Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN danışmanlığında, Musa KILAVUZ tarafından hazırlanan "Gıdaların hızlı mikrobiyolojik analizlerinde gaz oluşum süresinin beli

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDALARIN HIZLI MİKROBİYOLOJİK ANALİZİNDE GAZ OLUŞUM SÜRESİNİN BELİRLENMESİ Musa KILAVUZ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

2 Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN danışmanlığında, Musa KILAVUZ tarafından hazırlanan "Gıdaların hızlı mikrobiyolojik analizlerinde gaz oluşum süresinin belirlenmesi" adlı tez çalışması 05/10/2007 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı'nda Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof. Dr. Lütfü ÇAKMAKÇI Üye Üye : Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN : Prof. Dr. Ayhan TEMİZ Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi GIDALARIN HIZLI MİKROBİYOLOJİK ANALİZİNDE GAZ OLUŞUM SÜRESİNİN BELİRLENMESİ Musa KILAVUZ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN Bu çalışmada, salça, ketçap, mayonez ve pizza sosu; Lactobacillus sp, maya, koliform grup bakteri (E. coli) ve Bacillus sp. ile belirli konsantrasyonlarda ayrı ayrı kontamine edilmiştir. İnkübasyonlar, bu mikroorganizmaların optimum koşullarında gerçekleştirilmiştir. Kontamine edilen gıda örnekleri, çalışmalarda kullanılan özel Durham tüpü içeren büyük tüp düzeneğinde mikroorganizma kültürlerine uygun besiyeri ile inkübasyona bırakılmış ve bu düzenekteki gaz oluşum sürelerinin seyri, kontamine edilmiş örneklerde standart kültürel yöntemlerdeki koloni oluşum süresi ile karşılaştırılmıştır. Araştırmada gıdalardaki mikroorganizma varlığının belirlenmesi, standart kültürel yöntem ve Özel Durham tüpü içeren düzenek yöntemi ile kıyas edilmiştir. Bu düzenekte gaz oluşumunun belirlenmesi ile mikroorganizma varlığının tespit edilmesi yüksek seviyedeki kontaminasyonlarda daha kısa sürelerde gerçekleşmiştir. Bu sonuç kullanılan düzeneğin zaman olarak standart kültürel yönteme göre daha avantajlı olduğunu göstermiştir. Eşik değerler laktobasil, maya ve koliform için sırası ile salçada 6.22; 6.34 ve 7.28; ketçapta 6.19; 5.80 ve 5.19; mayonezde 3.68; 3.86 ve 4.75; pizza sosunda 4.98; 5.72 ve 5.68 log kob/g şeklinde hesaplanmıştır. Bu değerler, bu düzeydeki kontaminasyonda gaz oluşum süresi ile koloni oluşum süresinin eşit olduğu mikroorganizma sayılarıdır. Bunların üzerindeki kontaminasyonlarda gaz oluşum süresi, altındaki kontaminasyonlarda ise koloni oluşum süresi avantajlı olmaktadır. 2007, 48 sayfa Anahtar Kelimeler: Hızlı yöntemler, laktobasil, maya, koliform, Durham tüpü, gaz oluşum süresi i

4 ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF GAS PRODUCTION TIME FOR RAPID MICROBIOLOGICAL ANALYSIS OF FOODS Musa KILAVUZ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN In this study, tomato paste, ketchup, mayonnaise and pizza sauce were contaminated with Lactobacillus sp., yeast, coliform group bacteria (E. coli) and Bacillus sp. in specified concentrations. Incubations were actualized under the optimum conditions of those microorganisms. Contaminated food samples were incubated with convenient media for the culture of microorganism in the big sized tube apparatus which is containing the special Durham tube used in this study. And also observing period of gas production time in this apparatus, colony constitution time in the contaminated samples was compared with standard cultivation methods. In the study, the dedection of microorganism presence were compared with Standard cultivated method and aparatus method containing special Durham tube. In this aparatus, dedermination of microorganism presence in high level contaminations with the dedection of gas production were actualised in a shorter time. This result showed that used aparatus has much more advantage in terms of time over Standard cultivated method. Activation values of lactobacil, yeast and coliform are calculated as respectively 6.22; 6.34 and 7.28 in tomato paste; 6.19; 5.80 and 5.19 log cfu/g in ketchup; 3.68; 386 and 4.75 log cfu/g in mayonnaise; 4.98; 5.72 and 5.68 log cfu/g in pizza sauce. These values are the number of microorganism found in that level of contamination when gas production time and colony constitution time are equal. For contamination above these levels gas production time has an advantage and moreover for contamination below these levels colony constitution time has an advantage. 2007, 48 pages Key Words: Rapid method, lactobacilli, yeast, coliform, Durham tube, gas production time ii

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarımın ve araştırmalarımın her aşamasında bana yön veren, yardım, öneri ve engin bilgilerini benden esirgemeyerek paylaşan, akademik ortamda olduğu kadar beşeri ilişkilerde de yetişmeme ve gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam Sn. Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN'a, çalışmalarım süresince bilgi ve manevi desteklerini esirgemeyen değerli bölüm hocalarımdan Sn. Prof. Dr. Nezihe TUNAİL, Sn. Prof. Dr. Kamuran AYHAN, Sn. Yrd. Doç. Dr. İbrahim ÇAKIR, Sn. Dr. Şeref TAĞI, Araş. Gör. Sn. Gökçe POLAT ve Doktora öğrencisi Sn. Deniz KOÇAN'a, laboratuvarda birlikte çalıştığım tüm arkadaşlarıma, çalışmalarım süresince birçok fedakârlıklar göstererek beni destekleyen aileme en derin duygularımla teşekkür ederim. Musa KILAVUZ Ankara, Ekim 2007 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... ABSTRACT... TEŞEKKÜR... ŞEKİLLER DİZİNİ... ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Mikrobiyolojik Analizlerin Genel İlkesi Standart Sayım Yöntemleri Metabolizmaya Dayalı Analizler Metilen Mavisi indirgeme testi Empedans ölçümü Gaz oluşumuna dayalı analizler Hızlı Analizler Metabolizmada Gaz Oluşumu Gazın Belirlenmesi MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Mikroorganizmalar Gıda örnekleri Besiyerleri Deney tüpleri Yöntem Mikroorganizmaların aktifleştirilmesi Tüplere gıda ve mikroorganizma ilavesi Gaz oluşum süresinin belirlenmesi Gaz oluşumundaki sayının belirlenmesi Koloni oluşum süresinin belirlenmesi Çalkalamalı inkübasyon Piruvat ilavesi.. 16 i ii iii vi iv

7 3.2.8 Bacillus sp.'de ph ölçümü İstatistik analiz ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Lactobacillus sp.'nin Standart Analizi Salçada Lactobacillus sp.'nin standart analizi Ketçapta Lactobacillus sp.'nin standart analizi Mayonezde Lactobacillus sp.'nin standart analizi Pizza Sosunda Lactobacillus sp.'nin standart analizi Mayanın Standart Analizleri Salçada mayanın standart analizi Ketçapta mayanın standart analizi Mayonezde mayanın standart analizi Pizza sosunda mayanın standart analizi Koliformun Standart Analizi Salçada koliformun standart analizi Ketçapta koliformun standart analizi Mayonezde koliformun standart analizi Pizza sosunda koliformun standart analizi Salçada Bacillus 'un ph' ya Dayalı Analizi Çalkalamanın Etkisi Pirüvat İlavesinin Etkisi Koliforma etkisi Mayaya etkisi SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Spiral plater cihazı ve bu cihazla ekimi yapılmış Petri kutusu 4 Şekil 2.2 Temel metabolik yollar.. 9 Şekil 2.3 Gaz belirlenmesinde Amojel uygulanması. 11 Şekil 3.1 Denemelerde kullanılan tüp düzeneği. 13 Şekil 4.1 Salçada laktobasilin doğrusal grafiği Şekil 4.2 Ketçapta laktobasilin doğrusal grafiği 21 Şekil 4.3 Mayonezde laktobasilin doğrusal grafiği.. 23 Şekil 4.4 Pizza sosunda laktobasilin doğrusal grafiği 24 Şekil 4.5 Salçada mayanın standart analizi 25 Şekil 4.6 Ketçapta mayanın standart analizi. 27 Şekil 4.7 Mayonezde mayanın standart analizi Şekil 4.8 Pizza sosunda mayanın standart analizi. 29 Şekil 4.9 Salçada koliformun standart analizi. 31 Şekil 4.10 Ketçapta koliformun standart analizi Şekil 4.11 Mayonezde koliformun standart analizi 34 Şekil 4.12 Pizza sosunda koliformun standart analizi.. 35 Şekil 4.13 Salçada Lactobacillus sp.'ye çalkalamanın etkisi 39 Şekil 4.14 Salçada koliforma pirüvat ilavesinin etkisi. 41 Şekil 4.15 Salçada mayaya pirüvat ilavesinin etkisi.. 42 vi

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1 Salçada laktobasilin standart analiz sonuçları Çizelge 4.2 Ketçapta laktobasilin standart analiz sonuçları Çizelge 4.3 Mayonezde laktobasilin standart analiz sonuçları Çizelge 4.4 Pizza sosunda laktobasilin standart analiz sonuçları Çizelge 4.5 Salçada mayanın standart analizi Çizelge 4.6 Ketçapta mayanın standart analizi 26 Çizelge 4.7 Mayonezde mayanın standart analizi.. 28 Çizelge 4.8 Pizza sosunda mayanın standart analizi 29 Çizelge 4.9 Salçada koliformun standart analizi. 30 Çizelge 4.10 Ketçapta koliformun standart analizi.. 32 Çizelge 4.11 Mayonezde koliformun standart analizi Çizelge 4.12 Pizza sosunda koliformun standart analizi. 35 Çizelge 4.13 Salçada Bacillus 'un ph' ya Dayalı Analizi Çizelge 4.14 Salçada Lactobacillus sp.'ye çalkalamanın etkisi 38 Çizelge 4.15 Salçada koliforma pirüvat ilavesinin etkisi 41 Çizelge 4.16 Salçada mayaya pirüvat ilavesinin etkisi vii

10 1. GİRİŞ Gıdaların mikrobiyolojik analizinde iki önemli sorun; koloni oluşmasına bağlı olarak analiz süresinin uzunluğu ve sahte negatif sonuçlardır. Petri kutusunda koloni oluşumunun fark edilmesi için gereken süre koliform grup bakterilerde saat iken, küflerde bu süre en az 4 gün olarak verilmektedir. Sayım esaslı testlerde sahte negatif sonuçlar, özelikle düşük mikroorganizma varlığında sıklıkla alınmaktadır. Örneğin, salçaların mikrobiyolojik analizinde standart olarak laktobasil, maya ve küf ile toplam bakteri ekimleri yapılmaktadır seyreltiden Petri kutularına 1'er ml aktardıktan sonra uygun besiyerlerinin ilavesi ve inkübasyon sonunda Petri kutularında herhangi bir koloni gelişmesi olmaması esas alınmakta ve böyle bir sonuçta, analizi yapılan mikroorganizma "yok" olarak kabul edilmektedir. Oysa salçada dolum sırasında 1 kob/g düzeyinde laktobasil bulaşması halinde, analiz sırasında bu salçadan fiilen 0,1 g örnek alınmış olduğu için Petri kutusunda 1 koloni oluşma şansı sadece %10'dur. Bir diğer deyiş ile böylesi bir analizde en iyimser olarak 24 saat sonunda ve sadece %10 olasılıkla tehlikenin farkına varılacak, ancak bu süre içinde üründeki laktobasil, ürünü bozacak düzeye gelecektir. Başta ketçap ve mayonez olmak üzere steril olmayan gıdalara özellikle dolum aşamasında laktobasil, maya ve koliform grup bakteri bulaşması olduğunda bu mikroorganizmalar asitlik vb. koruyucu etmenlere bağlı olarak yavaş ya da hızlı olarak gelişerek gıdayı bozabilmektedir. Salça gibi sadece asitlikle korunan bir gıdaya asidofilik karakterli laktobasil bulaşması halinde salçanın çok kısa bir süre içinde bozulacağı açıktır. Bu gibi sorunlara karşı hızlı analiz yöntemleri üzerinde kayda değer çalışmalar yapılmakta ve çeşitli mikrobiyolojik yaklaşımlara dayalı cihazlar ve/veya sistemler geliştirilmektedir. Bugün için standart kapasitede bir işletme için bu gibi cihazların fiyatlarının yüksekliği yanında sarf malzemesi ile bakım/ onarım giderleri de oldukça caydırıcı olabilmektedir. 1

11 Bu çalışmanın amacı söz konusu 2 soruna farklı bir yaklaşımla çözüm aramaktır. Bu gibi gıdalara bulaşan saprofitlerin büyük bir çoğunluğu gaz oluşturur. İçinde Durham tüpü bulunan sıvı besiyerine 5 g aktarılan salçada örneğin; laktobasil varsa gaz oluşturacak ve oluşan gaz, gözle görülebilecektir. Basit olarak, bulaşan mikroorganizma sayısı ne kadar fazla ise gözle görülebilir gaz oluşumu için gereken süre o denli kısa olacaktır. Bu çalışmanın ilk aşamasında farklı konsantrasyonlarda laktobasil, maya ve koliform grup bakteri aşılanmış salça, ketçap, mayonez ve pizza sosu, tarafımızca geliştirilmiş basit bir sistemde, içinde büyük Durham tüpleri olan ve 45 ml besiyeri içeren büyük tüplere 5'er g olarak aktarılmış ve inkübasyon sonunda gaz oluşum süresi izlenmiştir. Paralel olarak katı besiyerinde koloni oluşum süresi gözlenmiş ve gaz görüldüğü anda katı besiyerine ekim yapılarak mikroorganizma sayısı hangi düzeye eriştiğinde gaz görüldüğü kontrol edilmiştir. İkinci aşamada aynı şekilde hazırlanan tüpler, çalkalamalı inkübatöre konulmuş ve aynı değerlendirmeler yapılarak çalkalamanın etkisi araştırılmıştır. Son aşamada ise gaz oluşumunu hızlandırmak için besiyerine piruvat eklenmiştir. Aynı gıda örneklerinde gaz oluşturmayan bir Bacillus türü için ph düşmesi izlenerek bakteri varlığının belirlenmesi araştırılmıştır. Çalışmanın en zor olan tarafı, konu ile doğrudan ilgili hiç bir kaynağa rastlanmamış olmasıdır. Dolayısı ile elde edilen sonuçlar ağırlıklı olarak kendi içinde değerlendirilmiştir. 2

12 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Mikrobiyolojik Analizlerin Genel İlkesi Mikrobiyolojik analizler temel olarak sayım, var/yok, biyolojik stabilite ve toksin testleri şeklinde uygulanır. Saprofit mikroorganizmaların steril olmayan gıdalarda belirli sayılarda bulunmasına izin verilir. Bu durumda ürünün standartlar içinde olup olmadığının belirlenmesi için izin verilen mikroorganizma grubunun sayılması gereklidir (Halkman ve Ayhan 2000, Anonim 2005). Sayım, sadece saprofit mikroorganizmalar için değil, ürüne göre değişmek üzere Staphylococcus aureus gibi patojen bakteriler için de uygulanabilir. Örneğin; süt ürünleri, kazein ve kazeinatta S. aureus için verilen n; c; m; M değerleri sırası ile 5; 2; 1,0X10 1 kob/g ve 1,0X10 2 kob/g şeklindedir ( /Turk_Gida_Kodeksi/Kodeks_Tebligler/ html 2001). 2.2 Standart Sayım Yöntemleri Mikrobiyolojide geçerli olan yöntem, koloni sayımıdır. Genel olarak yayma, dökme ve damlatma şeklinde 3 sayım şekli varsa da asıl olarak yayma yöntemi kullanılması benimsenir. Gıdadaki hedef mikroorganizma sayısı bu yöntemle belirlenebilecek sayının altında ise dökme kültürel sayım uygulanır. Son zamanlarda 3 adet standart Petri kutusuna eşit olarak 1 ml'nin dağıtılması ve yayılması yanında 14 cm büyük Petri kutularına doğrudan 1 ml aktarılıp yayılması gibi uygulamalar da standartlarda yer almaktadır. Damlatma kültürel sayım ise, günlük analizlerde uygulanmamaktadır (Gürgün ve Halkman 1988). Ekim işleminde basit olarak bir robot kullanılan "Spiral Plater" tekniği uygulamadaki kolaylık nedeni ile giderek yaygınlaşmaktadır. Bu teknikte Petri kutusu dönerken, mikroşırınga ile içeriden dışarıya doğru olmak üzere kültür ekilir. Sonuçta inoküle edilen kültürde ne kadar fazla sayıda mikroorganizma varsa dış yüzeylere doğru o denli 3

13 fazla gelişme olacaktır. Sonuçta standardize edilmiş şablon aracılığı ile örnekteki mikroorganizma sayısı saptanmış olur. Şekil 2.1'de Spiral Plater cihazı ve bu teknikle ekimi yapılmış bir Petri kutusu görülmektedir. Şekil 2.1 Spiral Plater cihazı ve bu cihazla ekimi yapılmış Petri kutusu ( 2000). Hangi yöntemle olursa olsun Petri kutusunda koloni oluşması için belirli bir süre gereklidir. Koliform grup bakterilerde olduğu gibi hızlı gelişen mikroorganizmalarda kolonilerin sayılabilmesi için en az saate gerek varken, küfler ve Rhizobium bakterilerinde bu süre 3-5 gün kadardır. Sonucun alınması için gereken sürenin uzunluğu mikrobiyolojik analizlerin en büyük dezavantajıdır ve bu nedenle hızlı analiz yöntemleri üzerinde çalışılmaktadır. Standart (yayma) yönteminde ideal olarak sıvı gıdalarda kob/ml ve katı gıdalarda kob/g mikroorganizma bulunduğu zaman sağlıklı bir sayım sonucu elde edilir. Steril olmayan çoğu gıda için bu değerler "toplam bakteri" gibi izin verilen sayımlar için geçerlidir. Oysa steril olmasa bile gıdalarda kalite indeksi olarak ele alınan -örneğin koliform grup- bakteriler için bu değerler çok yüksektir. Sayım için sıvı gıdalarda kob/ml ve katı gıdalarda kob/g mikroorganizma bulunduğunda Petri kutusunda gelişen koloni sayısı teorik olarak 10 olacaktır ve bu değer artık güvenilmez sınıra yakındır. Bu durumda dökme kültürel sayım ya da En Muhtemel Sayı (EMS) yöntemi uygulanması, gıdada hedef alınan sayı daha da az ise ve 4

14 eğer gıda uygunsa membran filtrasyon tekniğinin uygulanması gerekir. Bu gibi durumlarda; EMS yönteminde ilk seyreltiden çift kuvvet besiyerine ekim gibi uygulamalar da söz konusudur. 2.3 Metabolizmaya Dayalı Analizler Mikroorganizmanın çeşitli metabolitlerini belirleyerek dolaylı yönden de sayım yapılabilir. Bu analizlerde önceden bir standart hazırlanır ve metabolit üretim süresine göre gıda örneğindeki mikroorganizma sayısı belirlenir. Prensip olarak analiz edilen gıdada hedef mikroorganizma ne kadar fazla ise üretilen metabolitin belirlenmesi için gereken süre o kadar kısa olur. Dolayısıyla metabolizmaya dayalı yöntemler, yoğun mikroorganizma varlığını belirlemek için hızlı analiz yöntemleri olarak da düşünülebilir. Aşağıda konu ile ilgili 3 farklı örnek verilmiştir Metilen Mavisi indirgeme testi Çiğ sütlerdeki bakteri sayısını belirlemek için çok yaygın kullanılmış bir uygulamadır. Basit olarak; çiğ süte metilen mavisi damlatılır ve inkübasyona bırakılır. Çiğ sütte bakteri sayısı ne kadar fazla ise bir seri enzimatik reaksiyon sonunda metilen mavisinin indirgenmesi o denli kısa zaman alır. Çiğ sütlerde paralel olarak kültürel sayım da yapılıp, indirgeme süresi ile bakteri sayısı arasında bir doğrusal denklem grafiği elde edilir. Daha sonra sadece metilen mavisi testi yapıldığında bu denklem kullanılarak çiğ sütteki bakteri sayısı belirlenmiş olur (Jay 1996, Temiz 1996). 5

15 Bu testin en büyük dezavantajları süt içerisinde bulunan farklı mikroorganizma gruplarının farklı enzimatik güçte olabilmeleri ile çiğ süte antibiyotik ya da çeşitli inhibitörlerin varlığında sayım sonuçlarında kayda değer sapmaların olabilmesidir. Sütte az sayıda, ancak enzim üretim gücü yüksek olan bakteriler bulunduğunda sayım sonucu olduğundan çok daha fazla olarak değerlendirilecektir. Bu sorun, çok sayıda örneğin paralel olarak kültürel sayımı ve elde edilen değerlerin istatistik olarak yorumlanması ile kısmen de olsa giderilebilir. Çiğ sütte çeşitli nedenlerle başta antibiyotik olmak üzere çeşitli inhibitör maddeler bulunabilmektedir. Bu gibi maddelerin varlığında çok sayıda bakteri olmasına rağmen bunlar gelişip metilen mavisini indirgeyebilecek kadar enzim üretememekte ve sonuçta indirgeme süresi uzun olduğu için bu sütlerde az sayıda bakteri olduğuna karar verilmektedir. Bu sorun nedeni ile metilen mavisi testi ile benzer şekilde uygulanan resazurin indirgeme testi artık kullanılmamaktadır (Anonim 2005) Empedans ölçümü Her sıvıda bir elektriksel geçirgenlik ve direnç vardır. Gıda örneği sıvı besiyerine ilave edilip, inkübasyona bırakılır. Bu aşamada elektriksel geçirgenlik ölçülür. İnkübasyon boyunca bu sıvı karışımda mikroorganizma gelişmesine bağlı olarak 2 temel değişme olur. Bunlardan birincisi metabolit salgılanması, ikincisi ise besiyerindeki büyük moleküllerin daha küçük moleküllere parçalanmasıdır. Bu değişiklikler, sıvı karışımdaki elektriksel direncin değişmesine de neden olurlar (Harrigan 1998, Wawerla et al 1999). Metilen mavisi indirgeme testinde olduğu gibi, gıda içerisinde ne kadar fazla mikroorganizma varsa değişim o denli kısa olacaktır. Yine, aynı gıda örneğinde paralel olarak yapılan kültürel sayım sonuçları ile bu değerler işlenerek sayım sonucu elde edilebilir (Temiz 1996). 6

16 Empedans ölçümüne dayalı analizin en büyük avantajı farklı selektif sıvı besiyerleri kullanılarak farklı mikroorganizma gruplarının sayımının yapılabilmesidir. Toplam bakteri için genel bir sıvı besiyeri kullanılırken, koliform grup bakteriler, laktobasiller ve maya için selektif besiyerleri kullanılmaktadır (Turantaş ve Ünlütürk 2003, Bell et al 2005). Bu sistemde elektriksel geçirgenlikteki değişimin ölçülmesi doğrudan besiyerine daldırılan elektrotlarla yapılmaktadır. Ancak laktobasillerde olduğu gibi eğer hedef mikroorganizma yeterli bir elektriksel geçirgenlik değişimine yol açamıyorsa (ya da bu değişim sistem tarafından sağlıklı olarak ölçülemiyor ise) dolaylı olarak da analiz yapılabilmektedir. Bu amaçla en çok kullanılan uygulama NaOH olan bir kabın içine elektrotların daldırılması, inkübasyon sırasında ortaya çıkan CO 2 'in bu kap içindeki NaOH ile birleşerek elektriksel geçirgenlikte değişime neden olmasıdır (Rule 1997, Bell et al 2005). Bakım-onarım ile yedek parça ve işletme giderlerinin yüksek olması gibi nedenlerle bu sistem Türkiye'de fazla rağbet bulmamıştır Gaz oluşumuna dayalı analizler Gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren bakterilerin büyük çoğunluğu besiyerinde gelişirken CO 2 oluşturur. Besiyeri olan tüpün içine gaz geçirgen bir ambalajda NaOH çözeltisi ile ph indikatörü olarak bromothymol blue ilave edildiğinde içteki tüpün rengi mavi olur. Analiz edilecek gıda maddesinde bulunan bakterilerin inkübasyon süresinde oluşturdukları gaz, içteki tüpe geçer, NaOH ile birleşerek ph'yı düşürür ve indikatör renk değiştirir. Bu sistemde de gıda maddesinde bakteri ne kadar fazla ise renk değişim süresi o denli kısadır ( sensimedia.html 2007). Gaz oluşumu ile dolaylı bakteri sayımına dayalı hazır tüpler vardır ancak fiyatları yüksek olduğu için günlük kullanımda yeterli rağbet bulmamıştır. 7

17 2.4 Hızlı Analizler Mikroorganizmaya özgü enzimlerin saptanması ile birlikte gerek sayım gerek var/yok testleri için pek çok hızlı yöntem geliştirilmiştir. Gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren en önemli bakterilerden birisi olan E. coli analizlerinde, IMVEC testi yerine 4-Methylumbelliferyl-ß-Glucuronide (MUG) substratının kullanılması ile birlikte IMVEC testleri ile yapılan ve 4 gün süren tanımlamaya büyük ölçüde gerek kalmamıştır (Dogan et al 2002). Yine gıda mikrobiyolojisinde Salmonella, Listeria, Campylobacter, E. coli O157:H7 vb. patojenlerin ve/veya indikatör mikroorganizmaların sayılması/ aranması konusunda pek çok hızlı analiz sistemi geliştirilmektedir. Genetik ve serolojik esaslı pek çok hızlı test yanında robotların kullanılması da giderek yaygınlaşmaktadır (Fung 1997, Notermans 1997, Feng 2001). 2.5 Metabolizmada Gaz Oluşumu Gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren mikroorganizmaların bir kısmı gelişmeleri sırasında gaz oluşturur. Oluşan gaz genellikle CO 2 iken, bazı metabolik yollar sonunda H 2 de ortaya çıkar. Şekil 2.2'de 3 temel metabolik yol özet olarak verilmiştir. Metabolizmadaki substrat parçalanmasının ilk plandaki hedefi enerji kazanılmasıdır. Enerji kazanılmasını mümkün kılan reaksiyonlar ise oksidasyonlardır. Karbohidratlarda bulunan karbon, okside olup hücreyi CO 2 olarak terk eder (Tunail 2003). Substrat dehidrogenasyonu ile ortaya çıkan hidrojenlerin ortamdan uzaklaştırılması, bir başka deyiş ile redükte piridin nükleotidlerin tekrar rejenere olarak işlevlerini sürdürebilmesi için çeşitli bakterilerde değişik yollar vardır. Bunlar, hidrojenleri üzerine alabilecek akseptörlere göre aerob solunum, fermantasyon ve anaerob solunum şeklinde gruplandırılır. 8

18 Şekil 2.2 Temel Metabolik Yollar (MacFaddin 2000) Metabolizmadaki substrat parçalanmasının ilk plandaki hedefi enerji kazanılmasıdır. Enerji kazanılmasını mümkün kılan reaksiyonlar ise oksidasyonlardır. Karbohidratlarda bulunan karbon, okside olup hücreyi CO 2 olarak terk eder (Tunail 2003). Substrat dehidrogenasyonu ile ortaya çıkan hidrojenlerin ortamdan uzaklaştırılması, bir başka deyiş ile redükte piridin nükleotidlerin tekrar rejenere olarak işlevlerini sürdürebilmesi için çeşitli bakterilerde değişik yollar vardır. Bunlar, hidrojenleri 9

19 üzerine alabilecek akseptörlere göre aerob solunum, fermantasyon ve anaerob solunum şeklinde gruplandırılır. Şekerler, genellikle monosakkarit ve bazen disakkarit olarak hücre membranından geçer ve metabolizmaya hekzoslar olarak dâhil olur. Hekzoslar, hücre içinde üç önemli katabolik yoldan birini, değişik koşullar altında bir diğerini izleyerek üç karbonlu bileşiklere (C 3 -iskeletlerine) dönüşürler. Üç karbonlu bileşiklerden pirüvatın diğer metabolik yollarla olan bağlantısı fazla olduğundan metabolizmada özel bir yeri vardır. Madde dönüşüm yolları içinde pirüvat en önemli ara ürün olarak ortaya çıkmaktadır. Pirüvat çok sayıda sentez yollarına bağlanarak çok çeşitli sentez ürünlerinin oluşumuna katılır. Aerob veya anaerob mikroorganizmalarda hekzosların parçalanması pirüvata kadar aynı yolu takip eder (Tunail 2003). Bakteri fermantasyonları sonunda a) laktik asit, b) asetik ve formik asit, c) laktik asit ve etil alkol, d) etil alkol, e) asetoin ve CO 2, f) süksinikten propiyonike kadar asitler ve CO 2, g) CO 2 ve asetondan isopropanole kadar çeşitli bileşikler, h) bütirik asitten bütanole kadar çeşitli bileşikler oluşur. Bu fermantasyon yolları ile birbirinden kesin olarak ayrılan son ürünler oluşmakla birlikte pek çok araştırıcıya göre bakterilerin büyük çoğunluğu alkol fermantasyonu, laktik asit fermantasyonu, propiyonik asit fermantasyonu, karışık asit fermantasyonları ve bütanol fermantasyonundan birisini kullanır (MacFaddin 2000). 2.6 Gazın Belirlenmesi Mikrobiyel gelişme sonunda oluşan gazın belirlenmesi çeşitli şekillerde yapılır. Bunlardan en yaygın kullanılan yöntem, 1898 yılında H.E. Durham tarafından geliştirilen ve ismine izafeten Durham tüpü olarak adlandırılan küçük tüplerin kullanılmasıdır (Fung and Miller 1970). Özellikle koliform grup bakteri analizinde çok yaygın olarak kullanılan bu tüpler, standart deney tüplerine göre daha küçüktür. Ters olarak (tüp boğazı asıl tüpün dibine gelecek şekilde) standart tüpün içine bırakılır, besiyeri ilave edilir, otoklavlama sırasında tüpün içinde kalan hava kendiliğinden çıkar. 10

20 Ekim ve inkübasyon sonrasında oluşan gaz, ters olarak duran Durham tüpü içinde toplanır. Bu şekilde gaz oluşumun belirlenmesi sadece EMS yönteminde koliform bakteri sayımı için değil, başta laktik asit bakterilerinin tanımlanması olmak üzere farklı amaçlarla çeşitli karbohidratlardan gaz oluşumunun saptanması için de kullanılır (MacFaddin 1999, Bell et al 2005). Oluşan gaz, ozmofilik maya sayımında olduğu gibi ekimi yapılan sıvı besiyeri üzerine %2 agar çözeltisi ilavesi ile de belirlenebilir. Bu yöntemde sıvı besiyerinde gelişen maya tarafından oluşturulan gaz, agar katmanını yukarı doğru iter. Salmonella analizinde kullanılan Triple Sugar Iron Agar besiyerinde gaz yarıkları oluşması Salmonella için tipik reaksiyondur (Anonim 2005). Gaz oluşumun belirlenmesi için çeşitli yöntemler üzerinde çalışılmıştır. Bakteri tanımlaması amacıyla Amojel uygulamasında (Şekil 2.2) mikroplate'e ekim yapıldıktan sonra Pastör pipeti ile her kuyucuğa 4 damla Amojel ve mineral yağ karışımı ilave edilmiş ve besiyeri inkübasyon sırasında oluşup, Amojel-mineral yağ karışımı arasında tutulan gaz 10 saat içinde belirlenmiştir (Fung and Miller 1970). A: Asit oluşumu (sarı renk) B: Değişiklik yok (kırmızı renk) C: Asit ve gaz oluşumu (sarı renk) Şekil 2.3 Gaz Belirlenmesinde Amojel Uygulanması (Fung and Miller 1970) Yaygın kullanım alanı olan 3M PetriFilm yönteminde oluşan gaz, üstte bulunan film tabakasındaki jel tarafından tutulmaktadır (Raugel 1999). 11

21 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Mikroorganizmalar Bu çalışmada kullanılan Lactobacillus sp., koliform grup bakteri (E. coli) ve Bacillus sp., Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarı Kültür Koleksiyonundan sağlanmıştır. Maya, bozuk bir salçadan izole edilmiş olup, tanımlanması yapılmamıştır. Bacillus ve Lactobacillus sp. önceki çalışmalarda domatesten izole edilmiş ve tür tanımlaması yapılmamıştır Gıda örnekleri Denemelerde kullanılan salça, ketçap, mayonez ve pizza sosu Ankara piyasasında satış yapan marketlerden sağlanmıştır Besiyerleri Materyal olarak kullanılan şahit mikroorganizmaların analizinde Lactobacillus sp. için MRS Broth (Merck), maya için Sabouraud Dextrose Broth (Merck), koliform grup bakteri için LST Broth (Merck), Bacillus için CASO (Tryptic Soy) Broth (Merck); katı besiyerinde sayımlarda Lactobacillus sp. için MRS Agar (Merck), maya için Sabouraud Dextrose Agar (Merck), koliform için VRB Agar (Merck), Bacillus için CASO Agar (Merck) kullanılmıştır. Tüm besiyerleri 121 o C'da 15 dakika süre ile otoklavlanarak sterilize edilmiştir. İçinde Durham tüpü olan besiyerlerinde önce tüp içinde kalan hava tüp boğazındaki delikten mekanik olarak çıkartılmış, sonra otoklavlanmıştır. 12

22 3.1.4 Deney Tüpleri Denemelerde kullanılan iki çeşit tüpten büyük olanın çapı 3 cm, yüksekliği 15 cm'dir. Bu büyük tüplerin içerisine yerleştirilen ve gaz oluşumunu görmek için misina ile beraber kullanılan özel Durham tüplerinin çapı 1 cm, yüksekliği 10 cm'dir. Bu tüplerin açık ağzının 0,5 cm yukarısında misina bağlamak amacı ile 3 mm çapında delik açılmış ve buraya misina bağlanmış, inokülasyondan sonra misina hafifçe yukarı çekilerek Durham tüpünün besiyeri seviyesinin 1 cm kadar yukarısına çıkması sağlanmıştır. Böylece özellikle salça ve ketçap gibi renkli materyal ile çalışılırken gaz çıkışı izlenebilmiştir (Şekil 3.1). Şekil 3.1 Denemelerde Kullanılan Tüp Düzeneği. Soldan sağa doğru; Misina ile çekilmemiş besiyeri içerisindeki Durham tüpü, Misina ile çekilmiş ve gaz oluşumu gözlenememiş Durham tüpü; Misina ile çekilmiş ve gaz oluşumu gözlenen Durham tüpü 13

23 3.2 Yöntem Mikroorganizmaların aktifleştirilmesi Buzdolabında saklanan mikroorganizmaların stok kültürlerinden yukarıda değinilen sıvı besiyerlerinde ve kendi optimum sıcaklıklarında ayrı ayrı olarak 1 gece boyunca (yaklaşık 16 saat) aktifleştirilmiştir Tüplere gıda ve mikroorganizma ilavesi 45'er ml olan sıvı besiyerlerine her mikroorganizma grubu için ayrı ayrı olmak üzere 5'er g gıda eklenmiş, Durham tüplerine hava girmemesine dikkat edilerek gıda ile besiyeri elle mekanik olarak karıştırılmıştır. Her biri ayrı ayrı aktifleştirilmiş mikroorganizmaların, aktifleştirme besiyerlerinde 10 8 kob/ml düzeyinde olduğu varsayılmış ve inokülümler bu varsayım üzerinden yapılmış, ancak, paralel analiz ile gerçek sayı belirlenmiştir. Kültürlerin standart seyreltmeleri yapıldıktan sonra gıda eklenmiş tüplere kob/g mikroorganizma aralığında olacak şekilde inokülüm yapılmıştır. Buna göre standart analizlerde her gıda ve her mikroorganizma için önce 10 8 'e kadar standart 1:9 seyreltme yapılmıştır. Sonra, içinde 45 ml besiyeri bulunan 8 tüpün her birine 5 g gıda maddesi ile seyreltilerin her birinden ayrı ayrı olarak 5 ml kültür eklenerek gıdada kob/g mikroorganizma varlığı olacak şekilde yapay kontaminasyon uygulanmıştır. Bu amaçla; örneğin salçada laktobasil çalışmasında, 45 ml MRS Broth olan 8 besiyerinin her birine 5 g salça ilave edilmiş, 10 8 /g düzeyindeki yapay kontaminasyon için orijinal tüpten (aktifleştirilmiş orijinal kültür) 5 ml ilave edilerek sanki salçada 10 8 /g laktobasil varmış gibi yapay bir kontaminasyon sağlanmıştır. Aynı şekilde 10 5 /g kontaminasyon için 10 3 seyreltiden ilgili tüpe 5 ml eklenmiştir. 14

24 Aktifleştirilmiş kültürde 10 8 /ml mikroorganizma olduğu sadece varsayımdır. Bu nedenle her çalışmada paralel olarak aktifleştirilmiş kültürdeki gerçek sayı standart yöntemlerle belirlenmiş ve ilgili çizelgelerde bu şekli ile verilmiştir. Özellikle yüksek seyreltme oranlarında (düşük sayıda mikroorganizma içeren tüplerde) bu teorik seyreltme sonunda yapay kontaminasyon her zaman başarılamamış ve ilgili tüplere 1 adet dahi mikroorganizma düşmediği de olmuştur Gaz oluşum süresinin belirlenmesi Her seri analizde tüpler, ilave edilen mikroorganizmanın gelişeceği optimum sıcaklıkta inkübasyona bırakılmış ve tüpler sürekli olarak izlenerek gaz görülen süreler kaydedilmiştir. Bu sürelerin belirlenmesinde gazın, fiziksel olarak gözle fark edildiği en küçük hacim esas alınmıştır Gaz oluşumundaki sayının belirlenmesi Gaz görülen tüpte hangi sayıya erişildiğinde gözle görülebilir gaz oluştuğunun belirlenebilmesi için standart yöntemle kültürel sayım yapılmıştır. Doğal olarak gaz oluşumu ilk olarak en konsantre inokülüm içeren tüpte görülmüş ve gaz görüldüğü anda elde edilen sayım sonuçları ilgili çizelgelerde "Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml)" olarak verilmiştir Koloni oluşum süresinin belirlenmesi İlave edilen her mikroorganizma için gözle görülebilir koloni oluşum süresi belirlenmiştir. Bu amaçla, standart boydaki Petri kutusunda 100 koloni oluşması hedeflenerek aktifleştirilmiş kültürün uygun seyreltisinden ekim yapılmış ve gözle görülebilir koloni oluşması için gereken süre belirlenmiş, ilgili çizelgelerde "kolonilerin gözle fark edilme süresi" olarak verilmiştir. Bu süre, salçada laktobasilin standart 15

25 analizinde kolonilerin tam oluşma süresi iken diğer tüm denemelerde mikrokolonilerin oluşma süresidir Çalkalamalı inkübasyon Mikroorganizmaların sıvı besiyerinde geliştirilmelerinde gelişmenin daha iyi olması için çalkalamalı inkübatör kullanılması önerilmektedir. Özelikle patojen bakteri analizlerinde iyi bir gelişme için çalkalamalı inkübatör kullanılması standartlara geçmiştir (Anonymous 1998, Halkman vd. 2001, gov/ora/ 2004). Yeterli bir mikrobiyel gelişme sonucunda daha fazla ve bir anlamda daha kısa sürede gözle görülebilir gaz oluşumu sağlanacağı açıktır. Buna bağlı olarak bu çalışma kapsamında sadece salçada Lactobacillus sp. için yukarıda açıklandığı şekilde hazırlanan ve inoküle edilen tüpler 120 d/d çalkalama hızında inkübasyona bırakılmıştır. Ayrıca çalkalama sırasında oksijen girişinin daha fazla olarak sağlanması amacı ile tüpler çalkalamalı inkübatöre 45 o açı ile yerleştirilmiş ve gaz çıkışı bu pozisyonda değerlendirilmiştir Piruvat ilavesi Yukarıda (2.5 bölümünde) piruvatın gaz oluşumu üzerinde etkisi verilmiştir. Buna göre denemeler kapsamında sadece salça ve laktobasil ile maya için ilgili besiyerlerine 2 g/l konsantrasyonda sodyum piruvat eklenerek gaz oluşumu üzerindeki etkisi araştırılmıştır Bacillus sp. 'de ph ölçümü Materyal olarak kullanılan Bacillus sp. ile çalışılırken ilgili besiyerinde (CASO Broth) yeterli bir gaz oluşumu gözlenmediği için ph değişimi ile gelişmenin ölçülmesi 16

26 araştırılmıştır. Bacillus sp.'nin gelişmesine bağlı olarak ph'da değişme olacağı açıktır. Diğer denemelerden farklı olarak Bacillus sp. için belirli sürelerde ph değişimi izlenmiştir İstatistik analiz İstatistik analizler çift yönlü varyans analizi ile yapılmıştır. Bu amaçla SPSS 11.0 Production Facility for Windows XP Profesional sürümü bilgisayar programı kullanılmıştır. 17

27 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA İzleyen ilgili bütün bölümlerde tekerrürler çizelgelerde gösterilmiş, çizelgelerdeki ortalama kolonlarında basit aritmetik ortalama alınmış, şekillerde sadece ortalamaların doğrusal grafikleri gösterilmiştir. Şekillerde regresyon formülü ile korelasyon katsayısı (R 2 ) değerleri de verilmiştir. Konuyla doğrudan ilgili kaynak yetersizliği nedeni ile bulgular kendi içinde tartışılmıştır. 4.1 Lactobacillus sp.'nin Standart Analizi Salçada Lactobacillus sp.'nin standart analizi Salçada laktobasilin standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.1'de ve 3 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.1'de verilmiştir. Çizelge 4.1 Salçada laktobasilin standart analiz sonuçları Salçadaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tek. 2. Tek. 3. Tek. Ort. 1. Tek. 2. Tek. 3. Tek. Ort. 7,90 8,14 8,00 8, ,90 7,14 7,00 7, ,90 6,14 6,00 6, ,90 5,14 5,00 5, ,90 4,14 4,00 4, ,90 3,14 3,00 3, ,90 2,14 2,00 2, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 8,44 9,01 8,90 8,78 18

28 10 8 Salça/ Laktobasil y = x R 2 = log kob/g dakika Şekil 4.1 Salçada laktobasilin doğrusal grafiği Çizelge 4.1'den izlendiği gibi aktifleştirilmiş kültürde varsayılan 10 8 kob/ml sayıya oldukça yakın inokülümler elde edilmiştir. En yüksek inokülümde ortalama 757 dakikada (12 saat 37 dakika) gaz görülmüştür. Bu aşamada tüpteki sayı 8,78 log kob/g'dır. Başlangıç inokülümünün 8,01 log kob/g olduğu dikkate alınırsa 757 dakikada sayı sadece 0,77 log kob/ml artmıştır. İkinci sıradaki yüksek inokülümde 838 dakikada gaz oluşmuştur. Bu tüpte de 8,78 log kob/g bakteri olduğu varsayılırsa 81 dakikada (1 saat 21 dakika) ilk tüple olan 1 log kob/g fark kapatılmıştır. Bu verilerden laktobasilin 1 gece aktifleştirilmiş olmakla birlikte oldukça uzun bir lag fazı geçirdiği düşünülebilir. Şekil 4.1'deki doğrusal grafik formülünden gaz görülen her hangi bir anda başlangıç sayısının ne olduğu ya da belirli bir başlangıç sayısında kaç dakikada gaz görüleceği hesaplanabilir. Örneğin; 1200 dakikada (20 saat) gaz görülürse başlangıç sayısının 4,89 log kob/ml olduğu ya da başlangıç sayısının 2,5 log kob/ml olması hâlinde gaz oluşumunun 1546 dakika (25 saat 46 dakika) sonra görülecektir. R 2 değerinin 0,9783 olarak elde edilmesi başlangıç sayısı ile gaz oluşum süresi arasında çok yüksek bir korelasyonun olduğunu göstermektedir. MRS Agar besiyerinde laktobasil 1016 dakikada (16 saat 56 dakika) belirgin koloni oluşturmuştur. Buna göre sadece 10 8 ve 10 7 log kob/g başlangıç inokülümü olan örneklerde zaman açısından gaz oluşumu koloni oluşumundan daha kısa sürede 19

29 belirlenebilmektedir. Salçada 10 8 ve 10 7 log kob/g laktobasil kontaminasyonun çok yüksek olduğu açıktır. Bu durumda gaz oluşumuna bağlı olarak laktobasil varlığının belirlenmesi yöntemi ileride tekrar tartışılacaktır. Yukarıda bölümde de belirtildiği gibi bu seride belirgin koloni oluşma süresi esas alınmıştır. Mikrokoloni oluşturma süresi bundan daha kısadır. Dolayısı ile salçada 10 8 ve 10 7 log kob/g gibi çok yüksek başlangıç inokülümü olması hâlinde dahi bu sistemin yararlı olmayacağı söylenebilir Ketçapta Lactobacillus sp.'nin standart analizi Ketçapta laktobasilin standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.2'de ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.2'de verilmiştir. Çizelge 4.2 Ketçapta laktobasilin standart analiz sonuçları Ketçaptaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 8,16 9,26 8, ,16 8,26 7, ,16 7,26 6, ,16 6,26 5, ,16 5,26 4, ,16 4,26 3, ,16 3,26 2, ,16 2,26 1, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 9,14 8,80 8,97 20

30 10 8 Ketçap/ Laktobasil y = x R 2 = log kob/ml dakika Şekil 4.2 Ketçapta laktobasilin doğrusal grafiği Çizelge 4.2. 'den görüldüğü gibi ketçapta laktobasilin standart analizinde 2. tekerrürde 9,26 log kob/ml ile varsayılan 10 8 log kob/ml'nin 1,26 log üzerinde bir değer elde edilmiştir. Tüm denemeler boyunca başka hiç bir aşamada laktobasil için böyle yüksek bir inokülüm elde edilmemiştir. Birinci ve ikinci tekerrür arasında >1 log kob/g başlangıç inokülüm farkı olmakla beraber, en yoğun kontaminasyon düzeyinde gaz görülmesi her iki tekerrürde de 535 dakika (8 saat 55 dakika) olmuştur. Bu çalışmada dikkat çeken konu, 2. tekerrürdeki yoğun kontaminasyonun neden olduğu gaz oluşturma süresinin, 1. tekerrüre göre beklendiği şekilde önde gitmesi iken, düşük kontaminasyon düzeyinde tersine bir sonuç elde edilmesidir. Daha da ilginç olarak 2 tekerrür ortalamasından elde edilen Şekil 4.2'de görüldüğü gibi R 2 = 0,9733 gibi yüksek bir korelasyon elde edilmesidir. Ketçapta şeker bulunması nedeni ile salçaya göre daha düşük belirleme süreleri elde edilmesi doğaldır ve nitekim Çizelge 4.1 ile Çizelge 4.2 beraberce incelendiğinde böyle bir sonuç elde edilmektedir. 21

31 Çizelge 4.2'ye göre laktobasil kolonileri ortalama 722 dakika (12 saat 2 dakika) süre içinde belirlenmiştir. Buna göre ancak çok yoğun kontaminasyonlarda gaz oluşturma testi ile laktobasil varlığının belirlenmesi koloni oluşmasına karşı avantajlıdır Mayonezde Lactobacillus sp.'nin standart analizi Mayonezde laktobasilin standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.3'te ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.3'te verilmiştir. Çizelge 4.3'teki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Çizelge 4.3 Mayonezde laktobasilin standart analiz sonuçları Mayonezdeki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 7,97 8,07 8, ,97 7,07 7, ,97 6,07 6, ,97 5,07 5, ,97 4,07 4, ,97 3,07 3, ,97 2,07 2, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 9,12 9,37 9,25 22

32 log kob/g Mayonez/ Laktobasil dakika 1050 y = x R 2 = Şekil 4.3 Mayonezde laktobasilin doğrusal grafiği Bu çalışmada tekerrürler arasındaki fark ketçapa göre daha azdır. R 2 değeri ise 0,9911 olarak hesaplanmıştır. Mayonezde laktobasilin gaz oluşturma süresi salça ve ketçaptan daha kısadır ve daha dolayısı ile daha düşük başlangıç kontaminasyonları, koloni oluşturma süresinden daha önce belirlenebilmektedir. Tersine olarak, gaz görüldüğü andaki sayı, salça ve ketçaptan daha fazladır Pizza sosunda Lactobacillus sp.'nin standart analizi Pizza sosunda laktobasilin standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.4'de ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.4'de verilmiştir. Çizelge 4.4'deki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Bu seri çalışmada, dakikalık kısa süreler içinde aniden ve 2,5-3 ml gibi fazla miktarda gaz oluşumu dikkat çekmiştir. Bununla beraber R 2 değeri 0,9799 gibi çok yüksektir. Koloni oluşum süresine bağlı olan analize kıyasla sadece yüksek başlangıç kontaminasyonları avantajlıdır. 2. tekerrürün 10 7 seyreltmesinde (8. tüp) teorik olarak 1,16 log kob/g bakteri olması gerekirken, bu tüpte 48 saat sonunda gaz oluşumu izlenmemiştir. İlk tekerrürde aynı seyreltme için 1525 dakika (25 saat 25 dakika) sürede gaz oluşmuş iken bu tüpte 48 23

33 saat sonunda gaz oluşmaması ancak "bu tüpe 1 adet dahi canlı bakteri aşılanmamıştır" şeklinde yorumlanabilir. Çizelge 4.4 Pizza sosunda laktobasilin standart analiz sonuçları Pizza Sosundaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 8,16 8,16 8, ,16 7,16 7, ,16 6,16 6, ,16 5,16 5, ,16 4,16 4, ,16 3,16 3, ,16 2,16 2, ,16 1,16 1, > * Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 8,87 8,80 8,84 * : 48 saat sonunda gaz oluşmayan tüp, ortalamaya dâhil edilmemiştir. Pizza sosu/ Laktobasil 10 log kob/g 8 6 y = x R 2 = dakika Şekil 4.4. Pizza Sosunda Laktobasilin Doğrusal Grafiği 24

34 4.2 Mayanın Standart Analizleri Salçada mayanın standart analizi Salçada mayanın standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.5'te ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.5'te verilmiştir. Çizelge 4.5'teki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Çizelge 4.5 Salçada mayanın standart analizi Salçadaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 6,57 6,69 6, ,57 5,69 5, , , ,57 3,69 3, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 6,85 6,95 6,90 Salça/ Maya 8 y = x R 2 = log kob/g dakika Şekil 4.5 Salçada mayanın standart analizi (Ortalama) Laktobasil ile genel olarak kıyaslandığında mayada daha az sayıda canlı hücre olduğunda gaz belirlenmektedir. Bu seride ortalama 950 dakikada (15 saat 50 dakika) 25

35 koloni oluşumu gözlenmiştir. Buna göre sadece 10 6 kob/g ve daha yoğun kontaminasyonlarda koloni oluşumuna göre gaz testi daha kısa sürede maya kontaminasyonunu göstermektedir. Salçada maya denemesinde R 2 = 0,9429 korelasyon katsayısı maya kontaminasyon düzeyi ile gaz oluşum süresi arasında kuvvetli bir ilişkiyi göstermektedir Ketçapta mayanın standart analizi Ketçapta mayanın standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.6'da ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.6'da verilmiştir. Çizelge 4.6'daki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Çizelge 4.6 Ketçapta mayanın standart analizi Ketçaptaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 7,26 7,06 7, ,26 6,06 6, ,26 5,06 5, ,26 4,06 4, ,26 3,06 3, ,26 2,06 2, ,26 1,06 1, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 7,35 7,11 7,23 26

36 log kob/g Ketçap/ Maya y = x R 2 = dakika Şekil 4.6 Ketçapta mayanın standart analizi (Ortalama) Ketçapta mayanın standart analizinde tekerrürler arasındaki inokülüm farkı yakındır. Koloni oluşturma süresi ile kıyaslandığında sadece yüksek kontaminasyon düzeylerinde gaz oluşturma süresine göre analiz avantajlı hale gelmektedir. Bu seride de R 2 = 0,9863 ile söz konusu iki değişken arasında yüksek bir ilişki olduğu görülmektedir Mayonezde mayanın standart analizi Mayonez de mayanın standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.7'de ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.7'de verilmiştir. Çizelge 4.7'deki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Yukarıda "4.1.4 Pizza sosunda laktobasilin standart analizi" bölümünde düşük kontaminasyon düzeyinde tüpe "1 adet dahi canlı hücrenin geçmediği" şeklinde bir yorum yapılmıştır. Söz konusu analizde 1,16 log kob/g ve 5 g sos üzerinden teorik olarak tüpte bulunması gereken sayı 72 kob/tüp olması gereklidir. Bu serinin 2. tekerrüründe -0,38 log kob/g ve yine 5 g hesabı ile tüpe aktarılan canlı hücre sayısı teorik olarak sadece 2 kob/tüp düzeyindedir ve bu inokülasyon düzeyinde, analiz yapılan seri ile uyumlu sonuç alınmıştır. Nitekim R 2 =0,9677 gibi yine yüksek bir korelasyon katsayısı vardır. 27

37 Çizelge 4.7 Mayonezde mayanın standart analizi Mayonezdeki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 6,02 5,62 5, ,02 4,62 4, ,02 3,62 3, ,02 2,62 2, ,02 1,62 1, ,02 0,62 0, ,02-0,38-0, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 6,99 7,04 7, Mayonez/ Maya y = x R 2 = log kob/g dakika Şekil 4.7 Mayonezde mayanın standart analizi (Ortalama) Koloni oluşturma süresi ile kıyaslandığında bu seride de sadece yoğun kontaminasyon düzeyleri, gaz analizi açısından avantajlı görülmektedir. 28

38 4.2.4 Pizza sosunda mayanın standart analizi Pizza sosunda mayanın standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.8'de ve 2 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.8'de verilmiştir. Çizelge 4.8'deki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Çizelge 4.8 Pizza sosunda mayanın standart analizi Pizza Sosundaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 1. Tekerrür 2. Tekerrür Ortalama 7,07 7,41 7, ,07 6,41 6, ,07 5,41 5, ,07 4,41 4, ,07 3,41 3, ,07 2,41 2, ,07 1,41 1, Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dakika): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 7,43 7,33 7,38 Pizza sosu/ Maya y = x log kob/g R 2 = dakika Şekil 4.8 Pizza sosunda mayanın standart analizi (Ortalama) 29

39 Pizza sosunda mayanın standart analizinde standart sonuçlar alınmıştır. Bir diğer deyiş ile yine koloni oluşturma süresine göre sadece yoğun kontaminasyon düzeylerinde gaz oluşturma testi avantajlıdır ve R 2 = 0,9858 ile yine yüksek bir korelasyon elde edilmiştir. 4.3 Koliformun Standart Analizleri Salçada koliformun standart analizi Salçada koliformun standart gaz oluşum analizi ile yapılan test sonuçları Çizelge 4.9'da ve 7 tekerrür ortalamasının doğrusal grafiği Şekil 4.9'da verilmiştir. Çizelge 4.9'daki sayı ortalamaları logaritmik değerleri üzerinden basit ortalama ile hesaplanmıştır. Çizelge 4.9 Salçada koliformun standart analizi Salçadaki Sayı (log kob/g) Gaz Oluşum Süresi (dakika) 1.T. 2.T. 3.T. 4.T. 5.T. 6.T. 7.T. Ort. 1.T. 2.T. 3.T. 4.T. 5.T. 6.T. 7.T. Ort. 8,93 8, , ,52 8,33 8, ,93 7,57 7,86 7,26 7,54 7,52 7,33 7, ,93 6,57 6,86 6,26 6,54 6,52 6,33 6, ,93 5,57 5,86 5,26 5,54 5,52 5,33 5, ,93 4,57 4,86 4,26 4,54 4,52 4,33 4, ,93 3,57 3,86 3,26 3,54 3,52 3,33 3, ,93 2,57 2,86 2,26 2,54 2,52 2,33 2, ,93 1,57 1,86 1,26 1,54 1,52 1,33 1, ,93 0,57 0,86 0,26 0,54 0,52 0,33 0, ,07-0,43-0,14-0,74-0,46-0,48-0,67-0,43 > >2880 > * Kolonilerin gözle fark edilme süresi (dak): Gaz oluştuğu anda 1. tüpteki sayı (log kob/ml): 8,88 8,79 8,36 8,40 8,54 7,51 8,33 8,40 *: ortalamada >48 saat dikkate alınmamıştır. 30