Parkinson Hastalığında Metilasyon Durumu ve Nörodejeneratif Belirteçler. Methylation Status and Neurodegenerative Markers in Parkinson Disease

Transkript

1 Clinical Chemistry 55:10, (2009) Genel Klinik Kimya Parkinson Hastalığında Metilasyon Durumu ve Nörodejeneratif Belirteçler Methylation Status and Neurodegenerative Markers in Parkinson Disease Rima Obeid, 1* Achim Schadt, 1 Ulrich Dillmann, 2 Panagiotis Kostopoulos, 2 Klaus Fassbender, 2 and Wolfgang Herrmann 1* GİRİŞ: Plazma total homosistein (thcy) konsantrasyonlarında artış demans, inme ve Parkinson hastalığı (PD) gibi yaşla ilişkili hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Metilasyon durumu Parkinson hastalarında homosistein metabolizmasını nörodejeneratif proteinlerle bağlantılandırabilir. YÖNTEMLER: Seksen yedi Parkinson hastasından (yaş ortalaması: 68 yıl; 35 i erkek) alınan kan örneklerini total homosistein, metilmalonik asit (MMA), Folat, Vitamin B 12, Vitamin B 6, S-Adenosil Metiyonin (SAM), S-Adenosil Homosistein (SAH) ve amiloid-β (1 42) açısından test ettik. Trombositten zengin plazma hazırlamak için 45 hasta alt grubundan alınan kan örneklerini sitratlı tüplere koyup amiloid öncülü protein (APP) için hücre ekstraktları hazırlama ve α sinüklein analizleri gerçekleştirme amacıyla yıkanmış trombositleri kullandık. Elli dokuz hasta alt grubunda siyah cevherdeki (substantia nigra) ekojenik alanı hesaplamak için beyin parankim sintigrafisini kullandık. BULGULAR: Parkinson hastalarında serum total homosistein konsantrasyonları artmıştı (ortalama: 14,8 µmol/l). Homosistein ( β katsayısı = -0,276) ve serum kreatinini (β = -0,422) plazmada SAM/SAH oranının önemli öngörüsel faktörleriydi (P < 0,01). Plazma SAM/SAH oranı DemTect skorlarının önemli bir belirleyicisiydi (β = 0.612, P = 0.004). Plazma SAH ve trombosit APP veya SAM ve α-sinüklein konsantrasyonları arasında önemli negatif korelasyonlar mevcuttu. Siyah cevherde daha geniş bir ekojenik alan daha yüksek MMA konsantrasyonlarıyla ilişkiliydi (P = 0.016). SONUÇLAR: Nörodejenerasyon belirteçleri (APP, α-sinüklein Parkinson hastalarında metilasyon belirteçleriyle ilişkilidir. Daha iyi bir bilişsel fonksiyon daha yüksek metilasyon potansiyeliyle (SAM/SAH oranı) ilişkiliydi American Association for Clinical Chemistry Alzheimer hastalığından (AD) 3 sonra Parkinson hastalığı (PD) en sık görülen ikinci nörodejeneratif hastalıktır. Beynin siyah cevher bölgesinde dopaminerjik nöronların kaybı Parkinson hastalarında bir dönüm noktasıdır. Hastalığın ikinci temel belirtisi hücre içi inklüzyon cisimciklerinin bol miktarda bulunan bir sinaptik terminal proteini olan α- sinükleinden zengin Lewy cisimcikleri ve Lewy nöronları) varlığıdır. (1). Parkinson hastalarında plazma total homosistein (thcy) konsantrasyonlarında artış olduğu bildirilmiştir (2, 3). Parkinson hastalarında homosisteindeki artış esasen folat ve B 12 vitamin durumuna ve PD semptomlarını gidermek için kullanılan tedaviye bağımlıdır. Artmış total homosistein daha kötü bir bilişsel durum (4), duyusal nöropati (5) ve depresyonla ilişkilendirilmektedir. L-dopa (L-3,4- dihidroksi fenilalanin) ile tedavi edilen Parkinson hastalarında hiperhomosisteinemi (HHCY) çok sık görülmektedir. L-dopa, bir S-adenosil metiyonin (SAM)-bağımlı enzim olan kateşol-o-metil transferazla (COMT) metilasyona uğramaktadır. L-dopa tedavisine başladıktan sonra Parkinson hastalarının total homosistein konsantrasyonlarında önemli bir artış olmaktadır (7). Hayvan çalışmaları L-dopa nın serebral SAM ın tükenmesine (%36-76 arasında), S-adenosil homosistein (SAH) konsantrasyonlarında ise belirgin bir artışa neden olduğunu göstermiştir(8). Metil grubu (metiyonin, kolin) vericilerini içeren besinlerin alımına devam edildiği takdirde L-dopa ile tedavi edilen hastalarda SAM için daha yüksek talepler daha bol miktarda endojen SAM ın yeniden sentezlenmesini gerektirebilmektedir. Ayrıca Alzheimer hastalığı anormal miktarda amiloid-β ile ilişkilendirilmektedir. 1 Department of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2 Department of Neurology, University Hospital of Saarland, Homburg, Germany. * Address correspondence to these authors at: University Hospital of Saarland, Department of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Gebäude 57, D Homburg/Saar, Germany. Fax ; rima. obeid@uniklinikum-saarland.de, kchwher@uniklinikum-saarland.de. Received February 11, 2009; accepted July 9, Previously published online atdoi: /clinchem Nonstandard abbreviations: AD, Alzheimer disease; PD, Parkinson disease; thcy, total homocysteine; HHCY, hyperhomocysteinemia; L-dopa, L-3,4-dihydroxyphenylalanine; COMT, catechol- O-methyltransferase; SAM, S-adenosyl methionine; SAH, S-adenosyl homocysteine; APP, amyloid-p precursor protein; ER, endoplasmic reticulum; MMA, methylmalonic acid; UPDRS, Unified Parkinson s Disease Rating Scale; MMSE, Mini-Mental Status Examination; PLP, pyridoxal5-phosphate; holotc, holotranscobalamin; MAO, monoamine oxidase; PCK, protein kinase C; PIMT, isoaspartyl methyl transferase; MAP, mitogen-activated protein; UPS, ubiquitin proteasome system 1852

2 Metilasyon ve Nörodejenerasyon Alzheimer hastalığında amiloid β öncül proteininden (APP) oluşturulmuş amiloid-β hücre içi ve hücre dışı arada birikerek amiloid plaklarına yol açmaktadır. Diğer taraftan Parkinson hastalığı bir α-sinüklein birikimiyle ilişkilidir. α-sinüklein nöron hücrelerinin presinaptik uçlarında ekspresse edilmiş 140 amino asitlik bir peptit dir. α-sinükleinin fizyolojik rolü tam olarak bilinmemekle birlikte bu proteinin nörotransmitter salımınını düzenlediği, endoplazmik retikulum (ER)/Golgi trafiğine katıldığı (9) veya sinaptik veziküllerle zayıf bir ilişki içinde olduğu varsayılabilir. Alzheimer hastalarının yaklaşık %15 25 inde α-sinükleinden zengin Lewy cisimciğine benzer inklüzyonlarla karakterize motor yetmezlik gelişmektedir (10). Son zamanlarda beyinleri içinde Lewy cisimcikleri bulunan hastalarda amiloid-β ve α-sinüklein arasında doğrudan bir etkileşim bildirilmiştir (11).Lewy cisimcikleri APP içerir (11).Lewy cisimcikleri içinde amiloid-β ve α sinükleinin oluşması birikimlerinin karşılıklı patolojik durumlarla ilişkili olabildiğini düşündürmektedir. Siyah cevherin pars compacta sında endotel hücresi çekirdeklerinin arttığı bildirilmiştir(12). Ayrıca vasküler yoğunluktaki değişiklikler homosistein ve metilmalonik asid (MMA) gibi toksinlerin nöronun hasar görebilmesine katkıda bulunabilmektedir. Parkinson hastalarında metabolik durumun olasılıkla α- sinüklein ve β-amiloid gibi bazı fonksiyonel proteinlerin birikmesini artırarak nörodejenerasyon u destekleyebildiğini varsaydık. Bu varsayımı test için plazma β-amiloid (1-42) konsantrasyonları ve trombositlerden izole edilmiş APP ve α-sinükleinle ilişkili SAM ve SAH gibi plazma metilasyon belirteçlerini ölçtük. Ayrıca siyah cevherdeki ekojenik alanla kan parametreleri arasındaki ilişkiyi araştırdık. Katılımcılar ve Yöntemler Çalışma 87 Parkinson hastasını (yaş ortalaması 68 yıl, 35 i erkek) kapsamıştır. Hastalar Saarland Üniversite Hastanesi Hareket Bozuklukları Merkezinden çağrılmıştır. Çalışma katılımcılarının tümünden bilgilendirilmiş onam alınmıştır Çalışma Saarland Üniversite Hastanesi Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. UPDRS (Unified Parkinson s Disease Rating Scale [Parkinson hastalığı Birleştirilmiş Değerlendirme Ölçeği]) III. Kısım (motor ölçek) kullanarak her hastanın fiziksel durumunu, Mini- Mental Muayene (MMSE) ve DemTect skorlarıyla global bilişsel durum işlevselliğini ölçtük. Çalışmaya alınmama kriterleri serum kreatininin µmol/l üstü olarak tanımlanan böbrek disfonksiyonu, B vitamini takviyesi alma veya son 3 ay içinde bir serebral veya koroner olay geçirmiş olma şeklindeydi. Yaş, Parkinson hastalığının süresi, sigara kullanımı, diyabet, depresyon, demans ve Parkinson hastalığı için kullanılan ilaçlara ait bilgiler toplanmıştır. Tok deneklerden alınan kan örnekleri EDTA antikoagülanı içeren tüplere konmuştur. Otuz dakika içinde kan 2000 devirde 10 dakika santrifüje edilmiştir. EDTA lı plazma (500µL), 50 µl 1N asetik asitle muamele edilerek, karıştırılmış ve SAM ve SAH analizleri için -80 o C de saklanmıştır. Ayrıca, trombositlerin ayrımı için 45 hastayı kapsayan bir alt gruptan kan toplayıp sitrat antikoagülanı ile muamele ettik. Sitratlı kan hemen 200 devirde 10 dakika santrifüje edilmiştir. Trombositten zengin plazma aspire edilmiş, trombositler iki kez PBS ile yıkanmış ve yıkanmış trombositler hemen APP ve α-sinüklein analizlerinden önce-80 o C de dondurulmuştur. Hücreleri; 500 µl ekstraksiyon tamponu çözeltisinde (10 mmol Tris, ph 7.4, 100 mmol NaCl, 1mmol EDTA, 1 mmol EGTA, 1 mmol NaF, 20 mmol Na 4 P 2 O 7, 2 mmol Na3VO 4, %1 Triton X-100, %10 gliserol, %0,1 SDS, %0,5 dezoksikolat, 1 mmol/l fenilmetilsülfonil flörür) ve bir proteaz inhibitör kokteylinde (Roche Diagnostics) eriterek trombosit ekstraktları hazırladık. Trombosit ekstraktı kısa aralarla 5 kez onar saniye sonikasyona tabi tutulmuştur. Bisinkiyonik asit çözeltisiyle (Sigma) birlikte % 4 CuSO 4-5H 2 O kullanılarak hücre ekstraktları içindeki total protein konsantrasyonlarını ölçtük ve kalibrasyon eğrisi için BSA yı kullandık. Biomol ve BioSource den elde edilen reaktifler kullanılarak trombosit ekstraktlarında sırasıyla APP ve α-sinüklein konsantrasyonlarını ölçtük.app analizi için yakalayıcı antikor insan APP sinin N- uç bölgesini, deteksiyon antikoru ise amiloit-β peptidin N-uç bölgesini tanımaktadır. O halde bu ELISA çözünebilir APPs α (amiloidojenik olmayan APP) APP70, 751 (çözünebilir APP), APP733 ve APP 695 i saptamaktadır. APP695 esasen beyin dokularında bulunurken (13), APP770 ve APP751 izoformları trombositlerde bol miktardadır (14).α-sinükleini saptayan kit, fosforilasyon durumundan bağımsız olarak total α sinükleini tanımaktadır. Kırk beş hastayı kapsayan bir alt kümede trombosit belirteçleri bulunmuştur. Trombosit belirteçlerini bir hücre ekstraktları tüm böleninde ölçülen proteine göre ayarladık. Innogenetics in yüksek duyarlılıklı ELISA testiyle serumda amiloid-β (1 42) konsantrasyonlarını ölçtük. İzotop işaretli iç standartlarıyla GC-MS kullanılarak serumda total homosistein, sistatiyon ve MMA konsantrasyonlarını ölçtük(15). LC-MS/MS kullanılarak Gellekink ve arkadaşlarına göre hafifçe modifiye edilmiş yöntemle EDTA lı plazmada SAM ve SAH konsantrasyonlarını (16) ve bir kemilüminesans immün analizle (Advia Centaur System) serumda total B 12 vitamini ve folat konsantrasyonlarını ölçtük. Immundiagnostik ten (holotc) alınan reaktiflerle bir flöresans detektörle bağlantılı HPLC ile plazma B 6 ve Axsym in otomatik yöntemini kullanarak serum holotranskobalamin (holotc) konsantrasyonlarını ölçtük. Elli dokuz hastada siyah cevherde doku ekojenisitesini göstermek için bir ultrasonografik teknik olarak beyin parankim sonografisinden Clinical Chemistry 55.10, (2009) 1853

3 yararlandık. Parkinson hastalığında siyah cevherin dejenerasyonunu saptamada bu yöntemin güvenilir ve tanısal olarak duyarlı olduğu kanıtlanmıştır (17). Bu değişken yarı-kantitatif bir parametre olduğundan hastaları siyah cevherdeki ekojenik alanlara göre 3 gruba ayırdık: siyah cevherde ekojenik alanları > 0,22 cm 2 (n= 27), 0.22 cm 2 (n=24) veya bulguları kesin olmayanlar (n=8). Son grup her iki yanda siyah cevherin ölçümünü imkânsızlaştıran yetersiz temporal kemik penceresi olan hastaları içermekteydi. Çalışmaya alınma sırasında hastaların hiçbiri B vitaminleri kullanmamaktaydı. SPSS nin 16.0 sürümü kullanılarak istatistiksel analizleri gerçekleştirdik. Sürekli değişkenler ortanca ( ) yüzdelikler olarak ifade edilmiştir. Ortalamalar arasındaki farklılıkları ANOVA ve post hoc Tamhane testleriyle karşılaştırdık ve tek değişkenli analizler kullanarak ortak değişkenler için düzeltmeler gerçekleştirdik. Verilerin normal dağılımını gerektiren testleri uygulamadan önce verilere logaritmik dönüşüm uygulanmıştır. Spearman testi kullanılarak farklı değişkenler arasındaki korelasyonları değerlendirdik. Şekil 1 de üç grup DemTect skorları [<9 (n=13); 9 12 (n=21);>12 (n = 53)] kullanılmıştır. Hastalar arasında DemTect skorlarında ve SAM/SAH oranlarındaki değişkenleri öngörebilen bağımsız değişkenler için aşamalı, retrograt regresyon analizleri uyguladık. P<0,05 değerinin istatistiksel açıdan anlamlı olduğu düşünülmüştür. Bulgular Bu makalenin sanal ortamdaki sürümüne eşlik eden Ek Tablo 1 de hastaların ana özellikleri ve eşlik eden ilaçlar gösterilmektedir.total homosistein veya ilişkili metabolitler üzerine sigara, antidepresanlar, monoamino oksidaz (MAO) inhibitörleri veya diyabetin herhangi bir etki göstermediğini saptadık (gösterilmemiş veriler). Tablo 1, Parkinson hastalarının tümünde, ve Parkinson hastalığının tedavisinin tipine göre ölçümlenen biyokimyasal belirteçlerin konsantrasyonlarını göstermektedir.. Bir doamin alan hastalar L-dopa ve bir agonistle birlikte L-dopa alanlara göre daha gençti (yaş ortalamaları sırasıyla 61, 74 ve 69 yıl). Ayrıca, Parkinson hastalığının en kısa ve en uzun tedavi süreleri sırasıyla dopamin agonistleri (ortalama 2,5 yıl) ve agonist-l-dopa kombinasyonuyla (ortalama 8.0 yıl) gerçekleşmişti. Yalnızca L-dopa tedavi grubunda ortalama plazma SAH konsantrasyonu en yüksek (ortalama: 17,2 nmol/l), yalnızca agonist tedavisi ile en düşük (ortalama: 12,7 nmol/l) düzeydeydi. L-dopa ile tedavi edilen hastalarda en yüksek SAH, MMA ve total homosistein ve en düşük holotc konsantrasyonları ve SAM/SAH oranı L-dopa ile daha yaşlı hastaların (ortalama: 74 yıl) ve daha uzun süreli hastalığın tedavi edilmesiyle ilişkiliydi. Şekil 1. DemTect skorlarına göre plazma vitamin B6 ve SAM/SAH oranları (ortalama yüzdelikler) [<9 (n = 13); 9 12 (n = 21); >12 (n = 53)]. Tedavinin tipi, yaş ve hastalığı süresine göre düzeltmeler yapıldıktan sonra en düşük ve en yüksekdemtect skor gruplar arasındaki farklılığın P değerleri B 6 vitamini için 0,013 ve SAM/SAH oranı için 0,024 idi.. SAH, MMA, total homosistein ve SAM/SAH konsantrasyonları açısından gruplar arasında farklılıklar yaş ve hastalığın süresine göre düzeltmeler yapıldıktan sonra kaybolmuştur (P > 0.05). Yalnızca veya COMT inhibitörü kombinasyonu alan katılımcılarda thcy, MMA, SAH, SAM gibi biyolojik belirteçleri ve vitaminlerin (B 6, B 12, holotc ve folat) konsantrasyonları ve SAM/SAH oranları denk düzeylerdeydi (gösterilmemiş veriler). Şekil 1 de gösterildiği gibi bilişsel fonksiyonları normal Parkinson hastaları (DemTect skorları > 12) (ortalama B 6 vitamini 48,4 nmol/l ve SAM/SAH : 9,0 ) plazma B 6 vitamin konsantrasyonları ve SAM/SAH oranları DemTect skorları <9 olanlara (ortalama B 6 vitamini: 26,1 nmol/l ve SAM/SAH 6,7) göre anlamlı derecede daha yüksekti Bilişsel durumu hafifçe kötüleşmiş hastalarda ( DemTect skorları: 9-12) B 6 vitamini SAM/SAH oranları ara düzeylerdeydi. Tedavinin tipi, yaş ve hastalığın süresine göre düzeltmeler yapıldıktan sonra en düşük ve en yüksek DemTect skor grupları arasındaki farklılık B 6 vitamini (P = 0,013) ve SAM/SAH oranı (P = 0,024) açısından önemli olmayı sürdürmüştür Clinical Chemistry 55:10, (2009)

4 Metilasyon ve Nörodejenerasyon Tablo 1. Parkinson hastalarının tümünde ve tedaviye göre hesaplanan belirteçler. a Belirteçler Tümü Dopamin agonisti L-dopa L-dopa artı dopamin agonisti n P (ANOVA) b Yaş, yıl 68 (54 78) 61 (52 69) 74 (62 80) c 69 (56 79) c <0,001 PD süresi, yıl 5 (0 12) 2,5 (0 10) 4 (0 15) 8 (3 15) c <0,001 DemTect skorları 14 (7 18) 15,5 (10,9 18,0) 13,0 (3,0 18,0) 12,5 (7,0 17,5) 0,092 thcy, Amol/L 14,8 (9,4 23,2) 13,3 (7,6 19,3) 16,4 (11,0 23,5) c 15,4 (10,5 24,6) 0,047 Cys, nmol/l 260 ( ) 238 ( ) 234 ( ) 277 ( ) 0,780 MMA, nmol/l 261 ( ) 218 ( ) 337 ( ) c 283 ( ) 0,032 Folat, nmol/l 19,0 (8,9 38,1) 20,7 (10,8 42,4) 21,2 (12,7 45,9) 15,7 (7,8 32,3) 0,094 Vitamin B12, pmol/l 236 ( ) 253 ( ) 239 ( ) 235 ( ) 0,932 HoloTC, pmol/l 43 (22 96) 44 (23 78) 35 (20 192) 48 (23 97) 0,867 Vitamin B6, nmol/l 43,7 (15,7 121,0) 43,7 (15,7 121,0) 49,5 (11,1 119,4) 34,0 (10,8 149,7) c 0,019 SAH, nmol/l 13,6 (9,8 28,3) 13,6 (9,8 28,3) 17,2 (11,3 32,9) c 13,7 (10,0 26,2) 0,005 SAM, nmol/l 124 (93 173) 124 (93 173) 133 (96 204) 122 (87 168) 0,394 SAM/SAH oranı 8,7 (5,5 13,3) 8,7 (5,5 13,3) 7,8 (5,5 11,4) c 8,4 (5,4 11,2) c 0,005 Siyah cevher ekojenik alan, cm 2 0,23 (0,13 0,48) 0,19 (0,12 0,36) 0,34 (0,10 0,63) 0,26 (0,13 0,50) 0,079 PlTsit alfa-sinüklein, Ag/L 20,5 (11,8 36,1) 25,1 (14,3 57,5) 20,6 (10,4 33,0) 20,4 (12,3 32,6) 0,173 Trombosit APP, Ag/L 700 ( ) 595 ( ) 551 ( ) 741 (0 1418) 0,289 Plazma amiloit-9, ng/l 26,9 (24,0 29,6) 25,8 (23,7 28,7) 25,7 (23,5 31,1) 27,8 (24,8 29,7) 0,705 Kreatinin, Amol/L 88,4 (61,9 114,9) 79,6 (61,9 99,0) 84,0 (61,9 132,6) 88,4 (61,9 112,3) 0,180 a Veriler ortanca değerleri göstermektedir ( yüzdelikler) b Yaş ve hastalığın süresine göre düzeltmeler yaptıktan sonra P değerleri: thcy (P = 0,970), MMA (P = 0,889), vitamin B6 (P = 0,196), SAH (P = 0,164) ve SAM/SAH (P = 0,426). Toplam hücresel belirteçler için düzeltilmiş trombosit belirteçleri.dört hasta ne L-dopa ne de dopamin agonistleri almıştır c P <0,05 dopamin agonistleri alan grupla karşılaştırıldığında. Ayrıca, DemTect skorları plazma amiloidi ile negatif bir korelasyon göstermiştir (1 42) (Spearman korelasyon katsayısı r = -0,45, P< 0,001). Çalışma hastalarının DemTect skorlarını öngörmek için aşamalı retrograt regresyon analizleri uyguladık (sanal ortamda Ek Tablo 2, model 1). Bu analize dahil edilen faktörler içinde yalnızca SAM/SAH oranı (β = 0,612, P = 0,004) DemTect skorlarının önemli bir öngörüsel faktörüydü. Plazma SAM/SAH oranının önemli öngörüsel faktörleri (2. model) total homosistein konsantrasyonları (β = -0,276, P < 0.001) ve serum kreatinin (β= -0,422, P =0,001) konsantrasyonları olmuştur (sanal ortam Ek Tablo 2). Plazma SAH konsantrasyonu trombosit APP ile Spearman korelasyon katsayısı r = -0,41, P = 0,007) (Şekil 2A), plazma SAM ı ise trombositler içindeki α- sinüklein ile (r = -0,32, P = 0.033) negatif bir korelasyon göstermiştir (Şekil 2B). İlaveten trombosit APP ve plazma amiloid β (1-42) P(1 42) (r = -0,34, P = 0,028), APP ile α sinüklein de (r = -0.35, P = 0.031) negatif bir korelasyon göstermiştir. Aksine plazma amiloid-β (1 42), trombositler içindeki α- sinüklein konsantrasyonlarıyla pozitif bir korelasyon içindeydi (r = 0,42, P = 0,005). Plazma SAM ve SAH ((r = 0,63, P< 0,001) arasında da bir korelasyon saptanmıştır. Ayrıca, folat ve B 6 vitamini konsantrasyonları da pozitif bir korelasyon göstermiştir (r = 0,60, P < 0,001). Şekil 3, plazma amiloid-β (1-42) üçte birlik dilimlerine göre folat, B6 vitamini, thcy, SAH konsantrasyonları ve SAM/SAH oranlarını göstermektedir. Şekil 3 de amiloit-β üçte birlik dilimleri (<25,8, 25,8 27,8, >27,8 ng/l) kullanılmıştır. Amiloidβ nın (1-42) en alt üçte birlik dilimindeki hastalara göre plazma amiloid-β nın (1-42) en üst dilimlerinde bulunan hastalarda total homosistein ve SAH konsantrasyonları anlamlı derecede daha yüksek, folat, B 6 vitamini Clinical Chemistry 55.10, (2009) 1855

5 Şekil 2. (A), Plazma SAH ve trombositler içindeki APP arasındaki korelasyon (B), Plazma SAM ve trombositler içindeki α- sinüklein arasındaki korelasyon konsantrasyonları ve SAM/SAH oranı daha düşüktü. Ancak en alt üçte birlik dilimde olanlara göre amiloitβ nin en üst üçte birlik dilimindeki hastalar daha yaşlı ( yaş ortalamaları sırasıyla 63 ve 72 yıl), ve daha uzun süreli Parkinson hastasıydı (3,5 ve 6,0 yıl), Bu nedenle en üst dilimdekilerin L-dopa dopamin agonisti tedavisi görme olasılığı daha yüksekti. Yaş, hastalığın süresi ve tedavinin türü için düzeltmeler yapıldıktan sonra en yüksek ve en düşük amiloit-β üçte birlik dilimleri arasında folat (P = 0,005) ve B 6 vitamini (P = 0,014) konsantrasyonlarında hâlâ anlamlı farklılıklar mevcuttu. En düşük üçte birlik dilimde (P = 0,078) total homosistein azalma eğiliminde olduğu gibi SAH ve SAM/SAH oranı artık önemli değildi (SAH için P = 0,114, SAM/SAH oranı için P = 0,103). Tablo 2 siyah cevherdeki ekojenik alana göre kan belirteçlerini göstermektedir. Siyah cevherde daha geniş bir ekojenik alan daha yüksek plazma MMA (236 vs 351 nmol/l, P = 0,016) konsantrasyonlarıyla ilişkiliydi. B 12 vitamini durumunun diğer belirteçleri (total B 12 vitamini ve holotc), total homosistein veya metilasyon belirteçleriyle böyle bir korelasyon mevcut değildi. Kreatinin ve tedavinin türü için düzeltmeler yapıldıktan sonra 2 grup arasında MMA konsantrasyonları arasındaki farklılık hâlâ anlamlıydı (P = 0.036). Tartışma Yaşlılarda Alzheimer ve Parkinson hastalığı sırasıyla demans ve hareket bozukluklarına yol açan önde gelen nörodejeneratif hastalıklardır. Parkinson hastalarının beyinlerinde karakteristik olarak alfa-sinükleinden zengin inklüzyonları içeren Lewy cisimcikleri bulunmaktadır. Ayrıca, Parkinson hastalarında demans ve amiloitten zengin plaklar gelişebilir. Bu örtüşen bozukluklar amiloid-β ve α-sinükleinin ilişkili olabildiğini düşündürmektedir. (18). Lewy cisimcikleri içinde amiloid-β ve α-sinükleinin bulunması birikmiş olmalarının ortaklaşa patolojik durumlar neden olabildiklerini de düşündürmektedir. Hipometilasyon olasılıkla APP ekspresyonunu veya amiloit-β ya hidrolizini hızlandırarak (19) nörodejenerasyona katılabilmektedir (19). Bu çalışmada nörodejeneratif proteinlerin (APP ve α -sinüklein) konsantrasyonlarıyla metil vericisi, SAM veya or the metiltransferaz inhibitörü SAH arasında bir ilişkinin varlığını gösterdik. Bu çalışmada Parkinson hastalarında total homosistein konsantrasyonları önceki çalışmalarda bildirilenlere benzemekteydi (3).Bu çalışmada tedavi yaklaşımının metabolizma belirteçler üzerine etkisi doğrulanamamıştır. Diğer taraftan total homosistein, MMA ve SAH konsantrasyonları yalnızca L-dopa tedavisi görenlerde diğer tedavi gruplarına göre, daha yüksekti Ancak, bu farklılıklar olasılıkla tedavi grupları arasındaki yaş farklılıklarıyla ilişkili olabilirdi. (Tablo1). Diğer taraftan l-dopa ile tedavi edilen hastalarda SAM dan kaçınma veya total homosisteini düşürmede COMT inhibitörlerinin önemli bir role sahip olduğunu saptayamadık. L-dopanın tetiklediği HHCY i önlemede COMT inhibitörlerinin rolüne ilişkin sonuçların çelişkili olması (20 22),bu etkinin bazal vitamin durumu gibi başka faktörlere bağlı olabildiğini düşündürmektedir. Plazmada metilasyonun bir göstergesi (SAM/SAH oranı) olarak total homosistein konsantrasyonları önemli bir öngörüsel faktördü.ilaveten plazma SAM ve 1856 Clinical Chemistry 55: 10, (2009)

6 Metilasyon ve Nörodejenerasyon thcy, µmol/l SAH, nmol/l SAM/SAH oranı < >27.8 Plazma amiloit- β 1 42) (ng/l) Şekil 3. Plazma amiloit-β üçte birlik dilimlerine göre B vitaminleri ve ilişkili metabolizma belirteçlerinin (ortanca yüzdelikler) konsantrasyonları (1 42). En düşük plazma amiloit β (1-42) üçte birlik dilimlerine göre anlamlı (P < 0.05). Yaş, hastalığın süresi ve tedavinin tipine göre düzeltmeler yapıldıktan sonra folat ve B vitamini (P < 0,05), için P değerleri anlamlı (P < 0,05) olup total homosistein (P = 0,078), ve SAM/SAH a (P = 0,103).yönelik bir eğilim saptanmıştır. SAH konsantrasyonları arasındaki pozitif korelasyon (r = 0.63) SAH ın artışıyla birlikte SAM ın da arttığını ve sonuçta total homosistein katabolizmasının etkinsizleştiğini akla getirmektedir. Parkinson hastaları için SAM/SAH oranı Dem Tect skorlarının önemli bir pozitif öngörüsel faktörüydü (sanal ortamda Ek Tablo 2). Yaş, hastalığın süresi yaş, hastalığın süresi ve tedavinin türü için düzeltmeler yapıldıktan sonra bilişsel fonksiyon skorlarıyla plazma SAM/SAH oranı arasındaki ilişkinin sebat etmiş olması bazı nörodejeneratif süreçlerde metilasyonun bir rolü olduğunu düşündürmektedir. (Şekil 4). DemTect skoruyla B 6 vitamini arasındaki ilişki yaş, hastalığın süresi ve Parkinson hastalığı tedavisi yaklaşımından bağımsız olması B 6 vitamini düzeylerindeki iyileşmenin Parkinson hastalarında bilişsel durumun kötüleşmesini geciktirebildiğini # # # Vitamin B 6, nmol/l Folat, nmol/l # düşündürmektedir. Parkinson hastalarında glutatyon dopaminerjik nöronlarda bulunan önemli bir antioksidandır. Ayrıca oksidatif stres Parkinson hastalığındaki dejeneratif süreçle ilişkilidir (23). B 6 vitamini Vitamin B6 sistatiyon β sentaz ve sistatiyon gama liyaz yoluyla total homosisteinin glutatyonun bir öncülü olan sisteine doğrudan dönüşümünü hızlandırmaktadır(24). Vitamin B 6 eksikliği oksidatif stresi tetiklemekte, 1-karbon metabolizmasındaki birkaç enzimi etkileyerek dolaylı yoldan glutatyonun azalmasına neden olmaktadır (25). İlaveten, B 6 vitamini folatı klatabolize eden bir enzim olan serin hidroksimetil transferazın bir kofaktörüdür. Bu fenomen B 6 vitamininin aynı zamanda dolaylı yoldan total homosisteinin atılmasını hızlandırarak homosisteinin yeniden metilasyonu için ortamda folatın bulunmasını sağladığı anlamına gelmektedir. Bu son öneri folat ile B 6 vitamini arasında saptadığımız direkt korelasyonla uyumludur (r = 0.60, P < 0.001). Parkinson hastalarında B 6 vitamini ve folatın olası koruyucu rolü B 6 vitamini veya folatla amiloid-β (1-42) arasındaki negatif korelasyonların varlığı gösteren verilerle desteklenmektedir. (Şekil 3). Topluca bu veriler B 6 vitamininin beyni amiloid-β birikiminden, oksidatif stresten ve dopamin yetersizliğinden koruyabildiğini, böylece bilişsel yetinin azalmasını geciktirdiğini düşündürmektedir. Plazma amiloid-β(1-42) konsantrasyonları nörodejeneratif hastalıkları olanlarda artmıştır(26). Bu proteinin nöronlardaki APP den oluştuğu ve kan-beyin bariyerini geçerek kana ulaştığı düşünülmektedir. Nöronların APP eksprese etme (28) ve amiloid-β oluşturma gibi birkaç özelliği trombositlerinkine benzemektedir (27). Bu nedenle trombositler içinde eksprese edilen serebral proteinlerin incelenmesi ilginç bir yaklaşımı temsil etmektedir. APP, β ve gama sekretazlar (Presenilin-1) tarafından β yolağında hidroliz olabilerek sırasıyla sapp β ve amiloid-β yı oluşturmaktadırlar. Alternatif ve nonamiloidojenik bir yolak α ve δ sekretazlar tarafından düzenlenmekte ve sapp α ve P3 oluşmaktadır. Metil inhibitörü SAH ve trombosit APP si (Şekil 2) ile trombosit APP sinin plazma konsantrasyonları arasındaki negatif korelasyonun SAH ın amiloidojenik yolağı hızlandırabilerek APP nin amiloid-β ya (1 42) hidrolizini teşvik ettiği varsayımını desteklemesi ilginç bir durumdur. Hipometilasyon, Presenilin-1 geninin ekspresyonundaki artış yoluyla amiloid-β üretiminin artışıyla ilişkili olabilmektedir. (30). Plazma amiloidi-β (1-42) ile trombositlerdeki amiloidojenik olmayan APP arasındaki tersinir korelasyon (r = 0,34, P = 0,028) amiloidojenik yolağı destekleyen, SAH artışı gibi metabolizma koşulları altında daha fazla amiloid-β (1-42) üretimi olduğunu düşündürmektedir. Clinical Chemistry 55: 10, (2009) 1857

7 Tablo 2. Siyah cevherdeki ekojenik alana göre değişkenler. a Belirteç Siyah cevherde ekojenik alan Siyah cevherde ekojenik alan <0.22 cm 2 >0.22 cm 2 P (ANOVA) n Yaş, yıl 63 (9,0) 67 (8,3) 0,123 Hastalığın süresi, yıl 4,5 (4,4) 6,0 (7,4) 0,120 DemTect score 14 (3) 14 (5) 0,246 Kreatinin, µmol/l 81,6 (11,3) 91,8 (21,6) 0,099 thcy, µmol/l 14,0 (3,2) 15,8 (10,8) 0,207 MMA, nmol/l b 236 (107) 351 (544) 0,016 Folat, nmol/l 19,2 (16,1) 17,9 (13,1) 0,614 HoloTC, pmol/l 47 (19) 48 (73) 0,676 Vitamin B12, pmol/l 232 (70) 251 (102) 0,385 Vitamin B6, nmol/l 51 (104) 46 (46) 0,616 SAM/SAH oranı 9,2 (2,1) 8,4 (2,5) 0,249 L-dopa artı dopamin agonisti, n (%) 8 (33) 13 (48) Dopamin agonisti, n (%) 14 (58) 5 (18,5) L-dopa, n (%) 2 (8) 9 (33) a Aksi belirtilmedikçe veriler geometrik ortalama (SS) şeklinde ifade edilmiştir.. b P = 0,036 serum kreatinin için düzeltme yaptıktan sonra Hipometilasyon durumunda fosfolipit metabolizmasındaki bozukluk muhtemel bir oluş mekanizmasını temsil edebilir. Fosfatidiletanolaminin metillenmiş bir ürünü olan fosfatidilkolin düşüklüğü protein kinaz C yi (PKC) azaltarak APP nin daha fazla oranda amiloit-β ya dönüşmesine yol açmaktadır (31) (Şekil 4). α-sinüklein Parkinson hastalarındaki nörodejenerasyonuna katılan önemli bir proteindir. α sinüklein dopaminerjik sinir iletisinde rol oynamaktadır. Bu protein dopamin biyosentezini ve homeostazı düzenlemektedir(32). α-sinüklein trombositler içinde eksprese edilmektedir. Plazma SAM ve trombosit α- sinüklein konsantrasyonları arasındaki tersinir korelasyon bu çalışmanın ilginç bir bulgusudur (Şekil.2). İki olası açıklama mevcuttur. Birincisi, kısıtlı SAM varlığının α-sinüklein geninin ekspresyonunu artırabildiği şeklindedir. HHCY, DNA hipometilasyonuyla ilişkilendirilmiştir(33). Homosistein ve metilasyon bozukluklarının çok sık görüldüğü (35) kronik alkolizmde (34) α-sinükleine ait mrna nın artmış olduğu saptanmıştır. İkincisi α- sinüklein dahil olmak üzere yaşlı veya stresle hasarlanmış proteinlerde SAH izoaspartil kalıntılarının onarımından sorumlu olan SAM a bağımlı bir enzimi, örneğin izoaspartil metiltransferazı (PIMT) inhibe edebilmektedir(36). PIMT, trombositlerin içinde eksprese edilmektedir(37). Bir metil grubu yetersizliğinin hayvan modelinde, düşük SAM izoaspartilden zengin ve yetersizliği olan hayvanlarda yığışmaya ve sinaptik iletinin bozulmasına yol açabilen α sinükleinin giderek daha fazla alıkonmasına neden olur (36). Kontrol hücreleriyle karşılaştırıldığında PIMT den yoksunlaştırılmış hücreler, mitojenle etkinleşmiş protein (MAP) kinaz zincirinin bileşenlerinde hiperfosforilizasyon neden olmuştur. (38). MAP kinaz bileşeni α-sinüklein ekspresyonuyla ilişkili olabilmektedir (39). Alfa-sinüklein ve amiloit-β sinir hücresi membranlarında ko-oligomerler oluşturabilmektedir (11). Amiloidin α-sinükleinle etkileşimi α- sinükleinin birikmesini kolaylaştırmaktadır. Bu gözenek oluşturan kompleks hücreler içinde kalsiyumun birikmesini hızlandırmaktadır. Çalışmamızda plazma amiloit-β (1-42) ile trombosit α-sinüklein arasındaki pozitif korelasyon (r = 0.42) ya her iki proteinin üretimi veya katabolizmasını kontrol eden ortak bir mekanizmanın varlığını düşündürmektedir Clinical Chemistry 55: 10, (2009)

8 Metilasyon ve Nörodejenerasyon SAM Şekil 4. Parkinson hastalığında metilasyonla nörodejeneratif süreci ilişkilendiren potansiyel mekanizmalar sapp, sçözünebilir APP; PC, fosfatidilkolin; PE, fosfatidiletanolamin; PS1, presinilin 1. Bir makul mekanizma yığılmış proteinleri bağlayan ve elimine eden ubikuitin proteazom sistemini (UPS) ilgilendirebilir Parkinson hastalarında HHCY, oksidatif strese neden olarak UPS yi tüketebilir ve sonuçta amiloit-β ve α-sinüklein oligomerlerinin oluşmasına yol açabilir (Şekil 4). Siyah cevherdeki ekojenik alanları daha geniş olanlarda serum MMA konsantrasyonlarının daha yüksek olduğu saptanmıştır. Ne holotc ne de total B 12 siyah cevher alanıyla ilişkili olduğundan bu korelasyon B 12 vitamini düzeyleriyle açıklanamaz. Siyah cevherdeki alana göre serum kreatinini de MMA konsantrasyonlarındaki farklılıktan sorumlu değildi.. MMA, hayvanların serebral kortekslerinde hücre çatısı proteinlerini fosforilizasyonunu artırabilir (40). Ayrıca, MMA nın Krebs siklüsüne, mitokondri elektron aktarım sistemine müdahale ederek sinir hücresinin ölümüne neden olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar B 12 eksikliği nörotoksisitesinin, düşük vitamin konsantrasyonlarından ziyade en azından kısmen MMA birikimiyle ilişkili olduğunu akla getirmektedir. Bu veriler topluca ele alındığında Parkinson hastalarında daha iyi bilişsel fonksiyonun daha yüksek metilasyon potansiyeli (SAM/SAH oranı) ve daha yüksek plazma B 6 konsantrasyonlarıyla ilişkili olduğunu saptadık. B 6 vitamininin bilişsel fonksiyon üzerine etkisi muhtemelen dolaylı olarak metilasyon durumunun iyileşmesi ve amiloid-β üretiminde azalmayla ilişkilidir. Hipometilasyon (yüksek SAH veya düşük SAM) amiloidojenik yolak yoluyla APP degradasyonunu hızlandırabilir ve α sinüklein konsantrasyonlarını artırabilir. Gelecek çalışmalar Parkinson hastalığı olanlardanörodejeneratif belirteçler üzerine B vitaminleri veya SAM takviyelerinin etkisini test edebilir Clinical Chemistry 55: 10, (2009) 1859

9 Yazarların Katkıları: Yazarların hepsi bu makalenin düşünsel içeriğine katkıda bulundukları ve şu üç gerekliliği karşıladıklarını doğrulamıştır: (a) verilerin kavram, tasarım, elde edilmesi, analiz ve yorumlanmasına önemli katkılar; (b) düşünsel içeriği için makalenin yazılması veya gözden geçirilmesi ve (c) yayınlanmış makalenin nihai onaylanması Yazarların potansiyel çıkar çatışmaları açıklamaları: Makalenin sunumuyla birlikte yazarların tümü Potansiyel Çıkar çatışmaları formunu doldurmuştur. Potansiyel çıkar çatışmaları:: Sponsorun Rolü: Fon sağlayan kuruluşlat çalışma tasarımı, çalışmaya alınan hastaların seçimi, verilerin gözden geçirilmesi, yorumlanması, metnin hazırlanması veya onaylanmasında herhangi bir rol oynamamıştır.. 1.Cookson MR. The biochemistry of Parkinson s disease. Annu Rev Biochem 2005;74: Blandini F, Fancellu R, Martignoni E, Mangiagalli A, Pacchetti C, Samuele A, Nappi G. Plasma homocysteine and L-dopa metabolism in patients with Parkinson disease. Clin Chem 2001;47: Yasui K, Kowa H, Nakaso K, Takeshima T, Nakashima K. Plasma homocysteine and MTHFR C677T genotype in Levodopatreated patients with PD. Neurology 2000;55: Zoccolella S, Lamberti P, Iliceto G, Diroma C, Armenise E, Defazio G, et al. Plasma homocysteine levels in L-dopatreated Parkinson s disease patients with cognitive dysfunctions. Clin Chem Lab Med 2005;43: Muller T, Renger K, Kuhn W. Levodopaassociated increase of homocysteine levels and sural axonal neurodegeneration. Arch Neurol 2004;61: O Suilleabhain PE, Sung V, Hernandez C, Lacritz L, Dewey RB, Jr., Bottiglieri T, az-arrastia R. Elevated plasma homocysteine level in patients with Parkinson disease: motor, affective, and cognitive associations. Arch Neurol 2004;61: Yasui K, Nakaso K, Kowa H, Takeshima T, Nakashima K. Levodopa-induced hyperhomocysteinaemia in Parkinson s disease. Acta Neurol Scand 2003;108: Liu XX, Wilson K, Charlton CG. Effects of L-dopa treatment on methylation in mouse brain: implications for the side effects of L-dopa. Life Sci 2000;66: Cooper AA, Gitler AD, Cashikar A, Haynes CM, Hill KJ, Bhullar B et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson s models. Science (Wash DC) 2006; 313: Hamilton RL. Lewy bodies in Alzheimer s disease: a neuropathological review of 145 cases using alpha-synuclein immunohistochemistry. Brain Pathol 2000;10: Tsigelny IF, Crews L, Desplats P, Shaked GM, Sharikov Y, Mizuno H et al. Mechanisms of hybrid oligomer formation in the pathogenesis of combined Alzheimer s and Parkinson s diseases. PLoS One 2008;3: e3135. Kaynaklar 12.Faucheux BA, Bonnet AM, Agid Y, Hirsch EC. Blood vessels change in the mesencephalon of patients with Parkinson s disease. Lancet 1999;353: Kang J, Lemaire HG, Unterbeck A, Salbaum JM, Masters CL, Grzeschik KH, et al. The precursor of Alzheimer s disease amyloid A4 protein resembles a cellsurface receptor. Nature 1987; 325: Ponte P, Gonzalez-DeWhitt P, Schilling J, Miller J, Hsu D, Greenberg B, et al. A new A4 amyloid mrna contains a domain homologous to serine proteinase inhibitors. Nature 1988; 331: Stabler SP, Lindenbaum J, Savage DG, Allen RH. Elevation of serum cystathionine levels in patients with cobalamin and folate deficiency. Blood 1993; 81: Gellekink H, van Oppenraaij- Emmerzaal D, van RA, Struys EA, den HM, Blom HJ. Stable-isotope dilution liquid chromatography-electrospray injection tandem mass spectrometry method for fast, selective measurement of S adenosylmethionine and S adenosylhomocysteine in plasma. Clin Chem 2005; 51: Gaenslen A, Unmuth B, Godau J, Liepelt I, Di SA, Schweitzer KJ, et al. The specificity and sensitivity of transcranial ultrasound in the differential diagnosis of Parkinson s disease: a prospective blinded study. Lancet Neurol 2008; 7: Kazmierczak A, Strosznajder JB, Adamczyk A.α-Synuclein enhances secretion and toxicity of amyloid beta peptides in PC12 cells. Neurochem Int 2008;53: Obeid R, Herrmann W. Mechanisms of homocysteine neurotoxicity in neurodegenerative diseases with special reference to dementia. FEBS Lett 2006;580: Lamberti P, Zoccolella S, Iliceto G, Armenise E, Fraddosio A, de MM, Livrea P. Effects of Levodopa and COMT inhibitors on plasma homocysteine in Parkinson s disease patients. Mov Disord 2005; 20: Valkovic P, Benetin J, Blazicek P, Valkovicova L, Gmitterova K, Kukumberg P. Reduced plasma homocysteine levels in Levodopa/entacapone treated Parkinson patients. Parkinsonism Relat Disord 2005;11: Ostrem JL, Kang GA, Subramanian I, Guarnieri M, Hubble J, Rabinowicz AL, Bronstein J. The effect of entacapone on homocysteine levels in Parkinson disease. Neurology 2005; 64: Jenner P. Oxidative stress in Parkinson s disease. Ann Neurol 2003;53 Suppl 3: S26 S Kannan K, Jain SK. Effect of vitamin B6 on oxygen radicals, mitochondrial membrane potential, and lipid peroxidation in H2O2-treated U937 monocytes. Free Radic Biol Med 2004; 36: Nijhout HF, Gregory JF, Fitzpatrick C, Cho E, Lamers KY, Ulrich CM, Reed MC. A mathematical model gives insights into the effects of vitamin B-6 deficiency on 1 carbon and glutathione metabolism. J Nutr 2009; 139: Gurol ME, Irizarry MC, Smith EE, Raju S, az- Arrastia R, Bottiglieri T, et al. Plasma betaamyloid and white matter lesions in AD, MCI, and cerebral amyloid angiopathy. Neurology 2006; 66: Bush AI, Tanzi RE. Alzheimer diseaserelated abnormalities of amyloid beta precursor protein isoforms in the platelet: the brain s delegate in the periphery? Arch Neurol 1998; 55: Padovani A, Pastorino L, Borroni B, Colciaghi F, Rozzini L, Monastero R, et al. Amyloid precursor protein in platelets: a peripheral marker for the diagnosis of sporadic AD. Neurology 2001;57: Casoli T, Di SG, Giorgetti B, Grossi Y, Balietti M, Fattoretti P, Bertoni-Freddari C. Release of betaamyloid from high-density platelets: implications for Alzheimer s disease pathology. Ann N Y Acad Sci 2007;1096: Fuso A, Seminara L, Cavallaro RA, D Anselmi F, Scarpa S. S- adenosylmethionine/homocysteine cycle alterations modify DNA methylation status with consequent deregulation of PS1 and BACE and beta-amyloid production. Mol Cell Neurosci 2005; 28: Hung AY, Haass C, Nitsch RM, Qiu WQ, Citron M, Wurtman RJ, et al. Activation of protein kinase C inhibits cellular production of the amyloid betaprotein. J Biol Chem 1993;268: Lotharius J, Barg S, Wiekop P, Lundberg C, Raymon HK, Brundin P. Effect of mutant alphasynuclein on dopamine homeostasis in a new human mesencephalic cell line. J Biol Chem 2002; 277: Yi P, Melnyk S, Pogribna M, Pogribny IP, Hine RJ, James SJ. Increase in plasma homocysteine associated with parallel increases in plasma S 1860 Clinical Chemistry 55: 10, (2009)

10 Metilasyon ve Nörodejenerasyon adenosylhomocysteine and lymphocyte DNA hypomethylation. J Biol Chem 2000; 275: Bonsch D, Reulbach U, Bayerlein K, Hillemacher T, Kornhuber J, Bleich S. Elevated alpha synuclein mrna levels are associated with craving in patients with alcoholism. Biol Psychiatry 2004;56: Purohit V, Russo D. Cellular and molecular mechanisms of alcoholic hepatitis: introduction and summary of the symposium. Alcohol 2002; 27: Vigneswara V, Lowenson JD, Powell CD, Thakur M, Bailey K, Clarke S, et al.proteomic identification of novel substrates of a protein isoaspartylmethyltransferase repair enzyme. J Biol Chem 2006; 281: Clarke S. Protein carboxyl methyltransferases: two distinct classes of enzymes. Annu Rev Biochem 1985;54: Kosugi S, Furuchi T, Katane M, Sekine M, Shirasawa T, Homma H. Suppression of protein L-isoaspartyl (D-aspartyl) methyltransferase results in hyperactivation of EGF-stimulated MEKERK signaling in cultured mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 2008; 371: Clough RL, Stefanis L. A novel pathway for transcriptional regulation of alpha-synuclein. FASEB J 2007;21: de Almeida LM, Funchal C, Pelaez PL, Pessutto FD, Loureiro SO, Vivian L, et al. Effect of propionic and methylmalonic acids on the in vitro phosphorylation of intermediate filaments from cerebral cortex of rats during development. Metab Brain Dis 2003; 18: Notice: This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2009;55:10 : , by permission of the publisher. Original copyright 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original publication source in the journal, Clinical Chemistry. Not: Bu makale AACC(American Association for Clinical Chemistry) nin izni alınarak tercüme edilmiştir. Çevirinin doğruluğundan AACC sorumlu değildir. Sunulmuş görüntüler dergi veya AACC nın olmayıp tamamen tamamen yazarlara aitdir. Bu makale; yayımcının izni alınarak Clinical Chemistry dergisinin 2009;55:10 : no lu sayısından alınmıştır. Orjinal kopya 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc aitdir. Bu makaleye atıf yapılacağı zaman lütfen Clinical Chemistry dergisindeki orijinal basım kaynağı gösterilmelidir. Clinical Chemistry 55: 10, (2009) 1861

11 1858 Clinical Chemistry 55: 10, (2009)