxo IgG-pozitif örnekler içeren, hamile bayanlardan, otoimmun hastalardan ve bazı non-viral siroz ile bazı hemolitik ve lipemik, toplamda 280 potansiyel reaktif örnek iki bölgede (AZ-VUB and Innogenetics ) incelenmiştir. Tüm örnekler INNOTEST HCV Ab IV testi ile negatif bulunmuştur. Ayrıca, diğer antikor testleri ile negatif bulunan 794 klinik örnekten (CRI Ghent, AZ- VUB Brussels) 793 tanesi INNOTEST HCV Ab IV testi ile de negatif bulunmuştur. INNOTEST HCV Ab IV testi Özgüllüğü 99.80% (9131/9148). Duyarlılık A. HCV ile enfekte olmuş hastalardan toplamda 541 örnek 3 bağımsız Fransız merkezinde, Max von Pettenkofer-Institut de ve Innogenetics de test edilmiştir(tablo 2). Tablo 2.HCV-pozitif örneklerin genotip dağılımı. Örneklerin genotipleri Örnek sayısı Miks 1

9 Belirlenemeyen 286 Toplam 541 INNOTEST HCV Ab IV testi ile tüm örnekler HCV antikoru için tarama-pozitif çıkmıştır. (100% duyarlılık). B. Diğer antikor testleri ile HCV-pozitif olarak bulunan toplam 365 klinik hasta örneği çalışılmıştır. INNOTEST HCV Ab IV testi ile hepsi pozitif bulunmuştur. INNOTEST HCV Ab IV duyarlılığı 100% (906/906). C. Laboratoire de Virologie Transfusionnelle INTS (Paris) de ticari serokonversiyon panelleri ile test edilen test duyarlılığı, kayıtlı testler ile rekabet edebilecek durumda bulunmuştur. Bu bilgiler Tablo 3 te özetlenmiştir. Tablo 3. Ticari serokonversiyonel paneller ile INNOTEST HCV Ab IV testinin reaktivasyonu PanelFirst panel member reactive with First panel member reactive with INNOTEST HCV Ab IVwith an alternative commercially available anti-hcv assay Panel Panel Panel Panel Panel Panel Panel Panel Panel Panel Panel Panel 12 2 >4 Panel Sonuçta, INNOTEST HCV Ab IV testi, serumda HCV antikorlarının belirlenmesinde oldukça duyarlı bir tarama testidir. Kesinlik Güvenilir sayılarda pozitif örnek ile çalışma-içi, çalışmalar-arası ve lotlar-arası varyasyonlar geliştirilmiştir. Farklı testler arasında önemli varyasyonlar (OD-değerleri ya da S/N değerlerinde) saptanmamıştır.