KARABAŞ OTU (Lavandula stoechas L.) BİTKİSİNİN FARKLI IN VITRO BESİN ORTAMLARINDA KÜLTÜRE ALINMASI

Transkript

1 II EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) KARABAŞ OTU (Lavandula stoechas L.) BİTKİSİNİN FARKLI IN VITRO BESİN ORTAMLARINDA KÜLTÜRE ALINMASI Serpil ORHAN Biyomühendislik Anabilim Dalı Sunuş Tarihi: Tez Danışmanı: Prof. Dr. Aynur GÜREL

2 III III Serpil Orhan tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan Karabaş Otu (Lavandula stoechas L.) Bitkisinin Farklı In Vitro Besin Ortamlarında Kültüre Alınması başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve 07/08/2007 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: İmza Jüri Başkanı: Prof. Dr. Aynur GÜREL Raportör Üye: Prof. Dr. Emine BAYRAM Üye: Doç Dr. Erdal Bedir.....

3 IV

4 V V ÖZET KARABAŞ OTU (Lavandula stoechas L.) BİTKİSİNİN FARKLI IN VITRO BESİN ORTAMLARINDA KÜLTÜRE ALINMASI ORHAN, Serpil Yüksek Lisans Tezi, Biyomühendislik Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Aynur GÜREL Ağustos, 2007 Bu tezde, tıbbi ve aromatik özelliklere sahip karabaş otu bitkisine ait sürgün nod eksplantlarının farklı besin ortamlarındaki büyüme parametreleri incelenmiştir. Çimlendirme, sürgün oluşumu ve gelişimi ile köklendirme için uygun besin ortamları belirlenmiştir. En iyi çimlendirmeler (%97), 1 mg/l Benzil Amino Pürin (BAP) içeren Murashige ve Skoog (1962) (MS) besin ortamında gerçekleştirilmiştir. Çimlendirilen iki adet karabaş otu tohumundan elde edilen sürgün nod eksplantlarından in vitro bitki klonları (klon 1 ve klon 2) çoğaltılmıştır. Klon 1 bitkiciklerinin sürgün nod eksplantları 9 farklı MS ortamına aktarılmış ve büyüme parametreleri; sürgün uzunluğu, sürgün sayısı, sürgündeki nod sayısı ve kök sayısı ile kallus oluşturan eksplant yüzdesi incelenmiştir. Klon 1 bitkiciklerine ait sürgün nod eksplantlarında, 0,1 mg/l Naftalen Asetik Asit (NAA) (ortalama 3,6 sürgün/eksplant, 8,44 nod/eksplant) ve 0,5 mg/l İndol Bütirik asit (IBA) (ortalama 3,44 sürgün/eksplant, 8,62 nod/eksplant) içeren MS ortamlarında en iyi sürgün gelişimleri sağlanmıştır. En iyi köklenmeler ise 1 mg/l NAA (ortalama 3,44 kök/eksplant) ve 0,5 mg/l NAA (ortalama 2,29 kök/eksplant) içeren MS ortamlarında gözlenmiştir. Kültüre alınan eksplantlarda en uzun boylu bitkicikler (ortalama 2,23 cm) 0,1 mg/l IBA içeren MS ortamında elde edilmiştir. Sürgün nod eksplantları, 1 mg/l BAP (%68,09) ve 0,5 mg/l BAP (%37,77) içeren MS ortamında yüksek oranda kallus oluşturmuşlardır. Klon 2 bitkiciklerinden alınan sürgün nod eksplantları 2 farklı MS ortamına aktarılmış ve elde edilen büyüme parametreleri klon 1 bitkilerinin büyüme parametreleri ile karşılaştırılmıştır. Büyüme parametreleri için

5 VI VI yapılan istatistiki değerlendirmede iki klon arasındaki farklılıklar önemsiz bulunmuştur. Tüm kültürlerde, 4000 lux aydınlatma, 27±4ºC sıcaklık ve 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık fotoperiyot kullanılmıştır. Anahtar Sözcükler: Lavandula stoechas L., karabaş otu, in vitro, klon, büyüme parametreleri.

6 VII VII ABSTRACT CULTIVATION of SPANISH LAVENDER (Lavandula stoechas L.) in DIFFIRENT IN VITRO NUTRIENT MEDIA ORHAN, Serpil M.Sc. Thesis. Bioengineering Department Supervisor: Prof. Dr. Aynur GÜREL August, 2007 In this thesis, growth parameters of nodal shoot explants of Spanish lavender a well known aromatic and medicinal plant were investigated in different culture media. Optimum nutrient media were determined for germination, shoot formation, development and rooting. The best germination in seeds was obtained on Murashige and Skoog, (1962) (MS) medium supplemented with 1 mg/l Benzyl Amino Purine (BAP) (%97). In vitro plant lines (clone 1 and clone 2) were propagated from nodal shoot explants of two germinated seeds. Nodal shoot explants of clone 1 plantlets were transferred on 9 different MS media and growth parameters (plantlet length, shoot number, nodal segment number and root number on shoot and percentage of shoots possessing callus formation) were investigated. The best shoot development in nodal shoot explants of clone 1 plantlets was obtained on MS medium supplemented with 0,1 mg/l Naphthalene acetic acid (NAA) (3,6 average number of shoots/explant, 8,44 average number of nodal segments/explant) and 0,5 mg/l Indole Butyric acid (IBA) (3,44 average number of shoots/explant, 8,62 average number of nodal segments/explant). The best root development was obtained on MS medium supplemented with 1 mg/l NAA (3,44 average number of roots/explant) and 0,5 mg/l NAA (2.29 average number of roots/explant). The tallest plantlets (2,23 cm average plant length) were observed on MS medium supplemented with 0,1 mg/l IBA. The nodal shoot explants induced high percentage of callus formation on MS medium supplemented with 1 mg/l BAP (%68,09) and 0,5 mg/l BAP (%37,77). Nodal shoot explants of clone 2 plantlets were transferred

7 VIII VIII to 2 different MS media. Then growth parameters of clone 2 plantlets in two media were compared with those of clone 1. Between two lines there weren t significant differences on growth parameters. All cultures were incubated at 27 ± 4 0 C under a light intensity of 4000 lux, with 16 hour photoperiod. Key Words: Lavandula stoechas L., Spanish lavender, in vitro, clone, growth parameters.

8 IX IX TEŞEKKÜR Bu tez çalışmasını bana veren ve her türlü desteği sağlayan, sayın Prof. Dr. Aynur GÜREL e, tez konusunun belirlenmesinde yardımlarını esirgemeyen ve kullandığım karabaş otu tohumlarını sağlayan Çanakkale On Sekiz Mart Üniversitesi öğretim üyesi sayın Doç. Dr. Hakan Turhan a, uygulamanın gerçekleştirilebilmesi için laboratuar ve malzeme desteği sağlayan ASGEN Tarım Ticaret A.Ş. Doku Kültürü Üretim Laboratuarı yöneticilerine, manevi desteklerinden dolayı aileme ve arkadaşlarıma teşekkürü bir borç bilirim.

9 X X İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... V ABSTRACT...VII TEŞEKKÜR...IX İÇİNDEKİLER... X ŞEKİLLER DİZİNİ... XIII ÇİZELGELER DİZİNİ...XVI 1. GİRİŞ LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ Bitkisel Özellikler Tıbbi Özellikleri Lavandula stoechas L. deki Doku Kültürü Çalışmaları MATERYAL ve METOD Materyal... 15

10 XI XI İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.2.Metod Besin ortamlarının hazırlanması Tohum sterilizasyonu Tohumların çimlendirme ortamına alınması Sürgün nod eksplantlarının sürgün gelişimi ortamlarında kültüre alınması Sürgün nod eksplantlarının kök gelişimi ortamlarında kültüre alınması Sürgün nod eksplantlarından tek tohum kökenli klonların çoğaltılması Kültür koşulları Denemenin kurulması ve verilerin değerlendirilmesi BULGULAR Kültüre alınan tohumlarda kontaminasyon durumu Kültüre alınan tohumlarda görülen gelişmeler Lavandula stoechas L. bitkilerinde in vitro sürgün gelişimi Lavandula stoechas L. bitkilerinde in vitro kök gelişimi Farklı besin ortamlarının in vitro Lavandula stoechas L. klonu üzerine etkileri TARTIŞMA ve SONUÇ...40

11 XII XII İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa KAYNAKLAR DİZİNİ ÖZGEÇMİŞ... 47

12 XIII XIII ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 2.1 (a) Lavandula stoechas yaprakları (b) Lavandula stoechas çiçekleri Lavandula vera DC nin in vitro çoğaltım potansiyeline büyüme düzenleyicilerinin etkisi (Andrade, 1999) (a) Çalışmada kullanılan karabaş otu tohumlarının elde edildiği kuru çiçekler (b) Çalışmada kullanılan karabaş otu tohumları Tohumların kullanılan sterilizasyon yöntemlerine göre kontaminasyon yüzdeleri Kültüre alınan tohumlarda çimlenme durumları (a) MS 1BAP ortamında kültüre alınan Lavandula stoechas L. tohumları (b) MS 1IBA ortamında çimlenen Lavandula stoechas L. tohumu (a) ve (b) Lavandula stoechas L. de sürgün gelişimleri Sürgün ortamlarında kültüre alınan 2-3 nodlu sürgün eksplantlarında görülen gelişmeler Sürgün gelişim ortamlarına alınan 2-3 nodlu sürgün eksplantlarında kallus oluşumu (a) ve (b) Lavandula stoechas L. de kök gelişimleri Kök gelişim ortamlarında kültüre alınan 2-3 nodlu sürgün eksplantlarında ortalama kök sayıları...29

13 XIV XIV ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) Şekil Sayfa 4.9 (a) ve (b) Lavandula stoechas L. bitkiciklerinin kök bölgesinde kallus gelişimleri Kök gelişim ortamlarına alınan 2-3 nodlu sürgün eksplantlarında kallus oluşumu (a) In vitro da geliştirilen uzun Lavandula stoechas L. sürgünü (MS 0,1IBA ortamında) (b) In vitro da geliştirilen kısa L. stoechas L. sürgünleri (MS 0,5BAP ortamında) (a) ve (b) 7 no lu ortamda (MS 0,1NAA) oluşan çoklu sürgünler (c) ve (d) 4 no lu ortamda (MS 0,1IBA) oluşan sürgünler (e) 9 no lu ortamda (MS 1NAA) oluşan çoklu sürgünler (f) 5 no lu ortamda (MS 0,5 IBA) oluşan tek sürgün üzerindeki sık nodlar (a) 1 No lu ortamdaki (MS 0,1BAP) köklü bitki (b) ve (c) 9 no lu ortamdaki (MS 1NAA) köklü bitkiler (d) 8 no lu ortamdaki (MS 0,5NAA) köklü bitki (a) ve (b) 6 No lu ortamda (MS 1IBA) kültüre alınan sürgün nod eksplantlarında gelişen kökler (a) 1 no lu ortamdaki (MS 0,1BAP) kalluslu bitki (b) 2 no lu ortamdaki (MS 0,5BAP) kalluslu bitki (a) ve (b) 3 No lu ortamda (MS 1BAP) kültüre alınan sürgün nod eksplantlarında oluşan kalluslar Dokuz farklı ortamda kültüre alınan klon 1 bitkilerine ait sürgün nod eksplantlarında görülen gelişmeler...36

14 XV XV ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) Şekil Sayfa 4.18 Dokuz farklı ortamda kültüre alınan klon 1 bitkiciklerine ait sürgün nod eksplantlarının kallus oluşturma yüzdeleri İki farklı ortamda kültüre alınan klon 1 ve klon 2 bitkiciklerine ait sürgün nod eksplantlarındaki gelişmeler İki farklı ortamda kültüre alınan klon 1 ve klon 2 bitkiciklerine ait sürgün nod eksplantlarının kallus oluşturma yüzdeleri...39

15 XVI XVI ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa 2.1 Lavandula stoechas L. bitkisinin aroma profili* Hatay yöresinde iki farklı lokasyondan alınan lavanta bitkilerinde uçucu yağ oranları (%) Farklı yörelerden alınan karabaş lavanta çeliklerinde köklenme oranı (%) Farklı yörelerden alınan karabaş lavanta çeliklerinde IBA konsantrasyonlarına göre kök uzunluğu ve kök sayısı MS (1962) besin ortamının içerdiği maddeler ve miktarları Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemleri Tohumların çimlendirilmesinde kullanılan ortamlar Sürgün gelişimi için kullanılan besin ortamlarının kompozisyonları Kök gelişimi için kullanılan besin ortamları Bitki büyüme düzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L. e ait klon 1 bitkilerinin büyüme parametreleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kullanılan ortamlar Bitki büyüme düzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L. e ait klon 2 bitkilerinin büyüme parametreleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kullanılan ortamlar Tohumların yüzeysel sterilizasyonları sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdeleri Kültüre alınan tohumlarda çimlenme durumları Sürgün ortamlarında kültüre alınan 2-3 nodlu sürgün eksplantlarında görülen gelişmeler....25

16 XVII XVII ÇİZELGELER DİZİNİ (devam) Çizelge Sayfa 4.4 Köklendirme ortamlarında kültüre alınan 2-3 nodlu sürgün eksplantlarında görülen gelişmeler Farklı büyüme düzenleyicileri içeren ortamların Lavandula stoechas L. klon 1 bitkilerinin büyüme parametrelerine etkisi Farklı büyüme düzenleyicileri içeren ortamların Lavandula stoechas L. klon 2 bitkilerinin büyüme parametrelerine etkisi 31

17

18 1 1. GİRİŞ Ülkemizde doğal olarak yetişen ve halk arasında karabaş otu, gargan otu ya da keşiş otu olarak bilinen Lavandula stoechas L., Lamiaceae (Ballıbabagiller) familyasına ait aromatik bir bitkidir. Yüzyıllardır Anadolu halk hekimliğinde antiseptik ve yara iyi edici gibi etkileri başta olmak üzere farklı rahatsızlıkların tedavisinde kullanılmaktadır (Ayral, 1997; Öztürk ve ark., 2005). Dünyada başlıca Güney Avrupa, Cezayir, Tunus, Kanarya Adaları, Güneybatı Asya ve Suriye de yayılış gösteren karabaş otu, ülkemizde özellikle Çanakkale, İstanbul, İstanbul-Büyükada, İzmit-Hereke, Balıkesir-Kazdağı, İzmir, Muğla, Datça, Antalya- Tekirova, İçel-Anamur, Hatay-Samandağı, Yayladağı bölgelerinde yetişmektedir (Ayral, 1997; Yenici, 1999). Lavandula stoechas L., habitat olarak kuru tepelerde, açık ormanlarda, kireçtaşlı ve granitli topraklarda yaşar. Bununla beraber, hemen hemen her çeşit toprakta, özellikle kuru ve çok asidik olmayan topraklarda yetişmektedir. Güneşli pozisyonda, nötralden alkaliye doğru bir toprağı tercih eden bitki kireçli toprakta da iyi yetişmektedir. Sıcak ve kuru ortamları sever, kuraklığa ve -5 ile -10 o C arasındaki soğuğa toleranslıdır (Yenici, 1999). Karabaş otunun tohum olgunlaşma zamanı Temmuz, Ağustos ve Eylül aylarıdır. İlkbaharda seraya ekilen tohumlar, üzerleri kapatılacak kadar gömülürler. Genellikle 1 3 ay içinde, 15 o C de çimlenmeler gerçekleşir. Fideler, ele alınacak kadar büyüdüklerinde hafifçe kendi saksılarından alınıp serada ilk kışları için yetiştirilirler. Daha sonra ilkbaharın ve don olaylarının geçmesi beklenir. Temmuz ve Ağustos aylarında yarı olgun dallar 7 10 cm ye ulaştığında kesilerek köklenme ortamına alınır ve birkaç hafta içinde yüksek oranda köklenirler. Çiçeklenme zamanı Mayıs, Haziran, Temmuz aylarıdır (Yenici, 1999). Karabaş lavanta çiçeği (Flos Lavandula romanae), L. stoechas L. nin kurutulmuş çiçek durumlarıdır. Eski yazarlar tarafından çok önem verilen bir drogdur. Ağrı kesici, antiseptik, yara iyi edici, yatıştırıcı (sara ve astımda), balgam söktürücü, idrar yolları iltihaplarını giderici, egzama yaralarını iyi edici, sinir ve kalp kuvvetlendirici gibi etkileri nedeniyle geniş bir kullanım alanı bulmuştur (Baytop, 1999).

19 2 Karabaş uçucu yağı (Oleum Lavandulae romanae), karabaş otu bitkisinin toprak üstü kısımlarından su buharı distilasyonu ile elde edilen bir uçucu yağdır. Kafur, fenkon, borneol, terpinol, sineol gibi bileşikler taşımaktadır. Haricen ve dahilen antiseptik ve yara iyi edici olarak kullanılmaktadır (Baytop, 1999). Karabaş otu, çiçeklenme süresinin uzun olması nedeniyle önemli ballı bitkiler listesinde yer almaktadır. Karabaş otunun balı oldukça açık sarı renkli olup kısmen geç kristalleşir. Kristalleştiği zaman ince granüller oluşturur. Balın nane kokusuna benzer bir kokusu vardır (Sıralı, 2002; Anonim, 2007a). Karabaş otu tıbbi ve aromatik amaçla kullanımı dışında güzel kokusu ve görünümü ile çevre düzenleme çalışmaları için önemli bir potansiyele sahiptir. Ayrıca insan beslenmesinden hayvan beslenmesine kadar hatta organik tarımda organik preparat (böcek kaçırıcı, allelopatik etkisi, vb.) olarak ta kullanılma olanakları olan bir bitkidir. Günümüzde doğal bileşiklerin öneminin artması bu gibi bitkilere duyulan ilgiyi arttırmaktadır (Ayanoğlu ve ark., 2000). Tıbbi ve aromatik bitkilerde etken maddeler, genotip ve çevreye bağlı olarak değişkenlik gösterir. Ticari olarak bir bitkinin üretilmesinde standardizasyon gereklidir. Bu nedenle, doku kültürü yöntemiyle aynı genetik yapıya sahip karabaş otu fidelerinin üretilmesi önemlidir. Ayrıca, karabaş otu tohumlarının çok küçük olması doğrudan ekim yapılmasında güçlüğe neden olmaktadır. Yine doku kültürü yöntemiyle üretimde, iklim faktörleri üretimi sınırlamayacağı için hedeflenen bitki materyaline ulaşmak daha kolaydır. Bu proje ile karabaş otunun (Lavandula stoechas L.) doku kültüründe başarıyla üretilmesi ve farklı in vitro kültür ortamlarının bitki gelişimi üzerine etkisinin saptanması amaçlanmıştır. Değeri yeni anlaşılmaya başlanan tıbbi ve aromatik bitkilerden biri olan karabaş otunun mikroçoğaltımı, bu proje sonuçlarının değerlendirilmesiyle yapılabilir. Buna ilave olarak, elde edilecek bulgular, ileride gerçekleştirilmesi planlanan karabaş otuna ait sekonder metabolitlerin hücre ve doku kültürü yöntemleri kullanılarak üretilmesi ile ilgili çalışmalar için de kaynak olarak kullanılabilecektir.

20 3 2. LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ 2.1. Bitkisel Özellikler Lamiaceae (Ballıbabagiller) familyası; çoğu tek veya çok yıllık, otsu, az bir kısmı sarılıcı bitkilerdir. Gövdeleri çoğunlukla dört köşelidir ve genellikle aromatik yağlara sahiptirler. Çok geniş bir familya olup 200 cins ve 3200 kadar türü vardır. Yetişme merkezi Akdeniz bölgesi olmakla birlikte, dünyanın hemen her yerinde yayılış göstermektedir. Ekonomik olarak önemli olan bu familya hem aromatik uçucu yağlarca zengin, hem de bahçelerde süs bitkisi olarak yetişebilecek pek çok türe sahiptir. Bunlardan elde edilen uçucu yağlar tıpta ve parfümeride kullanılmaktadır (Yenici, 1999). Lavandula cinsi Lamiaceae familyasına ait olup, çok yıllık, aromatik çiçekler ve yeşil yapraklar içeren türlere sahiptir (Anonim, 2007b). Bu türler arasında bulunan Lavandula stoechas L., cm yükseklikte, güzel görünüşlü, tüylü, kuvvetli kokulu, çalı formunda ve çok yıllık bir bitkidir. Zengin topraklarda yetişirken bitki çok yaprak yetiştirme eğilimindedir, ama az uçucu yağ verir. Bitki yeşil yapraklı, 1-12 arasında değişen sayıda yaprakları (Şekil 2.1a) tek parça lineer, kenarlar alta doğru kıvrıktır. Çok sayıda dala sahiptir. Dallar, 2 10 kadar çiçekli dairelerle sonlanır. Dalların ucunda silindirik durumda, sık başaklar şeklinde bulunan çiçekler (Şekil 2.1b) siyahımsı mor renklidir. Gövdenin en üstünde fertil küçük çiçekler ile böcekleri çeken dalların üstünde bulunan infertil çiçeklere ve yanında fertil çiçeklere sahiptir. Bitki çiçek durumu sapına göre iki alttüre ayrılır; subsp. stoechas - çiçek sapı: 0,5 2,5 cm, çiçek durumundan daha kısa, subsp. cariensis - çiçek sapı: 5 20 cm, çiçek durumundan daha uzun (Ayral, 1997; Baytop, 1999; Yenici, 1999).

21 4 (a) (b) Şekil 2.1 (a) Lavandula stoechas yaprakları (b) Lavandula stoechas çiçekleri 2.2. Tıbbi Özellikleri Bugün alternatif tıpta kullanılan pek çok bitki arasında bulunan Lavandula türleri, hem halk ilacı olarak, hem de pek çok preparatın bileşimine girmesi nedeniyle önemli bir yere sahiptir (Yenici, 1999). Lavandula türlerinin ait olduğu Lamiaceae familyası bitkileri, terpenoid bileşikler bakımından zengindir, ayrıca uçucu yağlar, flavonoidler, kumarinler ve az da olsa kinoid yapıda maddelerle bazı basit alkaloitler taşırlar. Dünyada Lavandula türleri üzerinde pek çok araştırma yapılmış ve yapılmaktadır. Bugün Lavandula türlerinden elde edilen droglar birçok farmakopede kayıtlı olup çeşitli amaçlarla kullanılmaktadır (Ayral, 1997). Lavandula stoechas L. bitkisinden özellikle drog olarak pek çok eski yazar söz etmektedir. Osmanlı İmparatorluğu döneminde bu bitkinin kolera tedavisinde kullanılması ve eczanelerde sattırılması ile ilgili 1848 yılında çıkmış bir padişah emri de bulunmaktadır (Yenici, 1999). Lavandula stoechas L., bir glikozit, saponinler ve uçucu yağ taşımaktadır. Türkiye de yetiştirilen Lavandula stoechas L. bitkisinin içeriğini oluşturan uçucu yağ bileşenleri ayrılmıştır. Çeşitli kromatografik yöntemlerle yapılan çalışmalarda ortalama %0,5-0,7 verimle elde edilen uçucu yağ başlıca kafur, fenkon, borneol, terpinol, sineol linalol, linalil asetat, bornil asetat ve kadinen taşımaktadır (Çizelge 2.1). Türkiye de

22 5 yetişen türlerde keton miktarının çok yüksek olduğu ve bu bakımdan Avrupa da yetişen türlerin uçucu yağından farklı olduğu bilinmektedir. Uçucu yağı %30 kafur ve %18 fenkon taşımaktadır, yani uçucu yağın yarısını ketonlar oluşturmaktadır. Bu uçucu yağda linalol miktarı %0,6 kadardır. Bu bakımdan Türkiye de yetişmekte olan türler linalol kaynağı değil, kafur kaynağı olarak yararlanılabilecek bitkilerdir. Doğal kafur dekstrojir bir maddedir. Kalp ve solunum analeptiği olarak sodyum kamfosülfonat sulu çözeltileri kullanılmıştır. Akciğer ve solunum yollarında antiseptik bir etki meydana getirdiğinden kafur taşıyan preparatlar buğu şeklinde veya kafur taşıyan pomatlar göğüs ve sırta sürülmek suretiyle kullanılmaktadır. Kafur elde edildikten sonra kalan uçucu yağdaki safrol, sabun sanayi ile vanilin ya da helyotropin sentezinde başlangıç maddesi olarak kullanılır. Ayrıca selüloit sanayinde faydalanılan bir madde olarak önem taşımaktadır (Ayral, 1997; Dülger ve Uğurlu, 1998; Baytop, 1999; Yenici, 1999). Lavandula stoechas L. türünün yaprak ve çiçeklerinden elde edilen uçucu yağın kokusu hoş olmadığından, esansı parfümeri endüstrisinden ziyade eczacılıkta kullanılmaktadır (Ayanoğlu ve ark., 2000). Bitkinin Anadolu halk hekimliğinde antiseptik ve yara iyi edici gibi etkileri başta olmak üzere farklı rahatsızlıkların tedavisinde kullanıldığı kayıtlıdır. Öztürk ve ark., İzmir yöresindeki yabani Lavandula stoechas L. subsp. stoechas taksonundan elde edilen uçucu yağın antibakteriyel ve antifungal kapasitesini araştırmışlardır. Bitkinin toprak üstü kısımları distillenerek uçucu yağı elde edilmiş ve % 1,1 oranında uçucu yağ içerdiği tespit edilmiştir. Yapılan gaz kromatografisi - kütle spektrometresi (GC-MS) analizinde saptanan 26 bileşikten uçucu yağın % 91,63 üne karşılık gelen 8 tanesi tanımlanmış, ana bileşen % 43,47 ile kafur olarak saptanmıştır. Uçucu yağın antibakteriyel ve antifungal etki çalışmaları disk difüzyon yöntemiyle yapılmış ve Proteus vulgaris e (ATCC 6897) karşı standart antibiyotiklerden daha kuvvetli antibakteriyel, Candida albicans (ATCC 10239) fungusuna karşı Nistanin e yakın düzeyde antifungal etki gösterdiği belirlenmiştir (Öztürk ve ark, 2005). Eczacılıkta bitkinin ağrı kesici (özellikle baş ağrıları), antiseptik, balgam söktürücü, idrar yolları iltihaplarını giderici, egzama yaralarını iyi edici, sinir sistemini yatıştırıcı (sara ve astım için) ve kalp kuvvetlendirici gibi etkilerinden yararlanılmaktadır. Uçucu yağının zayıf beslenmeye, romatizmaya ve spazmlara karşı kullanıldığı bilinmektedir. Ayrıca uçucu yağının insan kolon kanseri hücrelerine, hormona bağlı insan prostat

23 6 kanseri hücrelerine karşı aktivite gösterdiği bulunmuştur (Ayral, 1997; Yenici, 1999; Ayanoğlu ve ark., 2000). Çizelge 2.1 Lavandula stoechas L. bitkisinin aroma profili*. Bileşen Yüzde Alpha-pinene 21 Sabinene 0,7 Beta-pinene 0,4 Myrcene 0,8 Cymenes** 0,7 Multi-component*** 20,8 Ocimene - Fenchone 33 Alpha-terpinolene 0,8 Linalool 0,6 Camphor 26,2 Polycyclic ketons** 0,6 Borneol - Lavandulal - Terpineols** 0,2 Methyl thymyl ether - Linalyl acetate - Bornyl acetate 0,3 Carvaerol - Neryl/gerarylacetate - Caryophyllene 0,5 Bergamoteres** - Germacrenes** - Selinenes** 0,2 Farnesenes** - Bisabolenes* 0,3 Cadinenes** 0,2 Selinadiene - Diğer sesquitepenes 0,4 Caryophyllene oksit - Bilinmeyen diterpenler <0,1 Total sesquiterpenes 1,7 * Bileşiklerin isimleri İngilizce sunulmuştur. **İzomerler toplamı ***Beta-phellandrene, cis ocimene, limonene, cineole içerebilir.

24 7 Karabaş otu çiçeklerinin göğüs, karaciğer, dalak ve bazı kanser tiplerinin iyileşmesinde kullanıldığı literatürde kayıtlıdır. Çiçekli dalları çay olarak öksürük ve bronşitte, soğuk algınlığında, baş ağrısında, ayrıca kum sancısı, ülser, mide ve göğüs ağrılarında ve kalp rahatsızlıklarında kullanılır. Diyabete de iyi geldiği söylenmektedir. Şeker hastaları tarafından bitkisel çay olarak tüketilmektedir. Alerjiye karşı dalları kaynatılıp suyunda banyo yapılır. Seboreik dermatit ve kepek önlemede yararlıdır (Ayral, 1997; Ayanoğlu ve ark., 2000; Ertuğ, 2002). Anadolu da diş ve diş eti ile ilgili hastalıkların tedavisinde halk arasında yaygın olarak kullanılan bitkiler üzerinde yapılan araştırmada karabaş otunun bu amaçla kullanıldığı saptanmıştır (Gürsoy ve Gürsoy 2004). Datça yarımadası (Muğla) florası ve bu yörede halkın yararlandığı bitkiler ile Bodrum yöresinde halk tıbbında yararlanılan bitkiler başlıklı araştırmalarda bu yörelerde Lavandula stoechas L. subsp. stoechas ın yaygın olarak, özellikle de çiçekli kısımlarından hazırlanan infüzyonun dahilen kolesterol düşürücü olarak kullanıldığı belirlenmiştir (Ertuğ, 2002; Tuzlacı, 2002). Karabaş otu bitkisi iyi bir haşarat ilacıdır. Büyük dozlarda kullanımı ise narkotik özelliktedir ve ölüme bile neden olabilir (Ayral, 1997). Lavandula stoechas L., bitkisinin alkol ve su ekstrelerinin fibrinolitik sistem üzerindeki etkilerinin araştırılması için bir çalışma yapılmıştır. Çalışma sonucunda karabaş otu ekstrelerinin in vitro olarak fibrinolitik sistemi (kan pıhtısı içindeki fibrinin çözülmesi sistemi) aktive ettiği gözlenmiştir. Böylece Lavandula stoechas L. bitkisinin, koroner sisteme, damar sistemine ve dolaşım sistemine katkıları olduğu fikri desteklenmiştir (Yenici, 1999). L. stoechas çiçeklerinin metanolik sıvı ekstraktı (LS) nın, antispazmodik ve antikonvülsant aktiviteleri incelenmiştir. LS (600mg/kg) farelerde test edildiğinde pentylene tetrazole (PZT) ile oluşturulan sarsılmaların, şiddetini azaltıp gecikmelerini sağlamıştır. LS aynı zamanda, PTZ nin letal etkisini azaltmıştır. Diazepam ın etkisine benzer şekilde farelerin uyku süresini uzattığı tespit edilmiş olup sakinleştirici etkisi olduğu ispatlanmıştır. LS, tavşandan izole edilen ince bağırsak preparasyonlarında, spontan kasılmaların doza bağlı ( mg/ml) gevşemesine neden olmuştur. LS nin benzer dozları aynı zamanda K(+) in oluşturduğu kasılmaları engellemiştir ve böylece

25 8 kalsiyum kanalları bloke edilmiştir. İnce bağırsak preperasyonları LS ile muamele edildiklerinde, standart bir kalsiyum kanalı bloke edici madde olan verapamil in etkisine benzer şekilde etki göstermişlerdir. Bu bilgi bitki ekstraktının antikonvülsant ve antispazmodik aktivite gösterdiğini bildirmektedir (Gilani et al., 2000). İtalya da yabani olarak yetişen Lavandula stoechas L. ssp. stoechas bitkilerinin yaprak ve gövdeleri ile çiçeklerinden, su buharı distilasyon yöntemi ile uçucu yağlar elde edilerek antifungal etkileri test edilmiş ve Rhizoctonia solani ile Fusarium oxysporum üzerinde oldukça etkili, Aspergillus flavus üzerinde ise daha az etkili olduğu saptanmıştır (Angioni et al., 2006). Domateste çürüklüğe neden olan Phytophthora infestans mantarına karşı alternatif fungusid bulmak amacıyla yapılan çalışmada, bazı aromatik bitkilerin toprak üstü parçalarından uçucu yağlar elde edilerek denemeler yapılmıştır. Lavandula stoechas subsp. stoechas ın yüksek konsantrasyonlarının (25,6 µg/ml), bu fungusun etkisini inhibe ettiği tespit edilmiştir (Soylu et al., 2006). Karabaş otu (Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) uçucu yağlarının kimyasal kompozisyonları ve Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium ve Staphylococcus aureus a karşı inhibitör etkilerinin araştırılması amacıyla yapılan bir çalışmada, uçucu yağların güçlü bir antibakteriyel etki gösterdiği tespit edilmiştir (Dadalioglu et al., 2004). Lavandula stoechas L. antimikrobiyal aktivitesinin test edilmesi amacıyla yapılan bir diğer çalışmada, elde edilen ekstraktların, bazı Gram (-) ve (+) bakteriler (özellikle Staphlococcus aureus ATCC 6538P ve Staphlococcus epidermidis NRRL B-4877), maya kültürleri (özellikle Kluyveromyces fragilis NRRL 2415 ve Torulopsis sp.), flamentöz funguslar (özellikle Botrytis cinaeriae, Fusarium oxysporium ve Trichophyton rubrum) üzerine karşı bir antimikrobiyal aktivite içerirken çalışmada kullanılan aktinomisetler üzerine bir antagonistik etkisinin olmadığı saptanmıştır (Dülger ve Uğurlu, 1999) Lavandula stoechas L. deki Doku Kültürü Çalışmaları Bilimsel yayınlarda Lavandula stoechas L. ile ilgili hücre ve doku kültürü konularında çok fazla çalışma bulunmamaktadır. Projemize kaynak oluşturması

26 9 bakımından diğer Lavandula türlerine ait doku kültürü ve çoğaltım çalışmaları incelenmiştir. Büyüme düzenleyicilerinin Lavandula dentata L. in vitro sürgün çoğaltımı ve sürgün gelişimi üzerine etkilerinin araştırılması amacıyla yapılan bir çalışmada, tarla koşullarında yetiştirilmiş olgun bitkilerden alınan koltuk altı tomurcukları kullanılmıştır. En yüksek çoğaltma katsayıları 2,2 µm benziladenin (BA) ve 2,5 µm indol-3-bütirik asit (IBA) içeren Murashige ve Skoog (MS) ortamında elde edilmiştir. Kök gelişimi için en iyi ortam 2,5 µm naftalen asetik asit (NAA) içeren MS ortamı olarak belirlenmiştir. Köklenen bitkiler başarılı bir şekilde toprağa aktarılmıştır. Kısa süre (6 ay) kültürde kalan bitkilerde normal gelişme gözlenirken, uzun süre (1 yıldan fazla) kültürde kalanlarda düşük frekanslarda ve kalıtsal olmayan morfolojik değişiklikler belirlenmiştir (Echeverrrigaray et al., 2005). Lavandin (Lavandula officinalis Chaix X Lavandula latifolia Villars) çeşidi Grosso nun in vitro çoğaltım metodunun tanımlanması için, 30 g/l sükroz, 7,5 g/l agar ve büyüme düzenleyicileri içeren Linsmaier ve Skoog kültür ortamları kullanılmıştır. Başlangıç materyali olarak gövde nod eksplantları alınmış ve çeşitli büyüme düzenleyicilerin etkileri karşılaştırılmıştır: 0,2 mg/l benzil amino pürin (BAP) (Ortam A); 0,2 mg/l BAP+0.5 mg/l giberellik asit (GA3) (Ortam B). Kültürler, başlangıçta 10 mg/l BAP içeren ortamda (Ortam C) 15 gün bırakılmış ve ardından A ya da B ortamlarına transfer edilmişlerdir (C/A; C/B). Tüm koşullarda çoğaltma katsayıları benzerdir. Ancak farklı kaynaklardan alınan eksplantlar farklı çoğalma katsayıları vermişlerdir. 1 mg/l NAA (Ortam F) içeren ortamda kök gelişimi sağlanmıştır. Kallus gelişimi için çiçek parçaları (tomurcuk, çanak), yaprak, gövde nodu ve sürgün ucu kullanılmıştır. 1 mg/l 2,4-diklorofenoksi asetik asit + 0,5 mg/l kinetin (Ortam E) içeren ortamda kallus oluşumu teşvik edilmiştir. Kallusların gelişimi ve organogenezis de gözlenmiştir. En fazla sürgün rejenerasyonu ve maksimum köklenme oranları gövde eksplantlarından gelişen kalluslardan elde edilmiştir. Köklü bitkicikler dış koşullara kolaylıkla adapte edilmişlerdir (Panizza and Tognoni, 1988). Lavandula angustifolia Mill in vitro mikroçoğaltımı için koltuk altı tomurcukları kullanılmıştır. Çoğaltım için NAA, BA ve bunların kombinasyonlarının kullanıldığı Hindistan cevizi sütü içeren ve içermeyen MS ortamları denenmiştir. Kültürler, 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık koşullarda 45 m E m 2 s -1 ışık şiddetinde sürdürülmüştür. 1,15 ya da 3,15 mg/l BA içeren ortamlarda en iyi gelişme sağlanmıştır. Bununla birlikte, 3,15

27 10 mg/l BA içeren ortamdaki sürgünler küçük yapraklı kompakt formda oluşmuştur. Bu sürgünler kesilip hormonsuz MS ortamına aktarıldıklarında, 45 gün sonra yapraklarda ve gövdede önemli büyüme sağlanmıştır. Sonrasında ise bitkisel materyal köklenme için kullanılmıştır. Kök teşviki, 0,2-0,4 mg/l IBA içeren ½ MS ortamında elde edilmiştir. Daha sonra, sürgünler saksılara transfer edilmiş ve başarılı bir şekilde seraya şaşırtılmışlardır (Portilla et al., 1995). Aseptik koşullarda yetiştirilen Lavandula latifolia ve Lavandula stoechas çöğürlerinden alınan kotiledon, hipokotil ve kök eksplantlarının morfogenik kapasiteleri incelenmiştir. Bunun için, farklı konsantrasyonlarda ve kombinasyonlarda oksin (IAA, NAA ya da 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) ve sitokinin (BA ya da Kinetin) kullanılmıştır. Denemelerin çoğunda kök gelişimi gerçekleşirken IAA ya da NAA içerenler ortamların daha verimli olduğu gözlenmiştir. Denenen tüm ortamlarda Lavandula stoechas tan alınan eksplantlar, sürgün üretiminde başarısız olurken Lavandula latifolia dan alınan hipokotil ve kotiledon eksplantları, yüksek oranda tomurcuk oluşturmuştur (Calvo and Segura, 1988). Lavandula viridis in vitro klonal çoğaltımı için eksplant olarak doğal ortamda gelişmiş yetişkin bitkiler kullanılmıştır. Tek nodlu eksplantlar 0,44 µm BA içeren MS ortamında kültüre alınmıştır. En yüksek çoğaltma katsayısı (11,69 sürgün/nod) 0,67 µm BAP içeren ½ MS ortamında gözlenmiştir. Sürgünler Gresshoff ve Doy ortamında kolaylıkla köklenmişlerdir. Şeker konsantrasyonunun 58,4 mm dan 87,6 mm a çıkarılması, köklenme frekansında önemli bir artış sağlamıştır. Bitkiciklerin %80 i başarılı bir şekilde dış ortama aktarılmış ve normal gelişim gözlenmiştir (Dias et al., 2002). Büyüme düzenleyicilerinin, Lavandula vera D.C. nin köklenme ve sürgün çoğaltımı üzerine etkilerinin, araştırılabilmesi için mikroçoğaltım yapılan bitkilerden alınan nodal eksplantlar kullanılmıştır. Başlangıçta, aktif vegetatif büyüme dönemindeki bitkilerden alınan aksiler tomurcukların, 0.5 mg/l BA içeren MS ortamına alınmasıyla in vitro bitkicikler elde edilmiştir. Farklı büyüme düzenleyici kombinasyonlarının aksiler tomurcuk büyümesi üzerine etkisinin araştırılabilmesi için in vitro bitkilerden alınan nodal eksplantlar, farklı sitokininler içeren 0.2 mg/l NAA ile kombine edilen ya da edilmeyen MS ortamlarına aktarılmıştır. 30 günlük kültür süresinin ardından sonuçlar alınmıştır. Şekil 2.1 de görüldüğü gibi BA ve TDZ içeren ortamda sürgün uzaması ve gelişiminin daha iyi olduğu gözlenmiştir. TDZ, sitokinin benzeri etkisiyle eksplant başına

28 11 sürgün sayısını, sürgün gelişimini ve sürgün oluşturan eksplant yüzdesini arttırmıştır. Deneme yapılan tüm ortamlarda gün içinde kök gelişimi saptanmıştır. Bitkicikler toprağa başarılı bir şekilde transfer edilmiş, olgunlaştırılmış ve gelişen bitkilerde somaklonal varyasyon belirtisi görülmemiştir (Andrade, 1999). Şekil 2.2 Lavandula vera DC nin in vitro çoğaltım potansiyeline büyüme düzenleyicilerinin etkisi (Andrade, 1999) Akdeniz karabaş otunun (Lavandula stoechas L.) in vitro klonal çoğaltımı için yapılan araştırmada, dış ortamda yetişmiş bitkilerden alınan eksplantlar kullanılmıştır. In vitro kültür başlangıcında ve sürgün çoğaltımı sırasında, sürgün vitrifikasyonunu azaltıcı prosedürler geliştirilmiştir. Margara N30K tuzları ile 217,2 µm adenine hemisülfat (AdS) ve 0,05 µm NAA içeren kültür ortamına alınan tek nodlu eksplanlardan 4 5 haftada sürgün çoğaltımı elde edilmiştir. 5,4 µm NAA içeren ortamda in vitro köklenme (%100) gerçekleşmiştir (Nobre, 1996). Yabani Lavandula türlerinin kültürü için en uygun ortamın saptanması amacıyla yapılan bir çalışmada üç farklı ortam (A: 50% turbo, 25% perlit, 25% kum; B: 25% turbo,

29 12 25% çam kabuğu kompostu, 25% perlit, 25% kum; C: 50% çam kabuğu kompostu, 50% kum) kullanılmıştır. Bunlardan C ortamı aromatik bitkilerin yetiştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitki gelişimi için bitki boyu, ana ve ikincil sürgün sayıları, gövde kalınlığı, köklerin ve diğer parçaların yaş ve kuru ağırlıkları ölçülmüştür. Yavaş gelişen çeşitlerde, substratlar arasında fark görülmezken, hızlı gelişen türlerde, turbolu ortamda oldukça yüksek gelişim oranları gözlenmiştir (Lopez et al., 1993). Lavandula stoechas L. için uygun yetiştirme koşullarının saptanması amacıyla yapılan bir çalışmada, 4 aylık karabaş otu filizleri 1:1 ya da 2:1 oranında turbo:perlit içeren ve ph olan ortamda 6 ay kültüre alınmışlardır. Gübre olarak 20N-19P-19K, 2 g/l olarak haftada bir ya da iki haftada bir uygulanmıştır. Bu çalışmada 4 deneme kurulmuştur. 1:1 Ortamında haftada bir gübreleme; 2:1 ortamında haftada 1 gübreleme; 1:1 ortamında 2 haftada 1 gübreleme; 2:1 ortamında 2 haftada bir gübreleme yapılmıştır. 1:1 Ortamında (turbo: perlit) haftada bir yapılan gübreleme, sürgünlerin boylarının uzamasını sağlamıştır. 2:1 Ortamında (turbo: perlit) haftada bir yapılan gübreleme, bitkilerin uzun dik sürgünler ve türe özgü daha fazla yanal sürgünler oluşturmalarına yol açmıştır. İki haftada bir yapılan gübrelemelerde bitkilerde klorozis oluşmuştur. Bu uygulama 2:1 ortamı ile kombine edildiğinde sürgün uzaması inhibe edilmiştir ve bitkiler açık yeşil, kısa ve sert bir görünüm almıştır (Papafotiou et al., 2000). Lavandula stoechas bitkilerinin süs bitkisi olarak kullanılma potansiyeli üzerine yapılan bir çalışmada, karabaş otu bitkileri saksılarda yetiştirilmiştir. Denemeler, üç farklı çevre koşulunda yürütülmüştür: ısıtmasız basit bir sera, gölgelik kafes ve açık hava. Biçim, büyüme oranı ve çiçeklenme yüzdesi gibi ölçümler iklim verileri ile kıyaslanmıştır. Bitki en iyi gelişimini gölgelik kafes altında göstermiştir (Maloupa et al., 2000). Işık ve sıcaklık faktörlerinin Lavandula stoechas tohumlarının çimlenmesi üzerine etkilerinin araştırılması amacıyla yapılan bir çalışmada; tohumlar 25 gün boyunca 5, 10, 15, 20, 25, 30 ve 35 o C de karanlık ve aydınlık (12 saat) koşullarda kültüre alınmıştır. 5, 30 ve 30 o C de aydınlık ya da karanlık koşullarda bekletilen tohumlar çimlenmemiştir. 10, 15 ve 20 o C de aydınlık ya da karanlık koşullarda bekletilen tohumlarda çimlenme artarken maksimum çimlenme (%37,5) 25 o C de karanlıkta kültüre alınan tohumlarda görülmüştür. 10 o C de ışık altında çimlenme kapasitesi en yüksek orana (%96,2) çıkmış ve 25 o C ye doğru sıcaklık yükseldikçe çimlenme kapasitesi %76,2 lere düşmüştür. Işık altında bekletilen tohumlarda çimlenme karanlıktakilere göre daha erken gerçekleşmiştir.

30 13 Sonuç olarak L. stoechas tohumları için 15+5 o C sıcaklık ile aydınlık koşullar çimlenme için en iyi koşullar olarak belirlenmiştir (Maher et al., 2000). Hatay florasında yetişen karabaş lavantanın (Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) çelikle köklendirilmesi üzerine farklı lokasyonların ve hormon dozlarının etkisinin araştırıldığı bir çalışmada; biri sahil kesiminde (Işıklı) diğeri ise iç kesimde bulunan (Narlıca) iki lokasyondan alınan çeliklerin köklenme durumları incelenmiştir. Her iki lokasyondan alınan bitki örneklerinin çiçek ve yapraklarında uçucu yağ miktarları belirlenmiştir (Çizelge 2.2). Her iki lokasyondan da çelikler aynı zamanda, Şubat ayında alınmıştır. Yarı odunsu ve yapraklı olarak hazırlanan çelikler, sera koşullarında köklendirme ortamına aktarılmışlar ve on hafta sonra sökülerek incelenmişlerdir. Denemede köklenmeyi teşvik edici olarak IBA kullanılmıştır. İki farklı lokasyondan alınan çeliklere, IBA nın 1000, 2000 ve 4000 ppm lik dozları, 5 sn. süre ile uygulanmış ve hiç IBA uygulanmayan çelikler kontrol olarak kullanılmışlardır. Hormon dozları köklenmeyi olumlu etkilemiş ve her iki lokasyondan alınan çeliklerde, uygulanan IBA konsantrasyonlarındaki artışa bağlı olarak köklenme yüzdesi, kök uzunluğu ve kök sayısı artmıştır. Elde edilen veriler, Işıklı dan alınan çeliklerin, Narlıca ya göre daha yüksek köklenme oranına sahip olduğunu göstermiştir. En yüksek köklenme oranı (% 70), Işıklı köyünden alınan ve 4000 ppm IBA uygulanan çeliklerden elde edilmiştir (Çizelge 2.3), (Ayanoğlu ve ark., 2000). Çizelge 2.2 Hatay yöresinde iki farklı lokasyondan alınan lavanta bitkilerinde uçucu yağ oranları (%). Lokasyon Yaprak Çiçek Işıklı 0,78 1,10 Narlıca 1,12 0,88

31 14 Çizelge 2.3 Farklı yörelerden alınan karabaş lavanta çeliklerinde köklenme oranı (%). IBA Konsantrasyonu Lokasyonlar Işıklı Narlıca Ortalama 0 30,0 0,0 15, ppm 46,6 6,6 26, ppm 36,6 36,6 36, ppm 70,0 33,3 51,6 Ortalama 45,8 19,1 Çalışmada, kök uzunluğuna ait en yüksek değerler, 11,12 cm ile Işıklı dan alınan ve 4000 ppm IBA konsantrasyonuna tabi tutulan çeliklerden alınmıştır (Çizelge 2.4). Genel olarak, Işıklı dan alınan çeliklerin kök uzunlukları, Narlıca dan alınan çeliklere göre daha uzun olmuştur. Kök sayısı bakımından ise, en yüksek değerler 12,24 adet/çelik ile Işıklı yöresinden alınan ve 4000 ppm IBA konsantrasyonu uygulanan çeliklerden elde edilmiştir (Çizelge 2.4). Genel olarak, Işıklı yöresinden alınan çeliklerin kök sayıları, Narlıca yöresinden alınan çeliklere göre daha fazla olmuştur (Ayanoğlu ve ark., 2000). Çizelge 2.4 Farklı yörelerden alınan karabaş lavanta çeliklerinde IBA konsantrasyonlarına göre kök uzunluğu ve kök sayısı. IBA Konsantrasyonu Kök Uzunluğu (cm) Kök Sayısı (adet/çelik) Lokasyonlar Lokasyonlar Işıklı Narlıca Ortalama Işıklı Narlıca Ortalama 0 4,94 0,00 2,47 6,97 0,00 3, ppm 6,66 1,28 3,97 9,60 3,00 6, ppm 6,80 4,14 5,47 9,75 8,53 9, ppm 11,12 3,14 7,13 12,24 6,83 9,54 Ortalama 7,38 2,14 9,64 4,59

32 15 3. MATERYAL ve METOD 3.1. Materyal Çanakkale On Sekiz Mart Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü ne ait deneme alanında, yıllarında kültürü yapılan karabaş otu bitkilerine ait tohumlar materyal olarak kullanılmıştır (Şekil 3.1). (a) (b) Şekil 3.1 (a) Çalışmada kullanılan karabaş otu tohumlarının elde edildiği kuru çiçekler (b) Çalışmada kullanılan karabaş otu tohumları 3.2. Metod Araştırmada, karabaş otu bitkilerinden alınan tohumlarının yüzey sterilizasyonları, farklı yöntemler kullanılarak yapılmıştır. Steril tohumlar, değişik hormon kombinasyonlarına sahip MS (Murashige ve Skoog, 1962) ortamında kültüre alınmışlardır. Besin ortamlarının hazırlanması, tohumların sterilizasyonu, çimlendirilmesi ve eksplantların kültüre alınması ile ilgili yöntemler aşağıda ayrıntılı bir şekilde sunulmuştur.

33 Besin ortamlarının hazırlanması Araştırmada mineral maddeler, vitaminler, bitki büyüme düzenleyicileri ve gelrite içeren MS (Murashige ve Skoog, 1962) besin ortamları kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1 MS (1962) besin ortamının içerdiği maddeler ve miktarları. Maddeler MS Besin Ortamındaki Miktarlar (mg/l) NH 4 NO KNO MgSO 4.7H 2 O 370 MnSO 4.4H 2 O 22,3 ZnSO 4.7H 2 O 8,6 CuSO 4.5H 2 O 0,025 H 3 BO 3 6,2 KH 2 PO Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 CaCl 2.2H 2 O 440 KI 0,83 CoCl 2.6H 2 O 0,025 myo-inositol 100 Tritriplex(Na 2 EDTA) 37,3 FeSO 4.7H 2 O 27,8 Nikotinik asit 0,5 Pridoksin-HCl 0,5 Tiamin-HCl 0,1 Çimlenme, sürgün oluşumu ve gelişimi ve köklendirme çalışmaları için bitki büyüme düzenleyicilerinin farklı kombinasyonlarını içeren MS ortamları denenmiştir. Araştırmada kullanılan MS 1BAP ortamının (Çizelge 3.2) hazırlanması için önceden oluşturulmuş stok çözeltilerden 1 litre için gerekli olan miktarlar alınarak, behere aktarıldıktan sonra 1 mg BAP eklenmiştir. Ortama 30 g sükroz ilave edilip, hacim destile su ile 1 litreye tamamlanmıştır. Sükroz iyice eritildikten sonra seyreltilmiş NaOH ve HCl kullanılarak ph=5,8 e ayarlanmıştır. 2,5 g/l gelrite ilave edildikten sonra sürekli karıştırılarak kaynatılan ortam, sıcak olarak kapaklı deney tüplerine 10 ar ml olmak üzere dökülmüştür. Ağızları kapatılan tüpler, otoklavda C de 15 dakika sterilize

34 17 edilmişlerdir. Araştırmada kullanılan diğer besin ortamlarının hazırlanması sırasında da aynı işlemler uygulanmıştır Tohum sterilizasyonu Karabaş otu tohum örnekleri, öncelikle sabunlu su ile iyice yıkanıp akan çeşme suyuyla durulanmıştır. Tohumların sterilizasyonlarında 2 farklı yöntem kullanılmıştır. %70 lik etil alkolde 1 dakika bekletilen tohumlar, daha sonra %30 luk ticari sodyum hipokloritte (NaOCl) 20 ve 25 dakika tutulmuşlardır (Çizelge 3.2). Bu işlemlerin ardından, 3 kez steril distile suda çalkalanan tohumlar, steril filtre kağıdı üzerine bırakılmış, fazla sularından arındırılmışlardır. Çizelge 3.2 Tohumlara uygulanan sterilizasyon yöntemleri. Uygulama I II Etil alkol uygulaması NaOCl uygulaması %70 lik 1 dakika % 30 luk 20 dakika %70 lik 1 dakika % 30 luk 25 dakika Tohumların çimlendirme ortamına alınması Tohumların çimlendirilmesinde, gelrite içeren MS ortamı ve su ile ıslatılmış pamuklu ortamlar kullanılmıştır. Sterilizasyon prosedürü uygulanan tohumlar, her bir tüpte bir tohum bulunacak şekilde, çimlendirme ortamlarında kültüre alınmışlardır. Sükroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.3 de verilmiştir.

35 18 Çizelge 3.3 Tohumların çimlendirilmesinde kullanılan ortamlar. Ortam Sükroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 1 MS 30 g/l - 2 MS 1BAP 30 g/l 1 mg/l BAP 3 MS 1IBA 30 g/l 1 mg/l IBA 4 Nemli Pamuk Sürgün nod eksplantlarının sürgün gelişimi ortamlarında kültüre alınması In vitro koşullarda çimlendirilen karabaş otu tohumlarından gelişen steril çim bitkilerinden elde edilen, 2-3 nodlu sürgün eksplantları, her bir tüpte bir eksplant olacak şekilde, sürgün gelişimi ortamları içeren tüplere aktarılmıştır. Sürgün gelişimi için 3 farklı MS ortamı kullanılmıştır. Yarı katı besin ortamlarının sükroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.4 de verilmiştir. Çizelge 3.4 Sürgün gelişimi için kullanılan besin ortamlarının kompozisyonları. Ortam Sükroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 1 MS 1BAP 30 g/l 1 mg/l BAP 2 MS 2BAP 30 g/l 2 mg/l BAP 3 MS 5BAP 30 g/l 5 mg/l BAP

36 Sürgün nod eksplantlarının kök gelişimi ortamlarında kültüre alınması Tohum kökenli bitkiciklerden elde edilen 2-3 nodlu sürgün nod eksplantları, köklendirme ortamlarına alınmıştır. Kök gelişimi için kullanılan 4 farklı besin ortamının sükroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.5 de verilmiştir. Çizelge 3.5 Kök gelişimi için kullanılan besin ortamları. Ortam Sükroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 1 MS 0,1IBA 30 g/l 0,1 mg/l IBA 2 MS 1IBA 30 g/l 1 mg/l IBA 3 MS 2IBA 30 g/l 2 mg/l IBA 4 MS 1NAA 30 g/l 1 mg/l NAA Sürgün nod eksplantlarından tek tohum kökenli klonların çoğaltılması 1 mg/l BAP içeren MS ortamında çimlendirilen tohumlardan bir tanesi seçilmiş ve elde edilen çim bitkisi (klon 1) sırasıyla MS 0,1IBA, MS 1BAP, MS 0,1IBA ve MS 1BAP ortamlarında üçer hafta süreyle 4 kez altkültüre alınarak çoğaltılmıştır. Bu altkültürler sonucu elde edilen klon 1 bitkiciklerinden kesilen 2-3 nodlu sürgün eksplantları, 9 farklı ortamda (Çizelge 3.6) kültüre alınmış ve büyüme parametreleri kaydedilmiştir. Yine MS 1BAP ortamında çimlendirilen tohumlardan, bir diğeri seçilmiş ve elde edilen çim bitkisi (klon 2) sırasıyla MS 0,1IBA ve MS 1BAP ortamlarında üçer hafta süreyle 2 kez altkültüre alınarak çoğaltılmıştır. Altkültürler sonucu elde edilen klon 2 bitkiciklerinden kesilen 2-3 nodlu sürgün eksplantları, 2 farklı ortamda (çizelge 3.7) kültüre alınmış ve büyüme parametreleri incelenmiştir.

37 20 Çizelge 3.6 Bitki büyüme düzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L. e ait klon 1 bitkilerinin büyüme parametreleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kullanılan ortamlar. Ortam Sükroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 1 MS 0,1BAP 30 g/l 0,1 mg/lbap 2 MS 0,5BAP 30 g/l 0,5 mg/l BAP 3 MS 1BAP 30 g/l 1 mg/l BAP 4 MS 0,1IBA 30 g/l 0,1 mg/l IBA 5 MS 0,5IBA 30 g/l 0,5 mg/l IBA 6 MS 1IBA 30 g/l 1 mg/l IBA 7 MS 0,1NAA 30 g/l 0,1 mg/l NAA 8 MS 0,5NAA 30 g/l 0,5 mg/l NAA 9 MS 1NAA 30 g/l 1 mg/l NAA Çizelge 3.7 Bitki büyüme düzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L. e ait klon 2 bitkilerinin büyüme parametreleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kullanılan ortamlar. Ortam Sükroz Bitki Büyüme Düzenleyicileri 3 MS 1BAP 30 g/l 1 mg/lbap 6 MS 1IBA 30 g/l 1 mg/l IBA Araştırmada incelenen büyüme parametreleri; ortalama bitki boyu (cm), sürgün nod eksplantı başına ortalama sürgün sayısı (adet), sürgün nod eksplantı başına ortalama nod sayısı (adet), sürgün nod eksplantı başına ortalama kök sayısı (adet) ve sürgün nod eksplantlarının ortalama kallus oluşturma yüzdeleridir Kültür koşulları Tüm kültürler, fluoresan ışığında 4000 lux aydınlatma altında, 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık fotoperiyotta ve 27±4ºC sıcaklıkta tutulmuşlardır.

38 Denemenin kurulması ve verilerin değerlendirilmesi Araştırmamız, tohumlardan geliştirilen bitkiciklerden elde edilen sürgün nod eksplantlarında, sürgün ve kök gelişiminin incelendiği, ön denemeler ile, tek tohumdan geliştirilen klonlarda (klon 1 ve klon 2), büyüme parametrelerinin incelendiği, klon denemeleri olarak iki ayrı deneme şeklinde kurulmuştur. Tek faktör olarak besin ortamlarının (Çizelge 3.4; 3.5; 3.6; 3.7) ele alındığı ön denemeler ile klon denemeleri, 3 tekerrürlü olarak, tesadüf parselleri deneme desenine göre oluşturulmuş ve değerlendirilmiştir. Karabaş otu bitkisinde, klonlar arası farklılıkların saptanabilmesi için, denemelerden elde edilen büyüme parametreleri, birinci faktör olarak klonların (klon 1 ve klon 2); ikinci faktör olarak besin ortamlarının (Çizelge 3.7) ele alındığı 2 faktörlü tesadüf parselleri deneme deseninde incelenmiştir. Tüm değerlendirmelerde farklılıkların önem düzeylerinin ve boyutlarının saptanabilmesi için asgari önemli fark (AÖF=LSD) test yöntemi kullanılmıştır (Açıkgöz, 1998). Çalışmada, oransal olarak ifade edilen verilerin değerlendirilmesinde 0 değerleri içeren verilere log transformasyonu uygulanmıştır. Bu transformasyon tipinde sıfır değerlerinin her birine 1 değeri eklendikten sonra transformasyon yapılmıştır. Orijinal verilerin 1 den küçük olduğu durumlarda tüm veriler sabit bir sayı (100) ile çarpılarak negatif sonuç önlenmiş ve 10 tabanlı logaritma uygulanmıştır (Açıkgöz, 1988).

39 22 4. BULGULAR 4.1. Kültüre alınan tohumlarda kontaminasyon durumu Çalışmada, toplam 360 tohum çimlendirilmek üzere kültüre alınmıştır. Kullanılan 4 farklı ortamda (Çizelge 3.2) görülen kontaminasyon yüzdelerinin ortalamaları Çizelge 4.1 de gösterilmiştir. Dört farklı ortamda tohum sterilizasyonu bakımından yapılan istatistiki değerlendirmede, ortamlar arasındaki farkın ve uygulanan yöntemler arasındaki farkın önemsiz olduğu tespit edilmiştir. Çizelge 4.1 Tohumların yüzeysel sterilizasyonları sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdeleri. Uygulamalar 1 2 %30 luk Ticari NaOCl de 20 dakika %30 luk NaOCl de 25 dakika Ortamlar Tek. I Tek. II Tek. III Ort. Tek. I Tek. II Tek. III Ort. MS 3,3 10,0 6,7 6,7 0,0 3,3 0,0 1,1 MS 1BAP 6,7 3,3 3,3 4,4 0,0 0,0 0,0 0,0 MS 1IBA 6,7 3,3 0,0 3,3 3,3 0,0 0,0 1,1 Pamuk 10,0 0,0 3,3 4,4 0,0 3,3 0,0 1,1 Ort. 6,7 4,2 3,3 4,7 0,8 1,7 0,0 0,8 Uygulanan yöntemlerin tohumlarda kontaminasyon oluşum yüzdeleri üzerinde istatistiksel açıdan bir fark bulunmamış olsa da %0,8 değeri ile % 30 luk ticari NaOCl de 25 dakika olan uygulamanın daha etkili olduğu saptanmıştır. Tohumların aynı derişimdeki çözeltide 20 dakika bekletildiği diğer uygulamada çok farklı sonuçlar elde edilmemesine rağmen, kontaminasyon yüzdesi daha yüksek bulunmuştur (Şekil 4.1).

40 23 Kontamisnasyon Yüzdesi (%) ,7 0,8 1 2 Uygulama Numarası Şekil 4.1 Tohumların kullanılan sterilizasyon yöntemlerine göre kontaminasyon yüzdeleri 4.2. Kültüre alınan tohumlarda görülen gelişmeler Çimlenen tohum sayısı için yapılan istatistiki değerlendirme sonucunda, ortamlar arasındaki fark % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (F = 194,184). İstatistiki açıdan ilk grupta yer alan ortamda (MS 1BAP) çimlenen tohum sayısı ortalama 29,7 adettir. Bu ortamı, 8,3 ortalama ile 1 mg/l IBA içeren MS ortamı takip etmiştir. Daha düşük ortalamalara sahip olan nemli pamuk (5,7) ve MS (5,3) ortamları ise ikinci grupta yer almışlardır (LSD= 9,681) (Çizelge 4.2). Çizelge 4.2 Kültüre alınan tohumlarda çimlenme durumları. Çimlenen tohum sayısı (adet) Ortamlar Tek. I Tek. II Tek. III Ort. MS ,3 B MS 1BAP ,7 A MS 1IBA ,3 B Nemli Pamuk ,7 B Her bir tekerrürde kültüre alınan tohum sayısı 30 adettir.