T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ERKEK İNFERTİLİTESİNDE METİYONİN SENTAZ ( MS ) A2756G VE METİYONİN SENTAZ REDÜKTAZ ( MTRR ) A66G GEN

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ERKEK İNFERTİLİTESİNDE METİYONİN SENTAZ ( MS ) A2756G VE METİYONİN SENTAZ REDÜKTAZ ( MTRR ) A66G GEN POLİMORFİZMLERİNİN ETKİSİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABILIM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ Ali Şahin KÜÇÜKASLAN İZMİR ( 2008 )

2 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ERKEK İNFERTİLİTESİNDE METİYONİN SENTAZ ( MS ) A2756G VE METİYONİN SENTAZ REDÜKTAZ ( MTRR ) A66G GEN POLİMORFİZMLERİNİN ETKİSİ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ Ali Şahin KÜÇÜKASLAN DANIŞMAN Yard. Doç. Dr. Zuhal EROĞLU İZMİR ( 2008 )

3 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ Başkan : Yard. Doç. Dr. Zuhal Eroğlu (Danışman) Üye : Doç. Dr. Cumhur Gündüz Üye : Prof. Dr. Bülent Semerci Yüksek Lisans Tezinin kabul edildiği tarih:

4 ÖNSÖZ Yüksek lisans eğitimime başladığım andan itibaren bana her konuda destek veren, bana güvenen, ufkumun genişlemesini sağlayan, beni her konuda yüreklendiren ve tez çalışmam sırasında bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşarak yakından ilgiyle takip eden tez danışmanım Sayın Yard. Doç. Dr. Zuhal Eroğlu na, Yüksek lisans eğitimime başlamamda ve çalışma sürecinde gösterdiği ilgi ve destekten ötürü Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Prof. Dr. Nejat Topçuoğlu na, yüksek lisans eğitimimden tez çalışmamın devamında yaptığı yönlendirmelerle çalışmayı yakından ilgiyle takip eden ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Yard. Doç. Dr. Buket Kosova ya, yüksek lisanstan istatistiksel bilgilerinin elde edilmesi aşamasına kadar tecrübe ve bilgilerini benimle paylaşıp yardımını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Cumhur Gündüz e, Çalışmamın her aşamasıyla ilgilenip göstermiş olduğu yardım ve destekten ötürü ve ayrıca istatistiksel bilgilerin elde edilmesi aşamasında bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan, bana olan güveni ile çalışmama teşvik eden Sayın Araş. Gör. Vildan Bozok Çetintaş a, Yüksek lisans eğitimim boyunca bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan ve tez çalışmamda desteklerini her zaman hissettiğim, Sayın Araş. Gör. Aslı Tetik e, Tez çalışmam için gerekli olan hasta grubunun temin edilmesinde yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Bülent Semerci ye, Sayın Dr. Ulviye Aliyeva ya, Yüksek lisans eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan ve tez çalışmamda desteklerini her zaman hissettiğim, Sayın Araş. i

5 Gör. Nur Selvi, Sayın Araş. Gör. Çığır Biray Avcı, Sayın Araş. Gör. Burçin Tezcanlı ve Yavuz Dodurga ya, Yüksek lisans eğitimim boyunca desteklerinden ötürü ve paylaştığımız her şey için Sayın Çağdaş Aktan, Ayşegül Dalmızrak, Sinem Numanoğlu ve Araş. Gör. Duygu Aygüneş e, Güler yüzlerini hiçbir zaman eksik etmeyen ve yardımlarını esirgemeyen anabilim dalımızın çalışanlarından Gönül Saklıca, Anıl Karakaş ve Orhan Kalmaoğlu na, Anabilim Dalımızın diğer tüm çalışanlarına, Lisans ve yüksek lisans eğitimim boyunca her zaman yanımda olan Onur Akpınar, Kerem Yüksel, Hasan Laçin ve Emre Batır a, Beni büyük bir özveriyle bugünlere getiren, her zaman yanımda olduklarını bildiğim, tez çalışmam boyunca büyük sabır, sevgi ve desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili aileme, TEŞEKKÜR EDİYORUM. İZMİR / 2008 Ali Şahin Küçükaslan ii

6 İÇİNDEKİLER 1. BÖLÜM 1.1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER ERKEK ÜREME FİZYOLOJİSİ HİPOTALAMO - HİPOFİZO - GONADAL EKSEN TESTİSLER Leydig Hücreleri Seminifer 9 Tübüller Sertoli Hücreleri Germinal Hücreler SPERMATOGENEZ SPERMATOGENEZİN HORMONAL YOLLA DÜZENLENMESİ SPERMİN İLETİMİ, OLGUNLAŞMASI VE DEPOLANMASI FERTİLİZASYON ERKEK İNFERTİLİTESİNİN NEDENLERİ Sperm Bulgularına Göre Etiyolojisine Göre Pretestiküler nedenler Testiküler nedenler Kromozom anomalileri Y geni ve erkek infertilitesi Genetik defektler Gonadotoksinler Sistemik Hastalıklar Kriptorşidizm Varikosel İdiyopatik infertilite Posttestiküler nedenler İNFERTİLİTE TANISI ve KULLANILAN YÖNTEMLER Semen analizi Hormonal değerlendirme İmmunolojik değerlendirme Bakteriyolojik değerlendirme GENETİK POLİMORFİZMLER ve İNFERTİLİTE TEK NÜKLEOTİD POLİMORFİZMLERİ HOMOSİSTEİN VE METABOLİZMASI HİPERHOMOSİSTEİNEMİ VE NEDENLERİ HOMOSİSTEİN METABOLİZMASINDAKİ GENETİK BOZUKLUKLAR Metiyonin sentaz ( MS, MTR ) Metiyonin sentaz A2756G Polimorfizmi Metiyonin sentaz redüktaz ( MSR, MTRR ) 39 iii

7 Metiyonin sentaz redüktaz G66A Polimorfizmi MS ve MTRR POLİMORFİZMLERİNİN BELİRLENMESİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU / RESTRİKSİYON ENZİMİ UZUNLUK POLİMORFİZMİ ( PCR / RFLP ) Polimeraz Zincir Reaksiyonu Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) Yöntemi LIGHTCYCLER SİSTEMİ BÖLÜM 2.1. GEREÇ VE YÖNTEM KONTROL VE ÇALIŞMA GRUBU MS ve MTRR GEN POLİMORFİZMLERİNİN ANALİZİ MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Cihazlar MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Kimyasal Maddeler MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Hazır Kitler MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Primerler MS A2756G Polimorfizmi Analizinde Kullanılan Primer Çifti MTRR G66A Polimorfizmi Analizinde Kullanılan Primer Çifti MTR ve MTRR GEN POLİMORFİZMLERİ İÇİN ÇALIŞMA PROTOKOLLERİ DNA İZOLASYON AŞAMALARI PCR ve RFLP YÖNTEMLERİNDE KULLANILAN KİMYASAL ÇÖZELTİLERİN HAZIRLANIŞI Etidyum Bromid Hazırlanması dntp Hazırlanması 55 iv

8 3. BÖLÜM TAE ( Tris-Asetat-EDTA ) Tamponu % 3 lük ve % 6 lik Agaroz Jel Hazırlama MS ve MTRR GEN POLİMORFİZMLERİ İÇİN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU ( PCR ) MS A2756G Polimorfizmi İçin Polimeraz Zincir Reaksiyonu MTRR G66A Polimorfizmi İçin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR ) PCR SONRASI %3 lük ve %6 lık AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ RESTRİKSİYON ENZİM KESİMİ İLE POLİMORFİZM ANALİZİ MS A2756G Polimorfizmi Analizi İçin Restriksiyon Enzim Kesimi MTRR G66A Polimorfizmi Analizi İçin Restriksiyon Enzim Kesimi İSTATİSTİKSEL ANALİZ YÖNTEMLERİ Ki-Kare Testi Regresyon Analiz Testi BULGULAR KONTROL VE ÇALIŞMA GRUPLARININ GENEL ÖZELLİKLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ ve İSTATİSTİKSEL ANALİZLERİ Kontrol Grubu Çalışma Grubu GENOTİP VE HAPLOTİP ANALİZLERİ MS A2756G ( Asp919Gly ) Polimorfizmine Ait Bulgular Kontrol Grubu Çalışma Grubu İstatistiksel Analiz MTRR G66A ( Met22Ile ) Polimorfizmine Ait Bulgular Kontrol Grubu.. 69 v

9 Çalışma Grubu İstatistiksel Analiz BİLEŞİK HAPLOTİP ANALİZLERİ Kontrol Grubu Çalışma Grubu İstatistiksel Analiz BÖLÜM 4.1.TARTIŞMA BÖLÜM 5.1. SONUÇ VE ÖNERİLER BÖLÜM 6.1. ÖZET ABSTRACT BÖLÜM 7.1. YARARLANILAN KAYNAKLAR KISALTMALAR ÖZGEÇMİŞ vi

10 Tablo No Tablolar, Şekiller, Grafikler, Resimler Dizini Tablo 1: Kullanılan Cihazlar Tablo 2: Kimyasal Maddeler Tablo 3: Kontrol ve Çalışma Grubunun MS A2756G Genotip ve Haplotip Analiz Sonuçları Tablo 4: Kontrol ve Çalışma Grubunun MTRR G66A Genotip ve Haplotip Analiz Sonuçları Tablo 5: Kontrol ve Çalışma Gruplarının G66A ve A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz Sonuçları.. 72 Tablo 6: Kontrol ve Azospermi Gruplarının G66A ve A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz 73 Sonuçları... Tablo 7: Kontrol ve Oligozoospermi Gruplarının G66A ve A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz 74 Sonuçları Tablo 8: Azospermi ve Oligozoospermi Gruplarının G66A ve A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz Sonuçları Şekil No Şekil 1: Hipotalamo - Hipofizo - Gonadal Eksen... 6 Şekil 2: Spermin olgunlaşma basamakları Şekil 3: Spermatogenez in şematik 12 Şekil görünümü... 4: Homosisteinin metabolize yolları Şekil 5: MS A2756G Polimorfizmi İçin Yabanıl ( 1, 3, 4, 5 ), Mutant ( 2 ) ve Heterozigot ( 6 ) Genotiplerin RFLP sonrasında % 3 lük Agaroz Jeldeki Görüntüleri Şekil 6: RFLP sonrasında MTRR G66A Polimorfizmi İçin Heterozigot ( 1 ) ve Yabanıl ( 2 ) Genotiplerin % 6 lık Agaroz Jeldeki 68 Görüntüleri. vii

11 Grafik No Grafik 1: Kontrol ve Çalışma Grubunun MS A2756G Polimorfizm Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması; Genotip ve Haplotip Dağılımı.. Grafik 2: Kontrol ve Çalışma Grubunun MTRR G66A Polimorfizm Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması; Genotip ve Haplotip Dağılımı.. Grafik 3: Kontrol ve Çalışma Gruplarının MTRR G66A ve MS A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması 72 viii

12 1. BÖLÜM 1.1. GİRİŞ VE AMAÇ Fertilite, erkek ve kadın üreme sistemlerinin anatomik ve fonksiyonel olarak normal çalışmasına bağlı gelişen bir olaydır. Üreme sistemlerinden birinin herhangi bir nedenle bozulması fertiliteyi olumsuz yönde etkileyerek infertiliteye yol açmaktadır. İnfertilite, genel bir ifadeyle 1 yıl korunmasız cinsel birleşmeden sonra gebe kalınamaması olarak tanımlanmaktadır ( 2, 109 ). Gebeliği önleyebilen çok sayıda faktörden biri veya birkaçı ya kadın cinsiyetinde, ya erkek cinsiyetinde ya da her iki cinsiyette bir arada bulunabilir ( 2 ). İnfertilite olgularının yaklaşık % 20 si erkek faktöründen, % ı ise hem erkek hem kadın faktöründen kaynaklanmaktadır. Dolayısı ile erkek infertilitesi, toplam çiftlerin yarısında çocuk sahibi olamaması olarak tanımlanmaktadır ( 2, 43 ). Erkek infertilitesine neden olan etmenlerin bir kısmı genetik kökenli, bir kısmı da sonradan gelişen olaylardır. Özellikle azospermik ve şiddetli oligospermik hastaların etiyolojilerinde, hem cinsiyet hem de otozomal kromozomlarda meydana gelen sayısal veya yapısal bozukluklar genetik kökenli nedenlerin en önemlileri arasında yer almaktadır ( 41 ). Bugüne kadar yapılan çalışmalarla infertilitenin ortaya çıkışı, gelişimi ve ilerlemesinde etkili olan genetik ve moleküler mekanizmalar ortaya konmaya çalışılmış ve genomda oluşan bazı mutasyon ve polimorfizmlerin etkileri araştırılmıştır ( 8, 41,100, 107 ). Diğer yandan son 7-8 yıl içinde erkek

13 infertilitesinin tedavisi yönünde de cerrahi ve medikal yöntemler geliştirilmeye başlanmıştır. Bu yöntemlerden olan "mikroenjeksiyon ( ICSI, iğneli gebelik ) tekniği ile daha önce tedavi edilemeyen infertil erkekler başarılı bir şekilde tedavi edilebilmektedir. Spermatogenezis, birçok genin kontrol ettiği kompleks bir olaydır ( 35 ). DNA metilasyonu bu kompleks olayda yer alan ve genlerin ekspresyonlarını regüle eden önemli bir mekanizmadır. Son yıllarda metilasyon haricinde farklı mekanizmaların da spermatogenezis olayında önemli roller üstlendiği ileri sürülmektedir. Önemli rolü olduğu ileri sürülen mekanizmalardan biri folat metabolizmasıdır. Bu metabolizmada pek çok enzimin yanında Metiyonin Sentaz ( MS ) ve Metiyonin Sentaz Redüktaz ( MTRR ) enzimleri önemli rol oynarlar. Kobalamin bağlı metiyonin sentaz olarak ta tanımlanan MS enzimi, karbon metabolizması ve protein sentezi için gerekli olan metiyonin amino asit biyosentezinin son basamağını katalizler. MTRR enzimi ise metilasyonu indirgeyerek fonksiyonel olan metiyonin sentazı oluşturur ( 31 ). Folat; DNA sentezi, metilasyon reaksiyonları ve protein sentezinde önemli işlevleri olan bir moleküldür. Folat döngüsünde yer alan metiyonin sentaz ( MS ) ve metiyonin sentaz redüktaz ( MTRR ) enzimini kodlayan genlerde görülen bazı polimorfizmlerin, hipometilasyon ve homosistein artışıyla, DNA sentezi ve metilasyonu etkileyerek mayotik non-disjunction olayına ve buna bağlı olarak da anormal kromozomal segregasyonuna ( ayrılmasına ) neden olduğu ve bu yolla da bazı hastalıkların gelişiminde etkili olduğu belirlenmiştir. Ayrıca bu genlerdeki polimorfizmler, enzimlerin aktivitesinin değişmesine ve bireylerde homosistein düzeylerinin artışına da 2

14 neden olabilmektedir. Bu bilgiler ışığında biz, bu çalışmamızda folat metabolizmasında önemli görevleri olan MS ve MTRR enzimlerini kodlayan genlerde en yaygın görülen MS A2756G ve MTRR G66A gen polimorfizmlerinin erkek infertilitesi üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladık GENEL BİLGİLER Fertilite, erkek ve kadın üreme sistemlerinin anatomik ve fonksiyonel olarak normal çalışmasına bağlı olan bir durumdur. Gebe kalınmasını önleyen çok sayıda etken mevcut olup, hem erkek hem de kadında bu faktörlerin birlikte görülme olasılılıkları oldukça yüksektir. Gebeliği sağlayamayan çiftlerde, etiyolojik sebepler değerlendirilirken mutlaka hem erkek hem de dişi üreme fizyolojisi ve patofizyolojisinin tam anlamıyla araştırılıp, değerlendirilmesi oldukça önemlidir ( 2 ) ERKEK ÜREME FİZYOLOJİSİ İnsan testisi iki önemli fonksiyonu olan bir organdır. Birinci fonksiyonu; seminifer tübüllerde spermatogenez ile sperm oluşumunu sağlamak, ikinci fonksiyonu ise interstisyel dokudaki leydig hücrelerinden steroid hormonlarının ( androjenleri ) salgılanmasını sağlamaktır. Bu salgılanan steroid hormonlarından biri testosterondur. Testesteron yalnızca sperm üretimi için değil, aynı zamanda sekonder cinsiyet karakterlerin gelişmesi ve normal cinsel aktivitenin sürdürülmesi için de gerekli olan bir hormondur. Testesteronun bu fonksiyonları ön hipofizden; gonadotropinler, lüteinizan 3

15 hormon ( LH ) ve folikül uyarıcı hormon ( FSH ) salgılanması yoluyla kontrol edilir. Normal üreme fonksiyonu, hipotalamo- hipofizo- gonadal eksen kapalı geri dönüşlü ( feedback ) kontrol mekanizmasına bağlı olarak sürdürülmektedir ( 31 ) HİPOTALAMO - HİPOFİZO - GONADAL EKSEN Pek çok nukleus ünitelerinden oluşan ve beynin tabanında yer alan hipotalamus; retina, korteks ve talamus gibi birçok merkezden mesajlar alarak hipofizin endokrin fonksiyonlarını düzenler. Bu regülasyon hipotalamus ve hipofiz arasındaki bir vasküler portal ileti ile sağlanmaktadır. Hipotalamus ve hipofiz arasında gözlenen kapalı normal dolaşım, ön hipofizin hormonal regülasyonunda etkin rol oynar. GnRH (Gonadotropin Releasing-Hormon ) hipotalamustan salgılanan, hipofiz hormonlarını düzenleyen ve üreme fizyolojisinde önemli rol oynayan bir hormon olup ayrıca ön hipofizden LH ( Luteinizing hormone ) ve FSH ( Follicle-stimulating hormone ) ın salgılanmasını sağlar. Stres, egzersiz ve dietle salınımı değişen GnRH ın düzenlenmesinde katekolamin, prostaglandin ve testiküler steroidler etkin rol oynarlar. LH ve FSH hormonları hücresel metabolizmayı uyarmak için Leydig ve Sertoli hücrelerindeki reseptörlere bağlanırlar. Daha geniş dolaşım yapan FSH, LH a göre daha düşük konsantrasyondadır. Hipotalamo-hipofizogonadal eksen, kapalı bir geri dönüş kontrol mekanizmasıyla kontrol edilmektedir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalar hem serum FSH hem de LH 4

16 da meydana gelen yükselmelerin gonadal hormonların üzerinde inhibitör etkisi yaptığını göstermiştir. Testislerin önemli bir hormonu olan testosteron, erkeklerde LH sekresyonunun primer inhibitörüdür. Testesteron periferik dokularda güçlü bir androjen olan dihidrotestosterona ya da östrojen bileşiği olan östradiol e metabolize olabilmektedir. Bu androjenler ve östrojenler birbirinden bağımsız olarak LH salgılanmasını düzenlerler. İnsan ve hayvan çalışmalarıyla sertoli hücre faktörü olan İnhibin in FSH ın geri dönüş mekanizmasında önemli bir rol üstlendiği gösterilmiştir. Spermatogenetik aktivitenin düşmesi, İnhibin konsantrasyonunun azalmasına neden olurken, FSH düzeyinde artışa neden olabilmektedir ( Şekil 1 ). Diğer önemli hormonlardan olan prolaktin, gonadotropinlerle karmaşık bir ilişki içersindedir. Hiperprolaktinemili ve testosteron yetersizliği olan erkeklerde, serum LH düzeylerinin tutarsız biçimde düşük oluşu bu hastalarda hipotalamo-hipofizer eksenin düşük testosteron düzeylerine yanıt veremediğini göstermektedir. Diğer yandan prolaktin, GnRH üretimini inhibe etmektedir ve prolaktin salgılayan tümörlü hastalarda GnRH enfüzyonun LH' ı yükselttiği gözlenmektedir. Ayrıca yüksek prolaktin düzeyi androjen salgılamasını inhibe ettiği gibi merkezi sinir sistemini de doğrudan etkileyebilmektedir. Androjen verilen, yüksek prolaktin düzeyi bulunan bireylerde, prolaktin seviyeleri yüksek olduğu sürece libido ve cinsel fonksiyonun normale dönmediği gösterilmiştir ( 31 ). 5

17 Şekil 1: Hipotalamo - Hipofizo - Gonadal Eksen TESTİSLER Skrotum denen deri ve bağ dokudan yapılmış torbalar içinde sağ ve solda olmak üzere birer tane olan testislerin görevi, sperm ve hormonların oluşmasını sağlamaktır. Toplam ağırlığı gram olan testisler bir bölme ile skrotumda ayrılmaktadırlar. Skrotum, testisleri taşımanın yanı sıra kasılıp - gevşeyerek testislerin belli bir ısıda kalmasını sağlamaktadır. Testisler çift katlı zarla çevrili olup, testisi ilk saran tunica albuginea elastik olmayan bir dokudur. Bunun iç kısmı damar ve sinir bakımından zengindir. Testisler lob taşırlar ve her bir lobda 1-4 adet kıvrımlı seminifer tübül bulunmaktadır. Seminifer tübüller, kıvrıntılı borucuklar olup duvarlarında spermatogonium ve sertoli hücrelerini taşırlar. Spermatogonium hücreleri spermleri, oluşturur, sertoli hücreleri ise spermatogenezin yolunda gitmesini sağlayan İnhibin hormonunu salgılarlar ( 5, 44 ). 6

18 Leydig Hücreleri Testisin ara elemanlarından olan leydig hücreleri, toplam testis hacminin yaklaşık % 5-12 lik kısmını oluştururlar. Genç bir erkekte yaklaşık 700 milyon leydig hücresi bulunmaktadır. Leydig hücreleri, LH ve testis içindeki parakrin faktörlerin etkisiyle prekürsör hücrelerden farklılaşan hücrelerdir. Leydig hücreleri içinde vücutta bulunan testosteronun büyük bir kısmı kolesterolden sentez edilir. Kolesterol ise ya dolaşımdan gelmekte ya da leydig hücreleri içindeki endoplazmik retikulumdan yeniden ( de novo ) veya hücre içindeki yağ damlacıklarında bulunan kolesterol esterlerinden sentezlenmektedir. Oluşan testosteron endoplazmik retikulumdan sitoplazmaya, buradan da hücre dışına taşınarak kanda testosteron bağlayıcı proteine bağlanır. Testosteronun hücre dışına taşınması ve burada tutulması leydig hücresi dışında bulunan albumin, Androjen Bağlayıcı Protein ( ABP ) ve testosteron-östradiol bağlayan proteinler sayesinde gerçekleştirilmektedir. Leydig hücrelerinde testosteron yapımı primer olarak LH a bağımlı gerçekleşir. LH dışında FSH, prolaktin, LH-RH, aktivin, inhibin, Epidermal Growth Factor ( EGF ), insülin benzeri büyüme faktörü - 1 ( IGF-1 ), transforming growth factor b, prostaglandinler ve adrenerjikler gibi farklı otokrin ve parakrin faktörler de leydig hücrelerinde LH a bağımlı steroid sentezinin gerçekleşmesinde rol oynarlar. Bununla beraber, östrojen ve androjenlerin leydig hücrelerindeki streoid sentezini engelleyici rolleri de bulunmaktadır ( 2, 16, 35, 61 ). Ritmik LH salınımına cevaben belli aralıklarla salgılanan Testosteron un günlük sekresyon düzeyi sabah erken saatlerinde doruk noktada, akşam 7

19 saatlerinde ise en düşük seviyelerdedir. Bazı mekanizmalar leydig hücrelerinin LH' a cevaben üretilen testosteron üretim yeteneğini bozmakta ve testosteron üretimi için intratestiküler bir kontrol sistemi oluşturmaktadırlar. Sağlam testislerde eksojen LH uygulamasından sonra LH reseptörleri azalmaktadır. Yüksek dozlardaki GnRH ve analogları LH reseptörlerinin sayısını azaltır ve LH salgılanmasını inhibe etmektedir. Ayrıca östrojen, testosteron sentez yollarındaki enzimleri inhibe ederek testosteron üretimini doğrudan etkilemektedir. Hayvan modellerinde yapılan çalışmalarda prolaktin in LH reseptör sayısını arttırdığı gözlenmektedir ( 31 ). Normal erkeklerde testosteronun % 2' si serbest ( bağlanmamış ) halde, % 44' ü Testosteron-Östradiol Bağlayıcı Globulin ( TeBG ) halinde ve % 54' ü albümin veya başka proteinlere bağlı olarak, seminifer tübüllerde ise androjen bağlayıcı proteine ( ABP ) bağlı olarak bulunur. Androjenlerin biyolojik etkileri, hücre sitozolünde spesifik androjen reseptör proteini içeren hedef organlarda gözlenir. Testosteron dolaşımı terk ettikten sonra organizmadaki hedef hücrelere girmektedir. Bu hücrelerde 5-α redüktaz tarafından daha güçlü bir androjen olan dihidrotestosterona ( DHT ) dönüşebilir. Testosteron veya DHT, reseptör proteine bağlanarak bir kompleks oluşturur, bu kompleks de nüklear kromatine bağlanarak haberci RNA ( mrna ) sentezine yol açmak üzere çekirdeğe aktarılır ( translokasyon ). mrna, protein sentezine ve androjenik aktivitenin ortaya çıkmasına neden olmaktadır. 8

20 Androjenin hedef dokulardaki başlıca fonksiyonları: 1) Hipotalamo-hipofizer eksen tarafından gonadotropin salgılanmasının düzenlenmesi, 2) Spermatogenezin başlatılması ve sürdürülmesi, 3) Fötusun gelişmesi sırasında internal ve eksternal erkek genital sistemin farklılaşması ve 4) Pubertede cinsel gelişmenin endüksiyonudur ( 31 ) Seminifer Tübüller Olgunlaşmanın farklı evrelerinde germ ve sertoli hücrelerini içeren seminifer tübüller, testis hacminin % 85-90' ını oluştururlar ( 31, 35, 46 ) Sertoli Hücreleri Seminifer tübüllerin bazal membranları üzerinde bulunan, lümenine doğru ipliksi sitoplazmik uzantılar veren, bölünemeyen ve sayıları sabit kalan destek hücreleridir. Bu hücreler birbirlerine, bazal ve lümene bitişik bir kompartıman olmak üzere ikiye bölen sıkı bileşiklerle bağlanırlar. Ayrıca peritübüler kontraktil hücre tabakasının yakın ilişkide olduğu miyoid hücreleri ile birlikte kan-testis bariyerinin oluşturulmasına hizmet ederek spermatogenezi kolaylaştırırlar. Bunun başka gelişmekte olan germ hücrelerini beslerler ve fonksiyonunu kaybetmiş hücrelerin fagositozunu sağlarlar ( 31, 45, 46, 121 ). 9

21 Germinal Hücreler Spermatogenik hücreler; bazal membran üzerine yerleşmiş ve lümene doğru primer spermatosit, sekonder spermatosit ve spermatid şeklinde düzenli sıralanmış olan hücrelerdir yılında Heller ve Clermont, gelişme sürecinin farklı evrelerini temsil ettiği düşünülen 13 farklı germ hücresini saptamış ve en düşükten en yüksek farklılaşma derecesine göre: koyu tip A spermatogonialar ( Ad ); soluk tip A spermatogonialar ( Ap ); tip B spermatogonia ( B ); preleptoten primer spermatositler ( R ); leptoten primer spermatositler ( L ); zigoten primer spermatositler ( Z ); pakiten primer spermatositler ( P ); sekonder spermatositler ( II ) ve Sa, Sb, Sc, Sd1 ve Sd2 spermatidler şeklinde adlandırmışlardır ( 31, 45, 46 ) SPERMATOGENEZ Spermatogenez, ilkel kök hücrelerin yani spermatogoniaların bölünerek çoğaldığı ( ana hücrelerin yenilenmesi ) ve daha sonra spermatositlere dönüşecek yavru hücreleri oluşturan karmaşık bir süreçtir. Farklılaşmamış spermatogoniaların en ilkel formları kök hücreleridir. Kök hücrelerinin sürekli yenilenmesini sağlamak için mitotik bölünmeden sonra ilkel kök hücreler, koyu tip A spermatogonialar ( Ad ) yeni Ad hücrelerle birlikte soluk tip A spermatogoniaları ( Ap ) üretirler. Soluk tip A spermatogonialar mitotik bölünme sonrasında tip B spermatogonia dan preleptoten primer spermatosit lere dönüşürler. Primer spermatositler ise mayoz bölünme ile ilk olgunlaşma evresinden geçer ve kromozom sayılarını 46' dan 23' e indirirler. Her bir primer spermatosit, 2 sekonder spermatosite ve bunların her biri de 2 spermatide bölünür. Spermatidler daha sonra 10

22 spermiyogenez denilen bir süreçle spermatozoalara dönüşür. Bu süreçte çekirdek yoğunlaşması, sitoplazmanın büyük kısmının kaybı, kuyruk gelişimi ve mitokondriaların spermin orta bölümüne dizilmesi gözlenir ( Şekil 2 ) ( 2, 31, 46, 121 ). Şekil 2: Spermin olgunlaşma basamakları İnsan testislerinde hücrelerarası köprülerle birbirlerine bağlanmış olan germ hücre grupları aynı gelişme evresinde hep birlikte spermatogenez sürecinden geçerler. Gelişmekte olan germ hücrelerinin bu ardışık evre dizisi bir jenerasyonu ( kuşağı ) oluşturmaktadır. Germ hücre jenerasyonları 11

23 rastgele karışmaz aksine sınırlı sayıda hücre toplulukları ( evreler ) oluştururlar. Enine kesitlerin histolojik incelemelerinde pek çok germ hücresinin belli hücre grupları ile birlikte bulunduğu gözlenmektedir. Bu spesifik hücre toplulukları seminifer epitel evreleri olarak bilinmekte ve insan erkek cinsiyetinde 6 evre olduğu gözlenmektedir ( 31, 46 ). Spermatogenez, progresif biçimde ardışık evrelerin hücre topluluklarını ilgilendiren bir süreçtir. Seminifer tübülün herhangi bir segmentinde evre I' den evre IV' a ilerlemesi bir siklusu oluşturmaktadır. İnsanlarda her bir siklusun süresi yaklaşık 16 gündür ve ilkel spermatogoniumdan 4,6 siklüs sonunda olgunlaşmış bir sperm oluşturulur. Bu nedenle insanlarda tüm spermatogenik siklüs 74 gün ( 4. 6 x 16 ) sürmektedir ( 12, 31, 35, 46, 121 ). Şekil 3: Spermatogenez in şematik görünümü 12

24 SPERMATOGENEZİN HORMONAL YOLLA DÜZENLENMESİ Testislerin her iki kompartmanı arasında sıkı bir yapısal ve fonksiyonel ilişki bulunmaktadır. Sertoli hücreleri, spesifik yüksek afiniteli FSH reseptörleri içermeleri nedeniyle, FSH' ın hedef hücreleridir. Bu nedenle testosteron ve FSH, seminifer tübül epiteline yönlendirilmiş hormonlardır. Pubertede spermatogenezin başlamasında FSH ve daha az oranda da LH ( testosteron salgısını uyararak ) görev almaktadır. FSH, sertoli hücrelerinin ve kısmen de leydig hücrelerinin gelişmesinden sorumludur. Puberte öncesinde, testosteron tek başına spermatogenezi başlatmasına rağmen erişkinlerde ise ancak LH nın etkisiyle, başlamış olan spermatogenezin devam ettirilmesinde kalitatif olarak rol oynamaktadır. Spermatogenezin kantitatif olarak sürdürülmesinde ise FSH gereklidir. LH, spermatogenezde sadece leydig hücrelerini uyararak testosteron salgılatıcı etki göstermektedir. Bir sertoli hücre ürünü olan androjen bağlayıcı protein, androjenleri hücre içine, testosteron ise testislerden epididim kanalına taşınmasında rol oynar. Leydig hücrelerinin seminifer tübüllere fiziksel yakınlığı ve sertoli hücreleri tarafından androjen bağlayıcı proteinlerin oluşturulması, gelişmekte olan spermatozoanın mikroortamında yüksek androjen düzeyinin sağlanmasına neden olmaktadır ( 2, 31, 35, 46, 121 ). 13

25 SPERMİN İLETİMİ, OLGUNLAŞMASI VE DEPOLANMASI Spermin üretiminden testis; spermatozoaların olgunlaşması, depolanması ve taşınmasından ise epididim sorumludur. Testiste hareketsiz olarak bulunan ve ovumu dölleme yeteneğinden yoksun olan spermatozoalar, epididimden geçtikten sonra hareket ve dölleme ( fertilizasyon ) yeteneği kazanırlar. Testis kapsülü ( Tunika albuginea ) testis içine fibröz septumlar uzatır. Bu septumlar; seminifer tübülleri içeren piramid şeklinde ve sarmal yapıdaki yaklaşık 250 lobül oluşturur. Bu testiküler ağ yapısındaki lobüller birleşerek testiküler sıvının ve spermatozoaları epididim başına aktaran efferent kanalcıkların ( ductuli efferentes ) yapımında rol oynarlar. Epididim 5-6 m uzunluğunda tek bir tubuli kontortiden ibaret olup baş ( kaput ), gövde ( korpus ) ve kuyruk ( kauda ) olmak üzere 3 bölümden oluşmuştur. Spermin epididim den geçiş süresi ( testiküler sperm üretim hızı ) yaşla ve cinsel aktiviteyle birlikte değişiklik gösterir. Epididimin baş ve gövdesinde bulunan spermler olgunlaşma evresi sırasında; yüksek frekans, düşük amplitüde özellikleri ile hareketlilik ( progresif motilite ) ve oositlere penetrasyon yeteneği kazanır. Epididim aynı zamanda sperm için bir rezervuar veya depo görevi görür. Gonad dışı sperm rezervinin 209 milyon sperm olduğu ve % 50' den fazlasının epididim kaudasında lokalize olduğu belinmektedir. Epididim kaudasında depolanan bu spermler, cm uzunluğunda bir müsküler kanal olan ve içeriğini peristaltik dalgalarla ejakülatuvar kanala atan vas deferense girerler ve daha sonra erkek reprodüktif sistemi dışına emisyon ve ejakülasyonla atılırlar. Emisyon sırasında seminal vezikül ve prostattan gelen salgılar posterior 14

26 üretrada depolanır. Ejakülasyondan önce vas deferens ve boyun kısmının peristaltizmi sempatik sistemin kontrolu altındadır. Ejakülasyon sırasında sfinkterler gevşer ve semen, somatik kontrol altındaki perineal ve bülboüretral kasların ritmik kontraksiyonlarıyla üretraya atılır. Ejakülatın ilk sıvı kısmı karakteristik olarak spermatozoaların ve prostat salgılarının çoğunu, diğer kısmı ise esas olarak seminal vezikül salgıları ve yalnızca bir kaç spermatozoa içermektedir ( 2, 31 ) FERTİLİZASYON Normalde fertilizasyon, uterus tüpleri içinde sperm hücresinin ovumu döllemesiyle başlayan bir süreçtir ( 31, 109 ). Menstrüel siklusun ortasında servikal müküs, daha fazla miktarda ve yoğunluğu azalarak spermin uterusa girmesini ve spermin yüksek derecede asidik vajinal salgılardan korunmasını sağlamaktadır. Fertilizasyonun oluşabilmesi için spermatozoanın kadın reprodüktif yolu içinde belli fizyolojik değişiklikleri ( kapasitasyon ) geçirmesi gerekmektedir. Spermin ovumla etkileşime girmesi yeni flagellar hareketlerin ( hiperaktif motilite ) ve litik enzimlerin salınımına yol açarak spermin akrozom reaksiyonunu endükte etmektedir. Babadan yeni kuşağa, genetik materyalin taşınmasında etkin olan sperm hücreleriyle ilgili olarak ortaya çıkabilecek patolojiler sonucu gebeliğin sağlanamaması erkek infertilitesi olarak değerlendirilmektedir ( 109 ). Spermatozoa 60 mm boyunda, baş kısmı 3 X 4.5 mm çapında olan ileri derecede farklılaşmış bir hücredir. Baş kısmını yoğun kondanse olmuş kromatin içeren nukleus oluşturur. Başın ön kısmında yer alan akrozomun 15

27 görevi, içindeki enzimler yardımıyla oositi çevreleyen membranlara penetrasyonu sağlamaktır ( 2, 35, 36, 47 ). Spermatozoanın orta kısmında, aksonem in etrafını heliks tarzında çevreleyen mitokondriler yerleşmiştir ve bu organeller enerji için gerekli ATP sentezini yaparlar. Aksonem 9+2 mikrotubulü yapısında olup, etrafında outerdense fibriller bulunmaktadır. Sperm kuyruğunun kuvvetli hareket etmesini sağlayan bu fibriller disülfid bağlarından zengindirler. Aksonem içindeki enzimler ve proteinler, ATP' nin kimyasal enerjisini mekanik enerjiye çevirerek kuyruğun hareket etmesini sağlarlar. Spermatozoanın orta kısmından sonraki bölgede yer alan esas kısım başlamakta ve bu bölgenin ortasında etrafı fibröz kılıf ile çevrelenmiş aksonem bulunmaktadır. En son parçayı oluşturan son-kısım ( end-piece ) ise outer-dense fibriller içermeyen ve sadece aksonem taşıyan bölgedir. Son-kısım hariç spermatozoa yı dıştan saran plazma membranı, iyon ve diğer moleküllerin içeri taşınması ya da atılmasında rol oynamaktadır. Ayrıca bu membranın diğer bir görevi, yapısındaki özelleşmiş proteinler sayesinde fertilizasyon sırasında sperm-oosit etkileşimini sağlamaktır. Spermatozoa nın, temel görevi genetik materyal içermek olup, komponentleri fertilizasyonda önemli rol oynarlar. Örneğin embriyonun mitoz bölünme yapabilmesi için spermatozoa nın sentrozoma ihtiyacı vardır. Eğer sperm sentrozom içermiyorsa ya da sentrozoma ait bir defekt söz konusu ise embriyonun gelişimi mümkün olmamaktadır ( 47 ). 16

28 WHO ( Dünya Sağlık Örgütü ) standartlarına göre fertilizasyonun olması için optimal şartlarda semenin mililitresinde 20 milyon tane spermatozoa olması gerekmektedir ERKEK İNFERTİLİTESİNİN NEDENLERİ Bugün, erkek infertilitesine neden olan pek çok etken olduğu bilinmektedir. Bu etkenlerin en önemlileri: Sperm Bulgularına Göre: Aspermi: Psikojenik bozukluklar, retrograd ejakulasyon, emisyon yetersizliği, vasküler, hormonal ve ereksiyon bozuklukları nedeniyle seminal sıvının olmamasıdır ( 2, 48 ). Hipospermi: Prostat, seminal veziküller ve vaz deferens enfeksiyonları, travma ve tümörler, androjen eksikliği, kanal tıkanıklıkları, emisyon bozukluğu ve retrograd ejakulasyon nedeniyle toplam ejakulat hacminin 2 ml den az olması durumudur ( 2, 48 ). Hiperspermi: Prostat ve seminal veziküllerin enfeksiyonu ile ejakulat volümünün 8 ml den fazla olmasıdır ( 2 ). Azoospermi: Genetik, hormonal nedenler, ilaçlar, radyasyon, kanalların tıkanıklığı, germinal aplazi, enfeksiyon ve geçirilmiş operasyonlar sonucu ejakulat içinde hiç germinal hücre bulunmamasıdır ( 2, 49 ). Oligozoospermi: Kromozomal nedenler, idiopatik, inmemiş testisler, bazı ilaçlar, genital enfeksiyonlar, koit sıklığı, stres, beslenme, ısı vb. faktörlere bağlı olarak sperm sayısının 20 milyon / ml den az olması halidir ( 2, 50 ). 17

29 Astenozoospermi: Genital enfeksiyonlar, antisperm antikorların varlığı, varikosel, kartagener sendromu, toksik maddelerle temas, ısı, genetik anomaliler, ilaçlar, androjen yetersizlik, epididim fonksiyon bozuklukları, koit sıklığında azalma, ejakulat viskozite bozuklukları, prostat ve seminal vezikül fonksiyon bozuklukları nedeniyle normal motilitedeki sperm sayısının yarısından fazlasının azalmasıdır ( 2, 51 ). Teratozoospermi: Kromozomal nedenler, toksik maddelerle temas, seminal kanallarda deformasyon, emisyon bozukluğu ve epididim enfeksiyonu nedenleriyle WHO kriterlerine göre morfolojisi bozuk sperm sayısının % 40 dan fazla olması durumudur ( 2, 52 ). Oligoastenoteratozoospermi ( OAT ): Varikosel, inmemiş testis, ısı, ilaçlar veya çevresel toksinler nedenleriyle sperm dansite, motilite ve morfoloji bozukluklarının bir arada görülmesi durumudur ( 53 ). Nekrozoospermi: Kadına ait faktörler, immünolojik nedenler, genital enfeksiyonlar, travma, seminal kanallarda obstrüksiyon, varikosel, geçirilmiş operasyonlar ve yetersiz cinsel eğitim nedenleri ile WHO e göre sperm parametreleri normal değerde olmasına rağmen tüm spermlerin ölmesi halidir ( 2 ) Etiyolojisine göre: Etiyolojisine göre erkek infertilitesi 3 grup içinde incelenmektedir Pretestiküler nedenler Erkek infertilitesinde endokrin nedenler pretestiküler nedenler olarak da bilinmektedir. Fertiliteyi, hormon yetmezliği ya da hormonların aşırı salgılanması etkilemektedir ( 54 ). Bu hormonal nedenler; 18

30 Hipogonadotropik hipogonadizm: Hipogonadotropik hipogonadizm ( HH ) hipotalamus ya da hipofiz bezinde anatomik veya fonksiyonel bir bozukluğun olması sonucu serum gonadotropinlerinin düşük olması ile seyreden bir hastalıktır. Spermatogenezisin kısmi bozukluğu veya tam yokluğu ile karakterizedir ( 2, 54, 122 ). Hipofizer yetmezlik: Tümörler, enfarktlar veya granülomatöz süreçler hipofizer yetmezliğe yol açabilmektedir. Puberteden önce yetmezlik oluşursa, sürrenal ve tiroid yetmezliğiyle birlikte görülen büyüme geriliği tablosunun oluşumuna neden olur. Cinsel açıdan gelişmiş erkeklerdeki hipogonadizm nedeninin çoğunlukla hipofizer bir tümördür ( 31, 54 ). Adrenal bozukluklar: Sertoli hücreleri, testisin interstisyel hücre tümörlerinin tümü aralıklı olarak östrojen üretebilirler. Östrojen, primer olarak hipofizer gonadotropin salgılanmasını baskılayıp, testiküler yetmezliğe yol açabilmektedir. Androjen ise hipofizer gonadotropinleri baskılayarak sekonder testis yetmezliğine neden olabilir. Sporcular tarafından kullanılan ekzojen östrojenler geçici infertiliteye yol açabildiği rapor edilmiştir ( 123 ) Testiküler nedenler Kromozom anomalileri Kromozom anomalileri sayısal ( trizomi ) ya da yapısal ( translokasyon, inversiyon ) olabilir ( 55 ). Steril çiftler üzerinde yapılan çalışmalarda, erkeklerde kromozom bozukluklarının % 6,2 oranında olduğu ve erkek partnerin sperm sayısının 10 milyondan az olan gruplarda ise bu insidansın % 11 e kadar yükseldiği 19

31 gözlenmiştir. Azospermik hastaların % 21 inde ise önemli kromozomal bozuklukların olduğu belitilmiştir ( 55, 68 ). Klinefelter sendromu ve varyantları: Klinefelter sendromu en sık rastlanılan cinsiyet kromozom anomalisidir. Erkeklerde ilave X kromozomunun bulunmasıyla seyreden 1 / 500 doğumda gözlenen bir hastalıktır. Bu kişilerde azalan androjen, azospermi ve testosterona göre yüksek östrojen düzeyleri feminizan bir görünüme dolayısıyla da jinekomastiye neden olmaktadır. Yetişkinlerde testisler sert, küçük ve üreme hücrelerinden yoksundur. Epifizin geç kapanması yüzünden uzun kol ve bacaklara sahiptirler. Leydig hücre fonksiyonu bu hastalarda zayıflamıştır. Hastaların yaklaşık % 10' unda kromozomal mozaisizm olduğu için Klinefelter sendromu belirtileri daha hafif seyreder. Testisler içinde normal hücre klonu bulunabildiğinden dolayı da fertil olabilirler ( 31, 41, 55, 116, 124 ). XX Hastalığı ( Cinsiyet Dönüşümü Sendromu ): Klinefelter sendromunun bir formudur. Hastaların boyları normalin altında olması dışındaki belirtileri Klinefelter ile benzerlik göstermektedir. XYY Sendromu: Fenotipleri çok daha değişken olmasına rağmen bu sendromun insidansı Klinefelter sendromuna benzer. Bu hastalar da aşırı derecede boy uzunluğu dikkati çekmektedir. Çoğunun plazma LH ve testosteron düzeyleri normaldir ancak plazma FSH düzeyleri germ hücre hasarının yaygınlığına bağlı olarak değişkenlik gösterebilir. Hastaların ejakülatları azospermi veya normal değerler arasında değişir ( 31, 41 ). 20

32 Noonan Sendromu ( Erkek Turner Sendromu ): Turner sendromunun (XO ) erkekteki formudur ve bu hastalar Turner sendromunun tipik özelliklerine benzer özellikleri ( kısa beden yapısı, yayvan ense, düşük kulaklar, oküler bozukluklar ve kardiyovasküler anormallikler ) gösterirler. Noonan sendromlu hastaların çoğu kriptorşidizmli olup spermatogenez baskılanmış infertil bireylerdir. Miyotonik Distrofi: Belli başlı klinik özellikleri; frontal kellik ve testis atrofisinin bulunmasıdır. Otozomal dominant yolla kalıtılır ve belirtileri değişkendir ( örneğin hastaların % 80' inde testis atrofisi gelişir ). Puberte gelişmesi normaldir ancak yıllar sonra testis hasarı oluşur ( 31, 41 ). Bilateral Anorşi ( Kaybolan Testis Sendromu ): Bilateral anorşi çok nadir olarak 1 / erkekte gözlenen bir hastalıktır. Hastalar testiküler androjenlerin yokluğu nedeniyle cinsel yönden olgunlaşmamıştır. Karyotipleri normaldir. Ancak serum LH ve FSH düzeyleri yüksek fakat serum testosteron düzeyleri aşırı derecede düşüktür. Testis torsiyonu ve travması, vasküler travma veya enfeksiyon nedeniyle testisler yok olmuştur. İzole Sertoli hücresi Sendromu ( Germinal Hücre Aplazisi ): Bu sendromun nedenleri; doğumsal germ hücrelerinin yokluğu, genetik defektler, androjen yetmezliği gibi olaylardır. Klinik bulgular ise normal virilizasyon, normal kıvamlı fakat biraz daha küçük boyutlu testisler, jinekomastinin olmamasıdır. Bu hastalarda plazma testosteron ve serum LH düzeyleri normaldir. Ancak plazma FSH düzeyleri genellikle yükselmiştir. Başka testiküler bozukluklarda ( kabakulak, kriptorşidizm, ışınlama ve toksinlere bağlı hasar, yetişkin seminifer tübüler yetmezlik) seminifer tubüllerde yalnızca sertoli hücreleri 21

33 saptanabilmesine karşın bu erkeklerde testisler küçük olup histolojik formu homojen değildir. Translokasyonlar: Resiprokal dengeli translokasyonlar 1 / 500 kişide meydana gelmektedir. Dengeli translokasyonlu bir kişi genetik açıdan normaldir. Fakat bu kişiler çocuklarına genetik bilgiyi dengesiz olarak aktarırlar. Çocuklar genetik materyalleri ya az miktarda alır ya da çok miktarda alırlar. Down sendromunun nedenlerinden biri, anne ya da babaya ait dengeli translokasyonların kromozom 21 i kapsamasıdır ( 55 ) Y geni ve erkek infertilitesi 1976 yılında Tiepolo ve Zufardi, karyotip analiz çalışmaları sırasında Y kromozomun sperm üretiminde rol oynadığını belirlemişlerdir. Daha sonra 6 azospermili hastada karyotip analizi ile Y kromozomunun uzun kolunda geniş bir terminal delesyon bulmuşlar ve bu bölgenin tamamen spermatogenezden sorumlu olduğunu rapor etmişlerdir. Azospermi Faktör ( AZF ) olarak adlandırılan bu bölgedeki delesyonlar fenotipik bozukluk meydana getirmeden oligozoospermi ya da azospermiye neden olmaktadır ( 41, 106, 111 ). Mikrodelesyonlar fertil erkeklerde de bulunmasına rağmen, infertil erkeklerde daha sık bulunmaktadır ( 55, 86 ). Mikrodelesyonlar Y kromozomun üst üste binmeyen 3 bölgesinde bulunmaktadır ve AZF a-b-c olarak isimlendirilirler ( 55, 115 ). Dördüncü bölge olan AZFd ise AZFc ile üst üste binmekte ve bu bölgenin farklı bir bölge olduğu düşünülmektedir ( 55, 70, 81 ). 22

34 Mikrodelesyonlar yaygın olarak, DAZ ( Deleted in azoospermia ) genini çevreleyen AZFc bölgesinde bulunmaktadır. Bununla birlikte, DAZ geni delesyonu ve spermatogenez ya da AZFc mikrodelesyonları arasında zayıf bir korelasyon vardır ( 38, 55, 86 ). Azospermi ayrıca daha büyük AZFb Y mikrodelesyonlu erkeklerde de meydana gelmektedir ( 37, 55 ). Genellikle, Y kromozomundaki genler hayati aşamalar için gerekli değildir fakat erkek karakteristiklerini şifrelemektedir. Y mikrodelesyonlar, farklı derecelerde spermatogenezin bozulması ile ilişkilidir ( 25, 38, 55, 70, 89, 115 ). AZFc mikrodelesyonların sıklığı fazla olan bireylerin eşlerinde yinelenen düşüklerin olduğu bildirilmektedir ( 18, 55 ) Genetik defektler Kallmann sendromu: En yaygın X e bağlı bozukluktur. Baskın formu Xp22.3 te KALIG-1 geninde bir mutasyon ile X e bağlı resesif bozukluğa neden olmaktadır ( 27, 55 ). Kallmann sendromunun nadir formu otozomal dominant formu içermektedir ( 55, 95 ). Kallmann sendromlu hastalarda hipogonadotrofik hipogonadizm gözlenmektedir ve diğer klinik özellikleri, fasiyal asimetri, yarık damak, renk körlüğü, sağırlık, renal anomalileri bulunmaktadır. Replasman tedavisi ile spermatogenez stimule edilebilmektedir ( 27, 41, 55, 80, 95 ). Prader-Willi Sendromu: Kromozom 15 in kısa kolunda mutasyon ya da delesyon hastaya babasından ya da daha az sıklıkla annesinden bu lokusun 2 kopyası geçmektedir. Obezite, kriptorşidizm, hafif veya mental gerilik ile karakterizedir ( 41, 97 ). 23

35 Androjen duyarsızlığı: Reifenstein sendromu: Xq e lokalize olan androjen reseptör geninde meydana gelen bir defekt yüzünden X e bağlı resesif kalıtım göstermektedir. Herhangi bir genital anomali olmamasına rağmen inferitlile ile sonuçlanan androjen reseptör bozukluğu nadir olarak gözükmektedir ( 55, 107 ). Bazı olgularda ise genital anomali tanımlanmıştır ( 30, 55 ). Irklara göre değişebilen, ekzon 1 de uzun CAG ( sitozin-adeninguanozin ) tekrarları gözlenmiştir. Kistik fibroz mutasyonları: Kistik fibroz, beyaz ırkta gözlenen en yaygın otozomal resesif genetik bozukluktur. Kistik fibroz, kistik fibroz transmembran iletim düzenleyicisi ( CFTR ) genindeki mutasyonlardan kaynaklanır. Bu gen 7.kromozomun kısa kolunda lokalizedir. İyon kanalı, ejakulat kanalı, seminal vezikül, vas deferens in oluşmasına etki eden membran proteinini şifrelemektedir. Konjenital bilateral vas deferens yokluğu ( CBAVD ), CFTR mutasyonları ile ilişkilidir ve obstruktif azospermilerin % 2 sinde bulunmaktadır ( 20, 55 ) Gonadotoksinler İlaçlar: İlaçlar, testosteronu doğrudan engelleyerek androjen aktivitesini bloke edebilirler. Ayrıca hipofizer gonadotropinlerin salgılanmasını engelleyip östrojen seviyesini yükselterek infertiliteye neden olabilirler. Sık kullanılan simetidin, siproteron gibi ilaçlar sperm sayısını düşürürken jinekomastiye de neden olabilirler. Ayrıca eroin, marihuana vb.keyif verici maddeler ile bazı pestisidler de testiküler fonksiyonu bozabilir ( 31, 123 ). Işınlama: Germ hücreleri ışınlamaya karşı duyarlı olmasına rağmen leydig hücreleri oldukça dirençlidir. Az miktarda ışın, germ hücrelerini geri 24

36 dönüşümlü şekilde hasara uğratarak, yüksek düzeyde ışın ise testislerde kalıcı zarar oluşturarak spermatogenezi etkiler. Bu kişilerin FSH seviyesi artar ve spermatogenez ancak 2-3 yılda normale döner ( 31, 123 ) Sistemik Hastalıklar Böbrek Yetmezliği: Üremi, erkeklerde libido azalması, spermatogenezin bozulması ve jinekomastiye neden olabilmektedir. Bu durumda plazma testosteron düzeyleri düşmekte plazma LH ve FSH düzeyleri ise yükselmektedir. Üremide oluşan hipogonadizmin nedeni olasılıkla çok etmenlidir. Böbrek naklinden sonra, üremik hipogonadizm iyileşmektedir. Karaciğer Sirozu: Karaciğer sirozlu erkeklerde genellikle testiküler atrofi, empotans ve jinekomasti görülmektedir. Androjenlerin hepatik ekstraksiyonunun azalması, periferde östrojenlere dönüşümlerin artmasıyla plazma östradiyol düzeyleri yükselmektedir. hcc ( hepatocellüler carcinoma veya hepatoma ) uyarısına karşı meydana gelen plazma testosteron yanıtının azalması testiküler bir defekti düşündürmektedir. Defektif Androjen Aktivitesi: Bazı hastalıklarda gözlenen androjene direnç gelişimi erkeklerde genital organların tam olarak gelişememesine ve neticede infertiliteye yol açmaktadır. Özellikle serum testosteron ve LH düzeyleri artar. Orak Hücreli Anemi: Otozomal resesif geçiş göstermektedir. 11. kromozomda lokalize olan genin, zincirinin 6. pozisyonunda bulunan glutamin aminoasidinin yerine valin aminoasidinin gelmesi sonucu oluşmaktadır. Testiküler disfonksiyon, sperm dansitesinde azalma, hipotalamik-hipofizer defektler ve çok sayıda kan transfüzyonuna bağlı olarak gonadlarda demir depozisyonu sonucu hastalık oluşmaktadır ( 2, 41 ). 25

37 Kriptorşidizm: Yetişkin erkeklerde sık görülen, inmemiş testislerin 2 yaşından sonra deforme olduğu bir gelişme defektidir. Tek taraflı inmemiş testisli erkekler hariç, inmemiş testisin fertilite potansiyeli çok düşüktür. Çünkü çift taraflı kriptorşidizm olgularında semen kalitesi bozuk olmaktadır Varikosel: Varikosel, infertil erkeklerde en sık görülen nedensel bulgudur. Spermatik venlerde kapakçıkların olmaması veya yetersiz olması yüzünden kanın reflüsü infertiliteye yol açmaktadır. Varikosel sıklığı, yetişkin erkek populasyonunda % 10-15, infertilite nedeniyle değerlendirilen bireylerde % arasında olmaktadır. Varikoselli erkeklerin yaklaşık yarısında semen kalitesi bozulmuş olmasına rağmen, birçok varikoselli erkek fertil olmaktadır İdiyopatik infertilite: İnfertil erkeklerin yarısını nedeni bilinmeyen idiyopatik infertilite oluşturmaktadır. Erkek üreme fizyolojisi hakkında bilgiler arttıkça tam olarak açıklığa kavuşturulabilecektir ( 2, 31 ) Posttestiküler nedenler: Genital kanal obstrüksiyonları; enfeksiyon, immünolojik nedenler, cinsel fonksiyon bozuklukları, penisin koite engel olan veya vajen içine ejakulatın bırakılmasını önleyen anatomik deformasyonlar ( Hipospadias, retrograd ejekulasyon, penil eğrilikler vb. ) dır ( 2, 31 ). Son zamanlarda erkek infertilitesi için kromozomal anormallikler, Y- kromozom mikrodelesyonları, translokasyon, kistik fibroz transmembran konduktans regülatör mutasyonları ve diğer genetik faktörlerin, risk faktörleri olarak belirlendiği rapor edilmiştir ( 19, 26, 3, 76 ). Ayrıca DNA 26

38 metilasyonunun da spermatogenez sürecinde önemli rol oynadığı, metilasyon bloke edildiğinde testislerde kondense spermatid oluşumuna ve spermatozoa sayısını azaltarak, teratozoospermi ve astenozoospermi ye neden olduğu bildirilmiştir ( 6, 88 ) İNFERTİLİTE TANISI ve KULLANILAN YÖNTEMLER İnfertil erkekte yapılan değerlendirmelerin amaçları; muhtemel olarak düzeltilebilecek nedenlerin ortaya çıkarılması, yardımcı üreme tekniklerinin ( YÜT ) kullanılmasını gerektiren durumların belirlenmesi, YÜT den fayda görülememesi sonucu evlat edinmekten başka bir çözüm yolunun bulunmadığının saptanması, infertilite ile birlikte görülen hayatı tehdit eden durumların belirlenmesi ya da YÜT kullanılacaksa, çocuğun sağlığına etki edebilecek genetik risk faktörlerinin belirlenmesi olarak sıralanabilir ( 31, 56, 66 ). Eğer düzeltilebilir bir durum belirlenir ve tedavi edilirse fertilizasyon mümkün olabilmekte ve doğal yolla gebelik sağlanabilmektedir. Ancak tedavi edilemeyecek bir durumun varlığının ispatlanmasıyla çiftler, etkisi olmayan ve yan etkilerinin bulunduğu gereksiz tedavi yöntemlerinin vereceği stresten etkilenmemiş olurlar. Eğer infertilite genetik kökenli ise çocukta meydana gelebilecek muhtemel anomaliler hakkında çiftlere genetik danışmanlık sağlanılabilir. Bunların dışında, infertilite erkekte testis kanseri veya hipofiz tümörü gibi hayatı tehdit eden bir hastalığın göstergesi olarak da ortaya çıkmış olabilir ( 57, 67 ). Bu yüzden erken tanı konulup, tedavi edilmeleri birey açısından çok önemlidir. 27

39 İnfertilite yakınması ile gelen çiftlerde erkeğin araştırılmasına, herhangi bir doğum kontrol yöntemi uygulanmamasına ve 1 yıl geçmesine rağmen gebeliğin, görülmemesi halinde başlanılmalıdır ( 56 ). Erkek faktörlü infertilite tanısında kullanılan yöntemler; semen analizi, hormonal değerlendirme, immunolojik inceleme ve bakteriyolojik inceleme olarak sıralanabilir Semen analizi Semen analizi hormonal, spermatogenetik ve tüp sisteminin durumu hakkında oldukça bilgilendirici olan çok önemli bir incelemedir. Fakat semen parametrelerinin ölçülmesinin bir fertilite ölçütü olmadığının da bilinmesi gerekir. Semen analizi azospermi dışında, hastalar arasında steril ve fertil gruplar olarak kesin ayrımının yapılmasını sağlamaz. Semen parametrelerinin kalitesi azaldıkça gebelik şansı istatistiksel olarak azalır, Bu yüzden araştırmanın doğruluğu açısından peş peşe iki semen analizi yapılmalıdır. İki semen analizi arasında en az 1 ay süre bulunmalıdır. Üreme hikayesinde; koit sıklığı ve zamanlaması, infertilite süresi ve önceki fertilizasyon durumu, çocukluk hastalıkları, çocukluk ve puberte gelişimi, sistemik hastalıklar ( diyabet, üst solunum yolu hastalıkları gibi ) ve geçirdiği ameliyatlar, cinsel yaşam, cinsel yolla geçen hastalıklar, ısı gibi gonadal toksinlere maruz kalınma durumları sorgulanmalıdır. Daha önce çocuk sahibi olmuş olsa bile bu durum sonradan fertilizasyonunu bozabilecek bir faktör ile karşılaşmış olma olasılığını dışlamaz. Sperm motilitesi en temel sperm kalite göstergesi olup 20 milyon / cc normalin alt sınırı olarak kabul edilmektedir. Motilite değerlendirilirken total sayıya göre hareketlilik oranına ve ileri hızlı hareketlilerin oranına bakılır. İleri 28

40 doğrusal hızlı hareketi 0 ile 4 arasında derecelendirilmektedir. Buna göre en az spermlerin % 50 sinin iyi kalitede hareketli olması gerekir. Baş başa kuyruk kuyruğa aglütinasyonlar görülmesi enfeksiyon yada immün olayları akla getirebilmektedir ( 56, 109 ) Hormonal değerlendirme: Hormonal bir bozukluk olan infertil olgularda FSH ve testosteron düzeyi ölçülerek değerlendirmelidir. Düşük testosteron, hipogonadizmin göstergesi olup yüksek FSH düzeyi germinal epitel hasarını göstermektedir ve bu durumda azoospermi ya da ileri derecede oligospermi ortaya çıkmaktadır İmmunolojik İnceleme: Kesin bir infertilite nedeni sayılmasa da antisperm antikor ( ASA ) varlığı fertilite şansını azaltmaktadır. ASA servikal mukustan geçişi olumsuz etkilemektedir. Post koital testlerde anormallik olan çiftlerde, antisperm antikor bakılmalıdır Bakteriyolojik İnceleme: Klinik ve laboratuar bulguları prostatit lehine ise kültür gerekmektedir. Semptomatik olmayan enfeksiyonların olumsuz etkisi tartışmalıdır ( 56, 109 ). 29

41 GENETİK POLİMORFİZMLER ve İNFERTİLİTE Genetik materyalimizi oluşturan DNA ( deoksiribo nükleik asit ) molekülü, gen adı verilen ve belirli bir özelliği kodlayan birçok birim içermektedir. Kalıtımın işlevsel birimi olan genler, DNA nın kimyasal yapıtaşları olan nükleotidlerin ( A, T, G ve C ) doğrusal dizisinden oluşmaktadır ( 13 ). Bir geni oluşturan nükleotid dizisi ( baz dizisi ), genetik ifadenin son ürünü olan proteinlerin kimyasal bileşimini ( amino asit kompozisyonu ) kodlamaktadır. Bireyin kalıtsal özelliklerinin ortaya çıkmasını sağlayan nükleotid dizileri; yani genetik şifrenin yapısı genellikle fiziksel veya kimyasal dış etkenlerin ( X ışını, radyasyon, ultraviyole, bazı ilaç ve kimyasal maddeler, ani sıcaklık değişimleri, v.b ) uyarısıyla, bazen de kendiliğinden oluşan değişiklikler nedeniyle bozulabilmektedir. Yeni kuşaklara aktarılacak olan kalıtsal bilgide birdenbire ortaya çıkan ve süreklilik kazanan bu değişikliklere mutasyon adı verilmektedir ( 13 ). İnsan genomundaki baz dizisi değişiklikleri olarak tanımlanan mutasyonlar, bir gen bölgesinin dışında oluşabildiği gibi, gen bölgesinin içinde de meydana gelebilmekte ve aminoasit sırasını ve/veya kodlanan proteinin yapısını değiştirebilmektedir. Yapısı değişen bir proteinin fonksiyonu da bozulacağından, sonuçta klinik bulgu veren hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Marfan sendromu, kistik fibrozis, nörofibromatozis gibi genetik hastalıklar çeşitli mutasyonlar sonucu oluşan hastalıklara örnek olarak verilebilmektedir. Mutasyonların toplumda görülme sıklığı % 1 den daha azdır ( 108 ). 30

42 Bazı DNA baz dizisi değişiklikleri, her zaman ciddi bir hastalığa neden olmadan, çoğu zaman bir popülasyondaki genetik varyasyonların oluşmasına neden olabilirler. Bu şekilde toplumda % 1 den daha sıklıkla görülen belirli genetik varyasyonlar polimorfizm olarak tanımlanmaktadır. Mutasyonlar, hastalık nedeni oluyorken polimorfizmler ise hastalık nedeni olmayan ve hastalığa yatkınlık oluşturabilen nükleotid değişiklikleridir TEK NÜKLEOTİD POLİMORFİZMLERİ Tek baz değişimi ile oluşan polimorfizmler tek nükleotid polimorfizm ( single nucleotide polymorphisms, SNP ) olarak isimlendirilir ve genom dizisindeki Adenin (A), Timin ( T ), Guanin ( G ) ve Sitozin ( C ) bazlarından birisinin değişmesiyle meydana gelirler. Örneğin; AAGGCTAA dizisinin ATGGCTAA dizisi şekline dönüşmesi ile bir SNP oluşmaktadır. Varyasyonun SNP olarak değerlendirilebilmesi için o SNP nin populasyonda en az % 1 oranında görülmesi gerekmektedir ( 99, 102 ). İnsanlar arasındaki genetik farklılıkların % 90 ını oluşturan SNP ler genomda yaklaşık her bin bazda bir meydana gelmektedir ( 102 ). İnsan haploit genomunun 3 milyar bazdan oluştuğu düşünülecek olursa, yaklaşık her bin bazda bir meydana gelen total SNP sayısının, 3 milyon civarında olduğu hesaplanabilmektedir. Genelde her 3 SNP den ikisi C / T bazlarının değişimini içermektedir. Genomda meydana gelen SNP lerin yaklaşık olarak yarısı protein kodlama bölgesinde meydana gelmekte ve insanlar arasında kalıtsal varyasyonların sebebi olarak değerlendirilmektedir. Fonksiyonel bir SNP, bir 31

43 proteinin aminoasit dizisini veya ekspresyonunu değiştirerek, kişinin davranış özelliklerini, hastalığa yatkınlığını, dayanıklılığını ve tedaviye verdiği yanıtı modifiye edebilmektedir. DNA dizisindeki farklılıklar; bakteri, virüs, toksinler, kimyasal madde ve ilaçlar gibi çevresel etkenlere ve ayrıca hastalıklara karşı bireysel yanıtta farklılıkların oluşmasına neden olabilmektedir. Bu yüzden SNP lerin belirlenmesi, biyomedikal araştırmalarda ve farmakolojik ürünlerin geliştirilmesi gibi birçok alanda önem taşımaktadır. SNP lerin evrim süresince stabil kalması yani kuşaklar arası geçişte fazla değişmemesi, populasyon çalışmalarının kolay izlenmesine olanak sağlamaktadır. İnsan genomunun SNP haritasının çıkarılması konusunda dünyada pek çok sayıda araştırma grubu çalışmaktadır. Bu gruplar arasında en önemli olanlar, SNP Konsorsiyumu ( TSC Project ) ve International HapMap Project ( 125 ) gruplarıdır. SNP Konsorsiyumu, Şubat 1999 da insan genomunda eşit dağılım gösteren ~300,000 SNP nin tanımlanması ve fikri mülkiyet sınırlaması olmaksızın bilginin halka aktarılmasını sağlamak amacı kurulmuş olan bir organizasyondur. Hedefi iki yıl içerisinde 300,000 SNP yi tanımlamak olan bu konsorsiyum, 2001 yılı sonunda yayımladıkları bir raporla 1,4 milyon SNP nin tanımlandığını, 2003 yılında ise HapMap projesi ile 2,8 milyon SNP nin tanımlandığı bildirilmiştir ( 94 ). SNP haritalarının tanımlanması kanser, diyabet, vasküler hastalıklar gibi poligenik kalıtım gösteren pek çok hastalığın çözümlenmesinde yarar sağlamaktadır. 32

44 HOMOSİSTEİN VE METABOLİZMASI Homosistein, metiyonin metabolizması sırasında meydana gelen, sülfür içeren ve tiol bileşiklerinin metabolik yollarında önemli görevleri olan bir aminoasittir ( 42, 93 ). Ayrıca homosistein, insan vücudunda hücre ve dokuların büyümesi için gerekli temel bir aminoasit olduğu bildirilmiştir ( 17, 72 ). Homosistein metabolizması ise organizmada kofaktörler ya da kosubstratlar olarak vitaminlere bağlı önemli bir metabolizmadır ( 84 ). Esansiyal bir aminoasit olan metiyonin, vücuda diyetle alınabildiği gibi endojen proteinlerin bozulmasıyla ya da homosistein remetilasyonuyla da oluşabilmektedir. Metiyonin, yeni sentezlenen proteinlerin yapısına katıldığı gibi ATP yardımı ile enzimatik olarak bir sülfonium bileşiği olan S- adenozilmetiyonin ( SAM ) e de dönüşebilmektedir ( 22, 85 ). SAM ın metil grubu DNA metiltransferaz aracılığıyla koparılarak, S-adenozilhomosistein e ( SAH ) dönüşmekte ve adenozil kısmının hidrolitik olarak parçalanmasıylada homosistein oluşmaktadır ( 85, 105 ). Vücuttaki homosistein, transsülfürasyon veya yeniden metilasyon ( remetilasyon ) yollarından birisi ile metabolize olur ( Şekil 4; 14, 23, 78 ). Transsülfürasyon yolunda; vitamin B6 bağımlı bir enzim olan sistatyonin β sentetaz ( CBS ) enzimi görev yapar. Homosistein, CBS katalizörlüğünde sistatyonine, o da sisteine hidrolize olur ve son olarak sülfat a hidrolize olarak idrarla atılır ( 22, 23, 104 ). Remetilasyon yolunda; homosisteinden, metiyoninin yeniden sentezi iki farklı yolla gerçekleşmektedir. Kısa yolda; Betain Homosistein Metil Transferaz ( BHMT ) enzimi, bir metil vericisi olan betain in metil grubunu, 33

45 homosistein e aktararak metiyonin oluştururken kendisi dimetilglisin e dönüşmektedir. Uzun yolda ise 5-metiltetrahidrofolat, bir metil grubu vericisidir ve 5-10 metilentetrahidrofolat, metilentetrahidrofolat redüktaz ( MTHFR ) enzimi aracılığıyla 5-metiltetrahidrofolata dönüşür. 5- metiltetrahidrofolatın bir metil grubu, kobalamin ( vitamin B12 ) bağımlı enzim olan metiyonin sentetaz ( MS ) aracılığı ile homosisteine aktarılarak metiyonin oluşturulurken diğer taraftan da tetrahidrofolat meydana gelir. Daha sonra bu tetrahidrofolat tekrar 5-10 metilentetrahidrofolat a dönüşür ( 82, 96 ). Şekil 4: Homosisteinin metabolize yolları Plazmada, total homosisteinin % 70 i proteinlere bağlanarak, % 25 i disülfid bağı ile birbirlerine bağlanarak ( disülfid homosistein ) ve % 5 i de homosistein tiolacton halinde bulunur ( 104 ) Popülasyonlar arasında farklılık göstermeyen plazma homosistein düzeyi, 5-15 µmol/l olarak kabul edilmektedir ( 42 ). Ancak yaşa bağlı olarak 34

46 homosistein plazma seviyesinde hafif artma eğilimi gözlenebilir. Östrojen, total homosistein konsantrasyonunu beslenme ve kas kitlesinden bağımsız olarak düşürdüğü için, erkeklerde homosistein kadınlara göre 1 µmol / L daha yüksek olabilmektedir ( 77, 104 ) HİPERHOMOSİSTEİNEMİ VE NEDENLERİ Plazma homosistein düzeyi standardize edilememiş olmakla birlikte, genellikle 5-15 µmol / L düzeyi normal olarak kabul edilmekte ve 16 µmol / L üzerindeki değerler hiperhomosisteinemi olarak tanımlanmaktadır ( 112 ). Bireylerde sıklıkla rastlanan folat eksikliği hiperhomosisteinemi ye neden olarak infertilite dahil çeşitli hastalıklar için risk faktörü olarak değerlendirilmektedir. Folat seviyesi ve sonuçta oluşan metilasyon metabolizması anormal kromozom segregasyonuna yol açabilmektedir. Homosisteinin plazma seviyesinin önemli derecede yükseldiği durumlar, arteriyal ve venöz trombozis, inme, miyokardiyal infarkt ve kronik renal yetersizliğidir ( 15, 32, 71, 90, 91 ). Homosistein düzeylerini etkileyen ve hiperhomosisteinemiye neden olan faktörler aşağıda sıralanmıştır: Metabolizmadaki Genetik Bozukluklar; CBS eksikliği, MTHFR eksikliği, MS eksikliği Kronik Hastalıklar; Kronik böbrek yetmezliği, Akut lenfoblastik lösemi, Diyabet 35

47 Vitamin Yetersizliği ve Beslenme Bozuklukları; Vitamin B12, Folat, Vitamin B6 Kişisel Özellikler; ileri yaş, Erkek cinsiyet, Sigara kullanımı, Fiziksel inaktivite Menapoz İlaçlar; Metotreksat ( dihidrofolat redüktaz inhibitörü ), Fenitonin ve karbamezapin ( folat antagonistleri ), Nitröz oksit ( vitamin B12 antagonisti ), 6-azouridintriasetat ( vitamin B12 antagonisti ) ( 42 ) HOMOSİSTEİN METABOLİZMASINDAKİ GENETİK BOZUKLUKLAR Homosistein metabolizmasında görev alan enzimlerden özellikle CBS, MTHFR ve MS enzimlerinin hatalı veya eksik sentezlenmesi homosisteinemi ve homosisteinüriye neden olabilmektedir ( 1, 7, 42 ). Homosistein yolağında rolleri olan enzimlerde meydana gelen herhangi bir defekt; anormal folat seviyesine ve metilasyon metabolizmasının bozulmasına neden olabilmekte ve bunun sonucu olarak anormal kromozom segregasyonu meydana gelebilmektedir ( 65, 84 ). Homosistein metabolizmasındaki folat seviyesi oldukça önemlidir ve folat yetmezliği sıklıkla görülebilmektedir. Folat seviyesinin hiperhomosisteinemi ile ilişkisi, infertilite dahil çeşitli hastalıklar için bir risk faktörü olarak değerlendirilmektedir. Önceki çalışmalara göre, subfertil ve fertil erkeklerin her ikisinde kombine çinko sülfat ve folik asit tedavisinden sonra total normal sperm sayısının arttığı bildirilmiştir ( 84, 120 ). Yüksek konsantrasyonda 5,10-metilentetrahidrofolat ın varlığında, timidilat sentaz substratı, folat yetersizliği ile sonuçlanmakta ve deoksiuridin 36

48 monofosfat ( dump ) birikmesi sonucu DNA da timidin yerine urasil geçmektedir. DNA ya aşırı derecede yanlış urasil geçişinin tek zincir ve çift zincir DNA kırıklarına, kromozom kırıklarına ve mikronukleus oluşumuna neden olduğu gösterilmiştir ( 9, 63 ). Alternatif olarak, 5,10- metilentetrahidrofolat konsantrasyonu düşük olduğunda, SAM sentezi azalarak DNA hipometilasyonuna yol açmakta ve sonuç olarak bu durum anormal gen ekspresyonu, kromozom segregasyonu ve karsinogeneze neden olabilmektedir ( 4, 34, 63 ) Metiyonin sentaz ( MS, MTR ) 5 - metiltetrahidrofolat - homosistein metiltransferaz olarak da adlandırılan Metiyonin Sentaz enzimi, kromozom 1q43 e lokalize olan Metiyonin Sentaz ( MS ) geni ( Gene ID: 4548 ) tarafından kodlanmaktadır. Vitamin B12 bağlı metiyonin sentaz enzimi, metiyonin ve s- adenozilmetiyonin de novo üretiminde homosisteinin metilasyonu için 5-metil H4 folat ın metil grubundan faydalanan önemli bir folat enzimidir. MS reaksiyonu homosisteinin metiyonine remetilasyonu için kofaktör olarak vitamin B-12 (kobalamin) ye gereksinim duymaktadır ( 113 ). Bu enzim, metil vericisi olarak S-adenozilmetiyonini kullanarak metilasyonun indirgenmesiyle reaktive olmaktadır. Son zamanlarda, Metiyonin Sentaz Redüktaz ( MTRR ) adı verilen ve bu reaktivasyondan sorumlu proteine uygun cdna klonlanmıştır. MTRR, fonksiyonel durumda MS ı düzenleyen, Ferrodoksin - NADP + redüktaz ( FNR ) elektron transferaz ailesinin yeni bir üyesidir. 698 aminoasitten oluşan enzimin moleküler ağırlığı Da olup, 3,6kb lık predominant mrna sı northern blot analizi ile ortaya çıkarılmıştır 37

49 ( 73, 118 ). MS aktivitesinin yetersizliği hiperhomosisteinemi, homosisteinemi ve megaloblastik anemi ile sonuçlanabilmektedir ( 24, 74, 92 ). Nükleotit ve metiyonin biyosentezinde folat metabolizmasının önemi, SNP lerde tek karbon transferi ile hastalıklar için hem savunma ve hemde risk faktörü etkisi oluşturabilmesidir. Örneğin, MTHFR C677T gen polimorfizmi nöral tüp defekti ve diğer orta hat defektleri, Down Sendromu ve Pre-eklampsi gibi doğumsal komplikasyonlar ile yinelenen erken gebelik kaybında risk faktörü olarak belirlenmiştir. Bununla beraber, belirli koşullar altında, kolon kanserine ve akut lenfoblastik lösemiye karşı koruyucu etki oluşturabilir ( 126 ). Bu ikilemin etkisi için en uygun açıklama C677T MTHFR ın nukleotit biyosentezi için gerekli kritik koenzimi, 5, 10-metilen-H4 folat ın seviyesini artırdığıdır. Folat bakımından uygun beslenme, 5, 10-metilen-H4 folat ın yığılımı ile kansere karşı koruyabilir. Bununla beraber, folat bakımından yetersiz beslenme, aynı şekilde 5, 10-metilen-H4 folat ın hücresel seviyesini tehlikeye atmakta ve urasilin yanlış eşleşmesini arttırarak DNA instabilitesine ve karsinogeneze yol açmaktadır Metiyonin sentaz A2756G Polimorfizmi MS, homosisteinin metiyonine remetilasyonunu katalizleyen vitamin B12 bağlı olan gen tarafından kodlanır. İnsan populasyonunda bu gene ait polimorfik varyasyonlar gözlenmektedir. Son zamanlarda MS geninin pozisyondaki A G transisyonu ile aspartik asitin glisin aminoasitine dönüştüğü belirlenmiştir ( 11, 74, 101 ). Bu polimorfizm B12 kofaktörün reaktivasyonu ve metilasyonda rol alan domainde lokalize olduğundan enzimin aktivitesini değiştirdiği düşünülmektedir ( 98, 101 ). Önceki 38

50 çalışmalar 2756G alelinin azalmış plazma homosistein seviyeleri ve daha yüksek oranda formillenmiş folat ile ilişkili olduğunu göstermektedir ( 10, 33, 101 ). MS nin mutant allel sıklığı yaklaşık olarak dir ( 64 ) Metiyonin sentaz redüktaz ( MSR, MTRR ) Metiyonin sentaz redüktaz ( MTRR ); FMN (flavin mononucleotide binding ), FAD (flavin adenine dinucleotide binding ) ve nikotinamid adenin dinükleotit fosfat ( indirgenmiş formu, NADPH ) bağlayan bölgeler içeren ferredoksin-nikotinamid adenin dinükleotit fosfat ( NADP + ) redüktaz grubunun bir üyesidir. MTRR geni insan kromozomunda 5p15.3 p15.2 de haritalanmıştır ( Gene ID: 4552), ( 58 ). 34-kb uzunluğunda olup 15 ekzon içerir. Metil vericisi olarak S-adenozilmetiyonin i kullanan MS ın metilasyonun indirgenmesini katalizleyen ve DNA metilasyonuna katılan bir enzimdir ( 28, 75 ) ( Şekil 4 ). MTRR; MS ı reaktive eden kobalaminin (II) ( metil grubu içeren S- adenozilmetiyoninli ) metilasyonunu indirgemek için gereklidir ( 113 ). MTRR, MS ın kofaktörü olan metilkobalaminin rejenerasyonunu katalizleyerek aktif durumdaki MS enziminin korunmasında önemli rol oynar ( 63, 119 ). Şimdiye kadar, CblE ( Cobalamin E ) hastalarında MTRR geninde 15 patojenik mutasyon belirtilmiştir ( 73, 114, 118, 127 ). Bunlardan başka önemli olan G66A ve C524T polimorfizm belirlenmiştir. Bu iki polimorfizmin, postmenopozal kadınlarda serum osteokalsin seviyeleriyle ilişkisi araştırılmış 39

51 ve MTRR geninde 66A / C524 haplotipinin kemik erimesinde rolü olduğu gösterilmiştir ( 40, 69, 119, 128 ) Metiyonin sentaz redüktaz G66A polimorfizmi MTRR geni, homosisteinin metiyonine dönüşümünde rol oynar ( 72, 110 ) ve aktif durumda homosisteinin metiyonine remetilasyonu için MS ın bakımını üstlenir ( 110 ). Şimdiye kadar insan sağlığında MTRR genindeki polimorfizmlerin muhtemel güçlü etkisi hakkındaki bilgiler yeterli değildir ( 110 ). MSR şifreleyen MTRR geninde bazı mutasyonlar tanımlanmış ve bu mutasyonların missense mutasyonları, küçük ve büyük insersiyonlar veya delesyonlar olduğu belirtilmiştir ( 73, 118, 128 ). MTRR G66A polimorfizmin farklı etnik populasyonlarda ve Kafkas populasyonu içinde görülme sıklıklarının ( 28, 29, 83, 110 ) farklı olduğu gözlenmektedir ( 87, 110 ). MTRR 66G A lokusundaki polimorfizmler ayrıca plazma homosisteindeki artışla ilişkilidir, AA genotipi GA genotipinden daha büyük bir etkiye sahiptir. Bununla birlikte veriler çok sınırlı olup ileri araştırmalar bu ilişkinin daha iyi anlaşılması açısından önem kazanacaktır ( 110 ) MS ve MTRR POLİMORFİZMLERİNİN BELİRLENMESİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER MS ve MTRR gen polimorfizmlerinin belirlenmesinde en sık kullanılan yöntem, Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizm ( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP ) yöntemidir. 40

52 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU/ RESTRİKSİYON ENZİMİ UZUNLUK POLİMORFİZMİ ( PCR / RFLP ) Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimeraz zincir reaksiyonu ( polymerase chain reaction = PCR ), herhangi bir organizmaya ait genomik DNA da, dizisi bilinen herhangi bir bölgenin çoğaltılmasına ( amplifikasyon ) olanak veren in vitro DNA sentez yöntemidir. PCR, tekrarlanan 3 ana basamaktan oluşur: 1. Amplifiye edilecek çift iplikli DNA nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu ( denaturation ) 2. Primerlerin özgül hibridizasyona olanak verecek sıcaklıkta ( Tm değerinin C altındaki sıcaklık ) hedef bölgelere bağlanması ( annealing ) 3. Taq DNA polimeraz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği 72 0 C sıcaklıkta, zincirlerin primerlerden itibaren uzaması ( elongation ) PCR da gerekli olan bileşenler; 1. Amplifiye edilecek hedef DNA dizisini içeren kalıp DNA, 2. Amplifiye edilecek hedef DNA dizisinin komplementeri olacak şekilde seçilmiş kısa primerler, 3. Zincirin uzama reaksiyonunu gerçekleştiren termostabil karakterde Taq DNA Polimeraz enzimi. 4. Enzimin çalışması için gerekli kofaktör olarak görev alan Mg iyonunu sağlayan MgCl 2. 41

53 5. Amplifikasyona göre değişen miktarda hazırlanılan datp, dctp, dgtp ve dttp karışımı ( dntp ). Primerler, genomik DNA daki hedef bölge ile hibridize olabilen, nükleotid uzunluğunda ve sentetik olarak sentez edilen tek zincirli oligonükleotidlerdir. Hedef bölgeye özgül uygun primer çiftinin ( forward ve reverse primer ) doğru seçimi oldukça önemlidir. Denatürasyonun ardından primerlerin bağlanma aşamasındaki Tm değerinin saptanması, PCR reaksiyonunun gerçekleşmesi açısından büyük öneme sahiptir ve Tm=[ 4 0 C ( G+C ) C ( A+T ) ] formülü ile kolayca hesaplanır. Zincirin uzama reaksiyonunu gerçekleştiren Taq DNA polimeraz enzimi, Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen, optimal aktivitesini 72 0 C de gösteren ve 94 0 C de bile aktivitesini kaybetmeyen bir enzimdir. Taq DNA polimerazın görevi, tek zincirli DNA ya bağlanmış komplementer dizilerden itibaren DNA yı çoğaltmaktır. Polimeraz enzimleri, aktivite gösterebilmek için Mg 2+ iyonlarına ihtiyaç duyarlar; Mg 2+ iyonları, Taq enziminin kofaktörü olarak işlev görürler. Bu nedenle, en uygun MgCl 2 konsantrasyonunun oluşturulması gerekmektedir. Mg 2+ konsantrasyonunun fazla olduğu reaksiyonlarda hatalı eşleşmeler meydana gelirken, düşük olduğu reaksiyonlarda yeterli miktarda hibridizasyon gerçekleşmemektedir. Zincir, tek iplikli hedef DNA ya komplementer olan primer ile başlar ve Taq DNA polimeraz, ortamdaki dntp leri ( deoksinükleotid trifosfat ) kullanarak zinciri uzatır. dntp ler ( datp, dgtp, dttp, dctp ) Taq DNA polimerazın substratlarıdır. Sonuçta tek iplikli DNA çift iplikli forma dönüşür. 42

54 PCR ile denatürasyon, bağlanma ve uzama adımlarının tekrarlarına dayanan döngü sonrasında hedef DNA nın milyon kopyası elde edilmiş olur. Yöntemi: Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi ( RFLP ) Tek nükleotid polimorfizmlerinin ( SNP ) belirlenmesi için kullanılan moleküler biyolojik yöntemlerden biri restriksiyon enzimi uzunluk polimorfizmi ( RFLP, restriction fragment lenght polymorphism ) yöntemidir. Restriksiyon endonükleaz enzimleri, çift sarmal DNA yı özgül baz dizilerinden kesen ve bu şekilde DNA ile çalışılmasını imkan sağlayan enzimlerdir. Bu enzimler ile insan DNA sı, baz çifti uzunluğundaki fragmanlara ayrılabilmektedir. Bakterilerin büyük bir bölümü, bir veya birkaç türde restriksiyon enzimi sentezlerler. Bu enzimler, bakterilere dışarıdan giren yabancı genetik materyalleri ayrıştırarak mutasyonları önler ve böylece bakterinin kendi DNA sını korumasına yardımcı olurlar. Bakterilere özgül olan bu enzimler, çift iplikli DNA ( dsdna ) üzerinde özgün bir bölgeyi ( palindrom ) tanır ve dsdna nın her iki zincirindeki fosfodiester bağını keserek DNA yı tanıdıkları kesim noktalarından parçalara ayırırlar. Günümüzde değişik mikroorganizmalardan 500 e yakın restriksiyon enzimi elde edilmiştir. İsimleri, izole edildikleri bakterinin ilk üç harfi ile; aynı bakteriden birkaç enzim elde edildi ise de ek olarak Roma rakamı ile belirtilmektedir ( HhaI, SatI, PaeI ). RFLP yönteminde, örnek DNA bir veya daha fazla restriksiyon endonükleaz ile kesildikten sonra, fragmanlar moleküler büyüklüklerine göre 43

55 jel elektroforezinde ayrıştırılır. Moleküler ağırlık standardı ( marker ) yardımıyla, fragmanların moleküler ağırlıkları belirlenir. Jel, etidyum bromid ile boyandıktan sonra, fragmanlar UV ( 260 nm ) ışığı altında görünür hale getirilir ve değerlendirilir LIGHTCYCLER SİSTEMİ Gerçek zamanlı ( real-time ) bir PCR cihazı olan LightCycler ile polimorfik DNA bölgelerinin kantifikasyonu, tek nükleotid polimorfizm genotiplendirilmeleri ve mutasyon analizleri yapılabilmektedir. Bu teknik nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı artış gösteren floresan sinyalinin ölçülerek kısa sürede kantitatif değerlerin elde edilmesine olanak sağlar. Oldukça hızlı ısıtma ve soğutma kapasitesi sayesinde PCR döngüsü dakika içinde gerçekleştirilebilmektedir. Ayrıca sistemdeki erime eğrisi analizi ile mutasyonların ve SNP lerin belirlenmesi ve genotiplendirilmesi mümkün olabilmektedir. Bu yöntem sayesinde PCR dan sonra herhangi ek bir manuel işleme ihtiyaç duyulmadığı için kontaminasyon riski de en aza indirgenmektedir. LC cihazı ile genotipleme çalışmalarında hedefe özgül primerlerin yanında, özgül hibridizasyon probları kullanılmaktadır. Bu hibridizasyon probları, floresan boyalarla işaretlenen sekansa özgü oligonükleotid problardır. Hibridizasyon problarının bir tanesi potansiyel mutasyon bölgesini kapsamakta ve mutasyon probu olarak adlandırılmakta, diğer prob ise bağlanma probu ( anchor probu ) olarak isimlendirilmektdir. Mutasyon ve bağlanma probları, DNA ipliğine baş-kuyruk pozisyonunda hibridize olacak şekilde dizayn edilirler. 44

56 Araştırılan gen bölgesi, o bölgeye özgül iki primer ile amplifiye edilikten sonra, oluşan amplikon bir sonraki döngünün annealing aşamasında özgül hibridizasyon probları ile tespit edilir. Hibridizasyon problarından 1. oligo, 3' ucundan fluorescein ( donör boya ) ile 2.oligo ise, 5 ucundan LC Red 640 ( alıcı boya ) ile işaretlenirler. PCR ın denatürasyon aşaması boyunca hibridizasyon olmadığından bu fazda floresan ölçülmemektedir. Annealing aşamasında, iki oligonükleotid DNA fragmentine baş-kuyruk pozisyonunda bağlandığı için bu pozisyonda hibridize olduklarında iki floresan boya birbirine çok yaklaşmış olur. Fluorescein ile işaretli 1.oligo, LC cihazının ışık kaynağından ( LED- Light Emitting diyote ) yayılan 470 nm deki mavi ışık ile uyarılarak uzun dalga boyundaki ( 530 nm ) yeşil floresan ışığı yayar. 530 nm den yayılan enerji ikinci hibridizasyon probuna aktarılarak onu uyarır ve farklı bir dalga boyunda ( 640 nm ) kırmızı floresan ışık yayılmasına neden olur. İki prob arasındaki bu enerji transferi, Floresans Rezonans Enerji Transferi yani FRET olarak tanımlanır. Enerji transferinin etkili olabilmesi için iki boya molekülü arasındaki mesafenin çok az olması gerekmektedir ( 1 5 nükleotid arası ). Bu yüzden oligonükleotidlerin baş-kuyuk pozisyonundaki amplifikasyonu çok önemlidir. LC Red 640 ölçümü LC cihazındaki optik ünitenin ikinci kanalından ( F2 ) maksimum ışımanın olduğu annealing fazının sonunda yapılır. Annealing fazından sonra, sıcaklık artar ve uzama ( elongation ) aşamasında hibridizasyon probları amplikondan ayrılırlar. Elongation aşamasından sonra oluşan amplikonlar çift iplikli olduklarından hibridizasyon probları ile hibridize olamazlar. Bu durumda, iki 45

57 prob birbirlerinden uzakta ve serbest halde oldukları için FRET gerçekleşemez. Donör prob daima fluorescein ile işaretlenirken, alıcı prob LC Red 640 veya LC Red 705 ile işaretlenebilir. LC Red 705 aynı LC Red 640 gibi fluorescein in yaydığı 530 nm deki yeşil ışık ile uyarılabilirken, ondan farklı olarak 705 nm de kırmızı ışık yaymaktadır. Erime Eğrisi Analizi LC cihazı kullanılarak Real-Time PCR yöntemiyle, SNP lerin genotiplendirilmesi ve mutasyonların analizi oldukça hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilmektedir. Erime eğrisi ( melting curve ) analizi ile diziye özgül hibridizasyon problarının, tek iplikli DNA ya hibridize olmaları sıcaklığa bağlı olarak izlenebilmektedir. Her çift iplikli DNA ( dsdna ) molekülünün, kendine özgül bir erime sıcaklığı ( Tm ) vardır. Erime sıcaklığı DNA molekülünün % 50 sinin tek iplikli hale geldiği sıcaklık olarak tanımlanmaktadır. PCR işleminde, floresan boyalar ile işaretli diziye özgül problar ve amplifikasyonu sağlayacak primerler ile hedef gen bölgesi amplifiye edilir. Bu aşamada mutasyon ile ilgili bir bilgiye henüz ulaşılamaz. Ancak PCR işlemi tamamlandıktan sonra, erime eğrisi analizine geçilir. Floresandaki değişiklikler sürekli ölçülerek hastanın o gen için genotiplendirilmesi yapılabilir. 46

58 Ayrıca bu yöntem ile tek bir reaksiyonda belli bir gen bölgesi için birden fazla prob kullanılarak birden fazla mutasyon analizi yapılabilmektedir. LC cihazında aynı kapiller tüp içerisinde hibridizasyon probları ve erime eğrisi analizi yöntemi ile amplifikasyon ve genotiplendirme değerlendirmesi yapılabilmektedir. Bu sayede kontaminasyon riski oldukça azaltılarak 32 örnek bir saat gibi kısa bir sürede çalışılabilmektedir. 47

59 2. BÖLÜM 2.1. GEREÇ VE YÖNTEM KONTROL VE ÇALIŞMA GRUBU Çalışmamızda, kontrol grubu 50 sağlıklı erkek bireyden, çalışma grubu ise yılları arasında, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı na başvurup, klinik olarak Azospermi tanısı almış 50 erkek olgu ve Oligozoospermi tanısı almış 50 erkek olgu olmak üzere toplam 150 olgudan oluşturuldu. Çalışmaya katılan her olgu Gönüllü Olur Formu nu imzalayarak, çalışmaya katılmayı kabul etti. Olguların her birinden EDTA lı tüplere 3 er ml ( 2 tüp ) kan örneği alındı ve tıbbi özgeçmişleri ile ilgili sorular sorularak kaydedildi. Çalışma protokolümüz Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu tarafından tarihli ve 08-3/9 sayılı kararı ile onaylandı MS ve MTRR GEN POLİMORFİZMLERİNİN ANALİZİ Çalışmamızın amacına uygun olarak seçilen hasta ve kontrol grubundan elde edilen kan örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra, MS geninde; A2756G polimorfizmi, MTRR geninde; G66A polimorfizmi analizleri için önce Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR ) gerçekleştirildi. PCR sonrası oluşan ürünlere restriksiyon enzim kesimi uygulanarak genotiplemeleri yapıldı. 48

60 MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Cihazlar Tablo 1: Kullanılan Cihazlar CİHAZ LightCycler (PCR cihazı) Yatay Jel Tankı ve Düzeneği Termomikser Hassas Terazi Mikrodalga Fırın Santrifüj MARKASI Roche Thermo Eppendorf Sartorius Samsung Thermo Otomatik Mikropipetler Finnipipet (10, 20, 100, 200, 1000µl lik) Derin Dondurucu (-20 o C) Buzdolabı Otoklav Uğur Siemens Hereaus 49

61 MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Kimyasal Maddeler Tablo 2: Kimyasal Maddeler KİMYASAL MADDE Agaroz Etanol Glasial Asetik asit Isopropanol Tris 6x Mavi/Turuncu Yükleme Boyası MARKASI MBI Fermantas Smyras Merck Applichem Applichem MBI Fermantas MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Hazır Kitler DNA İzolasyon Kiti Kontrol ve çalışma grubunu oluşturan olgularının periferik kan örneklerinden, High Pure PCR Template Preparation Kit i ( Roche Applied Science, Germany ) kullanılarak DNA izolasyonları yapıldı. 50

62 High Pure PCR Template Preparation Kit İçeriği: 1. Binding Buffer: 4M urea, 200mM NaCl, 200 mm EDTA, ph 7,4, 25 o C 2. Proteinaz K 3. İnhibitör Removal Buffer: 5M guanidine-hcl, 20 mm Tris- HCl, ph 6,6, 25 o C ( 20 ml etanol ilave edildikten sonra kullanıldı ) 4. Wash Buffer: 20mM NaCl, 2 mm Tris-HCl, ph 7.5, 25 o C ( 80 ml etanol ilave edildikten sonra kullanıldı ) 5. Elution Buffer: 10 mm Tris, ph 8,5, 25 o C 6. High Pure filtre tüpleri 7. Collection ( toplama ) tüpleri MS ve MTRR Gen Polimorfizmleri Analizleri Esnasında Kullanılan Primerler MS ve MTRR genlerinin spesifik bölgelerinin PCR yöntemiyle amplifikasyonları için gen bölgelerine özgül primer dizileri seçildi. 51

63 MS A2756G Polimorfizmi Analizinde Kullanılan Primer Çifti MS genindeki A2756G polimorfizm analizi için seçilen primer çifti ile 329 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmanı amplifiye edildi. Forward Primer: 5 - AGG CAG GAA TTA GCA CAG T- 3 Reverse Primer: 5 GAT CCA AAG CCT TTT ACA CTC - 3 Liyofilize halde ve 0.01 µmol sentez skalasında ticari olarak satın alınan forward ve reverse primerlerinin ikisi de 100 pmol/µl olacak şekilde firmanın önerisi olan 100 µl steril su eklenerek çözüldü ve 20 µl lik eşit hacimlere bölünerek -20 o C de saklandı. Çifti MTRR G66A Polimorfizmi Analizinde Kullanılan Primer MTRR genindeki G66A polimorfizm analizi için seçilen primer çifti 66 baz çiftlik ( bç ) bir DNA fragmanı amplifiye edildi. Forward Primer: 5 GCA AAG GCC ATC GCA GAA GAC AT 3 Reverse Primer: 5 GTG AAG ATC TGC AGA AAA TCC A 3 Liyofilize halde ve 0.01 µmol sentez skalasında ticari olarak satın alınan forward primeri, 100 pmol/µl olacak şekilde firmanın önerisi olan 100 µl; reverse primeri ise 100 µl steril su ile çözüldü ve 20 µl lik eşit hacimlere bölünerek -20 o C de saklandı. 52

64 MS ve MTRR GEN POLİMORFİZMLERİ İÇİN ÇALIŞMA PROTOKOLLERİ DNA İZOLASYON AŞAMALARI 1. EDTA lı tüplere alınan kan örneğinden 200 µl si steril bir ependorf tüp içine aktarıldı. 2. Üzerine 200 µl Binding Buffer ve 40 µl Proteinaz K ilave edilip, pipetlenerek homojenizasyon sağlandı. 3. Tüpler, önceden 70 o C ye ayarlanan thermomixer cihazında 10 dakika inkübasyona bırakıldı. 4. İnkübasyon sonunda, karışım üzerine 100 µl izopropanol eklenip pipetlenerek iyice karıştırıldı. 5. Ependorf tüp içinde bulunan karşımın tamamı, collection tüp içine yerleştirilmiş filtreli tüpün içine pipetlendi rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 7. Santrifüj sonrasında, altta biriken sıvı (süpernatant) collection tüp ile birlikte atıldı, filtreli kısım yeni bir collection tüp içerisine yerleştirildi. 8. Filtreli tüpün üzerine 500 µl inhibitör removal buffer eklendi rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 10. Altta biriken sıvı, collection tüp ile birlikte atıldı. Filtre temiz bir collection tüp içine yerleştirildi. 53

65 11. Filtreli tüpün üzerine 500 µl wash buffer eklendi rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 13. Altta biriken sıvı collection tüp ile birlikte atıldı. Filtre temiz bir collection tüp içine yerleştirildi. 14. Filtreli tüpün üzerine ikinci kez 500 µl wash buffer eklendi rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 16. Santrifüj bitiminde, collection tüpün alt kısmında biriken sıvı uzaklaştırıldı ve rpm de 10 sn santrifüj edildi. 17. Altta biriken sıvı collection tüp ile birlikte atıldı ve filtre temiz bir ependorf içine yerleştirildi. 18. Önceden 70 o C ye ayarlanmış thermomixer cihazında ısıtılmış olan elution buffer dan 200 µl filtreli tüp içine pipetlendi rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 20. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı ve sonuçta ependorf tüpte genomik DNA kalmış oldu. Cam lifli filtreye nükleik asit bağlama yöntemine göre elde edilen genomik DNA lar MS ve MTRR gen polimorfizm analizleri için kullanıldı. 54

66 PCR ve RFLP YÖNTEMLERİNDE KULLANILAN KİMYASAL ÇÖZELTİLERİN HAZIRLANIŞI Etidyum Bromid Hazırlanması 10 mg/ml stok solüsyon elde etmek için, 1 gr etidyum bromid 100 ml steril distile suda çözüldü ve agaroz jelde kullanılmak üzere karanlık ortamda 4 o C de saklandı dntp Hazırlanması Deoksinükleotid trifosfatlar ( dntp ler ) eşit oranda datp, dgtp, dctp ve dttp lerden oluşur. 2mM konsantrasyondaki stok solüsyonunun hazırlanması için; datp, dgtp, dctp ve dttp nin her birinden 4 µl olmak üzere toplam 16 µl dntp, 184 µl steril distile su ile sulandırıldı ve 20 µl lik küçük hacimlere bölünerek -20 o C deki derin dondurucuda saklandı TAE ( Tris-Asetat-EDTA ) Tamponu Elektroforezde kullanılacak olan TAE tamponu için stok solüsyon olarak 50x TAE hazırlandı. 50x TAE için; 242 gr Tris, 500 ml distile su içinde çözüldükten sonra 57,1 ml glasial asetik asit ve 100 ml 0.5 M Na 2 EDTA eklendi ve son hacim distile su ile 1 litreye tamamlandı. % 3 lük ve % 6 lık agaroz jelde kullanılacak olan 1x TAE tamponu; 50x TAE stok solüsyonundan 1 ml alınıp, distile su ile 50 ml ye tamamlanarak hazırlandı. 55

67 % 3 lük ve % 6 lık Agaroz Jel Hazırlama % 3 lük agaroz için, 1,2 gr agaroz 40 ml 1x TAE içine ilave edilirken; % 6 lık agaroz için 1,8 g nuisive agaroz ve 0,6 g agaroz 40 ml 1x TAE tamponu içine ilave edildi ve mikrodalga fırında eritildi. Tamamen homojen bir eriyik haline gelen jel biraz soğuduktan sonra, 5 µl etidyum bromid eklenip iyice karıştırıldı ve yükleme kuyularını oluşturacak olan tarağın da takılı olduğu elektroforez transfer kabına döküldü. Jelin 4 o C de 15 dakika polimerleşmesi için beklendi. Jel polimerize olduktan sonra, tarak çıkarıldı ve agaroz jelin bulunduğu transfer kabı elektroforez tankına yerleştirildi. Elektroforez tankı, jelin 1 2 mm üzerini kaplayacak şekilde 1x TAE tampon çözeltisi ile doldurulup, örnekler kuyucuklara yüklendi. İlk kuyucuğa 6 µl DNA marker ( 50 bp DNA Ladder ), diğer kuyucuklara ise 5 µl PCR ürünü + 2 µl 6x yükleme boyası karışımı yüklendi. Jele yüklenen örnekler 90 V da 45 dakika yürütüldükten sonra görüntüleme analiz ve dokümantasyon sistemi ile görüntülendi MS ve MTRR GEN POLİMORFİZMLERİ İÇİN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU ( PCR ) Reaksiyonu MS A2756G Polimorfizmi İçin Polimeraz Zincir MS genindeki A2756G polimorfizm içeren 339 bç. lik gen bölgesi PCR yöntemi kullanılarak çoğaltıldı. Her bir örnek için hazırlanan 10 µl lik PCR reaksiyon karışımı aşağıda belirtildiği şekilde hazırlandı. 56

68 Bileşenler Hacim Steril Distile Su 4,8 µl Forward primer (100 µl) 0,5 µl Reverse primer (100 µl) 0,5 µl MgCl 2 1,2 µl Faststart Sybr Green DNA 1,0 µl Polimeraz (5 U/µl) Genomik DNA 2,0 µl Toplam Hacim 10 µl PCR protokolü: Denatürasyon 95 o C 30 sn Amplifikasyon 95 o 30 sn denatürasyon 58 o C 10 sn bağlanma 45 Döngü 72 o C 10 sn uzama Soğutma 40 o C 30 sn MTRR G66A Polimorfizmi İçin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) MTRR genindeki G66G polimorfizminin tespiti amacıyla polimorfizmi içeren 66 bç. lik gen bölgesi, PCR yöntemi kullanılarak çoğaltıldı. Her bir örnek için, hazırlanan 10 µl lik PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki gibi hazırlandı. 57

69 Bileşenler Hacim Steril Distile Su 4,8 µl Forward primer (100 µl) 0,5 µl Reverse primer (100 µl) 0,5 µl MgCl 2 1,2 µl Faststart Sybr Green (5 1,0 µl U/µl) DNA Polimeraz Genomik DNA 2,0 µl Toplam Hacim 10 µl PCR protokolü: Denatürasyon 95 o C 30 sn Amplifikasyon 95 o C 5 sn denatürasyon 53 o C 10 sn bağlanma 72 o C 3 sn uzama 45 döngü Soğutma 40 o C 30 sn PCR SONRASI %3 lük ve %6 lık AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ PCR sonrasında elde edilen ürünlerin büyüklüğü jel elektroforezinde kontrol edildi. MS A2756G ve MTRR G66A polimorfizm analizleri için yapılan PCR ürünleri % 3 lik ve % 6 lık agaroz jelde değerlendirildi. 58

70 ANALİZİ RESTRİKSİYON ENZİM KESİMİ İLE POLİMORFİZM PCR reaksiyonundan sonra elde edilen ve jel elektroforezinde görüntülenen PCR ürünleri, uygun restriksiyon enzimleri ile kesilerek; MS ve MTRR gen polimorfizm analizleri yapıldı MS A2756G Polimorfizmi Analizi İçin Restriksiyon Enzim Kesimi MS geninin A2756G polimorfizm analizi, enzim kesimi aşamasında Bacillus subtilis bakterisinden elde edilen BsuRI ( HaeIII ) restriksiyon enzimi kullanılarak yapıldı. BsuRI enzimi, toplam 3000 U ve 10 U/µl konsantrasyonda olacak şekilde ve 1ml 10x Buffer R [ 33 mm Tris-asetat ( ph 7.9 ), 10 mm magnezyum asetat, 66 mm potasyum asetat, 0.1 mg/ml BSA ] ile birlikte temin edildi. MS geninin PCR ile çoğaltılan 329 bç. lik hedef bölgesi, BsuRI restriksiyon enzimi için kesim yeri içermemektedir. Hedef gen bölgesinde A G değişiminin olması, bir kesim yeri oluşmasına ve PCR ürününün bu yerden kesilmesine neden olmaktadır. BsuRI restriksiyon enziminin tanıma bölgesi aşağıda gösterilmiştir: 5 G G C C 3 3 C C G G 5 59

71 BsuRI Enzim Reaksiyon Karışımı: Su 8.5 µl PCR ürünü 5 µl 10X Buffer R 1 µl 37 o C de 3 saat inkübasyon BsuRI 0,5 µl A2756G polimorfizm analizinde elde edilen PCR ürünü BsuRI restriksiyon enzimi ile kesildi. Kesim reaksiyonu sonucu oluşan ürünler % 3 lük agaroz jelde yürütülüp, görüntülendikten sonra genotipleme yapıldı. Kesim sonucunda elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bantlar: a. Polimorfizm bulunmayan, yabanil genotipteki olgularda 329 bç. büyüklüğünde tek bir DNA fragmanı, b. Heterozigot olan olgularda 329 bç., 219 bç., ve 110 bç. büyüklüğünde üç DNA fragmanı, c. Mutant olan olgularda ise 219 bç. ve 110 bç. büyüklüğünde iki DNA fragmanı şeklinde elde edildi MTRR G66A Polimorfizmi Analizi İçin Restriksiyon Enzim Kesimi MTRR geninin G66A polimorfizm analizi Neisseria denitrificans bakterisinden elde edilen NdeI restriksiyon enzimi kullanılarak yapıldı. 60

72 NdeI enzimi, toplam 2000 U/ml konsantrasyonda olacak şekilde ve 1ml 10x NeBuffer 3 ( 100 mm NaCl, 50 mm Tris-HCl, 10 mm DTT, ph 7,9 ) ile birlikte temin edildi. MTRR geninin PCR ile çoğaltılan 66 bç. lik hedef bölgesi, NdeI restriksiyon enzimi için kesim yeri içermemektedir. Hedef gen bölgesinde G A değişiminin olması, bir kesim yeri oluşmasına ve PCR ürününün bu yerden kesilmesine neden olmaktadır. NdeI restriksiyon enziminin tanıma bölgesi aşağıda gösterilmiştir: 5'...C A T A T G...3' 3'...G T A T A C...5' Enzim Reaksiyon Karışımı: Su 8,5 µl PCR ürünü 5 µl 37 o C de 3 saat inkübasyon 10x Buffer O 1 µl NdeI 0,5 µl G66A polimorfizm analizi için elde edilen PCR ürünü, NdeI restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra % 6 lık agaroz jelde yürütülüp, görüntülendikten sonra genotipleme yapıldı. Olguların genotipini belirleyen bantlar aşağıda belirtildiği şekilde belirlendi. 61

73 a. Polimorfizm bulunmayan, yabanil genotipteki olgularda 44 bç. ve 22 bç. büyüklüğünde iki DNA fragmanı, b. Heterozigot olan olgularda 66 bç., 44 bç., ve 22 bç. büyüklüğünde üç DNA fragmanı, elde edildi. c. Mutant olan olgularda ise 66 bç. büyüklüğünde tek bir DNA fragmanı İSTATİSTİKSEL ANALİZ YÖNTEMLERİ Hasta ve kontrol gruplarının MS A2756G ve MTRR G66A gen polimorfizm analizleri PCR/ RFLP yöntemi ile gerçekleştirildikten sonra elde edilen bulguların istatistiksel olarak değerlendirilmelerinde Ki-Kare Testi ve Regrasyon Analiz Testi kullanıldı Ki-Kare Testi İstatistikte en çok kullanılan temel örnekleme dağılışlarından biri olan Ki-kare testi, sağlık araştırmalarında da sıklıkla kullanılan ve en güvenilir olan analiz yöntemidir. Ki-kare analizi, çapraz tablo gözlerinde gruplar arasında gözlenen değerler ile beklenen değerlerin farkını dikkate alarak karşılaştıran bir testtir. Anlamlılık değeri p<0.05 tir Regresyon Analiz Testi İstatistik biliminin en önemli konularından birisini regresyon analizidir. Regresyon analizi, araştırma, matematik, finans, ekonomi, tıp gibi bilim alanlarında yoğun olarak kullanılmaktadır. Regresyon analizinin temelinde; gözlenen bir olayın değerlendirilmesinde hangi olayların etkisi olduğunun 62

74 araştırılması yatmaktadır. Regresyon analizi yapılırken, gözlem değerlerinin ve etkilenilen olayların bir matematiksel gösterimle yani bir fonksiyon yardımıyla ifadesi gerekmektedir. Kurulan bu modele regresyon modeli denilmektedir. Anlamlılık değeri p<0.05 tir. 63

75 3. BÖLÜM 3.1. BULGULAR KONTROL VE ÇALIŞMA GRUPLARININ GENEL ÖZELLİKLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ ve İSTATİSTİKSEL ANALİZLERİ Kontrol grubu, aralarında akrabalık ilişkisi bulunmayan 50 sağlıklı bireyden; çalışma grubu ise E.Ü.T.F Üroloji A.B.D da azospermi ve oligozoospermi tanısı almış 50 azospermili, 50 oligozoospermili toplam 100 olgudan oluşturulmuştur. Kontrol ve çalışma grubuna ait bireylerden EDTA lı tüplere alınan periferik kan örneklerinden genomik DNA izolasyonları yapıldıktan sonra ilgili gen bölgeleri PCR ile çoğaltılmış ve Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi ( RFLP ) yöntemi ile MS ( A2756G ) ve MTRR ( G66A ) polimorfizmlerinin genotiplemeleri yapılmıştır. Kontrol ve çalışma grubu ile ilgili genel bilgiler, elde edilen bulgular ve istatistiksel analiz sonuçları aşağıda belirtilmiştir Kontrol Grubu: Herhangi bir yardımcı üreme tekniği olmadan, genetik bir anomalisi olmayan, doğal yollardan en az bir sağlıklı çocuğu olan 50 sağlıklı erkek bireyden oluşan kontrol grubunun yaş ortalaması 40,48 ± 8,38 olarak saptanmıştır Çalışma Grubu: Azospermi tanısı konmuş 50 olgu ve oligozoospermi tanısı konmuş 50 olgu olmak üzere, toplam 100 bireyden oluşan çalışma gruplarının yaş ortalamaları sırasıyla 35,46 ± 4,82 ve 36,80 ± 5,39 olarak belirlenmiştir. 64

76 GENOTİP VE HAPLOTİP ANALİZLERİ MS A2756G ( Asp919Gly ) Polimorfizmine Ait Bulgular Kontrol ve çalışma grubunu oluşturan olguların MS A2756G gen polimorfizm analiz sonuçları, RFLP yönteminin uygulanmasından sonra elde edilen DNA fragmanlarının büyüklük ve sayılarına göre değerlendirilmiştir. RFLP sonucunda 329 bç. büyüklüğünde tek bir DNA fragmanına sahip olgular yabanıl tip ( AA ), 110 bç. ve 219 bç. büyüklüğünde iki DNA fragmanına sahip olgular mutant ( GG ) ve 329 bç., 219 bç., ve 110 bç. büyüklüğünde üç DNA fragmanına sahip olgular ise heterozigot ( AG ) genotip olarak tanımlanmışlardır ( Şekil 5 ). Şekil 5: MS A2756G Polimorfizmi İçin Yabanıl ( 1, 3, 4, 5 ), Mutant ( 2 ) ve Heterozigot ( 6 ) Genotiplerin RFLP sonrasında % 3 lük Agaroz Jeldeki Görüntüleri 65

77 Kontrol Grubu: Toplam 50 bireyden oluşan bu grupta, 30 kişinin yabanıl ( AA ) ( % 60,0 ), 19 kişinin heterozigot ( AG ) ( % 38,0 ) ve 1 kişinin de mutant ( GG ) ( % 2,0 ) genotipe sahip olduğu belirlenmiştir ( Tablo 3, Grafik 1 ). Haplotip analizi ile kontrol grubunda A alelinin sıklığı % 79 ( 79 Adenin ), G alelinin sıklığı ise % 21 ( 21 Guanin ) olarak saptanmıştır ( Tablo 3; Grafik 1 ) Çalışma Grubu: Toplam 100 olgudan oluşan bu grupta, 60 olgunun yabanıl ( AA ) ( % 60,0 ), 35 olgunun heterozigot ( AG ) ( % 35,0 ) ve 5 olgunun da mutant ( GG ) ( % 5,0 ) genotipe sahip olduğu belirlenmiştir ( Tablo 3; Grafik 1 ). Çalışma grubunun haplotip analizinde A alelinin sıklığı % 77,5 ( 155 Adenin ), G alelinin sıklığı % 22,5 ( 45 Guanin ) olarak bulunmuştur ( Tablo 3; Grafik 1 ). 66

78 Tablo 3: Kontrol ve Çalışma Grubunun MS A2756G Genotip ve Haplotip Analiz Sonuçları MS A2756G KONTROL GRUBU n=50 Sıklığı % ÇALIŞMA GRUBU n=100 Sıklığı % OR %95 CI p GENOTİP DAĞILIMI Yabanıl ( AA ) 30 ( % 60,0 ) 60 ( % 60,0 ) R 0,667 Heterozigot ( AG ) 19 ( % 38,0 ) 35 ( % 35,0 ) 0,400 0,045 3,579 0,412 Mutant ( GG ) 1 ( % 2,0 ) 5 ( % 5,0 ) 0,368 0,040 3,387 0,378 HAPLOTİP DAĞILIMI A G 79 ( % 79,0 ) 21 ( % 21,0 ) 155 ( % 77,5 ) 45 ( % 22,5 ) 1,092 0,609 1,960 0,445 Genotip Haplotip A G Yabanıl tip (AA) Heterozigot (AG) Mutant (GG) Toplam Kontrol Grubu Çalışma Grubu Grafik 1: Kontrol ve Çalışma Grubunun MS A2756G Polimorfizm Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması; Genotip ve Haplotip Dağılımı. 67

79 İstatistiksel Analiz: Kontrol ve çalışma grubu MS A2756G genotip ( X 2 =0.833; p>0,05 ) ve haplotip dağılımı ( X 2 =0,087, p>0,05 ) açısından kıyaslandığında aralarında anlamlı bir fark bulunamamıştır ( Tablo 3 ) MTRR G66A ( Met22Ile ) Polimorfizmine Ait Bulgular Kontrol ve çalışma grubunu oluşturan olguların MTRR ( G66A ) genotiplendirmeleri, RFLP yönteminin uygulanmasından sonra aşağıda belirtilen büyüklük ve sayıdaki DNA fragmanlarına göre yapılmıştır. Yabanıl genotipe sahip olgular ( GG ) 44 bç büyüklüğünde tek, mutant olgular ( AA ) 66 bç büyüklüğünde tek ve heterozigot olgular ( GA ) 66 ve 44 bç büyüklüğündeki iki DNA fragmanlarına sahip olmaları ile belirlenmiştir ( Şekil 6 ). RFLP sonucunda yabanıl ve heterozigot genotiplerde oluşan 22 bç. büyüklüğündeki DNA fragmanı küçük olmaları nedeniyle jelde görüntülenememiştir. Şekil 6: RFLP sonrasında MTRR G66A Polimorfizmi İçin Heterozigot ( 1 ) ve Yabanıl ( 2 ) Genotiplerin % 6 lık Agaroz Jeldeki Görüntüleri 68

80 Kontrol Grubu: Toplam 50 sağlıklı kişiden oluşan bu grupta, 41 olgunun yabanıl ( GG ) ( % 82,0 ) ve 9 olgunun heterozigot ( GA ) ( % 18,0 ) genotipe sahip olduğu bulunmuş ancak homozigot mutant ( AA ) genotipe rastlanmamıştır ( Tablo 4; Grafik 2 ). Kontrol grubunda A aleli sıklığı % 9 ( 9 Adenin ) ve G aleli sıklığı % 91 ( 91 Guanin ) olarak belirlenmiştir ( Tablo 4; Grafik 2 ) Çalışma Grubu: Toplam 100 olgudan oluşan bu grupta, 55 olgunun yabanıl ( GG ) ( % 55,0 ) 45 olgunun heterozigot ( GA ) ( % 45,0 ) genotipe sahip olduğu gözlenmiş ancak homozigot mutant ( AA ) genotipe sahip hiçbir olguya rastlanmamıştır. ( Tablo 4; Grafik 2 ). Çalışma grubunda A aleli sıklığı % 22,5 ( 45 Adenin ) ve G aleli sıklığı % 77,5 ( 155 Guanin ) olarak belirlenmiştir ( Tablo 4; Grafik 2 ). 69

81 Tablo 4: Kontrol ve Çalışma Grubunun MTRR G66A Genotip ve Haplotip Analiz Sonuçları MTRR G66A KONTROL GRUBU n=50 Sıklığı % ÇALIŞMA GRUBU n=100 Sıklığı % OR % 95 CI p GENOTİP DAĞILIMI Yabanıl ( GG ) 41 ( % 82,0 ) 55 ( % 55,0 ) R Heterozigot ( GA ) 9 ( % 18,0 ) 45 ( % 45,0 ) 3,727 1,638 8,480 0,002 HAPLOTİP DAĞILIMI G A 91 ( % 91,0 ) 9 ( % 9,0 ) 155 ( % 77,5 ) 45 ( % 22,5 ) 2, 935 1,371 6,283 0,002 Genotip Haplotip G A Yabanıl tip (GG) Heterozigot (GA) Toplam Kontrol Grubu Çalışma Grubu Grafik 2: Kontrol ve Çalışma Grubunun MTRR G66A Polimorfizm Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması; Genotip ve Haplotip Dağılımı. 70

82 İstatistiksel Analiz: Kontrol ve çalışma gruplarında MTRR G66A genotipinin dağılımı karşılaştırıldığında çalışma grubunda heterozigot ( GA ) genotipin anlamlı olarak arttığı gözlenmiştir ( X 2 =10,547, p<0,05 ) ( Tablo 4 ). Haplotip dağılımı açısından değerlendirildiğinde çalışma grubunda A mutant alel in artışı istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur ( X 2 =8,232, p<0,05 ) BİLEŞİK HAPLOTİP ANALİZLERİ Kontrol Grubu: MS A2756G ve MTRR G66A polimorfizmlerinin bileşik haplotip analizlerinde; kontrol grubunu oluşturan 50 bireyin % 71,83 ü G ( yabanıl ) / A ( yabanıl ), % 18,17 si G ( yabanıl ) / G (mutant), % 7,17 si A ( mutant ) / A ( yabanıl ) ve % 2,83 ü A ( mutant ) / G ( mutant ) olarak saptanmıştır ( Tablo 5; Grafik 3 ) Çalışma Grubu: MS A2756G ve MTRR G66A polimorfizmlerinin bileşik haplotip analizinde; çalışma grubunu oluşturan 100 olgunun % 57,72 si G ( yabanıl ) /A ( yabanıl ), % 19,78 i G ( yabanıl ) / G ( mutant ), % 19,78 i A ( mutant ) / A (yabanıl) ve % 2,72 si A ( mutant ) / G ( mutant ) olarak saptanmıştır ( Tablo 5; Grafik 3 ). 71

83 Tablo 5: Kontrol ve Çalışma Gruplarının G66A ve A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz Sonuçları Kontrol Çalışma G66A / A2756G Haplotipi Grubu (n=50) Grubu (n=100) OR % 95 CI p Sıklığı % Sıklığı % G ( yabanıl ) / A ( yabanıl ) % 71,83 % 57,72 R 0,072 G ( yabanıl ) / G ( mutant ) % 18,17 % 19,78 1,355 0,656-2,797 0,412 A ( mutant ) / A ( yabanıl ) % 7,17 % 19,78 3,432 1,365-8,627 0,009 A ( mutant ) / G ( mutant ) % 2,83 % 2,72 1,196 0,218-6,554 0,836 80% 70% 60% % 50% 40% 30% Kontrol Grubu Çalışma Grubu 20% 10% 0% G / A G / G A / A A / G Grafik 3: Kontrol ve Çalışma Gruplarının MTRR G66A ve MS A2756G Polimorfizmleri İçin Bileşik Haplotip Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması İstatistiksel Analiz Kontrol ve çalışma gruplarının G66A ve A2756G bileşik haplotip analizi sonucunda; bu iki grup arasında anlamlı bir fark olduğu, A ( mutant ) / 72