Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Kantitatif Antibiyogram ve Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans

Transkript

1 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: Hastane İnfeksiyonları Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Kantitatif Antibiyogram ve Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans Dr. Metin OTKUN*, Dr. Filiz AKATA*, Dr. Sesin KOCAGÖZ**, Dr. Müflerref TATMAN-OTKUN*, Dr. Yeflim ÇET NKAYA**, Dr. Bahri TEKER* Dr. Volkan DÜNDAR*, Dr. Serhat ÜNAL** * Trakya Üniversitesi T p Fakültesi, Klinik Bakteriyoloji ve nfeksiyon Hastal klar Anabilim Dal, Edirne. ** Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi, ç Hastal klar Anabilim Dal nfeksiyon Hastal klar Ünitesi, Ankara. ÖZET Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) infeksiyonlar ciddi ve tedavisi güç infeksiyonlard r. MRSA salg nlar n n epidemiyolojisini incelemek ve nozokomiyal yay l m yollar n tan mlamak için bireysel MRSA kökenlerinin ay rt edilebilmesi gerekir. Bu çal flman n amac kantitatif antibiyogram yöntemini kullanarak MRSA sürveyans n sa lamak ve sonuçlar n AP-PCR ile karfl - laflt rarak yinelenebilirlik, ay rt edici güç ve epidemiyolojik aç dan de erini incelemektir. Ekim May s 1996 döneminde 26 hastadan 33 MRSA izole edilmifltir. Kantitatif antibiyogram tipleme 33 izolat alt gruba ay rm flt r. Bunlardan birincisinde 27 izolat yer al rken, birinde iki ve dördünde birer izolat bulunmaktad r. AP-PCR ise MRSA izolatlar n dört gruba ay rm flt r. Bu gruplardan birincisinde 31 izolat yer al rken, üç izolat farkl amplifikasyon bantlar vermifltir. Epidemiyolojik veriler ile birlikte de erlendirildi inde her iki yöntemin de ay rt edici gücü s n rl bulunmufl, sonuçlar n birlikte de erlendirilmesi halinde daha yüksek ay rt edici güç sa lanm flt r. Sonuç olarak de iflik kökenlerin araya girmesine karfl n bir özel klonun Trakya Üniversitesi T p Fakültesi hastanemizde zaman içinde endemik hale geldi i saptanm flt r. Anahtar Kelimeler: MRSA, Sürveyans, Tipleme, Kantitatif Antibiyogram, AP-PCR SUMMARY Epidemiological Surveillance of Methicillin - Resistant Staphylococcus aureus by Quantitative Antibiogram and Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) Typing Methods The methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections are serious and difficult to treat. Epidemiologic investigation of MRSA infections and identification of modes of nosocomial MRSA transmission require the ability to distinguish individual strains. The purpose of this study was to follow the MRSA surveillance by using quantitative antibiogram and to analyze its reproducibility, discriminatory power and epidemiological value by comparing the results with AP-PCR. Thirty three MRSA isolates were obtained from 26 patients between October 1994 and May Quantitative antibiogram typing classified these isolates into six distinct groups. One of these groups included 27 MRSA isolates and one of the others included two MRSA isolates. The remaining four MRSA isolates were found to be different from each other and classified into four seperate groups. By AP-PCR four groups were discriminated among these isolates. Thirty-one of the isolates were in one group and the remaining two MRSA isolates were classified into distinct groups. Discriminatory power of both methods were found to be limited when the results were evaluated in accordance with epidemiological data. On the other hand, discriminatory power was more enhanced if the results of AP-PCR and quantitative antibiogram typing were evaluated together. It was concluded that although several different MRSA strains were involved, a special clone has become endemic in Trakya University Hospital. Key Words: MRSA, Surveillance, Typing, Quantitative Antibiogram, AP-PCR 106 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2

2 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, G R fi Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ilk olarak 35 y l önce tan mlanm flt r (1) ve halen tüm dünyada hastaneden kazan lm fl infeksiyonlar n önemli ve gittikçe artan bir etkenidir (2). Türkiye de S. aureus izolatlar nda metisilin direnci %25-40 aras nda de iflmektedir (3-7). MRSA salg nlar n n epidemiyolojisini incelemek ve nozokomiyal MRSA yay l m n n yollar n tan mlamak için bireysel MRSA kökenlerinin ay rt edilebilmesi gerekir (8). Hastane içinde S. aureus un klonal yay lma e ilimi klinik izolatlarda özgül tipleme yöntemlerinin gelifltirilmesine yol açm flt r. Ancak MRSA kökenleri aras nda yüksek derecedeki genetik yak nl k (9) nedeniyle özellikle rutin bakteriyolojik yöntemleri kullanan pek çok hastane laboratuvar için bu ayr m güç olabilir. K sa bir süre önce Tenover ve arkadafllar 12 de iflik tipleme yöntemini karfl laflt rm fllar ve epidemiyolojik çal flmalar için DNA kaynakl tiplemelerin daha uygun oldu unu, ama karfl laflt rd klar hiç bir yöntemin tek bafl na, ba lant s z kökenleri epidemiyolojik olarak ba lant l kökenlerden aç k bir flekilde ay rt etmeye yetmedi ini belirtmifllerdir (10). Antimikrobiyal duyarl l k testleri bu amaçla s k kullan lan yöntemlerden biridir. Ancak MRSA lar n büyük bir k sm benzer flekilde ço ul antibiyotik dirençli olduklar ndan bu yöntemin araflt rmalardaki yarar s n rl d r (11). Antimikrobiyal duyarl l k testleri ile tiplemenin do al bir zay fl bu duyarl l n s kl kla çevresel faktörler veya plazmidlerle de iflebilmesidir (12). Sürveyans çal flmalar nda yöntemin de erini artt rabilmek için Giacca ve arkadafllar disk diffüzyon testlerinde ölçülen inhibisyon zon çaplar n kullanarak yap lan bir benzerlik analizi önermifllerdir (13). Blanc ve arkadafllar kantitatif antibiyogram diye isimlendirilebilecek bu yöntemi MRSA sürveyans nda kullanm fllar, karmafl k ve pahal moleküler tipleme yöntemlerine ulafl lamayan durumlarda basit ve güvenilir bir yöntem oldu- unu ileri sürmüfllerdir (14). Bu çal flman n amac bir üniversite hastanesinde 20 ayl k bir dönem içinde kantitatif antibiyogram yöntemini kullanarak MRSA sürveyans n sa lamak ve sonuçlar n iyi tan mlanm fl moleküler bir tipleme yöntemi olan Arbitrarily primed PCR (AP-PCR) ile karfl laflt rarak yinelenebilirlik, ay rt edici güç ve epidemiyolojik aç dan de erini incelemektir. MATERYAL ve METOD Hastanenin özellikleri ve çal flma dönemi: Trakya Üniversitesi Hastanesi (TÜH) 400 yatakl, üçüncü basamak bir e itim hastanesidir. Hizmet etti i nüfus yaklafl k dir ve y lda yaklafl k hasta hastaneye yat r lmaktad r. TÜH de dört yatakl bir merkezi yo un bak m birimi bulunmakta olup S. aureus izolatlar nda metisilin direnci s kl 1995 y l içinde %48 olarak bulunmufltur (15). Bu çal flmaya Ekim May s 1996 aras klinik kültürlerinde MRSA üretilen tüm hastalar al nm flt r. Epidemiyoloji Çal flmaya al nan her hastadan TÜH nfeksiyon Kontrol Ekibi taraf ndan flu veriler toplanm flt r: demografik veriler, ikamet yeri, baflvuru ve ç k fl tarihleri, yat r ld servis ve hastane içinde varsa di er servislere nakli, daha önceki yat fllar, tan, bakteriyoloji sonuçlar ve infeksiyon kontrol önlemleri. Olgular yatt klar serviste ayn antibiyotip ile infekte baflka bir hasta ile ayn dönemde yatm fllar ise epidemiyolojik olarak ba lant l kabul edilmifl, epidemiyolojik ba lant kurulamayan olgular sporadik olarak nitelendirilmifllerdir. Ayn serviste MRSA l baflka bir hasta yok iken yat - fl n ilk 48 saati içinde izole edilen MRSA hastane d fl kökenli olarak düflünülmüfltür. Çal flman n ikincil bir amac da tipleme yöntemlerinin özgüllük ve duyarl l klar n de erlendirmek oldu undan ayn hastadan izole edilen birden fazla MRSA çal flmaya al nm flt r. Mikrobiyoloji S. aureus izolatlar Gram boyama, katalaz, koagülaz ve DNaz testleri ile tan mlanm flt r (16). Metisilin direnci 1 µg oksasilin diski, agar tarama (screen) (17) ve modifiye agar yayma (spread) (18) testleri ile araflt r lm flt r. Oksasilinin minimal inhibitör konsantrasyon (M K) de erleri mikrodilüsyon yöntemiyle NCCLS önerileri do rultusunda saptanm flt r (17). Metisiline dirençli oldu u yukar da belirtilen metodlarla do rulanan izolatlarda Ünal ve arkadafllar taraf ndan tan mlanan yöntem kullan larak PCR ile meca geni araflt r lm flt r (19). Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2 107

3 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Kantitatif antibiyogram tipleme Antimikrobiyal duyarl l k testleri Müller-Hinton agar ve standart antimikrobik diskler (Difco Laboratories, ABD) kullanarak NCCLS önerilerine göre disk diffüzyon testi ile yap lm flt r (20). Çal fl lan antimikrobikler: eritromisin, klindamisin, kotrimoksazol, gentamisin ve rifampisindir. Bu antimikrobiklerin seçilmelerinin nedenleri: (i) MRSA izolatlar nda de iflik ve ba ms z direnç mekanizmalar n n olmas ve/veya, (ii) Direncin kromozomal olmas ve/veya, (iii) Hastanemizde nispeten az kullan lmalar d r. Kantitatif antibiyogram tipleme disk diffüzyon testlerinde elde edilen inhibisyon zon çaplar n n benzerlik analizi yöntemiyle yap lm flt r (14). Benzerlik katsay s olarak Euclid aral kullan lm flt r; iki MRSA aras ndaki fark her bir antimikrobik için karfl laflt r lan iki izolat n inhibisyon zon çaplar aras ndaki farklar n kareleri toplam n n kareköküdür. ki organizma aras ndaki fark büyüdükçe benzerlik azalmaktad r. Bu formül her bir izolat n di er bütün izolatlar ile yak nl k derecesini saptamak için hesaplanm flt r. Ayn kökenin farkl zamanlarda antibiyogram tekrar yap ld nda belli bir de iflkenlik görülebilece inden tüm izolatlarda farkl zamanlarda iki kez disk difüzyon duyarl l k testi yap lm flt r. Her bir mikroorganizma için iki test aras ndaki Euclid aral klar na göre bir s n r de er seçilmifltir. Seçilen s n r de er ilk ve ikinci test sonuçlar aras ndaki Euclid aral klar n n en az %95 inden büyük olan de erdir. Bu yüzden yöntemin yinelenebilirli i en az %95 tir. ki ayr izolat aras ndaki Euclid aral s n r de erden düflükse kantitatif antibiyogram tipleme yönteminde izolatlar ba lant l olarak nitelendirilmifltir. Daha sonra a rl ks z olarak çiftleri gruplama yoluyla küme analizi yap lm fl ve buna göre bir dendrogram çizilmifltir. Hesaplamalarda ve dendrogram çiziminde SPSS for Windows (Release 6.1, SPSS Inc., 1994) bilgisayar program kullan lm flt r. Disk diffüzyon testlerinde kalite kontrol amac yla standart sufl olarak Escherichia coli ATCC ve S. aureus ATCC kullan lm flt r. Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) Bakteri DNA s n n haz rlanmas nda Ünal ve arkadafllar taraf ndan stafilokoklar için tan mlanm fl olan h zl lizis protokolü modifiye edilerek kullan lm flt r (19). fllem öncesinde tüm MRSA izolatlar n n Mueller-Hinton s v besiyerine ekimi yap lm flt r. 35 C da bir gecelik inkübasyonu takiben 5000 rpm de 20 dakikal k santrifüjle bakterilerin çökmesi sa lanm fl ve üst s v uzaklaflt - r lm flt r. Bakteri çökelekleri steril koflullarda ependorf tüplere aktar lm fl ve rpm de 5 dakika daha santrifüj edilmifltir. Üst s v uzaklaflt r ld ktan sonra kalan bakteri çökele inin üzerine 50 µl lizostafin (100 µg/ml, Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.) eklenip 5 dakika 37 C da su banyosunda tutulmufltur. Daha sonra bu süspansiyonun üzerine 50 µl proteinaz K (100 µg/ml, Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.) eklenmifl ve 5 dakika daha 37 C de bekletilmifltir. Tüpler kaynar su içinde 15 dakika kaynat ld ktan sonra 1 dakika rpm de santrifüj edilmifl ve üst s v yeni bir ependorf tüpe aktar larak -20 C de saklanm flt r. Elde edilmifl olan bu bakteri DNA süspansiyonunun 1 µl si 50 µl PCR kar fl m içinde amplifikasyona al nm flt r. Amplifikasyonlarda Mycobacterium tuberculosis e özgül primerler (5 CCTGTGGGGTCCGG- GCTTTC 3, 5 GATCTGCGGGTCGTCCCAGGT 3 ) kullan lm flt r. Her tüpte 50 mm KCl, 10 mm Tris- HCl (ph 8.3), %0.1 TritonX-100, 2.5 mm MgCl 2, her dntp den 0.2 mm, 1 ünite taq polimeraz enzimi Epicentre) ve 50 pmol primer olacak flekilde reaksiyon kar fl mlar haz rlanm flt r. DNA amplifikasyonlar (Stuart, EC) üretici firman n önerileri do rultusunda flu parametreler kullan - larak gerçeklefltirilmifltir: Low-stringency sikluslar (3 siklus): Denatürasyon 94 C 1 dakika Birleflme 30 C 1 dakika Uzama 72 C 1 dakika High-stringency sikluslar (45 siklus) Denatürasyon 94 C 1 dakika Birleflme 55 C 1 dakika Uzama 72 C 1 dakika Elde edilen amplifikasyon ürünlerinin 10 µl si, %2 lik agaroz jelde yürütülerek ultraviolet transillüminatör üzerinde incelenerek foto raflar çekilmifltir (21,22). AP-PCR çal fl l rken bir adet metisiline duyarl S. aureus (MSSA) ve bir adet metisiline dirençli S. epidermidis (MRSE) kökeni kontrol amac yla di er izolatlarla birlikte çal fl lm flt r. 108 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2

4 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, SONUÇLAR TÜH de Ekim May s 1996 döneminde 26 hastadan 33 MRSA izole edilmifltir. Bu hastalar n 8 i kad n, 18 i erkek olup yafl ortalamalar 44.4 ± 16.6 ( ) (ortalama ± standart sapma (minimum - median - maksimum) d r. Hastalar n 7 si merkez yo un bak m ünitesi 6 s ortopedi, 4 ü iç hastal klar, 2 si beyin cerrahisi ve birer tanesi gö üs hastal klar, nöroloji, üroloji, gö üskalp-damar cerrahisi, koroner yo un bak m ve genel cerrahi servislerinde yatm flt r. Multipl miyelom tan l bir hasta ise acil servise baflvurdu- unda istenen idrar kültüründe MRSA üremifltir. Ancak bu hastan n di er bilgilerine ulafl lamam flt r. Servis hastalar n n yat r lma nedenleri 8 inde travmaya ba l kemik k r klar, 3 ünde serebrovasküler hastal k, 3 ünde kronik böbrek yetmezli i, üçünde malignite, birer hastada ise ateflli silah yaralanmas, Guillain-Barré sendromu, gazl gangren, korozif madde içilmesi, tüberküloz ampiyem, kalp yetmezli i, akut arteriyel tromboz ve postoperatif pnömotorakst r. Hastalar n 12 sinde operasyon öyküsü al nm fl ve 23 ü MRSA n n saptanmas ndan önce antibiyotik kullanm flt r. En s k kullan lan antibiyotikler 14 hastada 2. veya 3. kuflak sefalosporin, 10 hastada imipenem ve 8 hastada aminoglikozitlerdir. MRSA kolonizasyonu ve infeksiyonunu kolaylaflt racak risk faktörü olarak 10 hastada nazogastrik sonda, 16 hastada idrar sondas, 6 hastada kemik-eklem protezi veya ortopedik çivi, 5 hastada damar içi kateter bulunmufltur. Bu hastalar n yat fl, ç k fl ve MRSA üremesinin saptand tarihler fiekil 1 de gösterilmifltir. MRSA izolatlar n n 20 si (%61) eritromisine, 30 u (%91) klindamisine, 2 si (%6) kotrimoksazole, 30 u (%91) gentamisine ve 29 u (%88) rifampisine dirençlidir. Bu izolatlar n izole edildikleri infeksiyon yerleri, tarihleri ve servisleri, çal fl lan antimikrobik diskleri çevresindeki inhibisyon zon çaplar, oksasilin minimal inhibisyon konsantrasyon (M K) de erleri ve meca geni sonuçlar Tablo 1 de gösterilmifltir. zolat 5, 7 ve 9, izolat 20 ve 21, izolat 17, 19, 22 ve 26, izolat 29 ve 30 ayn hastalardan izole edilmifl gruplard r. Tüm izolatlar n iki kez tekrarlanan antimikrobiyal duyarl l klar sonuçlar na göre elde edilen en büyük Euclid aral 11.5 tir ve 33 izolat n 32 sinde bu de er 8.0 den küçük bulunmufltur. Bu nedenle s n r de er 8.0 olarak seçilmifltir. Yöntemimizin yinelenebilirli i %97.0 (32/33) dir. Sonuçta izolatlar aras ndaki fark 8.0 den küçükse ba lant l kabul edilmifltir. Kantitatif antibiyogram tiplemeye dayanan dendrogram 33 izolat alt gruba ay rm flt r. Bunlardan birincisinde 27 izolat yer al rken, birinde iki ve dördünde birer izolat bulunmaktad r (fiekil 2). AP-PCR yöntemi ise MRSA izolatlar n dört gruba ay rm flt r. Bu gruplardan birincisinde 31 izolat yer al rken izolat 10, 14 ve 16 farkl bant paterni vermifltir (fiekil 3). Bunlardan izolat 10 ve 16 kantitatif antibiyogram ile de farkl bulunurken izolat 14 kantitatif antibiyogram ile ay rt edilememifltir. Buna karfl n kantitatif antibiyogram, AP-PCR taraf ndan büyük grupta olarak nitelendirilen izolat 1, 4, 2 ve 15 i ayr tipler halinde ay rt etmifl ve izolat 2 ile 15 i bir gruba sokmufltur. Ayn hastadan izole edilen izolatlar her iki yöntemle de ba lant l bulunmufltur. Kontrol amac yla çal fl lan MSSA ve MRSE kökenleri AP- PCR taraf ndan di er izolatlardan ay rt edilebilmifltir. Her iki yöntemin s n fland rma sonuçlar yine Tablo 1 de sunulmufltur. Hem kantitatif antibiyogram, hem de AP-PCR ile di erlerinden ayr lan 16 no lu izolat 256 µg/ml nin üstünde bulunan oksasilin M K de erine karfl n meca geni negatif olarak saptanm flt r. TARTIfiMA MRSA infeksiyonlar ciddi ve tedavisi güç infeksiyonlard r. Bu infeksiyonlar n tedavisi için çok az antimikrobik seçene i vard r ve bunlar n hiçbiri de ideal özellikleri tafl maz. Bu infeksiyonlar n korunmas nda bakterinin kaynaklar n saptamak ve yok etmek veya hastaya bulafl yollar n kesmek, böylece MRSA infeksiyonlar n n say s n azaltmak önemli bir amaçt r. Hangi kökenin, hangi kaynaktan ve hangi yollarla di er hastalara yay ld n saptayabilmek için kökenleri tiplendirerek tek tek ay rt edebilmek gerekir (22). MRSA tiplendirilmesinde fenotipik ya da genotipik özellikleri temel alan pek çok çal flma yap lm flt r, ama amaca tam anlam ile uyan ideal bir tipleme yöntemi bu güne kadar tan mlanamam flt r (23). MRSA tiplendirilmesinde kullan - lan çeflitli yöntemleri karfl laflt ran en genifl çal flmada hiç bir yöntemin di erlerine tam anlam yla üstünlük sa layamad, yöntemleri kombine etmenin daha iyi sonuç verece i ve bu nedenle her laboratuvar n iki tipleme yöntemini rutin olarak kullanmas gerekti i sonucuna ulafl lm flt r Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2 109

5 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Antibiyotip 6 Antibiyotip 5 Antibiyotip 4 Antibiyotip 3 Antibiyotip 2 Antibiyotip 1 Üroloji (10)* Beyin cerrahisi (4) ç hastal klar (16)* ç hastal klar (1) Koroner (2) Gö üs hastal klar (15) Ortopedi (6) Ortopedi (3) Ortopedi (5,7,9) ç hastal klar (8) Ortopedi (11) MYBÜ (12) MYBÜ (13) Acil (14)* Beyin cerrahi (17,19,22,26) MYBÜ (18) ç hastal klar (20,21) Ortopedi (23) MYBÜ (24) Nöroloji (25) MYBÜ (27) Ortopedi (28) MYBÜ (29,30) GKDC (31) MYBÜ (32) Cerrahi (33) Ekim 1994 May s 1996 fiekil 1. MRSA izole edilen hastalar n yat fl tarihleri ve servisleri. (Gri renkli çubuklar yat fl dönemlerini, dikine siyah çizgiler MRSA izolasyon tarihlerini göstermektedir. Parantez içindeki numaralar izolat no sudur. MYBÜ: merkez yo un bak m ünitesi; GDKC: gö üs-kalp-damar cerrahisi; *: AP-PCR taraf ndan ay rt edilen izolatlar). 110 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2

6 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Tablo 1. MRSA zolatlar n n Mikrobiyolojik ve Epidemiyolojik Özellikleri. zolat Tarih nfeksiyon yeri Servis CC SXT E GM RA OXA MecA Antibiyotip AP-PCR No tip Yumuflak doku ç hastal klar A Kan Koroner > A Cerrahi yara Ortopedi > A Cerrahi yara Beyin cerrahisi > A Cerrahi yara Ortopedi > A Cerrahi yara Ortopedi > A Cerrahi yara Ortopedi > A Kateter yeri ç hastal klar A Cerrahi yara Ortopedi Ç Ç drar Üroloji > C Cerrahi yara Ortopedi > A Trakeal aspirat MYBÜ A Kan MYBÜ > A drar Acil servis > B Balgam Gö üs hast > A Kateter yeri ç hastal klar >256-4 D Trakeal aspirat Beyin cerrahisi Ç Ç Trakeal aspirat MYBÜ Ç Ç BOS Beyin cerrahisi Ç Ç Kan ç hastal klar Ç Ç Kateter yeri ç hastal klar Ç Ç Nöral doku Beyin cerrahisi Ç Ç Cerrahi yara Ortopedi > A Kan MYBÜ > A Trakeal aspirat Nöroloji > A Cerrahi yara Beyin cerrahisi A Trakeal aspirat MYBÜ > A Cerrahi yara Ortopedi A Kateter yeri MYBÜ > A Trakeal aspirat MYBÜ > A Cerrahi yara GKDC > A Trakeal aspirat MYBÜ A Cerrahi yara Genel cerrahi > A CC: klindamisin, SXT: kotrimoksazol, E: eritromisin, GM: gentamisin, RA: rifampin, OXA: oksasilin, Ç: çal fl lmad, MYBÜ: merkez yo un bak m ünitesi, GKDC: gö üs-kalp-damar cerrahisi. Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2 111

7 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un 8 : Servis No + : MYBÜ 29 : MYBÜ 32 : Ortopedi 23 : MYBÜ 13 : MYBÜ 24 : Beyin Cer. 19 : Nöroloji 25 : Genel Cer. 33 : Ortopedi 6 : Ortopedi 11 : Beyin Cer. 22 : Beyin Cer. 26 : ç Hast. 8 : MYBÜ 30 : Ortopedi 5 : MYBÜ 12 : Beyin Cer. 17 : Ortopedi 28 : Ortopedi 7 : ç Hast. 20 : Ortopedi 3 : Acil Servis 14 : MYBÜ 18 : ç Hast. 21 : MYBÜ 27 : Ortopedi 9 : GTDC 31 : Koroner 2 : Gö üs Hast. 15 : ç Hast. 1 : ç Hast. 16 : Beyin Cer. 4 : Üroloji 10 : : S n r de er fiekil 2. Befl adet antibiyotik diskinin çevresindeki inhibisyon zonlar n n Euclid aral klar na göre çizilen dendrogram. (10). Seçilecek yöntemlerden biri epidemiyolojik bir çal flmada ileri incelemeye al nacak tüm olas kökenleri saptayacak duyarl l kta ve di eri de daha sonra ayr nt l köken farkl l n saptayacak özgüllükte olmal d r. Yöntemlerin seçilmesi laboratuvar n kaynaklar na ve personelinin teknik ustal na ba l d r. Maslow ve arkadafllar tipleme sistemlerinin befl özelli ini tan mlam fllard r (24). Bunlar tipleyebilme, yinelenebilme, ay rt edici güç, yorum kolayl ve kullan m kolayl d r. Kökenleraras farkl l saptayabilmek için teknik ustal k gereksinimi artt kça genellikle bu ustal olmayan klinik mikrobiyologlarca yöntemi uygulama iste i düflmektedir (14). Antimikrobiyal duyarl l k testleri haz rlamas ve yorumlamas en kolay, en ucuz ve en h zl tipleme yöntemidir ve özellikle küçük laboratuvarlarda köken yak nl n incelemenin ilk yolu olarak nitelendirilir. Bu yöntem hastane ortam na yeni ve farkl bir MRSA kökeninin giriflini saptamada baflar l bir flekilde kullan lm flt r (25). Ancak pek çok MRSA klonu benzer flekilde ço ul antibiyotik dirençli olduklar, direncin plazmid kaynakl olabilmesi ve hastane içinde kullan lan antibiyotiklerin seçici bask s yüzünden ayn anda farkl kökenlerde direncin geliflmesi nedeni ile zay f ay rt edici güçte bulunur. Duyarl, ara duyarl ve dirençli fleklinde s n flama yorumlar 112 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2

8 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, fiekil 3. AP-PCR yöntemi ile farkl izolatlardan elde edilen ço altma ürünleri. Bu ürünlerin elektroforezi sonucu elde edilen bant paternleri. (Kolon1: Molekül a rl k standard Kolon 2-7,10 ve 11: Ayn bant paterni gösteren izolatlar; Kolon 8 ve 9: Farkl bant paterni gösteren izolatlar). bu amaç için yetersiz olup inhibisyon zon çaplar n n de erlendirilmesi gerekir (14). Bu çal flmada kullan lan kantitatif antibiyogram tipleme inhibisyon zon çaplar n de erlendirerek yap lmakta ve antibiyogram tiplemenin tüm avantajlar n içermektedir. MRSA kökenlerinin moleküler tiplemesi temel ve epidemiyolojik MRSA çal flmalar nda büyük ümitler vaad etmektedir. Halen alt n standart olarak kabul edilen faj tipleme yerine PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) tekni i önerilmektedir (26). Buna karfl n zahmetli ve zaman al c, bu nedenle de rutin kullan ma uygulanamayacak bu yöntemin yerine kromozomal DNA daki de ifliklikleri saptamaya yarayan di er tipleme yöntemlerine e ilim çok daha güçlüdür. Bu yöntemlerden biri olan AP-PCR n en önemli avantajlar çok yönlülü ü ve teknik aç dan basitli idir. Deney koflullar standardize edildikten sonra 48 saat gibi çok k sa bir sürede bir çok köken birden çal fl labilerek bir bölgedeki veya hastanedeki epideminin kayna saptanabilir (27). Epidemiyolojik verileri önemsemeden yaln zca tipleme yöntemine güvenilmemelidir. Yöntemlerin karfl laflt rmal çal flmalar nda alt n standart toplanan epidemiyolojik veriler olmal, laboratuvar verileri bu verilerle birlikte yorumlanmal d r (12). Bu çal flmada da ayn (ayn hastadan, ayn günde ve ayn yerden) veya yak n ba lant l (ayn hastadan farkl gün veya yerden) olmas gereken izolatlar birlikte çal fl larak yöntemlerin duyarl l k ve özgüllükleri incelenmifltir. Kulland m z her iki yöntem de bu kökenleri ayn tip olarak göstermesine karfl n çal fl lan 33 izolat kantitatif antibiyogram tipleme alt, AP-PCR dört gruba ay rm flt r. Kantitatif antibiyogramda büyük gruba dahil edilen, ancak AP-PCR taraf ndan farkl bulunan izolat 14, acil servise baflvuran bir hastaya aittir ve hastane içi kökenlerle epidemiyolojik ba lant s oldu una dair bir bulgu saptanamam flt r. Bu durum kantitatif antibiyogram n az da olsa rastlanan bir zay fl olarak düflünülmüfltür. Koroner yo un bak mdan izole edilen izolat 2 ve gö üs hastal klar servisinde saptanan izolat 15 kantitatif antibiyogramda büyük gruptan ayr olacak flekilde bir gruba sokulmufl, ancak AP- PCR taraf ndan büyük gruptan ay rt edilememifltir. Bu iki izolat için de hastanedeki di er kökenlerle epidemiyolojik ba lant kurulamam fl ve sporadik olarak nitelendirilmifllerdir. Bu durumda AP-PCR yönteminin ay rt edici gücü zay f kalm fl, kantitatif antibiyogram ise bu iki izolat büyük gruptan ay rd halde birbirinden ay ramam flt r. zolat 1 ve 4 de kantitatif antibiyogram ile ay rt edilmifl, ancak AP-PCR ile büyük gruptan ayr lamam flt r. zolat 1 iç hastal klar servisinde saptanan en eski MRSA d r ve sonradan kronik böbrek yetmezli i nedeniyle diyalize al nan iç hastal klar servisinin di er üç hastas ndan izole edilen MRSA larla zaman fark oldukça fazlad r. zolat 4 ise beyin cerrahisi servisindeki en eski izolatt r. Dolay s yla bu iki izolat bu servislerde daha sonra görülen bask n klonla epidemiyolojik olarak ba lant s z görülmektedir. Olas l kla bu iki servis hastane içindeki bask n kökeni daha sonradan ortopedi veya merkez yo un bak m ünitesi (MYBÜ) nden alm fllard r. O halde, AP- PCR bu bahsedilen izolatlar için zay f ay rt edici güçte kalm fl olabilir. MRSA için kullan lan tipleme yöntemlerinin uyuflmayan sonuçlar n yorumlamak için herhangi bir ilke saptanmam flt r. Bu durumda bir yöntemin fazla ay rt edici oldu- u ileri sürülebilir (28). Ancak çok say daki MRSA klonu endemik bir MRSA zeminine toplumdan veya di er hastanelerden yeni kökenlerin araya giriflini de yans tabilir. Bu durumda toplum ve Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2 113

9 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un di er hastaneler farkl MRSA kökenleri için sürekli bir kaynak oluflturmaktad rlar (29). meca geni bulunamayan, ancak oksasilin M K de eri 256 µg/ml den yüksek bulunan izolat 16 her iki yöntemle de ay rt edilebilmifltir. Bu çal flmada hem kantitatif antibiyogram, hem de AP-PCR tipleme yöntemleri de iflik kökenlerin araya girmesine karfl n bir özel kökenin zaman içinde TÜH de endemik hale geldi ini göstermektedir. Bu kökenin ilk örne i izolat 3 olup Ekim 1994 te ortopedi klini inde saptanm flt r. Bu klonun TÜH e girifli çal flma dönemimiz öncesinde de olabilir. MYBÜ ise 1995 y l içinde aç lm flt r ve bu birimde ilk izolasyon te trafik kazas nedeniyle yat r lan bir hastaya aittir. Bu nedenle MYBÜ de sonradan endemik hale geçen klonun ilk kayna n n ortopedi oldu u düflünülmüfltür. Yerleflmeyi kolaylaflt racak di er faktörler ise olas l kla yüksek hasta say s, yetersiz personel, bu iki faktörün etkiledi i infeksiyon kontrol önlemlerinde, baflta el y kama olmak üzere aksamalar ve son olarak MRSA yerleflimini kolaylaflt racak afl r antibiyotik kullan m d r. Üçüncü kuflak sefalosporinler, imipenem ve aminoglikozitlerin yo un kullan m MRSA kökenlerinde di er S. aureus kökenleri içinde seçici bask sa layarak yay lmay kolaylaflt rmaktad r (30). Bu say lan faktörler özellikle hastanemiz yo un bak m biriminde belirgindir. Daha sonra MYBÜ tüm hastaneye klonun yay lmas için merkez görevini görmüfltür. Hastane içinde de iflik servislere yay l m n yolu servisler aras nakledilen hastalar yan s ra konsültan hekimler hatta t p ö rencileri olabilir. Sonuç olarak S. aureus izolatlar içinde 1995 y - l nda %48 e ulaflan metisilin direnci nedeniyle TÜH flu anda MRSA n n endemik oldu u bir hastanedir. Direnç özellikle bir klonun yay lmas na ba l d r. Hastanemiz infeksiyon kontrol ekibi taraf ndan mücadele sürdürülmekte ise de halen bu klonun eradike edilmesi güç görünmektedir. KAYNAKLAR 1. Barber M. Methicillin resistant stapylococci. J Clin Pathol 1961;14: Brumfitt W, Hamilton-Miller J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. N Eng J Med 1989; 320: Ar kan S, Taflova Y, Gür D, Özkuyumcu C, Ünal S, Akal n HE. Klinik örneklerden izole edilen stafilokoklar n antibiyotiklere duyarl l klar n n araflt r lmas. 5. Ulusal nfeksiyon Hastal klar Kongresi, 4-6 Eylül 1995, stanbul, Kongre Kitab 1995; Gürler N, Öngen B, Atilla A, Öksüz L, Töreci K. Gram pozitif koklarda seçimsiz duyarl l k deneylerinde saptanan direnç oranlar. ANKEM Derg 1995;9: Öztürk R, Midilli K, Ergin S, Aygün G. Cerrahpafla T p Fakültesi kliniklerinde yatan hastalar n klinik materyallerinden izole edilen stafilokoklar n antimikrobik maddelere duyarl l. ANKEM Derg 1995;9: Çetinkaya Y, Ünal S: Metisilin Derinçli Staphylococcus aureus infeksiyonlar : Epidemiyoloji ve kontrol. Flora 1996;1(3 ek): Akgül A, Dündar V, Metin T, Selçuk S: Haydarpafla Numune Hastanesi nde burun tafl y c lar ndan izole edilen Staphylococcus aureus sufllar nda oksasilin direnci. ANKEM Derg 1992;6: Fang FC, McClelland M, Guiney D, et al. Value of molecular analysis in a nozocomial methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreak. JAMA 1993;270: Kreiswirth B, Kornblum J, Arbeit RD, et al. Evidence for a clonal origin of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Science 1993;259: Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32: Mulligan ME. Epidemiologic and clinical utility of typing systems for differentiating among strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infect Cont Hosp Epidemiol 1991;12: Blanc DS, Christiane P, Moreillon P, Wenger A, Bille J, Francioli P. Quantitative antibiogram as a typing method for the prospective epidemiological surveillance and control of MRSA: Comparison with molecular typing. Infect Cont Hosp Epidemiol 1996;17: Giacca M, Menzo S, Trojan S, Monti-Bragadin C. Cluster analysis of antibiotic susceptibility patterns of clinical isolates as a tool in nozocomial infection surveillance. Eur J Epidemiol 1987;3: Blanc DS, Lugeon C, Wenger A, Siegrist HH, Francioli P. Quantitative antibiogram typing using inhibition zone diameters compared with ribotyping for epidemiological typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32: Otkun M, Akata F, Teker B ve arkadafllar Nozocomial infections in a third level education hospital in Türkiye: Trakya University Hospital First European Congress of Chemotherapy May 1996 Glaskow, Scotland. Abstract Book, Abstract No: Kloos WE, Lambe WD Jr. Staphylococcus. In: Balows A, Hausler WJ Jr, Herrman KL, Isenberg HD, Shadomy HJ (ed). Manual of Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC. American Society for Microbiology 1991: National Committee for Clinical Laboratory Stardards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Third edition; Approved standard. NCCLS Document M7-A3, Villanova, PA: NCCLS, Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2

10 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus un Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, 18. Richard P, Meyran M, Carpentier E, Thabaut A, Drugeon HB. Comparison of phenotypic methods and DNA hybridization for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32: Unal S, Hoskins J, Flokowitsch JE, Ernie Wu CY, Preston DA, Skatrud PL. Detection of methicillinresistant staphylococci by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, Fourth edition. Approved standard, NCCLS Document M2-A4, vol.10. Villanova, PA: NCCLS, Bellum A, Kluytumans J, Leeuwen et al. Multicenter evaluation of Arbitrarily primed PCR for typing of Staphylococcus aureus strains. J. Clin Microbiol; 1995;33: Liu PY, Shi Z, Lau Y et al. Use of restriction endonuclease analysis of plasmids and pulsed fiels gel electrophoresis to investigate outbreaks of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis 1996;22: Mulligan ME, Arbeit RD: Epidemiologic and clinical utility of typing systems for differentiating among strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infect Cont Hosp Epidemiol 1991;12: Maslow JN, Mulligan ME, Arbeit RD: Molecular epidemiology: The application of contemporary techniques to typing bacteria. Clin Infect Dis 1993;17: Archer GL, Mayhall CG. Comparison of epidemiological markers used in the investigation of an outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. J Clin Microbiol 1983:18; Saulnier P, Bourneix C, Prévost G, Andremont A. Random amplified polymorphic DNA assay is less discriminant than pulsed-field gel electrophoresis for typing strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1993;31: Struelens MJ, Bax R, Deplano A, Quint WGV, Van Belkum A. Concordant clonal delineation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by macrorestriction analysis and polimerase chain reaction genome fingerprinting. J Clin Microbiol 1993;31: Jorgensen M, Givney R, Pegler M, Vickery A, Funnell G. Typing multidrug resistant Staphylococcus aureus: Conflicting epidemiological data produced by genotypic and phenotypic methods clarified by phylogenetic analysis. J Clin Microbiol 1996;34: Couto I, Melo-Christino J, Fernandes ML, et al. Unusually large number of methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in a Portuguese hospital. J Clin Microbiol 1995;33: Jacob J, Meers PD. Partial characterization of an endemic strain of a methicillin- and aminoglycoside-resistant Staphylococcus aureus (MARSA) homogeneously resistant to beta-lactam antibiotics. J Hosp Infect 1992;21: YAZIfiMA ADRES : Prof. Dr. Serhat ÜNAL Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi ç Hastal klar Anabilim Dal nfeksiyon Hastal klar Ünitesi Hacettepe-ANKARA Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1997; 1: 2 115