T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI TANİK ASİDİN RUMEN BAKTERİLERİNİN BAZI FİBROLİTİK ENZİMLERİNE ETKİSİ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül-2007

2 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI TANİK ASİDİN RUMEN BAKTERİLERİNİN BAZI FİBROLİTİK ENZİMLERİNE ETKİSİ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ

3 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI TANNİK ASİTİN RUMEN BAKTERİLERİNİN BAZI FİBROLİTİK ENZİMLERİNE ETKİSİ Remzi KULOĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ Bu Tez 05/09/2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir.. Doç. Dr. M. Sait EKİNCİ Doç. Dr. Sedat YILDIZ Doç.Dr. Emin ÖZKÖSE DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ ENSTİTÜ MÜDÜRÜ Bu çalışma Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

4 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER Sayfa No İÇİNDEKİLER. I ÖZET... III ABSTRACT IV ÖNSÖZ... V ÇİZELGELER DİZİNİ VI ŞEKİLLER DİZİNİ..... VII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VIII 1. GİRİŞ Rumen ve Rumenin Mikrobiyal Ekosistemi Rumen Bakterileri Rumen Selülolitik Bakterileri Hemiselülotik Rumen Bakterileri Amilolitik Rumen Bakterileri Pektinolitik Rumen Bakterileri Enzimler Enzim Aktivitesini Etkileyen Faktörler Enzim Aktivitesi ve Miktarının Tayini Bitki Hücre Duvarının Yapısı Selüloz Ksilan Pektin Lignin Tanenler Tanik Astin Hayvan Beslenmesine Etkisi Tezin Amacı ve Kapsamı ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve METOD Materyal Kullanılan Kimyasallar Kullanılan Cihazlar ve Aletler Metod Anaerobik Besi Yeri Hücre Ekstraktları ve Süpernatantlarının Hazırlanması Protein Tayini Enzim testi (Assay) BULGULAR ve TARTIŞMA Bakteri Türleri Streptococcus bovis ES Ruminococcus albus SY Prevotella bryantii B Fibrobacter succinogenes S Butyrivibrio fibrisolvens JW11 21 I

5 İÇİNDEKİLER Sayfa No 4.2. Farklı Konsantrasyonlarda Tanik Asit İçeren Subsratların ph Değerleri ve Bakterilerin Yaşaması Taninlerin Mikroorganizmaların Selülolitik Enzimlerine Etkisi Tanik Asitin Streptococcus bovis ES1 Enzim Aktivitesine Etkisi Tanik Asitin Ruminococcus albus SY3 Enzim Aktivitesine Etkisi Tanik Asitin Prevotella byantii B14 Enzim Aktivitesine Etkisi Tanik Asitin Fibrobacter succinogenes S85 Enzim Aktivitesine Etkisi Tanik Asitin Butyrivibrio fibrisolvens JW11 Enzim Aktivitesine Etkisi Sonuç ve Öneriler KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ.. 35 II

6 ÖZET T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET TANİK ASİTİN RUMEN BAKTERİLERİNİN BAZI FİBROLİTİK ENZİMLERİNE ETKİSİ Danışman: Doç. Dr. M. Sait EKİNCİ Yıl : 2007, Sayfa : 37 Jüri : Doç. Dr. M. Sait EKİNCİ Doç. Dr. Sedat YILDIZ Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE Anaerobik rumen bakterileri Streptococcus bovis ES1, Prevotella bryantii B14, Fibrobacter succinogenes S85, Ruminococcus albus SY3, Butyrivibrio fibrisolvens JW11 anaerobik besi ortamından kültüre alındıktan sonra selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin aktiviteleri 0.05 M sodyum fosfat buffer içerisinde ph=6.5 ve 37 0 C sıcaklıkta ölçüldü. Farklı oranlarda tanik asidin enzim aktiviteleri üzerine etkileri incelendi. Tanik asit konsantrasyonunun % 0.1 den itibaren artırılması ile tüm bakterilerin selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz aktivitelerinde düşüş meydana geldiği ve % 0.3 luk tanik asit konsantrasyonunda ise enzim aktivitesinin tamamen durduğu gözlenlenmiştir. Anahtar kelimeler: Rumen, Rumen Bakterileri, Tanik Asit III

7 ABSTRACT T.R. UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAS SUTCU IMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF ANIMAL SCIENCE MSc THESIS ABSTRACT TANNİK ASİTİN RUMEN BAKTERİLERİNİN BAZI FİBROLİTİK ENZİMLERİNE ETKİSİ Supervisor: Assoc. Prof. Dr. M. Sait EKİNCİ Year : 2007 Page : 37 Jury : Assoc. Prof. Dr. M. Sait EKİNCİ Assoc. Prof. Dr. Sedat YILDIZ Assoc. Prof. Dr. Emin ÖZKÖSE Cellulase, xylenase and carboximetylcellulase activities of anaerobic rumen bacteria Streptococcus bovis ES1, Prevotella bryantii B14, Fibrobacter succinogenes S85, Ruminococcus albus SY3, Butyrivibrio fibrisolvens JW11 were 50 mm sodium phosphate buffer of ph 6.5 and temperature 37 0 C the effects of tannic acid on the activity of these fibrolytic enzymes cellulase, xylenase and carboximetylsellulase activities were decreased more than 0.1 % tannic acid concentration and enzymeactivities were completely inhibited in the 0.3 %tannic acid concentration. Key words: Rumen, Rumen Bacteria, Tannic acid IV

8 ÖNSÖZ ÖNSÖZ Tez konusunun belirlenmesi, çalışmanın yürütülmesi ve yazım aşamasında beni yönlendiren danışman hocam sayın Doç. Dr. Mehmet Sait EKİNCİ ye ve sayın Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE ye, katkılarından dolayı sayın Yrd. Doç. Dr. İsmail AKYOL a teşekkür ederim. Tez çalışma aşamasında; yardımlarını esirgemeyen başta Arş. Gör. Bülent KAR ve Arş. Gör. Uğur ÇÖMLEKÇİOĞLU na çalışma arkadaşlarım Halit YÜCEL ve Kalbiye SERDAROĞLU olmak üzere, tüm Biyoteknoloji ve Gen Mühendisliği Laboratuarı elemanlarına teşekkür ederim. Ayrıca tez çalışmam sırasında benden maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme teşekkürü borç bilirim. Eylül, 2007 KAHRAMANMARAŞ V

9 ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa no Çizelge 3.1. Anaerobik bakteri besi yeri içeriği.. 16 Çizelge 4.1. S. bovis ES1 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri (µmol/dak/mg protein) 23 Çizelge 4.2. S. bovis ES1 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin toplam aktiviteleri (µmol/dak/ ml kültür). 23 Çizelge 4.3. R. albus SY3 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri (µmol/dak/mg protein).. 24 Çizelge 4.4. R. albus SY3 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin toplam aktiviteleri (µmol/dak/ ml kültür). 24 Çizelge 4.5. P. byantii B14 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri (µmol/dak/mg protein) Çizelge 4.6. P. byantii B 1 4 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin toplam aktiviteleri (µmol/dak/ ml kültür). 25 Çizelge 4.7. F. succinogenes S85 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri (µmol/dak/mg protein) Çizelge 4.8. F. succinogenes S85 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin toplam aktiviteleri (µmol/dak/ ml kültür). 26 Çizelge 4.9. B. fibrisolvens JW11 selülaz, ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri (µmol/dak/mg protein) Çizelge B. fibrisolvens JW11 selülaz. ksilenaz ve karboksimetilselülaz enzimlerinin toplam aktiviteleri (µmol/dak/ ml kültür). 27 VI

10 ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa no Şekil 1.1. Rumenin şematik yapısı 1 Şekil 1.2. Selülozun diyagramatik yapısı. 6 Şekil 1.3. Buğdaygil ksilaninin diyagramatik yapısı.. 7 Şekil 1.4. Pektinin diyagramatik yapısı.. 8 Şekil 1.5. Ligninin diyagramatik yapısı.. 9 Şekil 1.6. Taninlerin diyagramatik yapısı. 10 Şekil 4.1. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, S. bovis ES1 mikroskobik görüntüsü.. 19 Şekil 4.2. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, R. albus SY3 mikroskobik görüntüsü 20 Şekil 4.3. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, P. bryantii B 1 4 mikroskobik görüntüsü. 20 Şekil 4.4. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, F. Succinogenes S85 mikroskobik görüntüsü 21 Şekil 4.5. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, B fibrisolvens JW11 mikroskobik görüntüsü VII

11 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ KMS KMSaz DNA g L mg/ml ml μg/ml μmol nm w/v :Karboksimetilselüloz : Karboksimetilselülaz : Deoksiribonükleik Asit : Gram : Litre : Miligram/mililitre : Mililitre : Mikrogram/mililitre : Mikromol : Nanometre : Weight/volum VIII

12 GİRİŞ 1. GİRİŞ 1.1. Rumen ve Rumenin Mikrobiyal Ekosistemi Ruminantlarda sindirim sistemi 4 bölümden meydana gelmektedir. İlk 3 ön mide bölümü özefagusun değişimi ile oluşmuştur. Dördüncü bölüm olan abomasum gastrik sindirimin gerçekleştiği yerdir ve monogastrik memelilerdeki mideye karşılık gelmektedir. Rumen, ruminant sindirim sisteminin hacim olarak en büyük kısmını teşkil eder ve retikulumla beraber sığırlarda lt, koyunlarda 10 lt hacmine ulaşan (Hobson ve Wallace, 1982) ve yoğun bir mikroorganizma populasyonu içeren, büyük bir fermantasyon kabı vazifesi görür. Barsak Kırkbayır Yemek borusu İşkembe Şirden Börkenek Şekil 1.1. Rumenin şematik yapısı Yeni doğmuş ruminantların temel besin maddesini süt oluşturur ve besinin sindirimini rumende o dönemin ana mikroorganizması olan Lactobacilli, Streptococci ve Clostridium yapmaktadır. Bununla beraber, genç hayvanlar otlatılmaya başlandıklarında hayatlarında başlıca gereksinim duydukları temel mikroorganizmaları alırlar. Rumen bakterileri yetişkinlerden yavrularına; salya, emzirme ya da ortak kullanılan su aracılığıyla taşındığı düşünülmektedir. Yetişkin hayvanların geviş getirmeleri sırasında rumen içeriği ağıza taşınmakta ve burada salyayla temas ederek, rumen içeriğinde bulunan bakteri ve protozoalar salyaya geçmektedir (Hobson, 1971). Anaerobik fungusların yetişkin ruminantlardan yavrularına geçişinin ise salya ve yemlerine bulaşmış olan dışkılarıyla olduğu düşünülmektedir (Lowe ve ark., 1987b; Milne ve ark., 1989). 1

13 GİRİŞ Sıvı fazdaki bakteri, protozoa ve fungusların ulaşacağı rakamlar, rumen iç epiteline bağlanan bitki parçacıkları ile ilişkilidir (Latham, 1980). Rumen sıvısındaki bu popülasyonların miktarları bakteriler için ml -1, protozoalar için ml -1 (Hungate, 1966) ve fungal zoosporlar için yaklaşık olarak ml -1 dir (Theodorou ve ark., 1990) Rumen Bakterileri Rumen Selülolitik Bakterileri Rumen içindeki bakteri türlerinin oranı hayvanların beslendiği yemin cinsine göre değişmektedir. Rumen içerisindeki bakteri türleri rumen ekosistemini değiştirmektedir. Rumen içerisinde yemlerde bulunan selülozu sindirme yeteneği olan başlıca bakteri türleri Fibrobacter succinogenes ve Ruminococcus flavefaciens dir. Bu türler yüksek selülaz üretim aktivitesine sahip kristal formdaki selülozu sindiren mikrorganizmalardır (Brynat, 1973;Forsberg 1981; Groleau ve Forsberg,1981 ve Pettipher ve Latham, 1979; Cheng, 1984;Dehority,1993). Rumende keşfedilen diğer selülolitik bakteri türleri Eubacterium (cillobakterium) cellulosolvens (Bryant., 1958) Clostridium lonsgisporium ve Clostridium locheadii ise ikinci gurup selüloz sindirici bakterilerdir (Weimer 1996). Bu türlerde rumen içinde az miktarda selüloz sindirmektedirler ( Dehority,1993 ). Rumen içindeki selüloz ve hemiselülozu sindirme kabiliyetleri olan bakteriler, selüloz sindiremeyen bakterilere göre daha fazla bulunmaktadır (Morris ve Gylswyk, 1980). Karakteristik olarak baskın halde bulunan rumen selülotik bakterileri yalnız selülozu besin maddesi olarak kullanırlar, F.succinogenes ve ruminocula ile birlikte selülozu sindirirler ve enerji kaynağı olarak yalnız nişasta içeren besi oratamında gelişirler.( Hungate, 1966; Weimer,1996) Hemiselülotik Rumen Bakterileri Rumen içerisinde hemiselülaz aktivitesine sahip olan birkaç tür protozoa, fungus ve bakteri izole edilmiştir (Stewart ve Brayant,1988; Willians ve Coleman,1988; Orpin ve Joblin,1988). Rumendeki bakteri türlerinin hemiselüloz aktivitesi diğer mikroorganizmalardan daha yüksek olduğu bildirilmiştir (Hespell ve Cotta,1995; Hespell ve Bryan, 1992). Önemli hemiselülotik bakteri türleri hemiselülozu pentoz şekerlerine parçalama özelliğine sahiptir. Hemiselülotik mikrorganizmalar hemiselülozu substrat olarak kullanırlar depolimeraz ve glikozidaz aktivetsine sahip olan bu mikroorganizmalar enerji kaynağı olarak yalnız nişasta kullanırlar (Dehority,1993; Hespell,1987; Hespell ve Whitehead, 1990). Baskın halde bulunan B. fibrisolvens selülozu parçalama kabiliyeti vardır. Bu bakteriler bitkilerin hücre duvarında bulunan ksileni, selülozdan daha fazla sindirirler (Dehority ve Scott, 1967; Morris ve Gylswk,1980). Böylece B.fibrisolvens bitkilerin hücre duvarını ve hücre duvarlarında bulunan ksilanı sindirler (Hespell,1987; Cotta ve Zeltwnager,1995). R. flavefaciens ve R. albus yem içerisindeki hemiselülozu parçalarlar, Fibrobacter türleri ve bazı ruminococci ler hemiselülozu eneji kaynağı olarak 2

14 GİRİŞ kullanırlar (Morrison ve Gylwyk.,1980;Dehority.,1991;Hespell.,1987). Selülotik olan F. succinogones ve R. flavefaciens, birlikte yetiştikleri ortamda ki hemiselülozu tam olarak sindiremezler fakat selülotik olmayan P. ruminocula ve B. fibrisolvens hemiselülozu tam olarak sindirirler (Dehority 1991,Miron ve Ben-Ghedalia 1993). Rumendeki önemli selüloz bakteriler depolimeraz enzinimine sahiptirler bunlar yem içinde bozulmamış halde bulunan hemiselülozu parçalarlar bununla beraber yalnız birkaç tür ruminococci glikozidaz aktivitesine sahiptir; zorunlu olarak oligosakkaritleri enerji kaynağı olarak kullanırlar B. fibrisolvens ve P. ruminocula aynı tip hemiselüloz aktivitesine sahiptir (Coen ve Dehority,1970) Amilolitik Rumen Bakterileri Çeşitli mikrorganizmaların üretmiş olduğu α amilaz, izomeraz, β amilaz, glukoamilaz ve α glukozidaz enzimlerinin birlikte bir seri reaksiyonu gerçekleştirmesiyle nişasta tamamen amilodekstrine kadar parçalanır. α amilaz, amilozun asıl zincirini oluşturan α (1-4) bağlarını rastgele koparır. İzo amilaz α (1-6) yan dallarını, glukoamilaz ve β amilaz amilodeksrini glikoz ve maltoza parçalar. Çok sayıda Amilolitik mikrorganizma α glikozidaz aktivitesine sahiptir (McAllister 1990; Flint ve Forsberg, 1995). Yüksek amilolitik olan bakteriler P. ruminocola 23 ve B14, R. amylophilus, B, fibrisolvens A38 ve 49, ve S. bovis amilaz aktivitesi gösterirler ve nişastayı substrat olarak kullanırlar (Cotta, 1988). S. bovis arpa, mısır ve buğdayda bulunan nişastayı R. amylophilus ve B. fibrisolvens ten çok daha hızlı sindirirler (McAllister et al.,1990a). B. fibrisolvens hücre içi amilaz aktivitesine; S. bovis ve R. amylophilus hücre dışı amilaz aktivitesine sahiptir (Cotta, 1988). Bu türlerden yalnızca S. bovis amilaz aktivitesi tam olarak incelenmiştir ( Walker, 1965). S. bovis çok fazla α amilaz aktivitesine sahiptir ve bu organizma laktik asit ürettiği için hayvan yemlerine besin değerini artırmak için kullanılır (Hungate et al., 1952) Pektinolitik Rumen Bakterileri Pektin ve karbanhidrat içeren seçici olmayan besiyerinden izole edilen 10 tür pektini asit forma dönüştürür. Buna rağmen yalnız P. ruminocula, Lachnospira multiparus ve B. fibrisolvens pektini enerji kaynağı olarak kullanır. Pektinaz ilave edilmiş rumen sıvısında S. bovis ve S. ruminantium ürerler (Dehority,1969;Wojciechowicz et al., 1982 Wojciechowicz and Ziolecki, 1984; Heinrichova et al., 1989; Chesson and Forsberg,1988). R. favefaciens in pektin sindirimi çok azdır, fakat pektini kullanırlar ( Wojciechowicz et al., 1982; Wojciechowicz and Ziolecki, 1984). 3

15 GİRİŞ 1.3. Enzimler Enzimler; karbon, oksijen, hidrojen ve azottan oluşan, kimyasal tepkimelerde katalizör olarak rol alan, yaşayan mikroorganizmalar (bakteriler, virüsler, mantarlar) tarafından salgılanan protein yapısında moleküllerdir. Hücre içerisinde meydana gelen binlerce tepkimenin hızını ve özgüllüğünü kendisi değişikliğe uğramadan düzenlerler. Hemen hemen her metabolik reaksiyon enzimler yardımıyla kontrol edilip hızlandırılır. Reaksiyonun başlangıç aşamasında enzimin etki ettiği madde substrat olarak adlandırılırken, reaksiyon sonucu miktarında artış görülen ve açığa çıkan madde ise ürün olarak adlandırılır. Enzim substratın dış yüzeyinden itibaren etki etmeye başlar, şeklini bozar ve ürünü açığa çıkarır. Ürün açığa çıktıktan sonra enzim başka bir substrat molekülüne işlemi yapmak için hazırlanır. Enzim aktivitesi çok yüksek sıcaklıklarda proteinlerin yapısı bozunmalara uğrayacağından inhibe edilirler (Bhat, 2000). Endüstriyel alanda kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları ve fazla miktarda elde edilebilmeleridir (Wiseman, 1987) Enzim Aktivitesini Etkileyen Faktörler Her enzim için aktivitelerin maksimum olduğu ph değerleri vardır. Bu değerlerin üzerinde ve altında aktivite düşer. Bir enzimin optimum ph sı normal hücre içi ortamı ph sı ile aynı değildir. Hücrelerde her birinin ph ya karşı davranışı farklı yüzlerce enzim mevcuttur ve ph nın karmaşık hücre içi kontrol mekanizmasında önemli bir yeri vardır (Bhat, 2000). Kimyasal tepkimelerin çoğu sıcaklık yükseldikçe daha hızlı gerçekleşir. Moleküllerin yüksek ısıda daha hızlı hareket etmeleri nedeniyle onların reaksiyona girmeleri kolaylaşır. Enzimle katalizlenen tepkime hızı 0-40 ºC arasında yükselir. Ancak 40 ºC den itibaren enzim zarar görmeye başlar. Böylece reaksiyon yavaşlar ve 60 ºC de enzim tamamen protein yapısı denatüre olacağından bozulur (Horikoshi ve ark., 1984, Bhat, 2000, Mawadza ve ark., 2000). Fakat yüksek sıcaklıkta yaşayabilen canlıların bünyelerindeki enzimler daha yüksek sıcaklıklarda aktivite göstermektedir. Bu enzimler biyoteknoloji uygulamalarında da büyük öneme sahiptir. Örneğin, 94ºC sıcaklıkta bile yaşamını sürdürebilen Thermus aquaticus adlı bakteriden izole edilmiş olan Taq Polimeraz enzimi, yüksek sıcaklıkta gerçekleşen PCR (Polimeraz Zincir Tepkimesi) tekniğinde kullanılıyor. Kimyasal tepkimelerde katalizör olarak kullanılan enzimlerin aktivitesini büyük oranda etkileyen önemli etmenlerden birisi de aktivatör ve inhibitör maddelerdir. Aktivatör maddeler enzimin etkin olduğu substrat üzerine etkinliğini artırırken, inhibitör maddeler (ağır metaller, zirai ilaçlar, antibiyotikler) genellikle bu etkiye inhibe edici 4

16 GİRİŞ yönde etki ederler. Enzim ile substrat arasına girerek enzimin substrata olan etkisini engeller ve enzim aktivitesini azaltıcı yönde etkide bulunurlar (Nelson ve Cox, 2000) Enzim Aktivitesi ve Miktarının Tayini Bir çözelti veya doku ekstraktı içindeki enzim miktarı, enzimin katalitik aktivitesinden yararlanılarak bulunur. Bunun için enzim hakkında şu bilgiler gerekmektedir; 1. Katalizlenen reaksiyon denkleminin net stokiyometresi, 2. Enzimin kofaktör veya metal iyonuna ihtiyacı olmadığı, 3. Substrat ve varsa kofaktörü için Km değerleri, 4. Optimum ph sı, 5. Enzimin kararlı ve aktivitesinin yüksek olduğu sıcaklık aralığı, 6. Substratın, parçalanma veya ürünün oluşma hızlarının tespit edilebildiği basit bir analitik metot. Bir çözelti içindeki enzim aktivitesi enzim ünitesi (birimi) cinsinden verilir. Her enzimi kapsayacak bir ünite tarifi olmamasına rağmen, optimal şartlarda bir mikromol substratı bir dakikada ürüne dönüştüren enzim miktarına bir enzim ünitesi denilmesi genel olarak kabul edilmiştir (Bhat, 2000) Bitki Hücre Duvarının Yapısı Bitki hücre duvarını oluşturan başlıca polimer grupları; selüloz, hemiselüloz, pektin, lignin ve az miktarda proteindir Selüloz Selüloz karasal ortamda fazla miktarda bulunan bir biyopolimerdir. Özellikle kuru bitkisel materyalin yapısında fazla miktarda bulunmaktadır (Eriksson ve ark., 1990; Schlesinger, 1991). Bitki hücre duvarı yapı taşı olan selüloz, bir çok lignoselülozun başlıca bileşeni olup, ß-1,4 glikozidik bağlı glikoz moleküllerinden oluşan bir homopolisakkarittir (Şekil 2.). Selülozun şekilsiz formu daha az molekül içi hidrojen bağına sahip olması nedeni ile nispeten kolay yıkılır ancak kristal formdaki selüloz fiziksel yapısı nedeniyle biyolojik yıkıma karşı daha dayanıklıdır (Beguin, 1990). Bu kristal yapı selülozun hidrolizinde selüloz liflerine göreceli olarak elastikiyet ve dayanıklılık kazandırır (Yamanaka ve ark., 1989). Selüloz molekülünün büyüklüğü (polimerizasyon derecesi) bitki hücresinin duvarında bulunan ikincil duvarda her molekülde 500 den daha az glukoz biriminin bulunmasına bağlı olarak değişir (Ljungdal ve Eriksson, 1985). Genellikle selülozun bitki hücre duvarındaki oranı hücre tipine ve evresine göre değişmektedir. Örneğin; birincil duvarın kuru ağırlığının %20-40 ı selülozdan oluşurken, ikincil duvarın %40-60 ı selülozdan oluşur. Pamuk tohumunun ikincil duvarının %100 ü selülozdur. İkincil hücre duvarı mikrofibrilleri birincil hücre duvarının mikrofibrillerine göre daha yoğundur ve daha çok selüloz kristalleri içerir (Marchessault ve Sundararajan, 1983). 5

17 GİRİŞ Selüloz doğada hemen hemen hiçbir zaman tek başına bulunmaz. Genellikle diğer bitkisel maddelerle beraber bulunur. Bu da selülozun doğal ortamda parçalanmasını etkilemektedir. Selüloz lifleri öncelikle hemiselüloz, pektin ve proteinlerin dahil olduğu diğer polimerlerin matriksine gömülmüş şekildedirler. Selüloz, hücre duvarına turgor basıncına dayanabilecek gerilebilir bir kuvvet verir. Eğer hücre duvarındaki su lignin ile değiştirilirse yüksek bir kuvvet elde edilir. Bitki dünyasında en fazla bulunan ve en basit yapıya sahip olan, aynı zamanda hücre duvarı yapısında yer alan yapısal polisakkaritlerin en önemlilerinden birisi selülozdur (Anonim, 1969). Selüloz; bütün bitki, ot ve ağaçların temel yapıtaşıdır. Selülozun en önemli görevi bitkilere sağlamlık, diklik ve destek sağlamaktır. Doğada saf halde bulunmaz. Odunun ağırlıkça %40 ını, ketenin %60-85 ini, pamuk liflerinin %85-90 ını selüloz oluşturur. Doğada birkaç çeşit selüloz bulunmaktadır. Bunların hepsi de endüstri açısından önemlidir, fakat değişik amaçlar için kullanılır. Selüloz türleri birbirinden a, b, d harfleriyle ayırt edilir. a selüloz, pamuktaki selüloz türüdür. Bütün türler arasında en önemli olanıdır. Hemi-selüloz adını alan b selüloz ve d selüloz ise asitlere ve bazlara karşı daha az dayanıklı, moleküller dallanmış halde ve daha kolay kopabilme özelliğindedir (Anonim, 1969) Şekil 1.2. Selülozun diyagramatik yapısı Selülozun glikoza kadar yıkımı için başlıca 3 enzim sınıfı gerekmektedir; endoglukanazlar (endo-1,4-β-glukanaz EC ), sellobiyohidrolazları da içeren ekzoglukanazlar (1,4-β-D-glukan sellobiyohidrolaz EC ) ve ekzoglukohidrolaz (1,4-β-D-glukan glukohidrolaz EC ) ve β-glukosidazlar EC Bu enzimler molekül içi glikozidik bağlarını poliglukan halka boyunca kırarlar. Ekzoglukanazlar (Sellobiyohidrolaz ve ekzoglukohidrolaz) poliglukan halkanın uçlarına saldırır ve bu uçlardan sellobiyoz ya da glikoz ünitelerini kopartır (Coughlin ve Ljungdahl, 1988; Goyal ve ark., 1991) Ksilan Selülozun yanı sıra ksilanlar bitkinin başlıca yapısal polisakkaritlerindendir ve ruminant beslemede önemli bir enerji kaynağıdır. Ksilanlar β-1,4 bağlı D-ksilopiranosil şekerlerinin oluşturduğu omurgaya eklenmiş α-2,3 bağlı L-arabinoz, α-1,2 glukuronik asit ya da 4-0-metil D-glukuronik asit ve ester bağları üzerinden bağlanmış ferulik, p- kumarik ya da asetik asitten oluşur (Şekil 3) (Marinsek Logar ve ark., 1998). Hemiselülozlar alkali çözünen genel olarak heteropolisakkarit yapısında olan polisakkaritlerdir (Wilkie, 1983). Düz ya da dallanmış yapıda, D-ksiloz, L-arabinoz ya da D-galaktoz veya bunların kombinasyonundan oluşan, farklı cinslerde polisakkarit 6

18 GİRİŞ gruplarını içerirler (Zimmermann, 1992). Birçok hemiselüloz ksilanca zengindir; β-1,4- ksilopiranosidaz gruplarından oluşan omurgaya, α-d-glukuronik asit ya da 4-0-metil-α- D-glukuronik asit ve α-l-arabinofuranoz birimleri bağlanır (Joseleau ve ark., 1992). Bazı ksilanların özelliği, bilhassa tahıl türlerinde, arabinosil kısımları üzerinden kovalent bağlı fenolik alt ünitelerin bulunmasıdır. Ksilanların yıkımı için, endo 1,4-β-Dksilanaz, β-ksilobiaz, β-ksilosidaz ve yan grupların yıkılması için gereken enzimlerin bileşiminin gerektiği belirtilmektedir (Orpin ve Letcher, 1979). Ksilanin ana omurgasını oluşturan glikozidik bağları β-1,4 endo ksilanaz (EC ) kırar. β-1,4 ekzo ksilanaz; α-arobinofuranosidaz (EC ), arobinaz yan zincirlerini hidroliz eder; α-glukoronidaz ksiloz ünitesinde ki glukoronik asit yan zincirlerini yok eder; O- asetil ksilan esteraz ( EC ) asetat gruplarını serbest bırakır. β-1,4 ksilosidaz (EC ) ksilobiyozları parçalar. Şekil 1.3. Buğdaygil ksilanının diyagramatik yapısı Pektin Pektinler genel olarak birbirlerine α-1,4-glikozidik bağlarla bağlanmış D- poligalakturonatlar ile asidik polisakkaritlerden meydana gelmişlerdir (Şekil 4). Ana zincire α-1,2 bağlarıyla bağlanan L-ramnoz dalları polimere helikal bir yapı kazandırmaktadır (Nordkvist, 1987). Pektin yıkımı hemiselüloz ve lignin arasındaki bağların kırılması sonucu gerçekleşir ve bu biyolojik yıkımda anaerobik funguslar da görev alır. 7

19 GİRİŞ Şekil 1.4. Pektinin diyagramatik yapısı Lignin Doğada en çok bulunan biyolojik materyallerin başında selüloz ve lignin gelir. Bunların, doğada mikrobiyolojik olarak sürekli parçalanması söz konusudur. Her yıl milyonlarca ton biyolojik molekül çeşitli organizmalar tarafından kimyasal olarak yıkılmakta ve yapılmaktadır. Ancak ligninin parçalanmasında moleküler oksijene ihtiyaç duyulur ve bunun da rumende eser miktarda bulunan oksijenin kullanılarak gerçekleştirilmesi mümkün olmamaktadır (Theodorou ve ark., 1996). Lignin bir karbonhidrat olmamasına karşın doğada daha çok selüloz ve hemiselüloz ile bir arada bulunduğundan karbonhidratlar içinde incelenenir. Lignin, pektin ve hemiselüloz gibi bir heteropolisakkarittir. Lignin molekülünün büyük kısmı merkez lignin molekülüne direkt C-C dan bağlanan ya da eter üzerinden bağlanan fenilpropanoid alt ünitelerinden oluşur. Yaygın bağlantı fenilgliserol-β-aril eter bağları ile olur ve fenilkumaran, diarilpropan ve bifenil bağları bunu takip eder. Kendine özgü bir şekilde ama düşük oranda da difenil eterleri ve pinoresinol bağlantıları da bulunmaktadır. Tüm bu bağlar hidrolizin imkansız ya da oldukça zor olmasını sağlamaktadır (Bresnak ve Brune, 1994). Lignin, karbonhidrat polimerleri ile çok yakın ilişkili olduğundan ve hemiselülozla kovalent bağlı olduğundan kısmi denatürasyon olmadan lignoselülozdan izole edilemez. Bu kovalent bağlar hücre duvarındaki polimerizasyon işlemi boyunca oluşur, oluşan tepkime sadece diğer oligolignoller ile değil eterlerin ve esterlerin benzeri olan hemiselülozların ürünlerinde glukuronik asidin karboksi ve hidroksi grupları ile de gerçekleşir (Freudenberg ve Neish, 1968; Higuchi, 1990). 8

20 GİRİŞ Şekil 1.5. Ligninin diyagramatik yapısı Taninler Tanin, tanik asit olarak da bilinir. Tanenler polifenolik bileşikler olup, kolza, bakla ve sorgum gibi bitkilerden elde edilen, açık sarı-kahverengi toz, pul ya da süngersi bir kütle halindeki biçimsiz (amorf) maddelere verilen addır. Taninler fenol yapısında katı bileşiklerdir ve suda çözünürler. Genellikle bitkilerin kök, odun, kabuk, yaprak ve meyvelerinde bulunur. Başlıca kullanım alanı olan dericilik ve boyacılık dışında taninler şarap ve biranın berraklaştırılmasında, petrol kuyularındaki sondaj çamurunun akışkanlığının artırılmasında ve buhar kazanlarının çeperlerinde birikinti oluşumunun engellenmesinde kullanılır. Tıpta damarları ve mukozayı büzücü etkilerinden ötürü bademcik, farenjit, basur ve bazı deri hastalıkları ilaçlarının bileşimine girer. Taninler kimyasal açıdan, hidroliz olabilenler taninler ve kondanse taninler (Şekil 6) olmak üzere iki ana grupta incelenir. Birinci grupta yer alan taninler bir asit ya da enzim eşliğinde hidroliz olarak gallik asit, pirokateşik asit ve şeker gibi, suda çözünebilen bileşikler verir. Suda az, alkolle asetonda iyi çözünür. Hidroliz olabilen taninlerin en iyi bilinen örneklerinden biri gallotaninlerdir. Çok daha geniş bir grup olan kondanse taninler ise hidroliz olamazlar. Bunlar ısı karşısında kuvvetli asitlerle ya da bazı yükseltgeyici maddelerle flobafen denen koyu kırmızı renkli çözünmez bileşikler oluşturur. 9

21 GİRİŞ a) Hidrolize tanin b) Kondense tanin Şekil 1.6. Taninlerin diyagramatik yapısı Taninler ayrıca tripsin ile α-amilazların sindirimdeki aktivitesini, substratlarla kompleks teşkil ederek önlerler veya onlara bağlanarak protein ve nişasta sindiriminin aksamasına yol açarlar. Taninler vitaminlerle de kompleks oluşturarak emilimini önlerler Tanik Astin Hayvan Beslenmesine Etkisi Tek mideli hayvanların aksine, düşük seviyede (10 40 g/kg kuru madde) taninin ruminant hayvanlarda yararlı oldugu bildirilmektedir. Nötr ortama yakın olan rumende, tanin çözünebilir proteinle bir kompleks oluşturmaktadır. Böylece proteinlerin mikroorganizmalar tarafından parçalanması önlenmektedir (Barry ve Manley, 1986, Jones ve Mangan, 1997). Bazı durumlarda, rasyonda bulunan taninin salya üretimini artırdıgı bildirilmiştir (Van Soest, 1994). Dolayısıyla salya ile birlikte fazla miktarda üre rumene tekrar geri gelmekte ve rumen mikroorganizmalarının kullanımına sunulmaktadır. Tanin hem rumende, proteinlerin aşırı bir şekilde parçalanmasını önlemekte hem de rumende kullanılmayan amonyaktan sentezlenen ürenin tekrar kullanmasına olanak sağlamaktadır. Taninin proteinlerle kompleks oluşturması ince bağırsağa daha fazla rasyon proteinin (bypass protein) gelmesini sağlamakta ve bunun neticesinde ise hayvansal üretim artmaktadır. Aynı zamanda karbonhidrat sindiriminde azalmada olmaktadır. Bu azalma hayvansal üretimi negatif yönde etkileyecek kadar olmamaktadır. Yüksek 10

22 GİRİŞ miktarda tanin rumende seluloz sindirimini azaltmakta bu da hayvanın yem tüketimine etki etmektedir (Barry ve Durcan, 1996). Tanin rumende proteinle kompleks oluşturur. Abomasumda bu kompleks ph dan dolayı kendi bileşenlerine ayrılır. Fakat serbest tanin, ince bağırsağın asidik olmayan bölgelerinde tekrar sindirim enzimleri veya bağırsak mukozasıyla kompleks oluşturabilir (Jones ve Mangan, 1997). Bu şekilde tanin ruminant hayvanlarda negatif etkisini basit midelilerde olduğu gibi gösterebilir Tezin Amacı ve Kapsamı Bu tezin amacı, herbivorların sindirim sistemindeki mikrofloranın önemli bir grubunu teşkil eden ve selülolitik olmaları nedeniyle biyoteknolojik uygulamalarda yüksek öneme sahip olan anaerobik bakterilerin bazı fibrolitik enzimlerinine tanik asitin etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla çalışma planı aşağıdaki gibi gerçekleştirilmiştir. 1. Bu çalışmada Rowert Research Institute (Aberdeen, İngiltere) den temin edilen anaerobik rumen bakterilerinden Streptococcus bovis ES1, Prevotella byantii B14, Fibrobacter succinogenes S85, Ruminococcus albus SY3, Butyrivibrio fibrisolvens JW C yetiştirilerek morfolojik olarak tanımlanması yapıldıktan sonra kültür stokları oluşturuldu. 2. Tanımlaması yapılan bakterilerin selülolitik ve hemiselülolitik enzim üretim düzeyleri belirlendi. 3. Fibrolitik enzimlerden selülaz, KMSaz ve ksilenaz enzim aktiviteleri üzerine farklı konsantrasyonlardaki ( % 0.1, % 0.2, % 0.3) tanik asitin etkisi incelendi. 11

23 ÖNCEKİ ÇALAŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bryant ve ark. (1961), yapmış oldukları çalışmada bakterilerde selülozun parçalanması hem aerobik hem de anaerobik bakteriler tarafından gerçekleştirildiğini ve herbivor hayvanlarda ve böceklerde selülozun parçalanması anaerobik kuşullarda gerçekleştiğini göstermiştir. Selülotik bakterilerin seçiminde aerobik ve anaerobik bakteriler çalışılmıştır (Hungate, 1950; Bryant ve Robinson, 1961; Miller ve Wolin., 1974). Braynt ve ark (1973), yapmış olduğu çalışmada Ruminococcus albus ve Butyrivibro fibrisolvens in bazı suşlarının selülotik olduğunu fakat bunlar yalnız amorf biçimdeki selülozu sindirdiğini bildirmiştir. Waldo (1973), Barry ve Duncan, (1984) yapmış olduğu çalışmada rumende nişasta sindirimi tanin seviyesinin artmasıyla birlikte azaldığını göstermiştir. Ayrıca liflerin sindirimi de tanin seviyesine bağlı olarak azaldığı bildirilmiştir. Fakat bazı araştırmacılar ise, lif sindiriminde bir azalma olmadığını kaydetmişlerdir Morris ve Van Gylswyk (1980), yapmış oldukları çalışmada B.fibrisolvens saf kültürleri normalde F.succinogenes, R.albus ve R.flavefaciens den daha az selüloz sindirim aktivetesine sahip olduğunu göstermişlerdir. Jones ve Megarrity (1986) yapmış olduğu çalışmalarda rumene transfer edilen mikrorganizmaların bazılarının taninlere adapte olduğunun bazılarının ise adapte olamadığı bulmuşlardır. Bu çalışmada evcil ve yabani ruminantlardan izole edilen taninlere karşı toleranslı bakteri çeşitlerinin fizyolojik ve filogenetik karşılaştırmaları yapılmıştır. Makkar ve ark. (1987) taninin karbonhidrat metabolizması ile ilgili enzimlerin (selülaz, amilaz, galaktosidaz) faaliyetlerini engellediğini bildirmişlerdir. Lowe ve ark. (1987), Mountfort ve Asher (1989), yaptıkları çalışmalarında ksilanlı ortamda, ksilanaz ve ksilobiaz enzimlerinin her ikisinin de kültür sıvısında ksilanın parçalanarak; ksiloz, ksilobioz ve ksilo-oligosakkaritlerin oluşması süresi boyunca görev aldığını belirtmişlerdir. Hespell ve ark. (1987), Hespell ve Whitehead (1990), yapmış oldukları çalışmada Prevotella (Bakteroides) ruminocola, Butyrivbrio fibrisolvens ve Eubacterium ruminantium türlerinin hemiselüloz ve ksileni sindirdiklerini ispatlamışlardır. Wood ve Garcia-Campayo (1990), genel olarak selülazların hücre dışı enzim komplekslerinin, ekzo 1,4-β-D-glukanaz (sellobiohidrolaz), endo 1,4-β-D-glukanaz ve β- D-glukosidaz içeren kristal selülozu hidrolize ettiğini belirtmişlerdir. Dehority (1991), Miron ve Ben-Ghedalia (1993), selülotik olan F. succinogones ve R. flavefaciens birlikte yetiştikleri ortamdaki hemiselülozu tam olarak sindiremezler fakat selülotik olmayan P. ruminocula ve B. fibrisolvens hemiselülozu tam olarak sindirdiğini bildirmişlerdir. 12

24 ÖNCEKİ ÇALAŞMALAR Bae ve ark (1993), rumen içerisinde baskın halde bulunan Fibrobacter succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminobacter amylophilus, ve Streptococcus bovis, türlerinin tanine töleranslı olduğu gösterilmiştir. Bu bakterilerin tanin protein kompleksini hidrolize edebildiği için zengin tanen içeren besi ortamında ürediğini bildirmişlerdir. Brooker ve Muslera (1994), yaptığı çalışmada Streptococcus gallolyticus un taninlere töleransı olduğu ve rumen içerisinde geniş bir dağılım gösterdiği ispatlanmışlardır. Waghorn ve ark. (1994a) yaptığı çalışmalarda taninin yararlı etkisinin yanında bazı zararlı etkisininde olduğu göstermişlerdir. Taninin karbonhidratlarla bileşik oluşturma eğiliminin proteinlere göre düşük olmasına rağmen, tanik asitin varlığı nişasta sindirimini % 9-17 oranında düşürdüğü in vitro olarak gösterilmiştir. Osawa (1990), yapmış olduğu çalışmada bir çok farklı coğrafik bölgelerde yaşayan koala, keçi ve atlardan izole ettiği çok sayıda bakterinin fizyolojik ve filogenetik karşılaştırmalarını yapmış ve bunların tanin töleranslı mikoorganizmalar olduğunu bildirmiştir. Jones ve ark. (1994), proteolitik rumen bakterilerinden Butyrivibrio fibrisolvens A38, Prevotella ruminicola B14 Ruminobacter amylophilus WP225, ve Streptococcus bovis 45S1 de taninin etkisini incelemiş ve taninin bu bakterilerde toksidite mekanizmasını harekete geçerdiği bildirmişlerdir. Broker ve Muslera (1994), yapmış olduğu çalışmalarda daha önceden izole edilen tanin töleranslı bakteriler tanin protein komplekssini hidrolize ederek yüksek konsantrasyonlarda tanin ve tanik asiti hidrolize edebildiklerini ispatlamışlardır. Jones ve Megarrity (1994), yapmış olduğu çalışmalarda rumene transfer edilen mikrorganizmaların bazılarının taninlere adapte olduğunun bazılarının ise adapte olamadığı bulmuşlardır. Bu çalışmada evcil ve yabani ruminantlardan izole edilen taninlere karşı toleranslı bakteri çeşitlerinin fizyolojik ve filogenetik karşılaştırmaları yapılmıştır. Odenyo ve Adiew (1997) ve Kumar (1992), yüksek oranda kondense tanin içeren ağaç tohumlarının hayvan yemi olarak kullanılmasının rumen içerisindeki besinleri sindiren bakteriler üzerine toksik etki yaptığını bildirmişlerdir. Odenyo and Osuji (1998) bitkilerin üretmiş olduğu sekonder bileşikler hayvanların besinlerden yararlanmasını önemli derecede azalttığını sekonder bileşiklerin rumenden izole edilen mikrorganizmalarda çeşitli morfolojik değişikliklere sebep olduğunu bildirmişlerdir. Nelson ve ark. (1998), izole ettikleri 6 farklı bakterinin 16S r RNA bölgesinin sekansını yapmışlar ve bu bakterilerin tanine toleranslı oldukları söylemişlerdir. İzole edilen bu bakterilerin Streptococcus genusuna ve Enterobacteriaceae familyasına ait oldukları anlaşılmıştır. 13

25 ÖNCEKİ ÇALAŞMALAR McSweeney ve ark. (1999), yatıkları çalışmada tanine toleranslı proteolitik rumen bakterisi Calliandra calothyrsus u izole etmişlerdir. Odenyo ve ark. (2001), tanine toleranslı olduklarını belirttiği bir çok rumen bakterisini tanik asit veya ham tanin ile beslenen gazel, keçi ve koyun gibi ruminantların rumenlerinden izole etmişlerdir. Bu bakterilerin Selenomonas sp, Streptococcus sp, Butyrivibrio fibrisolvens oldukları DNA analizleri ile belirtilmiştir. Bishop ve ark. (2004), tanine toleranslı Selenomonas ruminantium izole etmişlerdir. Kareuse ve ark. (2005), Streptococci lerin hidrolize tanin ve kondense tanine tolerans mekanizmaları üzerine çalışmış ve farklı Streptococci türlerinin tolerans seviyelerinin farklı olduğunu belirtilmişlerdir. Min ve ark. (2005), 11 rumen bakterisi üzerine Streptococcus bovis NCFB 2476, B315, Butyrivibrio fibrisolvens WV1, C211, Prevotella ruminicola 23, Prevotella benzeyen C21a, Ebacterium spp. C12b ve C124b, Clostridium proteoclasticum B316T, Ruminococcus albus ve Fibrobacter succinogenes kondense taninin etkisini incelemişlerdir. Kondense tanin miktarının proteolizi etkilediği ve proteolitik bakterilerin üremesini engellediğini ortaya koymuşlardır. Barahona ve ark. (2005), kondense taninin anaerobik rumen fungusu Neocalimastyx hurleyensis in fibrolitik enzimleri üzerindeki etkisini incelenmişler ve 40 mg/ml kondense taninin karboksimetilselulaz aktivitesinin tamamını ve 5,5mg/ml kondense taninin ksilenaz aktivitesinin yarısını durdurmaya yettiğini bildirmiştir. β-d ksilenaz aktivitesinin daha az hassas olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca tanin içeriği yüksek bitki materyalinin fibrolitik enzimler üzerinde direkt ortama tanin eklenmesinden daha etkili olduğunu bildirmiştir. Sabu ve ark. (2006), tannaz üreten Lactobacillus u koyunlardan izole etmişler ve taninin parçalanmasında rumen bakterisi Streptococcus bovis in de rol aldığını belirlemişlerdir. 14

26 MATERYAL ve METOD 3. MATERYAL ve METOD 3.1. Materyal Kullanılan Kimyasallar Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler ve alındıkları firmalar aşağıdaki gibidir. K 2 HPO 4 (Merck), KH 2 PO 4 (Merck), (NH 4 ) 2 SO 4 (Sigma), NaCl (Sigma), MgSO 4. 7H 2 O (Sigma), CaCl 2 (Merck), NaHCO 3 (Sigma), Glikoz (Sigma), sellüloz (Sigma), peptone (Fluka), Yeast Extract (Merck), Resazurin (% 1) (Sigma), Cystein HCl (Merck), Na 2 CO 3 (Sigma), Na-K-Tartarat (Merck), CuSO 4 (Merck), Folin s Clocol Teu s Phenol reagent dilute (Sigma), BSA ( Bovine Serum Albumin) (Sigma), NaOH (Sigma), Ksilan (Sigma), KMS (Sigma), selüloz (Sigma), Glikoz (Sigma), Bismut nitrat Na-K-Tartarat (Merck), NaOH (Sigma), PAHBAH (Parahidroxi benzoic acid hydrosides), NaH 2 PO 4 H 2 O (Merck), Na 2 HPO 4 (Merck), tanik asit(merck) Kullanılan Cihazlar ve Aletler Su banyosu (J.P. selecta), soğutmalı santrifuj (J.P. selecta), hassas terazi (Vipra), vortex (velp), otomatik pipetler (Biohit), inkubator (nüve), spektrofotometri (J.P. selecta), ph metre otoklav mikroskoplar (olympus), test tüpleri, ependorf tüpleri, ve fotoğraf makinası (olympus) kullanılmıştır Metod Anaerobik Besi Yeri Rumen mikrobiyolojisine ait, günümüzde kullanılan birçok anaerobik teknik ve besi yeri Hungate (1969) veya bu yöntemin biraz daha geliştirilmişi olan Bryant (1972) metoduna dayanmaktadır. Besi yerlerine son konsantrasyonu % 0.3 glikoz, % 0.2 selüloz, alacak şekilde enerji kaynağı eklenmiştir. 15

27 MATERYAL ve METOD Çizelge 3.1 de anaerobik bakteri kültürleri için hazırlanan besi yerinin içeriği verilmiştir. Çizelge 3.1. Anaerobik bakteri besi yeri içeriği Besi yeri Roll tüp agar (100 ml) (100 ml) Mineral Solüsyon 1 Mineral Solüsyon 2 * ** ml ml Rumen Sıvısı ml NaHCO 3 g Yeast Extract g Peptone g Resazurin (% 1) ml Cystein HCl g Enerji kaynağı *** g Saf su ml [ * ] Mineral Solüsyon 1: K 2 HPO 4 g 3.0 Saf su ml 1000 [ ** ] Mineral Solüsyon 2: KH 2 PO 4 g 3 (NH 4 ) 2 SO 4 g 6 NaCl g 6 MgSO 4. 7H 2 O g 0.6 CaCl 2 g 0.6 Saf su g 1000 [ *** ] Enerji Kaynağı : % 0.3 Glikoz, % 0.2 sellüloz, Anaerobik Besi Yerinin Hazırlanması Besi yerine konulacak tüm kimyasallar sırasıyla (Sistein-HCl hariç) belirtilen miktarlarda saf su, Mineral Solüsyon-1, Mineral Solüsyon-2 ve rumen sıvısı karışımı içerisinde çözülmüştür. Bu sırada besi yeri, ısıtıcılı manyetik karıştırıcı üzerinde sürekli ısıtılarak karıştırılmış ve ilave edilen maddelerin çözünmesi beklenmiştir. Besi yeri kaynamaya başladıktan sonra Cystein-HCl ilave edilmiş ve manyetik karıştırıcı ile karıştırılmaya devam edilirken, ortama CO 2 verilmiştir. (Besi yeri hazırlanırken, ısı etkisiyle O 2 nin ortamdan uzaklaştırılması amaçlanmaktadır. Isıtma sonrasında ortamda kalan O 2 nin giderilmesi için Cystein-HCl en son konulur). Resazurin indikatörünün etkisiyle, ısıtılmaya başlandığı andan itibaren mavi-mor olan besi yerinin rengi giderek pembeye, ortamda O 2 kalmayınca da besi yerinin olması gereken orijinal rengi olan sarıya dönmeye başlamıştır. Hungate tüplerine CO 2 verilerek, ortamdaki O 2 uzaklaştırılmıştır. Ortama CO 2 verilmeye devam edilerek, tüplere gerekli miktarda besi yeri ilave edilmiş ve O 2 girişine müsaade etmeyerek, hızlı şekilde tüplerin ağzı kapatılmıştır. 16

28 MATERYAL ve METOD Enerji kaynağı olarak % 0.3 glikoz, % 0.2 selüloz içeren besi yeri 110 C de 15 dakika otoklavlanmıştır Hücre Ekstraktları ve Süpernatantlarının Hazırlanması Hücre ekstraktları Flint ve ark. (1991) nın belirttiği metodun değiştirilmiş şekliyle hazırlanmış ve metodoloji aşağıda belirtilmiştir. İçinde enerji kaynağı olarak % 0.2 selüloz, % 0.3 glukoz bulunan besi yerlerinde üretilmiş anaerobik bakteriler, oda sıcaklığında devir/dak da 5 dakika santrifüj edilmiştir. Süpernatantlar ve hücreler ayrıldıktan sonra hücreler Na 2 HPO 4 tanponu içerisinde sulandırılmış ve ependorf tüplerine alınarak -20ºC de saklanmıştır. Anaerobik bakterilerin enzim aktivitesini test etmek amacıyla elde edilen hücre ve süpernatantlar kullanılıncaya dek 20 ºC de saklanmıştır Protein Tayini Anaerobik bakterilerin protein tayini yapılırken Lowry protein analizi metoduna dayanılarak gerçekleştirilmiş (Lowry ve ark., 1951) 5 μl hücre ekstraktı veya süpernatant 10 μl buz soğukluğundaki 1 M NaOH ile son hacim 250 μl olacak şekilde karıştırılmış ve 100ºC de 10 dakika kaynatılmıştır. Örnekler soğuduktan sonra 625 μl C solüsyonu (50 ml sol (A) + 2 ml sol (B) ) eklenmiş ve 10 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. Sonra 125 μl Folin Reagent (1:1 saf su) konulmuştur. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilen örnekler, 700 nm de okunmuştur. Protein Miktarının Saptanmasında Kullanılan Solüsyonlar aşağıdaki gibidir. Solüsyon (A) : % 5 lik Na 2 CO 3 Solüsyon (B) : %1 lik Na-K-Tartarat + %0.5 lik CuSO 4 ( ph=7, NaOH ile ayarla) Solüsyon(C) : 50 ml sol (A) + 2 ml sol (B) Solüsyon (D) : Folin s Clocol Teu s Phenol reagent dilute ( Olası yanlış şeker indirgenmelerini önlemek amacıyla distile su ile 1:1 oranında sulandırılarak kullanılır.) BSA standartı : 4 mg BSA 10 ml 0.5 M NaOH 17

29 MATERYAL ve METOD Enzim Testi (Assay) Ksilanaz, karboksimetilselülaz (KMSaz) ve selülaz aktivitesinin belirlenmesi serbest kalan şekerlerin ölçülmesi esasına dayanılarak (Lever, 1977) yapılmıştır. Standart olarak; 1 mg/ml glikoz kullanılmıştır. Enzim testleri, 0.05 M NaPO 4 tanpon (6.5 ph) içerisinde 37 C de, bir saat inkübasyona bırakılmıştır. Enzim testinin yapılışı aşağıdaki gibidir. Her bir tüpe 5 ml PAHBAH konur. (A karışımı): Her bir tüpe 10 μl hücre veya 20 μl spernatant son hacim 250 μl olacak şekilde subsrat ile ependorf tüplerinde karıştırılır. A karışımından inkübe edilmeden 100 μl alarak içerisinde PAHBAH bulunan tüplere konur. 70 C de su banyosunda 10 dakika bekletilir. 410 nm okunur.(t =0) A karışımı 37 C de 1 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra A karışımından 100 μl alarak içerisinde PAHBAH bulunan tüplere konur. 70 C de su banyosunda 10 dakika bekletilir. 410 nm okunur.(t =60) Spesifik Enzim Aktivitesin Saptanmasında Kullanılan Solüsyonlar Substrat: % 1 lik ksilan, KMS veya selüloz otoklavlanmış 0.05 M sodyum fosfat buffer içerisinde çözünür (ph =6.5). Bizmut: 10 ml d H2O içerisinde kullanmadan bir gün önce hazırlanır. Bizmut nitrat =4.84 gr Na-K-Tartarat =2.82 gr NaOH =1.2 gr (Assay yapılacağı zaman 100 ml PAHBAH içerisine 1 ml Bizmut eklenir.) PAHBAH: 0.05 M PAHBAH (Parahidroxi benzoic acid hydrosides) ( 1,522 gr) 200 ml 0.5 M NaOH ( 4 gr ) içerisinde hazırlanır. Standart: 950 μl 0.05M Na phosphate buffer + 50 μl subsrat (1mg/ml ksilen veya glikoz) Ksilanaz, karboksimetilselülaz (KMS), ve selülaz aktivitesinin belirlenmesi %0,%0.1, %0.2 ve %0.3 tannik asitli ortamda serbest kalan şekerlerin ölçülmesi esasına dayanılarak (Lever, 1977) yapılmıştır. Standart olarak; 1 mg/ml glikoz kullanılmıştır. Enzim testleri, 0.05 M NaPO 4 buffer içerisinde 37 C de, 6.5 ph da yapılmıştır 18

30 BULGULAR ve TARTIŞMA 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Bakteri Türleri Bu çalışmada kullanılan anaerobik rumen bakterilerinden Streptococcus bovis ES1, Prevotella byantii B14, Fibrobacter succinogenes S85, Ruminococcus albus SY3, Butyrivibrio fibrisolvens JW11 türleri Rowert Research Institute (Aberdeen, İngiltere) den temin edilmiştir. Kültürler anaerobik besi ortamına ekim yapılarak 37 0 C 3 gün gelişmeye bırakıldı. Gelişen kültürlerin morfolojik tanımlanması yapıldı Streptococcus bovis ES1 S. bovis ES1 gram(+) cocci µm, çapında, çoğunlukla çiftli ve kısa zincir şeklinde olur. S. bovis ES1 amilolitik, proteolitik, laktoperik ve pektinolitik mikroorganizmadır. Fermentasyon ürünü olarak formik asit, asetik asit, laktik asit, etanol ve karbandioksit üretirler. Şekil 4.1. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, S. bovis ES1 mikroskobik görüntüsü S. bovis ve diğer amilolitik bakterilerle bu yem maddelerinin fermantasyonu ruminal ph da düşüş ve rumen içinde organik asitlerin birikimine yol açar Ruminococcus albus SY3 R. albus SY3 gram (+) zayıf (-) 1-2 µm çapında çoğunlukla çiftli şekilde olur. R. albus SY3 selülolitik, ksilanolitik ve amilolitik mikroorganizmadır. Fermentasyon ürünü olarak formik asit, asetik asit, laktik asit, etanol ve karbandioksit üretirler. R. albus ve R. flavefaciens rumen içerisinde selülaz üretebilen önemli bakteriler arasında yer almaktadır. Bu bakteriler rumen içerisinde bitki hücre duvarının yıkılmasında önemli etkiye sahiptir. 19

31 BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.2. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, R. albus SY3 mikroskobik görüntüsü Prevotella bryantii B14 P. bryantii BB14 gram (-), oval,çubuk veya kokobasil, şekilli ve 1 µm çapında 6 µm uzunluğunda, çoğunlukla tekli veya zincir şeklinde olur. Şekil 4.3. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, P. bryantii BB14 mikroskobik görüntüsü P. bryantii BB14 amilolitik, ksilanolitik, proteolitik, deksrinolitik, laktoperik ve pektinolitik mikroorganizmadır. Fermentasyon ürünü olarak formik asit, n-butirik asit, laktik asit, süksünik, hidrojen ve karbandioksit üretirler. P. ruminocola selüloz ve hemiselülozu sindirebilmektedir. P. bryantii B14 rumen içerinde metan gazı üretmektedir. Bu bakterinin aşırı çoğalması sonucunda rumende şişmeye sebep olmaktadır. 20

32 BULGULAR ve TARTIŞMA Fibrobacter succinogenes S85 F. succinogenes S85 gram (-) kalın kokoid ten oval şekilli çubuk ve 0,8-1,5 µm çapında çoğunlukla çiftli şeklinde olur. Şekil 4.4. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, F. Succinogenes S85 mikroskobik görüntüsü F. succinogenes S85 selülolitik, ksilanolitik, amilolitik, proteolitik, laktoperik ve pektinolitik mikroorganizmadır. Fermentasyon ürünü olarak formik asit, asetik asit, süksünik asit, propiyonik asit, izovalerik asit, ve karbandioksit üretirler. F. succinogenes fibrolitik rumen bakterilerindendir. F. Succinogenes en az 11 çeşit selülaz, 5 çeşit ksilenaz ve geniş bir hemiselülaz çeşidi üretmektedir. Bu sayede bitkilerin hücre duvarında bulunan palisakkaritleri sindirmektedir Butyrivibrio fibrisolvens JW11 B. fibrisolvens JW11 gram (-) eğri çubuk (virgül) şekilli ve µm çapında 3-5 m uzunluğunda, çağunlukla tekli veya zincir şeklinde olur. B. fibrisolvens JW11 selülolitik, ksilanolitik, amilolitik, proteolitik, laktoperik ve pektinolitik mikroorganizmadır. Fermentasyon ürünü olarak formik asit, asetik asit, laktik asit, etanol ve karbandioksit üretirler. B. fibrisolvens JW11 rumen içersinde selülaz üretebilen önemli bakteriler arasında yer almaktadır 21

33 BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.5. Anaerobik % 0.3 glikoz % 0.2 selüloz içeren besi ortamında 37 ºC üç gün üremeye bırakılan, B fibrisolvens JW11 mikroskobik görüntüsü 4.2. Farklı Konsantrasyonlarda Tanik Asit İçeren Subsratların ph Değerleri ve Bakterilerin Yaşaması Substrat içerisine eklenen tanik asit miktarının artışına bağlı olarak enzim aktivitesindeki azalmasının veya durmasının nedeni ph değerinin değişmesinden enzimin çalışacağı minimum ph değerinden aşağıya düşmesinden kaynaklanabileceği düşünülmüştür ve ph değeri ölçülmüştür. % Tanik Asit ph Yapılan ölçümler sonucunda tanik asit miktarının ph değerini çok değiştirmediğini ve bu değişimin enzim aktivitesini çok etkilemeyeceği görülmektedir. Tanik asit içeren besi ortamlarında bakterilerin gelişimini incelemek için % 0.1, 0.2 ve 0.3 tanik asit içeren besi ortamlarına S. bovis ES1, P. byantii B14, F. succinogenes S85, R. albus SY3, B. fibrisolvens JW11 türlerinden ekim yapıldı. Bu bakteriler 37 ºC üç gün gelişmeye bırakıldı inkübasyan sonrasında % 0.1 ve % 0.2 tanik asit içeren ortamlarda bakterilerde üreye bildikleri ancak % 0.3 tanik asit içeren ortamda bakterilerin üreyemedikleri gözlemlendi. 22