YOTİK K DUYARLILIK TEST YÖNTEMLERY NTEMLERİ. Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD

Transkript

1 ANTİBİYOT YOTİK K DUYARLILIK TEST YÖNTEMLERY NTEMLERİ Dr Nuri ÖZKÜTÜK Celal Bayar Üniversitesi Tıp T p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD MANİSA

2 Tüberküloz ile savaşta en etkili yol; Hastalarının n erken saptanması Etkili tedavisi İle bulaş zincirinin kırılmask lmasıdır. Sorun; Artan ilaç direncinin nin etkin tedaviyi zorlaştırma rması

3 DSÖ nün ÇİD D TB prevelansının yüksek olduğu bölgelerde önerisi; DOTS-plus Standart ilaç tedavisi verilmemesi, Antibiyotik duyarlılık k test sonuçlar larına göre özgün tedaviler düzenlenmesid Gerektiğinde inde sekonder ilaçlar ların kullanılmas lması

4 CDC (Centers for Disease Control and Prevention) Her hasta içini in kültürde izole edilen ilk M.tuberculosis izolatına duyarlılık k testi Üç aylık k tedaviden sonra, kültür r pozitifliği i devam eden veya klinik yanıts tsızlığı olan her hastada testin tekrarı

5 Mikobakteriyel Duyarlılık k Test YöntemleriY Konvansiyonel yöntemler Direnç oranı yöntemi Mutlak konsantrasyon yöntemi Proporsiyon (orantı) yöntemi Genotipik (Moleküler) yöntemler DNA dizi analizi Reverse hibridizasyon testi (Line probe Assay) RNA/RNA mismatch analiz Heterodubleks analiz SSCP (Single strand conformation polymorphism) Real-time PCR DNA microarray PCR-ELISA Kültüre dayalı hızlı yöntemler BACTEC 460 TB MGIT 960 Versa TREK (ESP II) BacT/Alert 3D (MB/BACT) Kültüre dayalı diğer yöntemler Disk elüsyon E test Kolorimetrik yöntemler Mycolor-TK Resazurin (Alamar mavisi) MTT Canlı bakteri varlığına dayalı yöntemler Flow sitometri Lusiferaz taşıyıcı faj yöntemi Faj çoğaltma yöntemi

6 Proporsiyon (orantı) ) Yöntemi: Y Sık k kullanılan lan güvenilir g bir yöntemdir. y Bakteri suşu ilaçlı ve ilaçsız z b.y.lerineb ekilir Yüksek ve düşük d dilüsyonlu inokulumlar kullanılarak larak sayılabilir koloniler elde edilir K I K I R E R E

7 İlaçlı b.y.. ded üreyen koloni sayısı İlaçsız b.y.. de üreyen koloni sayısı %1 (KP) R

8 Besiyeri Lowenstein-Jensen (LJ) Uzun süre saklanabilir Ekonomiktir Koagülasyon işlemi sırasında ilaç büyük oranda inaktive olur CLSI tarafından önerilmemektedir. Middlebrook 7H10-7H11 Raf ömrü kısa Pahalı Daha kısa sürede (21 gün) Daha güvenilir sonuç verir CLSI, MD7H10 besiyerinde yapılan proporsiyon test yöntemini y referans yöntem y olarak kabul etmektedir. (Agar( Proporsiyon Yöntemi)

9 Proporsiyon yöntemi Direkt test Dekontamine ve konsantre edilmiş, ARB pozitif örnek kullanılır. İndirekt test Primer kültürde üremiş,, saf bakteri kolonileri kullanılır.

10 Avantajları; Direkt test Daha kısa k sürede s sonuç verir (3 hf) Hastanın n bakteriyel populasyonundaki dirençli bakteri oranını daha iyi gösterirg Dezavantajları İnokulumu doğru ayarlamak k zor Kontaminasyon Non-tüberk berküloz mikobakteriler Önerildiği i durumlar İlaç direncinin yüksek y olduğu u bölgelerdeb lgelerde, Dirençli TB den şüphelenildiği i durumlarda. Sonuçlar indirekt testle doğrulanmal rulanmalıdır. r.

11 Avantajları; İndirekt test Primer kültürde üremiş ve tanımlanm mlanmış saf bakteri kolonisi kullanılır. İnokulum standardizasyonu kolaydır. Standart yöntem y olarak kabul edilmektedir Dezavantajları; Daha geç sonuç verir Primer kültürde yetersiz üreme varsa hastadaki dirençli basil oranını tam yansıtmayabilir.

12 Kritik Proporsiyon (KP) Hastada doğal dirençli mutantlar bulunur ur Dirençli olanların n oranı KP sınırının s üzerinde ise; ilacın n tedavide etkili olamayacağı ğı, İlaç ile dirençli bakterilerin seçilece ileceği i düşünülürd Proporsiyon yönteminde amaç; KK da dirençli olan bakterilerin KP un üzerinde olup olmadığı ığını saptamaktır. Kritik Proporsiyon genelde %1 LJ de bazı ilaçlar ların KP u %10 (SM( SM,, ETH vs.)

13 Kritik Konsantrasyon (KK) İlaç-yöntem-besiyeri etkileşimleri imleri sonucu ulaşı şılmış ve standardize edilmiş değerdir. erdir. Bu u konsantrasyonlarda bakterinin üremesi engelleniyor ise ilacın n o bakteriye etkili olduğu söylenebilir. Yönteme ve besiyerine göre KK farklılığı ığı İlacın, bazb azı besiyeri komponentlerine farklı oranlarda bağlanma lanması ve absorbsiyonu Besiyerinin hazırlanmas rlanması sırasında değişik ik oranlarda inaktivasyonu asyonu, Yeterli üreme için i in gerekli olan süres rede değişik ik oranlarda inaktivasyonu asyonu

14 Önerilen kritik konsantrasyon ve kritik proporsiyonlar. Antitüberküloz ilaç 7H10 KK (μg/ml) KP (%) KK (μg/ml) KP (%) LJ İzoniazid (INH) Rifampisin (RİF) Streptomisin (SM) Ethambutol (EMB) Pirazinamid (PZA)* 50.0? Amikasin (AMK) Kapreomisin (KAP) Kanamisin (KAN) Etyonamid (ETH) Klofazimin (CLF) Sikloserin (CYC) Ofloksasin (OFL) PAS

15 Test edilen suşunun dirençli yada duyarlı olduğuna una KK da karar verilir. Bazı ilaçlar ların n yüksek y konsantrasyonunun da test edilmesi önerilir. INH 0.2μg/ml (KK) R düşük düzeyde INH 1.0μg/ml S direnç Bu durumda INH ın tedavi rejiminde yer alması yararlı olabilir.

16 Test edilecek ilacın n seçimi Önce primer ilaçlar lar test edilmeli. Primer ilaçlara lara karşı test edilen izolat; RİF e dirençli veya Diğer primer ilaçlardan lardan en az ikisine dirençli ise Sekonder ilaçlara lara karşı + EMB nin yüksek konsantrasyonuna karşı test edilmeli

17 Çalışılacak paneli her toplum kendi belirlemeli. li. Kararda etkili faktörler; hizmet verilen hasta populasyonu, toplumdaki ilaç direncinin prevelansı, ilaç direnci görüldg ldüğünde ek testlerin gerektirdiği i süres toplumda uygulanan ilaç rejimleri Örnek; Toplumda tek başı şına PZA direnci nadir ise Test edilecek primer ilaçlar lar paneline PZA dahil edilmeyebilir.

18 CLSI a göre Primer İlaçlarlar İzoniazid Rifampisin Etambutol Pirazinamid Sekonder ilaçlar lar Streptomisin Kapreomisin Etionamid Kanamisin Ofloksasin Rifabutin Ülkemizde Primer İlaçlarlar İzoniazid Rifampisin Etambutol Streptomisin

19 Kültüre dayalı hızlı yöntemler CDC; örnek kabul edildikten sonra 30 gün g n içinde i inde primer ilaçlara lara karşı duyarlılık k sonuçlar ları rapor edilmeli. Bu amaçla CLSI; FDA in de onayladığı bazı hızlı,, sıvıs besiyerinde kültüre dayalı ticari sistemlerin kullanılabilece labileceğini ini kabul etmiştir. tir. BACTEC 460 TB, MGIT 960, Versa TREK (ESP II)

20 Fakat; Hızlı ticari sistemlerde elde edilen sonuç, Test edilen izolatın herhangi bir ilaca karşı dirençli olduğunu unu gösteriyorsag steriyorsa, Kararsız z kalınm nmışsa Standart agar proporsiyon yöntemi ile testin tekrarı, Tekrar sırass rasında İNH ın yüksek konsantrasyonunun da test edilmesi önerilmiştir

21 BACTEC 460 TB (BectonDickinson) Yarı otomatize,, radyometrik BACTEC 12B besiyeri 14 C işaretli palmitik asit içerir i 14 C işaretli palmitik asit kullanımı 14 CO 2 Üreme İndeksi (GI)

22 Duyarlılık k testi, izolat ilaçlı ve ilaçsız şişelere ekilir. ilaçsız şişeye 100 kat dilüe inokulum ekilir. ilaçsız z ve ilaçlı şişelerdeki günlg nlük k GI artışı (ΔGI) karşı şılaştırılır. r. İlaçlı şişe ΔGI Kontrol şişesi ΔGI DİRENÇLİ İlaçlı şişe ΔGI < Kontrol şişesi ΔGI DUYARLI Günlük GI Gün Kontrol SM INH RIF EMB ΔGI

23 MGIT 960 (BectonDickinson) Tam otomatize,, radyometrik olmayan MGIT tüpün t n dibindeki silikon içine i ine floresan madde gömülüdür. Floresan madde sıvıs besiyerindeki oksijen varlığı ığına duyarlıdır. r. Üreyen mikobakterilerce oksijenin kullanılma ması ile floresans verir

24 Duyarlılık k testi, İlaçsız z tüpteki t üreme (1/100) ile ilaç içeren tüplerdeki t üremenin karşı şılaştırması esasına dayanır. MGIT 960 cihazı; floresansı sürekli izler, sonuçlar ları otomatik olarak yorumlar, dirençli ya da duyarlı olarak verir.

25 VersaTREK (ESP Culture System II) (Trek Diagnostic Systems) Tam otomatize,, sürekli s monitorize sistem Sıvı besiyeri üzerindeki boşlukta oluşan gaz basıncı değişiklikleri iklikleri ölçülerek değerlendirme erlendirme yapılmaktad lmaktadır Duyarlılık k testi,, antibiyotiksiz ve antibiyotikli şişelerdeki üremenin karşı şılaştırılması esasına dayanır.

26 Duyarlılık k Test Sonuçlar ları Geciktirilmeden bildirilmelidir. Her bir ilacın n adı ve sonucun yorumu mutlaka belirtilmelidir. (R-S)( CLSI alt komitesi; kullanılan lan yöntem y ve besiyeri; kullanılan lan konsantrasyonlar ve referans yönteme eşdee değer er karşı şılıkları, direnç oranının belirtilmesini önermektedir.

27 Teşekkürler Tulipa orphanidea (Manisa lalesi)