KIRMIZI ET KAS DOKUSUNDA YASAKLI ANABOLİZANLAR İÇİN LC-MS/MS İLE ÇOKLU ANALİZ YÖNTEMİ

Transkript

1 KIRMIZI ET KAS DOKUSUNDA YASAKLI ANABOLİZANLAR İÇİN LC-MS/MS İLE ÇOKLU ANALİZ YÖNTEMİ Prof. Dr. Bülent NAZLI, Dr. Muammer KAPLAN, Elmas Ö OLGUN, Öznur KARAOĞLU Ağustos-2015

2 SUNUM İÇERİĞİ Hormon ve Benzeri Maddeler-Anabolizanlar? İnsan sağlığı üzerindeki etkisi Sınırlamalar Analiz yöntemleri Hormonların sınıflandırılması Çalışmanın amacı İlgili kurumlar Matriks seçimi Analiz yöntemi Validasyon Sonuç 2

3 ANABOLİZAN İLAÇLAR Hormonlar kan dolaşımı ile hedef organlara taşınan ve hedef organlar üzerinde etkiye sahip maddelerdir. İki tip hormon bulunmaktadır: doğal hormonlar ve kimyasal olarak üretilmiş anabolizanlar. Bu hormon ve anabolizanlar hayvanlarda büyümeyi hızlandırmakta ve et/yağ oranını yükseltmektedir. Cinsiyet hormonları etkisi gösteren anabolizanların AB dışındaki bazı ülkelerde büyüme geliştirici madde olarak kullanımı yasaldır. Bu ülkelerin yetkili mercileri bu maddeleri risk-free olarak değerlendirmektedir (ör. ABD). Avrupa da bu maddelerin kullanımı yasaktır.

4 ANABOLİZAN İLAÇLAR İLLEGAL KULLANIMI Hormon ve benzeri amaçla kullanılan maddeleri içeren hayvansal kökenli gıdaların insan tüketimine sunulması da yasaktır. Yasaklı anabolizan kullanımı etin kalitesini düşürmekte ve su tutmuş et satışı tüketici haklarının suistimal edilmesine sebep olmaktadır. Yasaklı hormonların kullanımının kontrolündeki eksiklik sonucunda oluşacak tüketici riski göz ardı edilemez. Güvenli ve hızlı test sistemleri tüketicinin korunması için oldukça önemlidir

5 İNSAN SAĞLIĞINA ETKİSİ Hormon ve bezneri amaçla kullanılan maddeler insanlarda olası karsinojenik olmasından dolayı kullanımı yasaklanmıştır. International Agency for Research on Cancer IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.

6 İNSAN SAĞLIĞINA ETKİSİ Grup 2A: Ajan (karışım) insanlarda olası karsinojenik etki göstermektedir. Bu kategorideki ajanların veya karışımların hayvanlar üzerinde yapılan deneysel çalışmalar sonucunda insanlarda henüz kesin olarak karsinojen etki gösterdiği kanıtlanmamıştır. Androjenık anabolik steroidler, stilbenler, zeranol ve metabolitleri

7 SINIRLAMALAR AB Komisyonu Direktifi 81/602/EC 1981 yılında hayvan yetiştiriciliğinde hormonal veya thyreostatik özellik gösteren bileşiklerin kullanımını engellemiştir. Bundan sonra, tüm üye ülkelerde hormon ve benzeri ilaçların tespiti ve izlenmesi için bir üniform uygulaması başlatmak için komisyon ilk direktifi yeniden düzenleyerek 85/358/EC direktifini yayınlamıştır. Steroid ve benzeri maddeler canlı hayvan ve hayvansal ürünlerde komisyonun 96/23/EC direktifine göre tanımlanmıştır. Gıda Değeri Olan Hayvanlara Uygulaması Yasaklanan Ve Belli Şartlara Bağlanan Hormon Ve Benzeri Maddeler Hakkında Tebliğ Yetki Kanunu: 3285, KHK 560, 4631, 6343, 1262 Yayımlandığı R.Gazete: Tebliğ No: 2003/18

8 ANALİZ YÖNTEMLERİ YÖNTEM İNEBİLDİĞİ LİMİT SPE Sayısı SÜRE DEZAVANTAJ ELİSA <0.5 mcg/kg 2-3 Her bir analit için ayrı numune hazırlama Konfirmasyon gerekliliği ÇOKLU ELİSA <0.5 mcg/kg 2-3 Çoklu analiz olduğu için tek numune hazırlığı Konfirmasyon gerekliliği GCMS < 2 mcg/kg 2-3 Her bir grup için ayrı ayrı numune hazırlanması MSTFA ile türevlendirmeden gelen zorluk LCMSMS < 0.5mcg/Kg 2-3 Her bir grup için ayrı ayrı numune hazırlanması

9 HORMON YA DA HORMON BENZERİ ETKİYE SAHİP MADDELER «Aşağıda belirtilen hormon ya da hormon benzeri etkiye sahip maddelerin, gıda değeri olan hayvanlara anabolik amaçla uygulanması yasaktır. Bu maddeler şunlardır»: a) Stilbenler, stilben türevleri, tuzları ve esterleri, b) Antitiroidal etkili maddeler, c) Anabolizan amaçla kullanıma uygun steroidler, d) Zeranol da dahil olmak üzere rezorsilik asit laktonlar, e) Beta agonist etkili maddeler. Gıda Değeri Olan Hayvanlara Uygulaması Yasaklanan Ve Belli Şartlara Bağlanan Hormon Ve Benzeri Maddeler Hakkında Tebliğ

10 ÇALIŞMANIN AMACI Hormon ve benzeri ilaç kalıntılarının kırmızı et kas dokusunda basit, hızlı ve ekonomik bir analitik metot geliştirilmesi, 2002/657/EC direktifine göre valide edilen metot ile Ulusal Kalıntı İzleme Programı kapsamında Türkiye de anabolizan madde analizlerinin yapılması amaçlanmıştır.

11 ÇALIŞMALARDAN SORUMLU LABORATUVARLAR Yetkili Laboratuvarlar Görevli Olduğu Analizler CRL İsmi ve Grup Adress Adana Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü Elazığ Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü Adana Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Kayseri Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Konya Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Ulusal Gıda Referans Laboratuvar Müdürlüğü CHARM II ile tetrasiklin, makrolit ve streptomisin CHARM II ile betalaktam, sülfonamit GC-MSile naftalin ELISA ile kloramfenikol ICP-MS ile ağır metal Malaşit yeşili BVL-CRL Beta Agonists Anthelmintics Anticocidials including Nitroimidazoles Non-steroidal anti inflammatory drugs (NSAIDs) Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Bundesallee 50, Gebäude Braunschweig Telefon: 0531/ Telefax :0531/ Bursa Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü A6, B1, B2b, (*) Director: Dr.Petra Gowik İzmir Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü A6, B1, B2b (*) (*) UKİP de yer alan analiz tablosu kapsamında Yetkili-Referans Laboratuvarlar Görevli Olduğu Analizler Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Toksikoloji Laboratuvarı Dr.Ayşin BAŞSATAN YORULMAZ İzmir Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Ankara Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Antibakteriyal maddeler (Grup B1), kloramfenikol (Grup A6) malaşit yeşili, yem (*) Nitrofuranlar, nitroimidazoller (Grup A6), anthelmintikler (Grup B2a), antikoksidialler (Grup B2b), NSAID (Grup B2e), balda fumagillin (Grup B2f), Stilbenler/steroid (Grup A1, A3), resorsilik asit laktonlar (Grup A4) ve pestisitler (Grup B2c, B3a, B3b) Ağır metaller (Grup B3c) ve balda naftalin Sütte kurşun; yumurtada ağır metal (grup B3c); mikotoksinler (Grup B3d) RIVM-CRL Stilbenes, stilbene derivatives and their salts and esters Antithyroid agents Steroids Resorcylic acid lactones (RALs) including zeranol sedatives Mycotoxins National Institute for Public Health and the Environment (RIVM) Antonie van Leeuwenhoeklaan MA Bilthoven Director: Dr.Leendert A. van Ginkel

12 MATRİKS SEÇİMİ Substances Diethylstilbester ol (DES) Dienstrol (DE) Hexestrol (HEX) Substances Zeranol Zearalanone Marker Residue Metabolite Taleranol A1 Stilbens Matrix Urine Liver Meat (includ ing fish) Matrix Urine Liver Muscle Urine Liver Recommended concentration* 1 ppb for DES 2 ppb for DE 2 ppb for HEX 2 ppb (for all substances) 1 ppb (for all substances) A4 Recorcylic acid lactones and derivates Recommended concentration* 2 ppb 2 ppb 1 ppb 2 ppb 2 ppb Substances A3 Steroids Marker Residue Metabolite 17 Beta Oestradiol 17 Beta Oestradiol Ethninylestradiol 17 Beta Testosterone 17 Beta Trenbelone Melengestrol Medroxyprogester one Methyltestosterone Ethninylestradiol 17 Beta Testosterone 17 Beta Trenbelone Melengestrol (acetate) Matrix Serum Muscle Urine Liver Muscle serum Urine Liver Muscle Urine Liver Muscle Kidney fat Muscle Kidney fat Muscle CRL GUIDANCE PAPER (7 December 2007) CRLs VIEW ON STATE OF THE ART ANALYTICAL METHODS FOR NATIONAL RESIDUE CONTROL PLANS Recommended concentration* 0,1 ppb 1ppb 1 ppb 2 ppb 1 ppb Male < 6 months:10 ppb Male 6-18 months:10 ppb Female < 18 months 0,5 ppb 2 ppb 2 ppb 1 ppb 2 ppb 2 ppb 1 ppb 5 ppb 1 ppb 1 ppb 1 ppb

13 NUMUNE HAZIRLAMA/EKSTRAKSİYON 5 g homojenıze edilmiş kırmızı et kası 2 gr/ 12 ml Bond Elut C-18 kartuş 10 ml Asetat Tamponu ph hacim metanol, 1 hacim su İle kolon şartlandırılır 100 ppb Internal standart karışımından 100 mcl 1 dk vortexlenir 150 mg Proteas enzimi ilave dilerek 37 C de 1 gece inkübe edilir Numune yüklenir 1 hacim su ile yıkama yapılır 1 hacim 20/80 Su/aseton ile yıkama yapılır Oda ısısına getirilen numuneye 10 ml metanol ilave edilerek 1 dk vortexlenir 4000 rpm de 5 dakika santrifüjelenir üst faz başka kaba aktarılır Metanolle ekstraksiyon ikinci kez tekrarlanır 1 hacim heptan geçirilirek vakum altında 5 dakika kurutulur 10 ml Acetonıtrıl ıle elusyon yapılarak 40 C de kuruluğa kadar solvent uçurulur 0.2 ml mobil faz ile kuru bakiye çözülür. Birleştirilen metanol fazları whatman 1 den süzülerek 180 ml su ile dilue edilir LC-MS/MS

14 LC ve MS PARAMETRELERİ Kolon Mobil Faz Enj. Hacm i Akış Hızı Kolon Sıc. Süre C-18 (100 X 2.1 mm) 5 mikron A 10 mm Amonyum Asetat + %0,1 Asetik Asit B Metanol 50 µl 0.2 ml/dak 40 0 C 20 dak Zaman Mobil Faz B (%) (dak) Steroid ana ion Q1 ( Kantitatif ion ) Cap Volt\ coll Energy Q3 ( Kalitatif İon ) Cap Volt\ coll Energy Dwell Time 17a ethynylestradio l / /25 0,075 alfa estradiol /15 132,6 60/15 0,075 beta estradiol / /15 0,075 (-) hexestrol ,5 80/ /15 0,075 Progesterone / /20 0,075 Testosterone / /20 0, trenbelone /10 0,075

15 METOT VALİDASYON 2002/657/EC Direktifine göre: Linearite Geri Kazanım Tekrarlanabilirlik Tekrarüretilebilirlik Tayin Limiti (CCα) Tespit Limiti (CCβ)

16 DOĞRULAMA PARAMETRELERİ VE KRİTERLERİ Validasyon Parametre Ne/nasıl Kriter Seçicilik Reaktif körü ve kontrol numunelerinde cevap Geri Kazanım Matriks standartlardan elde edilmiş lineariteye akrşılık hesaplanan numunelerin karşılaştırılması % Doğruluk CRM numunesi ile 6 tekrarlı yapılan çalışmadan hesaplanır. 1 µg/kg -%50 ile +%20 arasında >1 µg/kg-10 µg/kg -%30 ile +%10 arasında 10 µg/kg -%20 ile +%10 arasında Tekrarlanabilirlik Tekrarüretilebilirlik Karar Limiti (CCα) Tespit Limti(CCβ) Linearite Tekrarlanabilirlik % RSD sini belirleyin, her konsantrasyonda hazırlanmış 6 set numuneler için hesaplanır 3 gün boyunca 2 farklı kişiden elde edilen çalışmalardan% RSDr hesaplanır. 3 gün boyunca çalışılmış en düşük konsantrasyondaki çalışmadan hesaplanır. 3 gün boyunca çalışılmış en düşük konsantrasyondaki çalışmadan hesaplanır. Her gün için 4 konsantrasyonda hazırlanmış matriks ilaveli standarttan hesaplanır. 10 µg/kg-100 µg/kg %20 > 100 µg/kg-1000 µg/kg % µg/kg %10 1 µg/kg (*) 10 µg/kg (*) 100 µg/kg % µg/kg %16 Kalıntılar < ±%20 (*) 100 µg/kg altındaki konsantrasyonlarda Horwitz denklemi kabul edilebilir değerler vermediğinden dolayı bu konsantrasyonun altındaki çalışmalarda olabildiğince düşük % RSDr değerleri elde etmeye çalışılır.

17 PERFORMANS LİMİTİ S/N 2 0,5 ppb S/N 10 0,1 ppb

18 LİNEARİTE 1. GÜN 2. GÜN 3. GÜN 17- alfa-estradiol progesterone hexestrol

19 METOT VALİDASYON/GERİ KAZANIM 1 Gün 1 ppb % GK ort sd %RSD 17- alfa-estradiol alfa ethnylestradiol beta estradiol Dienesterol Diethylstilbesterol DES hexestrol progesterone testesterone trenbelone alfa zearalanol alfa zearalenol beta zearalanol beta zearalenol zearalenone zan

20 METOT VALİDASYON/CCα-CCβ ve LOD LOQ Ort Geri Kazanım (%) % Genişletilmiş Bel. Kırmızı Et matriksi performans limti ( ppb) LOD ( ppb) LOQ ( ppb) % RSDr Ccα ( ppb) CCβ ( ppb) 17- alfaestradiol 1 0,1 0, ,2 1,08 1,17 17-alfa ethnylestradiol 1 0,1 0, ,3 1,24 1,48 17-beta estradiol 1 0,1 0, ,2 1,06 1,12 Dienesterol 1 0,1 0, ,2 1,08 1,16 Diethylstilbester ol DES 1 0,1 0, ,2 1,04 1,08 hexestrol 1 0,1 0, ,2 1,08 1,17 progesterone 1 0,1 0, ,2 1,09 1,17 testesterone 1 0,2 0, ,2 1,11 1,22 trenbelone 1 0,1 0, ,2 1,08 1,17 alfa zearalanol 1 0,1 0, ,2 1,06 1,43 alfa zearalenol 1 0,1 0, ,2 1,03 1,42 beta zearalanol 1 0,2 0, ,2 1,05 1,43 beta zearalenol 1 0,4 1, ,2 1,07 1,43 zearalenone zan 1 0,1 0, ,2 1,06 1,44

21 YANLIŞ POZİTİF Kırmızı renkli kromatogram sucuk numunesi Yeşil renkli kromatogram standart

22 KONFİRMASYONUN ÖNEMİ Relative Hassasiyet (% Ana pik ) LC-MSMS (relative ) > 50 % ± 20 % > ± 25 % % > ± 30 % % 10 % ± 50 % Standart Q1/Q3 oranı 8:4 =2 ± 20 % Numunede beklenen benzetme oranı 1,6-2,4 Numune Q1/Q3 oranı 2:12,5=0,16 Failed

23 SONUÇLAR Yasaklı anabolizan ilaç kalıntılarının kırmızı et numunelerinde analizleri için yeni bir analitik yöntem geliştirilmiş ve 2002/657/EC AB direktifi kriterlerine göre valide edilmiştir. Daha ekonomik- anabolizan maddelerin analizi tek bir SPE kullanumı ile gerçekleştirilmiştir. Daha pratik ve hızlı-mevcut yöntemlere göre, aynı sürede 3 kat daha fazla örnek çalışılabilir.

24 Özetle, Geliştirilen metot ile, şu ana kadar gıda olarak tüketime sunulan büyük baş hayvanlarda, denetimi yapılamayan yasaklı hormon ve benzeri ilaç kalıntılarının analizi hızlı ve ekonomik olarak gerçekleştirilebilecektir.

25 TEŞEKKÜR Çalışmalarda katkısı olan arkadaşlarım adına; Prof. Dr. Bülent NAZLI-İZÜ Dr. Muammer KAPLAN-MAM Özcan KUBAT-MAM Öznur KARAOĞLU-MAM Dr.Ayşin YORULMAZ-EVKMAE Dr.Yasemin GÜREL-EVKMAE Beni dinlediğiniz için TEŞEKKÜR EDERİM