SAS-MX CK VIS-10 Izoenzim Kullanım Talimatı REF REF (sadece jel kit) REF (sadece reaktif kit)

Transkript

1 SAS-MX CK VIS-10 Izoenzim Kullanım Talimatı REF REF (sadece jel kit) REF (sadece reaktif kit)

2 KULLANIM AMACI SAS-MX CK Vis-10 İzoenzim kit agaroz jel elektroforezi tarafından serum veya plazmada Kreatin Kinaz İzoenzimlerin ayırma ve kantitatif tespiti içindir. Kreatin fosfokinaz (CK) (EC ) tersinir reaksiyonda katalizör olan bir enerji transferi enzimidir. CK, bazı dokularda az miktara sahip iskelet kası, kalp kası ve beyinde öncelikli bulunur 1. Cerrahi girişimler, kas içi enjeksiyonlar ve miyokard enfarktüsü gibi çeşitli klinik vakaların bazıları serumda artmış CK aktivitesine neden olur 2,3. Yüksek CK aktivitesinin kaynağı izoenzim değerlendirmesi ile daralmış olabilir. M ve B olan iki molekül CK ın alt birimleridir ve üç izoenzim üretiminin kombinasyonudur. CK-MM (iskelet kasından alınan öncelikle izole edilir), CK-MB (miyokard) ve CK-BB (beyinden alınan öncelikle) 3. CK izoenzim analizi miyokard hasarının erken tespitinde kullanılan en önemli prosedürlerden birisidir 4. Akut miyokard infarktüsü (MI) sonrası CK-MB yaklaşık 4 ila 6 saat kadar serum içerisinde görünür, saatte pik aktivitesine ulaşır ve 72 saat içinde tamamen yok olabilir. MI sonrası ilk 48 saat içinde, CK-MB, ağır koronarv yetersizliği vakalarında olduğu gibi Ml olan hastaların % 100'ünde bulunur 1,3,5. Ml tanısında en kesin laboratuvar testleri laktat dehidrogenaz (LD) izoenzimi ile birlikte CK izoenzim çalışmaları yapılarak gerçekleştirilir 3,5-8. Bu iki test ile elde edilen özgüllük ve duyarlılık, MI ın doğru tanısında ek enzim çalışmaları için gerekliliğini ortadan kaldırmıştır 7. CK ve LD izoenzimlerinin patern yorumunda en önemli durum birden fazla incelenen paternin karakteristik değişiminin tespit edilmesidir (CK-MB hızlı görünür ve görünmez ve LD2 üzerinden LD1 çevrilir) 1,3,9. CK-MB de sürekli yükselme miyokard enfarktüsü göstergesi değildir. CK-MB, normalin üst sınırını asla aşmayan toplam CK da küçük bir infarkt tanısında yararlı olabilir 10. Miyokard tarafından üretilen CK sadece % CK-MB dir ve kalan CK- MM dir. Bu nedenle, miyokard infarktüsü nedeniyle CK da yükselme CK-MB de artmaz ancak CK-MM de artar. CK ın izoenzimleri çeşitli yöntemlerle değerlendirilmiştir Elektroforez izoenzimlerin tam ayrılığında belirgin avantaj sağlar 3. CK izoenzimleri bir agaroz jel üzerinde elektroforetik mobilitelerine göre ayrılır, aşağıdaki reaksiyon sırasına göre CK izoenzimlerini gösteren bir reaktif ile inkübe edilerek devam eder: Paternler kalitatif olarak incelenir yada paternler dansitometri tarafından kantitatif tespit edilir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. 1

3 BİLEŞENLER 1. SAS-MX CK Izoenzim Jel (x10) Koruyucu olarak sodyum azid ile AMP tamponunda agaroz içerir. Jel paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 2. SAS-MX CK Izoenzim Buffer (1x 100ml) MOPSO tampon ph içerir. Saf su ile 1 litre şişe içeriğini dilüe edin. 3. CK Izoenzim Reaktif (10x 1ml) Yukarı gösterilen reaksiyon sırasına göre kreatin kinaz izoenzim in tanımlanması için gerekli bileşenleri içerir. Çözdürme talimatı için ADIM-ADIM PROSEDÜRE bakın. 4. CK Izoenzim Diluent (1x 10.5ml) Koruyucu olarak MES, sakaroz ve sodyum azid içerir. Dilüent paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 5. CK Izoenzim Kromojen (1x 1ml) Tetranitro mavi tetrazolium (TNBT) ve dimetilformamid (DMF) içerir. Kromojen paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 6. CK Izoenzim Aktivatör (1x 1ml) Su içinde 2-Mercaptoethanol içerir. Aktivatör paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 7. Diğer Kit Bileşenleri Her kit için kullanım talimatı ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda Numune Aplikasyon Template (Template 2 = 10 x 8 örnek, Template 4 = 10 x 10 örnek) ve kurutma kağıdı A ve D kurutucu içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-MX CK Izoenzim Jel Jeller derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2. SAS-MX CK Izoenzim Buffer Konsantre buffer C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe buffer C de 2 ay stabildir. 3. CK Izoenzim Reaktif Reaktif C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. 4. CK Izoenzim Diluent Dilüent C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. 5. CK Izoenzim Kromojen Kromojen C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. 6. CK Izoenzim Aktivatör Aktivatör C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir.kontaminasyondan kaçının. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKLİ ÖĞERLER Katalog No.4063 SAS-MX Tankı Katalog No.1525 EPS600 Güç kaynağı Katalog No Inkübasyon odası derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını 35 C li inkübatör Cam Plaka Boya arındırıcı Solüsyon: 900ml saf su ve 100 ml glacial asidik asidi karıştırın. Ağzını sıkıca kapatarak saklayın. Saf su 2

4 ÖRNEK ALMA VE HAZIRLAMA Tercih edilen numune taze toplanmış serumdur. Örnekler alınır alınmaz test edilmelidir. Eğer gerekirse, örnekler C de 48 saate kadar veya 20 C de 2 haftaya kadar dondurarak saklanabilir. Oda sıcaklığında çözülmeye bırakın. Örnek Toplama: Örnek toplamanın doğru zamanlaması miyokard infarktüsünün (MI) değerlendirilmesinde CK İzoenzim paternlerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. En az 4 örnek toplanmalıdır - mimimum 36 saatte her 8-12 saatte bir örnekler alınmalıdır. Engelleyici faktörler: 1) Kırmızı hücreler CK aktivitesi içermediğinden, hemolizli ürünler enzimde reaksiyon sırasını engelleyebilir böylece hemolizli örneklerin kullanılması tavsiye edilmez 21. 2) Örneklerin tekrarlanan çözülmesi ve dondurması CK aktivitesini bozar. 3) Bazı ilaçlar CK izoenzim aktivitesi etkileyebilir 22. 4) CK ısı tarafından inaktive olur 21. 5) Bazı örneklerde, albumin MB ve BB bant bölgeleri arasında gözle görülür bir bant oluşturabilir. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Her 100μl hasta örneği veya kontrolü için 1μl CK İzoenzim Aktivatör ekleyin ve C de kullanım öncesi 10 dakika inkübe edin. 2. Paketten jeli çıkarın ve kağıt bir havlu üzerine koyun. Uygulama noktasında jel yüzeyini (jel kenarlarındaki '-' işareti arasında) kurutucu A kullanarak kurutun, kurutucuyu atın. NOT: Jel elektroforez başlamadan önce 5-7 dakikayı geçmeden plastik shell in dışına alınır. 3. Jelin kenarındaki - işareti ile örnek uygulama templaytını hizalayın (tercihinize göre ya 8 örnek ya da 10 örnek). Templaytin üstüne kurutucu A koyun ve iyi temas etmesi için aralıklara doğru parmağını sürtün. Kurutucuyu çıkarın ve adım 6 da kullanmak için ayırın. 4. Her aralık için 1μl örnek uygulayın ve 4 dakika boyunca emmesini bekleyin. 5. Örneklerin emilimi devam ederken, SAS-MX çemberin her bir iç bölümüne 45ml buffer dökün. 6. Örneklerin emilimi ardından Adım 3 de ayrılmış olan kurutucu A ile templaytı kurutun ve hem kurutucuyu hem de templaytı çıkarın. 7. Çember içine agaroz aşağı bakacak şekilde yerleştirin, çember üzerindeki uygun pozisyonlar ile pozitif (+) ve negatif(-) köşeleri hizalayın. 8. Elektroforez yapılır: 100 volt, 20 dakika. 9. Örnekler elektroforez olurken, inkübasyon çemberine su ile nemlendirilmiş bir kurutucu D koyun ve dengeye gelmesi için 45 C de ayarlı inkübatöre koyun. 10. Elektroforezin tamamlanmasından önce yaklaşık 3-4 dakika, 1ml CK İzoenzim Diluent ve 70μl CK İzoenzim kromojen ekleyerek 1 şişe CK İzoenzim Reaktifinini sulandırın ve iyice karıştırın. Vortekslemeyin. 11. Elektroforez ardından, cam plaka üzerine agaroz jel tarafı yukarı bakacak şekilde koyun. CK İzoenzim Reaktif şişe içeriğini jelin anot (+) kenarı boyunca dökün. 12. Bir serolojik pipet kullanarak jelin anot kenarından katot(-) kenarına reaktifi yayın. 15 saniye bekleyin ve katot kenarından anot kenarına reaktif yayın. 15 saniye bekleyin ve jel fazlalığını alın. 13.Cam plakadan jeli çıkarın ve inkübasyon çemberine koyun. Jeli inkübe edin:30 dakika, 45 C dakika boya arındırıcı solüsyon içinde jeli durulayın. 15.Saf su ile jeli yıkayın ve C de kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Jellerin değerlendirmesinin her bir laboratuvarda bu test için üretilen normal değerlere karşı yapılması önerilir. Tamamlanmış jeller her zaman karanlıkta saklanmalıdır. 3

5 Kalitatif Değerlendirme: SAS-MX CK Izoenzim jel ilgili bantların varlığı veya yokluğunda incelenecektir. Kantitatif Değerlendirme: 1 saat içinde tamamlanmış jelleri 590nm de tarayın. CK-BB hızlı hareket eden en anodik banttır ve CK-MM yavaş hareket eden en katodik banttır. CK-MB, CK-MM ve CK-BB ye ara ürün olarak göç eder 1-3. Çok sayıda atipik CK bandı rapor edilmiştir. CK-MB arasında göç eden atipik bantlar IgG karşı CK-BB kompleks e ve lipoproteine karşı CK-MM komplekse bağlanmıştır. Mitokondriyal CK katot olarak CK- MM ye göç eder ve bir kanser hastasından alınan belirlenmiş-makro-ck bir bant katot olarak CK-MM ye göç eder. CK-MM Genellikle CK izoenzim sadece normal serumda bulunur 1. İskelet kası hasarı, miyokard hasarı veya beyin hasarında artmıştır 1,3. CK-MB Normal bireylerden alınan serumda 0-4% oranında bulunabilir 24. CK-MB aktivitesinin küçük miktarları olası miyokard infarktüsü için bir uyarı olarak yorumlanmıştır ve seri CK ve LDH İzoenzim çalışmaları ile takip edilmelidir. Aşağıdaki kriterler yerine getirildiğinde miyokard infarktüsüün pozitif göstergesi: Uygun klinik ortamda 2, CK-MB aktivitesinin >5% den daha büyük toplam CK aktivitesinde, minimum 10IU/L 1,15,25 de ve CK-MB (relatif olarak hızlı görünme ve kaybolma) 1,3,9 paternde karakteristik değişiklik gösterir. İkinci miyokard infarktüsün pozitif tanımlanması: ilk MI sonrası düşüş başladıktan sonra CK-MB artar. Total CK da düşüş başladıktan sonra bir artış göstermeyebilir. Açık kalp cerrahisi 3 sonrası - CK ve LD izoenzimlerinin değerleri en yüksek tanısal durumlardan daha az spesifiktir. CK-MB operatif prosedürden gelen miyokard hasar nedeniyle yükselmiş olacaktır. LD ekstrakorporeal dolaşımdan gelen hemolizi ikinci olarak ters çevirebilir. Infarkt hastalarda CK-MB aktivitesi daha yüksek seviyelerdedir fakat izoenzim aktivitesinin geniş aralığı tam ayrım imkansızken MI hastalarında kaydedilen MI olmayan hasta çakışmaları görülür. Bu zorluğa rağmen, MI tanısında doğruluk post-operatif dönemde CK-MB in seri tespitler yapıyorken artırılabilir. MI olmayan hastalar CK-MB post-operatifde 2,26 daha hızlı bir düşüş gösterirken, peri-operatif infarkt hastaları genellikle CK-MB düzeylerinde ilerleyici bir artışa sahip olacaklardır. MI dışındaki hastalıklarda: Şiddetli koroner yetmezlik, Duchenne's müsküler distrofi, Rocky Mountain Benekli Ateşi, Rabdomiyoliz, Dermatomiyozit, myoglobinüri Polimiyozit, Reye Sendromu yükselme görülür. CK-BB Genellikle prostat kanserli hastaların serumunda ve bazen diğer karsinom ve malign tümörlerlü hastalarında serumunda görülür(bkz. SINIRLAMALAR). Nadiren kan-beyin bariyeri hasarı nedeniyle beyin hasarlı hastaların serumunda görülmektedir 1,27. Bazen ciddi şok sendromlu hastaların serumunda (muhtemelen akciğer ya da ince bağırsak tutulumuna bağlı) görülebilir. Bazen kronik böbrek yetmezliğine sahip hastaların serumunda görülür 1. Atipik CK gruplarından çok sayıda bildirilmiştir. CK-MB ve CK-MM arasında göç eden atipik bantlar pozitif tanımlama olmadan diğerleri gibi IgG 28,29 için CK-BB kompleksin ve Lipoprotein 30 için CK-MM kompleksin oluşmasına neden olmuştur Mitokondriyal CK, CK- MM 34 için kathodal olarak göç eder ve bir kanser hastasından izole edilen belirlenmiş 'makro' CK bir bant, ayrıca CK-MM 35 için kathodal olarak göç etti. KALİTE KONTROL CK / LD Kontrolü (Kat.No.5134) prosedürünün tüm aşamalarını doğrulamak için kullanılabilir ve her plaka çalışmasında kullanılmalıdır. Kabul edilebilir test değerleri için sağlanan paket prospektüsüne bakın. SINIRLAMALAR SAS-MX CK İzoenzim prosedür tümör belirteçleri tanımlamak için dizayn edilmemiştir. 4

6 REFERANS DEĞERLERİ Normal aralık çalışmaları görünüşte sağlıklı erkek ve kadın gönüllüler kullanılarak yapılan aşağıdaki sonuçları vermiştir: CK-MM = 100% CK-MB = 0% CK-BB = 0% PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Doğrusallık Yöntem, CK aktivitesi bant başına 1300 IU / L e kadar lineer bir cevap verir. Duyarlılık Yöntem bant başına 8 IU / L duyarlıdır. Tekrarlanabilirlik BİBLİYOGRAFYA 1. Brish, L.K., CK & LD Isoenzyme. A Self-Instructional Text, Am. Soc. Of Clin. Path. Press, Chicago, 1984 : Wolf, P.L., Griffiths, J.C and Koett, J.W., Interpretation of Electrophoretic Patterns of Proteins and Isoenzymes, Mason Publishers, New York, 1981 : Tietz, N.W., Ed. Textbook of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1986 : Galen, R.S., The Enzyme Diagnosis of Myocardial Infarction, Human Path., 1975; 6(2): Wagner, G.S., Roe, C.R., Limbird, L.E., Rosati, R.A. and Wallace, A.G., The Importance of Identification of the Myocardial-Specific Isoenzyme of Creatine Phosphokinase (MB Form) in the Diagnosis of Acute Myocardial Infarction, Circulation, 1973; 47: Marmor, A. and Alpan, G., Specificity of Creatine Kinase MB Isoenzyme for Myocardial Injury, Clin. Chem., 1978; 24(12): Galen, R.S., Reiffel, J.A. and Gambino, S.R., Diagnosis of Acute Myocardial Infarction, J. Am. Med. Assoc., 1975; 232(2): Frolich, J., Brosseuk, A., Grant, A. and McLennan, M., Study of the Value of CPK and LDH Isoenzyme Determinations in the Differential Diagnosis of Ischemic Chest Pain, Clin. Biochem., 1978; 11(6): Yasmineh, W.G., Pyle, R.B, Cohn, J.N., Nicoloff, D.M., Hanson, N.Q. and Steele, B.W., Serial Serum Creatine Phosphokinase MB Isoenzyme Activity After Myocardial Infarction, Circulation, 1977; 55(5): D Souza, J.P., Sine, H.E., Horvitz, R.A., Kubasik, N.P., Brody, B.B. and Barold, S.S., The Significance of the MB Isoenzyme in Patients with Acute Cardiovascular Disease with a Normal or Borderline Total CPK Activity, Clin. Biochem., 1978; 11(5): Mercer, D.W., Separation of Tissue and Serum Creatine Kinase Isoenzymes by Ion- Exchange Column Chromatography, Clin. Chem., 1974; 20(1): Rao, P.S., Lukes, J.J., Ayres, S.M. and Mueller, H., New manual and Automated Method for Determining Activity of Creatine Kinase Isoenzyme MB, by Use of Dithiothreitol: Clinical Applications, Clin. Chem., 1975; 21(11):

7 13. Jockers-Wretou, E. and Pfleiderer, G., Quantitation of Creatine Kinase Isoenzymes in Human Tissues and Sera by an Immunological Method, Clin. Chim. Acta, 1975; 58: Roberts, R., Sobel, B.E. and Parker, C.W., Radioimmunoassay for Creatine Kinase Isoenzymes, Science, 1976; 194: Van Der Veen, K.J. and Willebrands, A.F., Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera, Clin. Chim. Acta, 1966; 13: Wong, R. and Swallen, T.O., Cellulose Acetate Electrophoresis of Creatine Phosphokinase Isoenzymes in the Diagnosis of Myocardial Infarction, Am. J. Clin. Pathol., 1975; 64: Burger, A., Richterich, R. und Aebi, H., Die Heterogenitat der Kreatin-Kinase, Biochemische Zeitschrift, 1964; 339: Deul, D.H. and van Breeman, J.F.L., Electrophoresis of Creatine Phosphokinase from Various Organs, Clin. Chim. Acta, 1964; 10: Rosalki, S.B., Creatine Phosphokinase Isoenzymes, Nature, 1965; 207: Trainer, T.D. and Gruenig, D., A Rapid Method for the Analysis of Creatine Phosphokinase Isoenzymes, Clin. Chim. Acta, 1968; 21: Henry, R.J. and Cannon, D.C., Ed s, Clinical Chemistry Principles and Techniques, 2 nd Edition, Harper and Row, New York, 1974: