El Kitabı. HHV6 Real-TM Quant. İnsan Herpes Virus 6 Kantitatif Tespiti İçin Real Time PCR kiti REF V10-100FRT REF TV10-100FRT IVD

Transkript

1 IVD Sadece Vitro Diagnostic Kullanım için HHV6 Real-TM Quant El Kitabı İnsan Herpes Virus 6 Kantitatif Tespiti İçin Real Time PCR kiti REF V10-100FRT REF TV10-100FRT 100

2 İSİM HHV6 Real-TM Quant KULLANIM AMACI HHV6 Real-TM Quant kiti biyolojik malzemelerde Human Herpes Virus 6 nın kantitatif tespiti için, in vitro Real Time amplifikasyon testidir. DNA, Internal (iç) Kontrol (IC) ve HHV6 pol-gene için spesifik floresan raportör boya propları ile Real Tme aplifikasyon kullanılarak, amplifiye edilen numune ekstraktıdır. Test, her biri tek tek işlenmiş numune için, amplifikasyon kontrolü olarak hizmet veren ve olası reaksiyon inhibasyonunu tanımlamak için bir IC (-globin gen) içerir. TAHLİL PRENSİBİ HHV6 Real-TM Quant kiti, örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyonu olmak üzere, iki ana proses esasına dayanmaktadır. HHV6 DNA amplifikasyon sonuçları, Joe/HEX/Yellow da ve Internal kontrol olarak kullanılan -globin gen FM/Green kanalda tespit edilir. Eğer numune doğru hazırlanmamışsa veya muhafaza edilmemişse (yetersiz miktar < 2,0 x 10 4 genom/numune), Internal Kontrol tespit edilemeyecek ya da çok düşük siyalli olacaktır. Kit, kan ve diğer hesaplamalarından lökosit ekstraksiyon prosedür çalışmalarını önleyen bir tüpte, -globin gen ve DNA HHV6 eş zamanlı tespiti için kantitatif standartlar içerir. Aşağıdaki formül kullanılarak, hücrelerin standar miktarlarında ( örneğin; 10 6 HHV6 DNA konsantrasyonu hesaplanır. insan hücresinde) 10 6 hücrede* Kopya HHV6 DNA = reaksiyondaki kopya HHV6 DNA/ reaksiyondaki kopya insan DNA x 2*10 6 *10 6 hücresi 2*10 6 insan genomu içerir.

3 SAĞLANAN MALZEMELER Modül No.1: Real Time PCR kit (V10-100FRT) Part N 2 HHV6 Real-TM Quant : Real Time amplifikasyon PCR-mix-1 HHV6/Glob, 2 x 0,6 ml PCR- buffer-frt, 2 x 0,3 ml TaqF Polymerase, 2 x 0,03 ml Negative Control, 1,2 ml;* Pos HHV6 & Human DNA C+, 2 x 0,2 ml;** DNA-buffer (C-), 0,5 ml Quantitation Standard HHV6 & Glob: o QS1, (konsantrasyon10 4 kopya/numune) 0,2 ml, o QS2,(konsantrasyon 10 2 kopya/numune)0,2m l, 120 test için reaktif içerir. Module No.2: Complete Real Time PCR test with DNA purification kit (TV10-100FRT) (DNA purifikasyon kitli (TV10-100FRT) komple Real Time PCR testi) Part N 1 DNA-sorb-B : Sample preparation (numune hazırlama kiti) Lysis Solution, 2 x 15 ml; Sorbent, 2 x 1,25 ml; Washing Solution 1, 2 x 15 ml; Washing Solution 2, 2 x 50 ml; DNA-eluent, 2 x 5 ml; 100 test için reaktif içerir. Part N 2 HHV6 Real-TM Quant : Real Time amplifikasyon PCR-mix-1 HHV6/Glob, 2 x 0,6 ml PCR- buffer-frt, 2 x 0,3 ml TaqF Polymerase, 2 x 0,03 ml Negative Control, 1,2 ml;* Pos HHV6 & Human DNA C+, 2 x 0,2 ml;** DNA-buffer (C-), 0,5 ml Quantitation Standard HHV6 & Glob: o QS1, (konsantrasyon 10 4 kopya/numune) 0,2 ml, o QS2, (konsantrasyon10 2 kopya/numune)0,2 ml, 120 test için reaktif içerir. * numune hazırlama prosedüründe negatif kontrol olarak kullanılmalıdır : 100 µl C (Negative Control) ü Cneg etiketli tüpe ekleyin ** 90 µl C (Negative Control) ü ve 10 µl Pos HHV6 & Human DNA C+ ü Cpos etiketli tüpe ekleyin.

4 SAĞLANMAYAN, GEREKLİ MALZEMELER Bölge 1: Örnek Hazırlama: -DNA ekstraksiyon kiti(modül No.1) -Biolojik kabin -Vortex - eppendorf tipli tüpler için masaüstü mikrosantrifüj -Kuru ısı bloğu -Vorteks mikser -Pipetler -Filtreli steril pipet uçları -1,5 ml polipropilen steril tüpler -Biyolojik tehlikeli atık konteyneri -Buzdolabı, dondurucu Bölge2:Real Time amplifikasyon: Real Time Thermal cycler Reaksiyon Tüpleri Çalışma İstasyonu Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları Vorteks Mikser Dondurucu, buzdolabı MUHAFAZA KOŞULLARI HHV6 Real-TM Quant, 20 C de, DNA-sorb-B +2-8 C de muhafaza edilmelidir.. Kitler 2-8 C'de sevk edilebilirler, ancak alındıklarında hemen 2-8 C ve -20 C de muhafaza edilmelidirler. STABİLİTE HHV6 Real-TM Quant etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır. Işık, ısı veya neme maruz kalma, kitin bazı bileşenlerini etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden, reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. Bileşenler, etiketlerde belirtilenler dışındaki koşullarda muhafaza edildiğinde düzgün çalışmayabilir ve tahlil sonuçlarını olumsuz etkileyebilir. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; SACACE, ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir.

5 UYARILAR VE ÖNLEMLER In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Sadece In Vitro Diagnostic kullanım için Kullanıcı her zaman aşağıdakilere dikkat etmelidir: Lysis Solüsyonu,guanidine thiocyanate* içerir. Guanidin tiyosiyanat solunduğunda veya yutulduğunda veya deri ile temas halinde zararlıdır. Asit ile temasında toksik gaz oluşturur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). Aerosol engelli steril pipet uçları kullanın ve her işlem için yeni pipet ucu kullanın. Ekstrakte edilmiş pozitif malzemeleri (örnekler, kontroller ve amplikonlar) diğer tüm reaktiflerden uzakta tutun ve ayrı bir alanda reaksiyon karışımına ekleyin. Tahlile başlamadan önce tüm bileşenleri oda sıcaklığında tamamen çözün. Bileşenleri, çözündüğünde karıştırın ve kısa süre santrifüjleyin. Reaktif ve örnekler ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu kullanın.işlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi birşey yemeyin- içmeyin, kozmetik uygulamayın veya kontakt lenslere ellemeyin. Son kullanı tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallara uygun olarak imha edin. Örnekler potansiyel bulaşıcı olarak dikkate alınmalı ve işlemler uygun biyogüvenlik yöntemlerine uygun olan biyolojik kabinde yapılmalıdır. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. Örnek veya reaktifin deri, göz ve mukoza zarları ile temasından kaçının, temas olması halinde su ile yıkayınız ve hemen tıbbi yardım alın. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı Ekstraksiyon alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. Bu kitteki bazı bileşenler koruyucu olarak sodium azid içerir. Reaktif transferi için metal tüp kullanmayınız. * Sadece Modül No.2için

6 ÜRÜN KULLANIM SINIRLARI Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostic için kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır (UNI EN ISO :2012). Kullanım kılavuzu ile tam uyum, optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu üzerinde ve tüm bileşenlerin etiketlerinde yazılı olan son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Kiti, son kullanım tarihinden sonra kullanmayın. ÖRNEK ALINMASI, MUHAFAZA VE TAŞINMASI HHV6 Real-TM Quant aşağıdakilerden DNA ekstrakt analizi yapabilir: ACD ya da EDTA lı tüplerde toplanan tam kan; buffy coat; balgam: 1 hacim balgam 1 hacim tuzlu suya eklenir ve kuvvetlice vortekslenir g/dakika devirde 10 dakika santrifüjlenir. Süpernatantı ayırın, DNA ekstraksiyonu için yaklaşık 100 µl bırakın. swab: swabı nükleaz içermeyen 1,5 ml tüpün içine koyun ve 0,2 ml medium transport ekleyin. Swabları medium içerisinde saniye şiddetlice çalkalayın. Tükürük, Beyin omurilik sıvısı (liquor), İç organ biyopsi malzemesi, Bu örneklerin toplandıktan hemen sonra işlenmesi önerilir. Örnekleri 24 saatten fazla olmamak üzere 2 8 C de muhafaza edin ya da 20/80 C de dondurun Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır. DNA IZOLASYONU Herhangi bir ticari RNA / DNA izolasyon kiti, burada belirtilen IVD-CE "NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA" paragrafındaki örnek türleri için valide ise, kullanılabilir. Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitleri kullanmanızı önerir: DNA-Sorb-B (Sacace, REF K-1-1/B) Ribo Virus 50 spin column extraction kit (Sacace, REF K-2-C) SaMag Viral Nucleic Acids Extraction Kit (Sacace, REF SM003) beyin omurilik sıvısı ve hücresiz vücut sıvıları için; SaMag STD DNA Extraction Kit (Sacace, REF SM007) swablar için.

7 DNA ekstraksiyonunu, lütfen üreticinin talimatına göre gerçekleştirin. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA (modul no.2ile sağlanan reaktifler) 1. Lysis Solution ve Washing Solution (+2-8 C de muhafazası durumunda ) buz kristalleri yok olana kadar 60 C 'ye kadar ısıtılmış olmalıdır. 2.. Gerekli miktarda 1.5 ml lik polipropilen tüpleri hazırlayın. 3. Her tüpe 300 µl Lysis Solution u ekleyin. 4. Uygun tüplere 100 µl numune ekleleyin. 5. Kontrolleri aşağıdaki gibi hazırlayın: Cneg etiketli tüpe100 µl C (Negative Control.) ekleyin. Cpos etiketli tüpe 90 µl C (Negative Control) ve 10 µl Pos HHV6 & Human DNA C+ ekleyin 6. Tüpleri vortekleyin, 65 C de 5 dakika inkübe edin ve 5 saniye santrifüjleyin. 7. Sorbent i kuvvetlice vorteksleyin ve her tüpe 25 µl ekleyin saniye vorteksleyin ve oda sıcaklıgında peryodik olarak vorteksleyerek 10 dakika inkübe edin. 9. Bütün tüpleri 5000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve her tüpten peleti dağıtmadan süpernatantı ayırın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin. 10. Her tüpe 300 µl Washing Solution 1 ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve 5000 g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve her tüpten peleti dağıtmadan süpernatantı ayırın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin. 11. Her tüpe 500 µl Washing Solution 2 ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve her tüpten peletleri dağıtmadan süpernatantı atın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin Adımı tekrarlayın. 13. Bütün tüpleri kapakları açık halde 65 C de 5 dakika inkübe edin. 16. Peleti 50 µl DNA-eluent te resüspanse edin.5 dakika 65 C de inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 17. Tüpleri en fazla ( g) hızda 2 dakika inkübe edin.süpernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Amplifikasyon, ekstraksiyonla aynı günde gerçekleştirilmelidir.

8 PROTOKOL: Reaksiyon Hacmi= 25 µl 1. Gerekli miktardaki tüpleri hazırlayın (N + 6 controls (4 standard, 1 Neg. control, 1 Pos. Control). 2. Her bir örnek için,10*(n+1) µl PCR-mix-1-FRT HHV6/Glob, 5,0*N PCR-Buffer-FRT ve 0,5*N TaqF Polymerase yeni steril tüpler hazırlayın.vorteksleyin ve 2-3 saniye santrifüjleyin. 3. Uygun tüpe 10 µl extracte DNA ve 15 µl Reaction Mix ekleyin. Pipetlemeyle karıştırın. 4. Kalitatif çalışmaiçin 1 pozitif kontrol ve 1 negatif kontrol hazırlayın: Cpos etiketli tüpe 10 µl QS2 ekleyin; Cneg etiketli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; 5. Kantitatif analiz için 1 negatif kontrol (Cneg etiketli tüpe 10 µl DNAbuffer ekleyin ) ve standartlar için 4 tüp hazırlayın. 4 etiketli tüpe 10µl Quantitation Standards HHV6 & Glob (QS1, QS2) ekleyerek, iki kez QS1 ve QS2 standartlarını yapın.; Amplifikasyon 1. Tüpleri kapatın ve Real Time ThermalCycler a transfer edin. 2. Numuneler, kontroller ve standartların pozisyonlarını programlayın. 3. Enstrümanları aşağıdaki gibi programlayın: Rotor-tip Enstrümanlar 1 Plate- veyamodular tip Enstrümanlar Adım Sıcaklık, С Süre Tekrarlar Sıcaklık С Süre Tekrarlar dakika dakika sn 95 5 sn sn sn sn sn 95 5 s 95 5 sn sn Floresan sinyal tespiti sn Floresan sinyal tespiti sn sn 1 Örneğin Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen) 2 Örneğin, SaCycler-96 (Sacace), CFX/iQ5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) Floresan, Cycling 2 evresinin(60 C) 2. adımında FAM/Green ve JOE/Sarı /Hex/Cy3 kanallarında tespit edilir.

9 ENSTRÜMAN AYARLARI Rotor-tip enstrümanlar Kalibrasyon/Gai Kanal n Optimizasyonu Eşik Diğer Ayarlar/Outlier Removal Slope Correct FAMGreen 5 Fl ila %10 açık JOE/Yellow 4 Fl ila %10 açık Fl Plate-tip Enstrümanlar Eşik çizgisi, sadece pozitif numunelerin sinyal birikiminin sigmoid eğrilerini geçmeli, taban çizgisini geçmemelidir; aksi takdirde, eşik seviyesi yükseltilmelidir. Floresan eğrilerinin doğrusal olduğu seviyede eşiği ayarlayın ve negatif örnek eğrilerini geçmeyin. SONUÇ ANALİZİ: Sonuçlar eşik hattı ile floresan eğrisinin geçiş varlığı sayesinde,cihazın yazılımı ile yorumlanır. İnternal Kontrol (İnsan DNA'sı) FAM/Green kanalda ve HHV6 Joe/HEX/Yellow kanalda tespit edilir. Kopya HHV6 DNA konsantrasyonu 10 6 hücre içinde aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: Kantitatif analizde,toplam DNA, tam insan kanı, beyaz kan hücreleri veya iç organ biyopsi malzemelerinden izole edilmişse, örneklerdeki her standart hücre miktarı (10 5 ) başına HHV6 DNA logaritmik konsantrasyonu aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: Eğer DNA tükürük, orofarinjel swab ve beyin omurilik sıvısından (liquor) izole edilmişse,numunenin (kopya HHV6 DNA) ml başına HHV6 DNA konsantrasyonu aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: Kopya HHV6 DNA = Calc HHV6 DNA х 100 (kopya/ml), HHV6 DNA Joe/HEX/SYellow kanalda hesaplanan, HHV6 DNA kopya/reaksiyon sayısıdır.

10 Hesaplama manuel ya da Microsoft Excel program kullanılarak yapılabilir. İsim Tip kopya HHV- 6 (Joe/yellow)/ reaksiyon kopyaglob (Fam/green) / reaksiyon lg HHV-6/10*5 hücreleri kopya HHV- 6/10*6 hücreleri A B C D E=LOG(C/D*200000) F=C/D* Bilinmeyen E+05 1 Bilinmeyen E+05 2 Bilinmeyen E+04 2 Bilinmeyen E+04 3 Bilinmeyen E+03 3 Bilinmeyen E+03 C- Bilinmeyen C- Bilinmeyen C+ Bilinmeyen E+04 C+ Bilinmeyen E+04 QS1 Bilinmeyen QS1 Bilinmeyen QS2 Bilinmeyen QS2 Bilinmeyen Pos HHV6 & Human DNA C+ 2 değeri arasındaki fark bir çalışma esnasında %25 ten büyük olmamalıdır. PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Analitik Özgünlük Primerlerin ve probların analitik özgünlüğü, negatif numuneler ile valide edilmiştir. Spesifik Human Herpes Virus 6 primerleri ve probları ile herhangi bir sinyal oluşturmamışlardır. HHV6 Real-TM Quant kitinin özgünlüğü %100 idi. HHV6 Real-TM Quant kitinin potansiyel çapraz reaktivitesi, kontrol gruplarına karşı test edilmiş ve diğer patojenlere karşı hiç bir çapraz reaktivite gözlemlenmemiştir. Analitik Hassasiyet HHV6 Real-TM Quant kiti, 200 kopya/ml ya da 10 5 hücre başına 5 kopya HHV6 DNA dan az olmayan hassasiyetle, testlerin %100 ünde Human Herpes Virus 6 DNA nın tespitine olanak sağlar. HHV6 Real-TM Quant nın lineer aralığı, HHV6 DNA kopya/ml dir. Eğer sonuç 500 kopya/ml den az ise, sonuçlar 500 kopya/ml den daha az olarak belirtilmelidir. Hedef Bölge: polymerase gene HHV6

11 SORUN GİDERME Analiz sonuçları aşağıdaki durumlarda dikkate alınmaz: 1. Negatif konrol aplifikasyonu (NCA) için FAM/Green ve JOE/Yellow/HEX 'teki Ct değerinin sonuçları grid görünümü ve Ct değeri ekstraksiyon negatif kontrol (C-) JOE/Sarı/HEX kanalda numune veya reaktif kontaminasyonu gösterirse. HHV6 DNA,DNA ekstraksiyon aşamasından başlanılarak tespit edildiği tüm numunelerin PCR analizi tekrarlanır. 2. Kantitatif analizde, JOE/Yellowı/HEX (HHV6) veya FAM/Green kanalda pozitif kontrol amplifikasyon (C+,KGS2) Ct değeri için grid sonuçlar yoksa, HHV6 DNA 'nın tespit edilmediği tüm numune amplifikasyonları tekrarlanır. 3. Eğer pozitif kontrol ekstraksiyon (PCE, Pozitif Kontrol DNA HHV-6 ve insan DNA'sı) Ct değeri, JOE(HHV6) veya FAM kanalda yoksa, tüm numunelerin analiz sonuçları geçersiz kabul edilir. DNA amplifikasyon aşamasından başlanılarak tüm numune analizleri tekrarlanır. 4. Eğer JOE/Yellow/HEX kanalında numune Ct değeri yoksa, DNA ekstraksiyon aşamasından başlanılarak numune analizi tekrarlanır. Bu, DNA kaybı veya inhibitör varlığı nedeniyle, klinik malzeme hazırlanmasındaki hatalar nedeniyle olabilir. 5. JOE/Yellow/HEX kanalında (HHV6 DNA) klinik numune Ct değeri, Ct sınır değerini (>36) aşarsa, bu gibi numunelerin sonuçları belirsiz (şüpheli) kabul edilir. Bu tür numunelerin analizi çift çalışılarak tekrarlanır. Eğer her iki tekrarda da sonuçlar pozitif ise, sonuç pozitif olarak kabul edilir. Eğer sonuçlar iki tekrarda farklı çıkarsa, bu gibi numunelerin analiz sonuçları belirsiz (şüpheli) olarak kabul edilir. 6. Eğer kantitatif testlerde DNA kalibratörlerinde her reaksiyon başına kopya sayısı belirtilen değerden %30 fazla çıkmışsa, rotordaki tüplerin yerleşim sırasını kontrol edin. DNA kalibratörleri numune tablosunda "standartlar" olarak adlandırılan hücrelerin içinde olmalıdır ve rotor-tip enstrümandaki hücre no.1 boş olmalıdır (herhangi bir test tüpü ile doldurun). 7. Eğer kantitatif testlerdeki Standart eğri penceresindeki R ilişki katsayısı, 0.9 'dan düşükse, bu kalibrasyon hatasını gösterir. DNA kalibratör ayarları doğru olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse değiştirin. Bu işe yaramazsa, tüm numuneler ve kalibratörler için PCR çalışılır.

12 KULLANILAN SEMBOLLERİN AMLAMLARI Liste Numarası Dikkat! Lot Numarası <n> testleri için yeterli içerik Sadece In vitro Diagnostic kullanım Versiyon.: de muhafaza İmalatçı NCA NCE Negative Control of Amplification Negative control of Extraction Kullanım Talimatlarına Bakınız C+ Positive Control of Amplification Son kullanım tarihi IC Internal (İç) Kontrol * SaCycler is a registered trademark of Sacace Biotechnologies * CFX and iq5 are registered trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen * MX3005P is a registered trademark of Agilent Technologies * ABI is a registered trademark of Applied Biosystems * LineGeneK is a registered trademark of Bioer * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: